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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A imunidade inata é a primeira linha de defesa contra patógenos estimulada pelo reconhecimento de estruturas moleculares características de microorganismos tais como o lipopolissacarídeo (LPS). Os receptores ativados por protease (PARs) fazem parte de uma família de receptores metabotrópicos ativados por serino proteases através da clivagem proteolítica em sua porção N-terminal, denominados PAR1-4. Dentre esses, PAR2 é expresso tanto em leucócitos quanto em células residentes dos pulmões e, sua ativação tem sido relacionada com o desenvolvimento da inflamação e recrutamento celular, porém, ainda não está bem esclarecido o envolvimento da ativação de PAR2 por seus agonistas endógenos na resposta inflamatória induzida pelo LPS. O objetivo desse trabalho foi então avaliar o papel de PAR2 e das proteases endógenas no recrutamento de neutrófilos para o pulmão de camundongos C57BL/6 em resposta à instilação intranasal (i.n.) de LPS. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética animal (CEUA/UFMG, 150/2017). Os resultados mostram que a administração i.n. de LPS ou triptase induziram o aumento do número de neutrófilos recuperados no lavado broncoalveolar (BAL) após um período de 4h, e que o pré-tratamento com injeção intraperitoneal (i.p.) do antagonista de PAR2 (ENMD-1068) ou com instilação i.n. do inibidor de proteases (aprotinina) 1h antes do estímulo com LPS reduziram a presença dessas células no BAL. Em contrapartida, o prétratamento com ENMD-1068 também aumentou o número de neutrófilos no sangue periférico dos animais. O antagonista de PAR2 diminuiu os níveis da quimiocina CXCL1 mensurada no sobrenadante do BAL obtido no intervalo de 4h após o tratamento i.n. com LPS. Além disso, a análise histopatológica em pulmões de camundongos corados com hematoxilina-eosina demonstrou que o ENMD-1068 reduziu a inflamação pulmonar induzida pelo LPS. Ademais, a expressão de PAR2 estava aumentada nos pulmões de camundongos 4h após a administração i.n. de LPS em comparação ao grupo controle. A depleção de mastócitos provocada pelo pré-tratamento com o composto 48/80 reduziu o número de neutrófilos no BAL dos animais tratados pela via i.n. com LPS. A amplitude dos sinais de cálcio e o número de células responsivas ao LPS foram reduzidos em células RAW 264.7 pré-incubadas com ENMD-1068 durante 40 min. antes do estímulo com LPS ou que foram tratadas com LPS na presença do coquetel de inibidores de proteases. Em conclusão, nossos resultados sugerem um papel de PAR2 e da triptase de mastócitos no recrutamento de neutrófilos para os pulmões de camundongos induzido por LPS. Innate immunity is the first line of defense against pathogens triggered by the recognition of molecular structures present in the microorganisms like LPS. Proteinase-activated receptors (PARs) are part of a family of metabotropic receptors activated by serine proteases through proteolytic cleavage in their Nterminal portion named PAR 1-4. Among these, PAR2 is expressed in leukocytes and resident lung cells and its activation has been related to the development of inflammation and cell recruitment, however, the involvement of PAR2 activation by its endogenous agonists in inflammatory response induced by LPS is not well understood. The aim of this work was to evaluate the role of PAR2 and endogenous proteases in neutrophils recruitment to the lung of C57BL/6 mice in response to intranasal (i.n.) instillation of LPS. The experimental protocols were approved by the animal ethics committee (CEUA/UFMG, 150/2017). The results show that intranasal administration of LPS or mast cell (MC) tryptase induced an increase in the number of neutrophils recovered in bronchoalveolar lavage (BAL) 4h later, and pretreatment with intraperitoneal injection of PAR2 antagonist (ENMD-1068) or with intranasal instillation of protease inhibitor (aprotinin) 1h prior to stimulus with LPS reduced the presence of these cells in BAL. In contrast, pre-treatment with ENMD-1068 increased the number of neutrophils in peripheral blood of animals. PAR2 antagonist also decreased the production of CXCL1 chemokine measured in supernatants of BAL obtained 4h after LPS instillation. Moreover, histopathological analysis in mouse lungs stained with hematoxylin and eosin showed that ENMD-1068 treatment reduced pulmonary inflammation induced by LPS. In addition, PAR2 expression was increased in lungs of mice 4h after LPS stimulation when compared to PBS-instilled mice. Mast cell depletion by pretreatment with compound 48/80 reduced the number of neutrophils recovered in BAL of animals treated by intranasal instillation with LPS. The amplitude of calcium signals and the number of responsive cells to LPS were reduced in RAW 264.7 cells preincubated with ENMD-1068 during 40 min. before stimulus with LPS or treated with LPS in the presence of protease inhibitors cocktail. In conclusion, our results suggest a role for PAR2 and MC tryptase on neutrophil recruitment into the lung of mice induced by LPS.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A microbiota tem um papel central no desenvolvimento do sistema imune, na maturação e ativação das células imunes. Devido à influência da microbiota sobre o sistema imune, ela pode exercer um papel direto no processo de resposta contra agentes patogênicos. Animais isentos de germes (GF), podem ser mais resistentes ou suscetíveis a infecções em comparação aos animais convencionais (CV), que possuem a microbiota completa associada. A resistência e susceptibilidade são dependentes do patógeno causadores da infecção. A microbiota é extremamente importante no processo de eliminação da Leishmania major in vivo, já que camundongos SWISS/NIH GF são susceptíveis a esta infecção, apesar de polarizarem uma resposta Th1. O objetivo desse trabalho foi de melhor elucidar os mecanismos de suscetibilidade nesse modelo, onde hipotetizamos que macrófagos, importantes células hospedeiras da L. major possam apresentam um comprometimento em sua ativação e produção de moléculas efetoras que eliminem o parasito. Mostramos que os animais GF e CV apresentam um infiltrado de células linfoides semelhante, eles são incapazes de curar a lesão, e que o desenvolvimento de lesão crônica com maior carga parasitária está associada a uma maior quantidade de células mielóides infectadas na lesão em relação aos animais CV. A microbiota atua diretamente no espectro de ativação de macrófagos, células essas que apresentam plasticidade na ativação dependente de estímulos endógenos e exógenos, incluindo estímulos microbianos. A ausência de microbiota potencializa o perfil de ativação alternativo, caracterizado pela expressão das proteínas YM1, FIZZ1 e arginase I, e também o perfil regulatório de ativação, caracterizado pela IL-10 e SPHK1. Por outro lado, macrófagos de animais GF apresentam sua ativação clássica prejudicada, pois produzem menos IL-12, TNF, espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico. Durante o desenvolvimento da infecção. Durante infecção in vivo os camundongos GF apresentam uma menor capacidade de eliminação do parasito, pois na lesão dos animais GF existe uma menor quantidade de macrófagos iNOS+. Enzima essa responsável pela produção de óxido nítrico, molécula microbicida responsável pela eliminação do parasito intracelular. As diferenças encontradas para ativação de macrófagos in vitro e para resposta deles in vivo, podem explicar o fato dos animais CV controlarem a lesão e os animais GF não. The microbiota plays a central role in immune system development, maturation and activation of immune cells. Due to the influence of the microbiota on the immune system, the commensal microorganisms can play a direct role in the immune response against pathogens. Germ free animals (GF), which do not have an associated microbiota, can be more resistant or more susceptible than conventional (CV) animals, which have the complete associated microbiota. The resistance or susceptibility are dependent on the pathogens that elicit the infection. The microbiota is important for in vivo elimination of Leishmania major, because GF Swiss/NIH mice are susceptible to the infection, regardless their capacity to polarize a Th1 immune response as the CV mice. The aim of our work is to better understand the mechanisms that might explain the susceptibility of GF mice even in a context of a Th1 immune response. We hypothesize that macrophages, relevant host cells for L. major, might present an impairment in their classic activation allowing the parasite growth. In our work we showed that GF and CV animals presented similar lymphoid infiltrate and the chronic lesions with a higher parasite load is associated with a higher quantity of infected myeloid cells. Macrophages are cells that present a broad spectrum of activation dependent on endogenous and exogenous stimuli, including microbial stimuli. Our data show that the absence of microbiota exacerbates the alternative activation profile, characterized by the YM1, FIZZ1 and arginase I expression, as well as the regulatory activation profile, characterized by IL-10 and SPHK1. On the other hand, macrophages derived from GF mice showed an impaired classical activation phenotype as they produce less IL-12, TNF, reactive oxygen species and nitric oxide.. During in vivo infection, the GF mice present a lower parasite elimination capacity, because in the lesion of GF animals there were lesser iNOS+ macrophages. This enzyme is responsible for the production of nitric oxide, the microbicidal molecule responsible for the elimination of the intracellular parasite. The differences found for the activation of macrophages in vitro and their response in vivo may explain the fact that CV animals control the lesion and the GF animals are not.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A esclerose múltipla é uma doença autoimune, de fundo genético, que afeta o sistema nervoso central. As manifestações iniciais são derivadas de respostas imunológicas intensas que afetam principalmente a substância branca do cérebro e da medula espinhal, sendo seguida por uma fase crônica com caráter neurodegenerativo. Diante da complexidade da doença e da dificuldade de tratamento, nosso grupo de pesquisa tem estudado alternativas imunorregulatórias capazes de reduzir os sinais clínicos da doença que apresentem poucos ou nenhum efeitos adversos. Previamente a esse trabalho, utilizamo-nos de um protocolo para indução da tolerância oral a HPS65 produzida pela bactéria recombinante Lactococcus lactis atrevas do qual obtivemos bons resultados na prevenção dos sintomas da encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida em camundongos C57BL/6 pela imunização com o antígeno mieliníco MOG. No presente trabalho o mesmo protocolo foi utilizado para o tratamento da EAE depois da sua indução. Camundongos imunizados com MOG receberam por via oral a cepa Lactococcus lactis produtora da proteína de choque térmico HPS65, durante cinco dias. O tratamento foi eficiente na redução do índice clínico da EAE da mesma formar que na prevenção da doença. Foi observado por análise histológica e microscopia intravital que o tratamento inibiu o recrutamento de leucócitos para a medula espinhal tanto no parênquima quanto nos vasos sanguíneos que irrigam as meninges. Nos órgãos linfoides secundários, houve um aumento da frequência das células T reguladoras, principalmente aquelas que expressam a forma da embrana citocina TGF-B (latente associete peptide - LAP). Não houve alteração na frequência de linfócitos T CD4+ ativados nos animais tratados indicando que o mecanismo de inibição não envolve imunossupressão. Multiple sclerosis is a genetic and autoimmune disease that affects the central nervous system. The initial manifestations is an intense immune responses that primainly affect the white matter of the brain and spinal cord, followed by a chronic phase with a neurodegenerative character.Because of the complexity of the disease and the difficulty to treat, has been testing therapeutic alternatives that wold modulate the disease development presenting minimal sides effects. In a previus study, we used a protocol for the induction of oral tolerance using a recombinant HPS65 producing Lactococcus lactis and we obtained good results in the prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), induced in C57BL / 6 mice by MOG immunization. In the present study, the same protocol was used for the treatment. In the present study, mice received orally HPS65-producing Lactococcus lactis strain for five days after disease induction. The treatment was as efficient in reducing the clinical score of EAE as the prevention protocol. Using histologicalIt analysis and intravital microscopy, we observed that the treatment inhibited the recruitment of leukocytes to the spinal cord, both in the parenchyma and in the blood vessels that irrigate the meninges. In the secondary lymphoid organs, there was an increase in regulatory T cells, especially those that express the membrane form of the cytokine TGF-B in the membrane (LAP). This effect occurred with no alteretion in the frequency of ativadet lynphocytes indicating that there immunoregulation was not associated with immunosuppressive.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A dicotomia TH1/TH2 que tanto elucida os modelos de resistência e suscetibilidade nas infecções por Leishmania major não é aplicável à infecção por L. amazonensis. Nesta infecção observam-se respostas imunológicas mistas, sem efetivamente polarizar para nenhum perfil conhecido, diferenciando os paradigmas envolvidos na suscetibilidade e na resistência a parasitos. O TNF é uma citocina pleiotrópica, atua na mediação da inflamação, desenvolvimento e homeostasia do tecido linfóide, destruição da matriz extracelular, e tantas outras. A atuação do TNF se dá via dois receptores, TNFR1 e TNFR2, ambos desencadeiam a resposta inflamatória, mas exclusivamente através do TNFR1 o TNF auxilia na regulação e supressão desta reposta através da apoptose via caspase 8/3. Assim, nosso trabalho visou a identificação do papel do TNFR1 no curso de infecção e desenvolvimento das lesões cutâneas em camundongos infectados por L. amazonensis. Nossos dados revelaram a importância do TNFR1 no controle da lesão, embora não no controle parasitário. Este controle se mostrou mais eficaz no modelo de infecção subcutâneo, onde além de promover o controle da lesão, foi importante para manutenção tecidual do órgão infectado, possivelmente pela contínua produção de IL-10. Ainda, na fase aguda da infecção, atua no recrutamento de células mielóides e linfócitos para o sítio de infecção e, na fase crônica, regula o recrutamento celular, apenas na via subcutânea. A apoptose via TNFR1 foi inibida durante a infecção intradérmica por L. amazonensis, sendo utilizada uma via alternativa, porém que, segundo nossos dados, parece ser inibida pela sinalização pró-inflamatória do TNFR1, uma vez que a apoptose foi menor nos camundongos selvagens. Em conclusão, nossos dados sugerem o envolvimento do TNFR1 na resistência à infecção por L. amazonensis, pois foi observado atuando tanto na promoção da inflamação como na sua regulação. Esta regulação é crucial para a manutenção do órgão acometido, parece estar relacionada com a produção ininterrupta de IL-10, observada principalmente na infecção subcutânea. As diferentes vias de infecção evoluem para diferentes tipos de resposta, parece que na via intradérmica a falta de controle das células necróticas está associada à perda massiva de tecido, enquanto que na via subcutânea o controle do recrutamento celular está envolvido com a manutenção do órgão infectado. The Th1/Th2 paradigm that explains most models of infection with Leishmania major does not apply to the experimental models of infection with L. amazonensis. In this latter model, mixed immunological responses rather than polarization are observed, in contrast with the Th1/Th2 paradigm of resistance and susceptibility. TNF is a pleiotropic cytokine that mediates inflammation, lymphoid tissue development and homeostasis, extracellular matrix destruction, among other functions. TNF binds to two receptors, TNFR1 and TNFR2. Both receptors trigger inflammatory responses but only by binding to TNFR1 TNF mediates regulation or supression of inflammation, through induction of apoptosis via caspase 8/3. Hence, our work aimed at the identification of the role of TNFR1 the mouse model of infection with L. amazonensis. Our data reveal the importance of TNFR1 in the control of lesion development, but not on the control of parasite replication. This control was more efficient in the subcutaneous model of infection where, in addition to promoting lesion control, TNFR1 was importante in the maintainance of tissue homeostasis, probably due to IL-10 production. Furthermore, in the accute phase of the subcutaneous infection, TNFR1 mediated recruitment of mieloid cells and lymphocytes to the site of infection and, in the chronic phase, regulated cell recruitment. TNFR1-mediated apoptosis was inhibited during intradermic infection by L. amazonensis, and an alternative pathway was in play. However, our data indicate that apoptosis seems to be inhibited by the pro-inflammatory signaling through TNFR1, since apoptosis was lesser in wild-type mice. In conclusion, our data suggest the involvement of TNFR1 in resistance to L. amazonensis. This conclusion is supported by the fact that TNFR1 acts both in the promotion and in the regulation of inflammation. Regulation is crucial for preservation of the infected tissue, and seems to be related to continuous production of IL-10, observed mainly in the subcutaneous infection. The two different routes of infection evolve into diferente types of responses: the intradermic route the lack of control of necrosis is associated to massive tissue loss, while the subcutaneous route control of cell recruitment preserves the affected tissue.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Trabalhos anteriores de nosso grupo demostraram que promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis possuem uma citolisina capaz de lisar eritrócitos e macrófagos, a qual chamamos de leishporina, devido ao seu mecanismo de lise ser por formação de poros na membrana de macrófagos. Embora a leishporina já tenha sido caracterizada por nós sob diversos aspectos bioquímicos, sua identidade molecular é ainda desconhecida. Uma vez que o genoma da L. major já foi completamente sequenciado, iniciamos nosso trabalho buscando por genes que pudessem codificar proteínas que tivessem atividade citolítica e ser responsável pela atividade da leishporina. Nossas pesquisas no banco de dados tritrypDB, revelaram a existência de 3 genes anotados como hemolisinas do tipo III putativas denominados LmjF36.5500, LmjF36.5510, LmjF36.5520. Estas sequências mostraram uma homologia significativa com outras hemolisinas do tipo III formadoras de poros e já caracterizadas em outros organismos. Mostramos por PCR em tempo real que 2 destes genes são expressos em promastigotas na fase estacionária, fase em que a expressão da atividade da leishporina é máxima. Quando comparamos a expressão destes mRNAs entre promastigotas e amastigotas, verificamos que o mRNA do gene Lm5500 é mais expresso em amastigotas, enquanto que para o mRNA de Lm5520 parece não haver diferenças significativas, como demonstrado por PCR em tempo real e Northern blot. Não detectamos mRNA para o gene Lm5510, o que sugere que este gene é pouco/ou não expresso. A fim de determinar a localização subcelular destas proteínas, anticorpos policlonais foram produzidos em camundongos BALB/c e utilizados em microscopia de imunofluorescência confocal. Aparentemente, a proteína codificada pelo gene LmjF36.5520 se localiza em uma estrurura alongada e única, que aparenta ser o Túbulo Multivesicular (MVT), que se estende do bolso flagelar até a extremidade posterior do parasito. A proteína codificada pelo gene LmjF36.5500 está localizada em estruturas que se assemelham aos acidodocalcissomos. Confirmando os resultados PCR em tempo real, não foi possível detectar a fluorescência para a proteína codificada pelo gene Lmjf36.5510. Parasitas superexpressores das proteínas Lm5500 e Lm5520 foram gerados para avaliarmos o fenótipo lítico dos mesmos. Nossos resultados demonstram que os clones que superexpressam as proteínas Lm5500 e Lm5520 têm sua atividade litica aumentada em relação aos mock transfectados. Esse resultado indica que esas proteínas são potencialmente candidatas a codificarem a leishporina ou a uma proteína importante para a ação da leishporina.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Leishmania são parasitos protozoários transmitidos em sua forma promastigota para hospedeiros vertebrados pelo inseto vetor durante o repasto sanguíneo. No hospedeiro mamífero, amastigotas replicam no interior de macrófagos e infectam células, levando à amplificação da infecção. Embora a transferência de amastigotas para células sadias seja um passo crucial na evolução da infecção, ainda não é completamente compreendida. Neste trabalho, infecções por L. amazonensis e L. guyanensis em macrófagos de BALB/c e C57BL/6 foram comparadas e a morte celular do macrófago investigada. Como já sabido, infecções em camundongos levam a diferentes progressões da doença. L. amazonensis causa infecção crônica em ambas as linhagens murinas (ainda que menos grave em C57BL/6), enquanto que a infecção por L. guyanensis é controlada nessas linhagens. In vitro, a infecção em macrófagos por L. amazonensis é persistente, enquanto o crescimento de L. guyanensis é controlado pela célula hospedeira em ambas as linhagens. L. amazonensis induz in vitro apoptose em macrófagos tanto de C57BL/6 quanto de BALB/c, caracterizada pela exposição de fosfatidilserina (PS), clivagem internucleossômica do DNA, e consequente hipodiploidia. Nenhum destes sinais é observado em macrófagos infectados com L. guyanensis, que aparentemente morrem por necrose, como indicado pelo aumento de células positivas para iodeto de propídeo (PI), mas não para Anexina V. Apoptose de macrófagos induzida por L. amazonensis se dá pela ativação das caspases 3, 8 e 9, em ambas as linhagens. Considerando estas duas espécies de Leishmania e as duas linhagens de camundongos, a apoptose de macrófagos induzida nos momentos iniciais de infecção está associada com uma infecção crônica, independente da sua gravidade. Macrófagos saudáveis foram observados fagocitando células infectadas com L. amazonensis, o que, até então, não tinha sido verificado, podendo ser uma forma de propagação da amastigota, levando à amplificação da infecção. Leishmania are protozoan parasites transmitted by the insect vector during blood meal to the vertebrate host as promastigotes. In the mammal host, amastigotes replicate inside macrophages and are transmitted to healthy cells, amplifying the infection. Although transfer of amastigotes from infected to healthy cells is a crucial step that may shape the outcome of the infection, it is not fully understood. In the present work, L. amazonensis and L. guyanensis infection in C57BL/6 and BALB/c macrophages were compared and macrophages death was investigated. As previously shown, infection of mice results in distinct outcomes: L. amazonensis causes a chronic infection in both strains of mice (although milder in C57BL/6), whereas L. guyanensis infection is controlled by the strains. In vitro, infection is persistent in L. amazonensis-infected macrophages whereas L. guyanensis growth is controlled by host cells from both strains of mice. L. amazonensis induces apoptosis of both C57BL/6 and BALB/c macrophages in vitro, characterized by phosphatidylserine (PS) exposure, DNA cleavage into nucleosomal size fragments, and consequent hypodiploidy. None of these signs were seen in macrophages infected with L. guyanensis, which seem to die through necrosis, as indicated by increased propidium iodide (PI)-, but not Annexin V-, positive cells. L. amazonensis-induced macrophage apoptosis was through activation of caspases-3, -8 and -9, in both strains of mice. Considering these two species of Leishmania and strains of mice, macrophage apoptosis, induced at the initial moments of infection, is associated with chronic infection, regardless of its severity. Healthy macrophages were observed phagocytizing L. amazonensis-infected cells, which had not been verified so far, and could be a way of amastigote spreading, leading to the amplification of infection.

Outra Agência As lesões periapicais desenvolvem-se como uma resposta do hospedeiro frente às infecções endodônticas. A óxido nítrico sintase (NOS) e a NADPH oxidase são enzimas responsáveis por gerarem espécies reativas de oxigênio e nitrogênio cuja principal ação, entre muitas, relaciona-se à resistência contra patógenos. Essas enzimas são produzidas por fagócitos e outros tipos celulares. Nesse estudo, avaliaram-se os aspectos imunológicos e histológicos da lesão periapical induzida em camundongos C57BL/6 selvagem, iNOS-/- e PHOX-/-. Os resultados mostraram que os animais deficientes da iNOS expressam elevados níveis IL-1, TNF-, RANK, RANKL e MCP-1 comparado àqueles deficientes da PHOX e o selvagem. A reabsorção óssea apical foi maior nos camundongos iNOS-/- comparados aos outros grupos estudados. Observou-se discreto infiltrado inflamatório nos camundongos selvagens e PHOX-/-, enquanto os camundongos iNOS-/- apresentaram intenso infiltrado mononuclear e polimorfonuclear. Avaliou-se também, a presença de linfócitos T na lesão periapical e na medula óssea adjacente em três tempos operatórios diferentes: 3, 7 e 14 dias após a indução da lesão periapical. Comprovou-se a presença de linfócitos T expressando mRANKL, 3 e 7 dias após o procedimentos operatórios, mas não no 14º dia. Por sua vez, na medula óssea, linfócitos T mRANKL+ foram encontradas em todos os tempos operatórios. Detectaram-se, também, fibroblastos e osteoblastos expressando mRANKL 3 dias após a indução da lesão periapical. Os resultados sugerem que os linfócitos T, fibroblastos e osteoblastos parecem ser as células responsáveis pela expressão de mRANKL e, conseqüentemente, pela diferenciação dos osteoclastos nos primeiros momentos do desenvolvimento da lesão periapical. Ademais, os microrganismos e seus subprodutos presentes nas infecções radiculares dos animais C57BL/6 selvagens e PHOX-/- podem interagir com receptores da resposta imune inata, induzindo a expressão da iNOS e a produção de NO, que podem controlar o processo infeccioso nos tecidos perirradiculares. As espécies reativas de oxigênio não parecem cumprir um papel importante na resistência contra infecções bacterianas nesse modelo de estudo já que as características imunológicas e histológicas da lesão periapical nos animais deficientes da PHOX são semelhantes ao camundongo C57BL/6. The development of periapical lesions is a consequence of host response against an endodontic infection. The nitric oxide synthase and the NADPH oxidase are responsible for generating reactive oxygen and nitrogen intermediates whose main action, amongst many others, is the resistance against pathogens. Phagocytes and other cellular types can produce these enzymes. The aim of this study was to investigate the immunologic and histological aspects of periapical lesion in C57BL/6 wild-type mice, iNOS-/- and PHOX-/-. The results showed that the iNOS-/- mice expressed high levels of IL-1, TNF-, RANK, RANKL and MCP-1 when compared to those with a deficiency in NADPH oxidase and to the wild-type one. The apical thickening of the periodontal ligament was greater in the iNOS-/- mice when compared with the other groups under study, indicating a greater bone resorption. A mild inflammatory infiltrate was noticed in the wild-type mice, as well as in the PHOX-/- ones, whereas the iNOS-/- mice had an intense mononuclear and polymorphonuclear infiltrate. We also evaluated the presence of T cells in the periapical lesion and in the adjacent bone marrow in three different post-operative stages: 3, 7, and 14 days after the induction of periapical lesion. There were T cells expressing mRANKL on day 3 and 7 after the operative procedures, but not on the 14th day. In turn, mRANKL+ T cells were found in the bone marrow in all pos-operative times. Fibroblasts and osteoblast expressing mRANKL were also detected 3 days after the periapical lesion induction. These findings suggest that the T cells, osteoblasts and the fibroblasts seem to be the cells responsible for the expression of mRANKL and, therefore, for the mediation of osteoclast differentiation in the earlier stages of the periapical lesion development. Furthermore, the microorganisms and their products present in the root canal infections of the C57BL/6 wild-type mice as well as in the PHOX-/- animals may interact with receptors of the innate immune response, inducing the expression of iNOS and the production of NO, which may control the infectious process in the periradicular tissues. The reactive oxygen intermediates seem not to play an important role in the resistance against bacterial infections in this model of study since the immunological and histological characteristics of the periapical lesion in PHOX-deficient animals are similar to those found in the C57BL/6 mice.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Outra Agência Neste trabalho, estudamos a interação entre promastigotas de Leishmania major e neutrófilos de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6, utilizados como protótipos de susceptibilidade e resistência à infecção por este parasita. Demonstramos diferenças intrínsecas entre as duas linhagens na produção de óxido nítrico, que se refletiram na expressão da enzima responsável, a óxido nítrico sintase indutível (iNOS). Neutrófilos obtidos de camundongos C57BL/6 produzem mais óxido nítrico em resposta ao estímulo de IFN-γ e LPS em relação à linhagem BALB/c. Promastigotas de L. major foram capazes de inibir a produção de NO e a expressão da enzima em ambas as linhagens de camundongo. Demonstramos ainda que a produção de radicais de oxigênio, outro mecanismo microbicida de neutrófilos, também é diferenciada nos neutrófilos das duas linhagens de camundongo. Neste caso, a linhagem BALB/c é capaz de produzir uma quantidade maior de radicais de oxigênio em resposta a PMA. A expressão de proteínas p40phox e p47phox se mostrou diferenciada nos neutrófilos das duas linhagens de camundongos. A produção de radicais de oxigênio é influenciada pela interação de promastigotas de L. major com a célula. In this study we investigated the interaction between Leishmania major promastigotes and neutrophils of two mouse strains, BALB/c and C57BL/6, the prototype hosts for susceptibility and resistance to L. major infection. We showed intrinsic differences between neutrophils of these two mouse strains in the nitric oxide (NO) production, reflected in nitric oxide syntase (iNOS) expression. C57BL/6 neutrophils produced more NO after IFN-γ and LPS exposure than BALB/c cells. L. major promastigotes were able to reduce NO production and iNOS expression, in both mouse strains. We demonstrated that oxygen radicals production, another microbicidal mechanism of neutrophils, differed between cells of the two mouse strains. Neutrophils from BALB/c mouse produced more oxygens radicals than C57BL/6 cells after PMA stimulation. The p40phox and p47phox expression was distinct in neutrophils from those two strains. The oxygen radicals production is inhibited by interaction with L. major promastigotes.