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Intracellular forms of Trypanosoma cruzi were destroyed in infected mouse macrophage cultures treated for 24 h with micromolar concentrations of phenazine methosulfate, brilliant cresyl blue, or crystal violet. Parasites were not killed in macrophages which were only treated with the dyes before infection, indicating that the drugs did not induce a protracted state of macrophage trypanocidal activity.

Monoclonal antibodies were raised against the surface of epimastigotes and metacylic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi , as shown by electron microscopy, agglutination, and immunofluorescence. The antibodies were stage specific but not strain specific. A deleterious effect of the antibodies on T. cruzi culture forms was shown by the drastic reduction of parasite motility and incorporation of nucleic acid precursors. Some fraction of the parasite population, however, was viable and replicated and infected mouse macrophages in culture. The antibodies were found to also mediate complement-induced lysis of culture forms of T. cruzi.

Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados três complexos de cobre com ligantes imínicos, com o objetivo de avaliar sua atividade tripanocida. Esses complexos foram caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas, como UV-Vis, Infravermelho e EPR, além de análise elementar e espectrometria de massa. Juntamente com outros complexos similares previamente sintetizados pelo nosso grupo, tiveram suas atividades avaliadas frente à forma tripomastigota do parasita T. cruzi, responsável pela fase aguda da doença de Chagas, por ensaios de viabilidade celular, com determinação do valor de seus IC50, concentração em que observamos a morte de 50% da cultura celular, pela metodologia denominada MTT. Todos os complexos mostraram-se eficientes frente a tripomastigotas, apresentando valores de IC50 abaixo de 10 µM, com quatro deles obtendo índice de seletividade maior que 10, fator importante para definir agentes promissores antichagásicos. Complexos selecionados também tiveram sua atividade verificada frente à forma amastigota do parasita, responsável pela fase crônica da doença, utilizando método de imageamento por microscópio de fluorescência e contagem celular. Estudos de inibição da cruzaína, uma cisteíno-protease importante para o metabolismo do parasita foram conduzidos em colaboração com o laboratório do Prof. Wagner Alves de Souza Júdice, da Universidade de Mogi das Cruzes. Quatro dos compostos testados apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, sendo dois de cobre, um de zinco e um ligante livre. Os estudos também permitiram diferenciar os mecanismos de inibição dos compostos, com os complexos de cobre apresentando um mecanismo de inibição clássico e o composto de zinco e o ligante livre apresentando o mecanismo de inibição competitiva parabólica com cooperatividade. In this work, three copper complexes with iminic ligands were synthesized and characterized, with the objective of evaluating their trypanocidal activity. These complexes were characterized by several spectroscopic techniques, such as UV-Vis, Infrared and EPR, in addition to elementary analysis and mass spectrometry. Together with other similar complexes previously synthesized by our group, their activities were evaluated against the trypomastigote form of the parasite T. cruzi, responsible for the acute phase of Chagas disease, by cell viability tests, with determination of the value of their IC50, concentration in that we observed the death of 50% of the cell culture, by the methodology called MTT, all presenting IC50 values below 10 µM, with four of them obtaining a selectivity index greater than 10, important factor for defining promising antichagasic agents. Selected complexes also had their activity verified against the amastigote form of the parasite, responsible for the chronic phase of the disease, using a fluorescence microscope and cell counting imaging method. Inhibition studies of cruzain, a cysteine protease important for the metabolism of the parasite, were conducted in collaboration with the laboratory of Professor Wagner Alves de Souza Júdice at the University of Mogi das Cruzes. Four of the tested compounds showed inhibitory activity against cruzain, two of copper, one of zinc and a free ligand. The studies also allowed to differentiate the mechanisms of inhibition of the compounds, with the copper complexes presenting a classic inhibition mechanism and the zinc compound and the free ligand presenting the competitive parabolic inhibition mechanism with cooperativity.

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi constituindo-se em um problema de saúde pública em vários países da América Latina. No seu complexo ciclo de vida, o protozoário passa por quatro estágios diferentes: tripomastigota metacíclica, amastigota, tripomastigota sanguíneo e epimastigota, que permitem sua sobrevivência nos diferentes ambientes com os quais o parasita entra em contato. A diferenciação dos tripomastigotas de T. cruzi em amastigotas (amastigogênese) ocorre com grandes mudanças morfológicas, estruturais e metabólicas no parasita e pode ser reproduzido in vitro por exemplo, pela acidificação do meio extracelular. Apesar dos vários trabalhos descritos na literatura, o processo ainda não é totalmente compreendido. A participação de NO na transdução de sinal durante a amastigogênese, sugerida por dados não publicados de nosso grupo, assim como a via de sinalização dependente de AMPc, foram o foco do presente estudo. A indução da amastigogênese foi obtida por incubação de tripomastigotas em meio de cultura acidificado (pH 6,0) e os parâmetros estudados comparados com parasitas controle (meio de cultura, pH 7,4). Estudamos a variação no perfil de nucleotídios cíclicos (AMPc, GMPc), de quinases (PKA, MAPK- ERK1/2), de uma fosfatase (PP2A), assim como o perfil de proteínas fosforiladas, S-nitrosiladas e nitradas até 6 h do início da amastigogênese. O processo foi dividido nas etapas: inicial (até 60 minutos) e tardio (em torno de 3-4 h), caracterizados por um aumento de formas amastigotas na etapa tardia. Houve um aumento de aproximadamente 17 vezes no nível de AMPc nos primeiros 15 minutos da amastigogênese (meio pH 6,0), seguido por aumento discreto no nível de PKA fosforilada, utilizado como indicador de atividade enzimática, este mais evidente na etapa tardia (360 minutos). Quanto à subunidade catalítica fosforilada da MAPK (ativa), há uma aparente diminuição no nível de fosforilação na fase inicial (30 minutos) e aumento na etapa tardia (120 minutos) do processo de amastigogênese. Quanto ao perfil geral de fosforilação de proteínas, há uma diminuição de fosforilação em torno de 30 minutos, seguida de aumento de fosforilação em proteínas de aproximadamente 5 e 100 kDa, mas de maneira geral, não se observaram grandes mudanças nesse perfil com a metodologia utilizada. Quanto às modificações por NO e seus derivados, foram observadas modificações por S-nitrosilação e nitração das proteínas, além do aumento de GMPc em torno de 60 minutos. Embora essas modificações modulem a atividade biológica de uma grande diversidade de proteínas, seu papel biológico não foi explorado.8 Em resumo, nossos resultados apontam para uma variação no perfil de fosforilação, S-nitrosilação e nitração de proteínas, além do aumento de AMPc e GMPc ao longo do processo de amastigogênese in vitro, com a via de sinalização dependente de quinases/ fosfatases e de óxido nítrico ocorrendo ao longo do processo de amastigogênese. Chagas disease is a neglected disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi and is a public health problem in several Latin American countries. In its complex life cycle, the protozoan goes through four different stages: metacyclic trypomastigote, amastigote, blood trypomastigote and epimastigote, which allow its survival in the different environments which the parasite comes into contact. The differentiation of T. cruzi trypomastigotes into amastigotes (amastigogenesis) occurs with large morphological, structural and metabolic changes in the parasite and can be reproduced in vitro by, for example, acidification of the extracellular medium. Despite the many data described in the literature, the process is not yet fully understood. The participation of NO in signal transduction during amastigogenesis, suggested by unpublished data from our group, as well as the cAMP-dependent signaling pathway, were the focus of the present study. The induction of amastigogenesis was obtained by incubating trypomastigotes in acidified culture medium (pH 6.0) and the studied parameters compared with control parasites (culture medium, pH 7.4). We studied the variation in the profile of cyclic nucleotides (cAMP, cGMP), kinases (PKA, MAPK-ERK1 / 2), phosphatase (PP2A), as well as the profile of phosphorylated, S-nitrosylated and nitrated proteins up to 6 h. onset of amastigogenesis. The process was divided into early (up to 60 minutes) and late (around 3-4 hours), characterized by an increase in amastigote forms in the late stage. There was an approximately 17-fold increase in cAMP level in the first 15 minutes of amastigogenesis (pH 6.0 medium), followed by a slight increase in phosphorylated PKA level, most evident in the late stage (360 minutes). As for the phosphorylated catalytic subunit of MAPK (active), there is an apparent decrease in the phosphorylation level in the early phase (30 minutes) and increase in the late stage (120 minutes) of the amastigogenesis process. As for the general protein phosphorylation profile, there is a decrease in phosphorylation around 30 minutes, followed by an increase in phosphorylation of proteins (approximately 5 and 100 kDa), but overall, no major changes were observed in this profile with the methodology used. As for modifications by NO and its derivatives, modifications were observed by S-nitrosylation and protein nitration, besides the increase of cGMP around 60 minutes. Although these modifications modulate the biological activity of a wide range of proteins, their biological role has not been explored. In summary, our results point to a variation in phosphorylation, S-nitrosylation and nitration profile of proteins, as well as an increase in cAMP and cGMP along the amastigogenesis process, implicating kinases / phosphatases and nitric oxide dependent signaling pathways in this differentiation.

Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

O FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) é um clássico fator peptídico de crescimento que ativa vias intracelulares de sinalização molecular promovendo a transição G0 → G1 e o comprometimento com o ciclo celular. Não surpreendentemente, seus papéis pró-tumoral e angiogênico estão bem caracterizados e estabelecidos na literatura. No entanto, um crescente corpo de evidências tem indicado que o FGF2 também pode exercer efeitos anti-tumorais in vitro e in vivo, em modelos murinos e também humanos. Neste contexto, nosso grupo publicou em 2008 que o FGF2 exerce um efeito antiproliferativo seletivo em células murinas malignas dependentes de alta atividade de K-Ras e H-Ras. Os genes ras compõem a família de oncogenes mais frequentemente mutada em tumores malignos humanos, alcançando aproximadamente 30% de todos os casos. O desenvolvimento de terapias contra tumores dependentes de Ras fracassou, apesar dos intensos esforços e investimentos desde a descoberta em 1982 de suas mutações ativadoras em múltiplos cânceres. O objetivo deste trabalho foi desvendar os mecanismos moleculares pelo quais o FGF2 inibe irreversivelmente a proliferação de células malignas dependentes da atividade de Ras, empregando como modelos experimentais a linhagem murina Y1 de células adrenocorticais, e 4 linhagens humanas derivadas de sarcomas de Ewing. Identificamos que o efeito citotóxico do FGF2 não se processa por um mecanismo novo e independente das viasproliferativas classicamente ativadas por fatores peptídicos de crescimento. Ao contrário, seu efeito tóxico é resultado de sinalização mitogênica exagerada decorrente de estimulação sustentada por FGF2. A ativação da via de MAPK, principal sinalização mitogênica intracelular, a níveis elevados e sustentados provoca estresse mitogênico, que se propaga para a fase S na forma de estresse replicativo. Nesta situação, a célula passa a depender exageradamente da sinalização protetora de ATR, de modo que a combinação de estimulação com FGF2 e inibição de ATR foi altamente letal para as células malignas dependentes de Ras empregadas neste trabalho. Também analisamos as bases moleculares de resistência a FGF2 exibida por células Y1 anteriormente selecionadas para resistir ao efeito tóxico do FGF2 (Y1FRs). Descobrimos que a pressão seletiva do FGF2 não teve efeito na expressão de seus receptores, mas provocou a eliminação de um dos dois cromossomos que portam a amplificação gênica de ras nesta linhagem, enquanto o segundo cromossomo foi mantido por ser a única fonte de genes ribossomais ativos. Suas cópias de ras, no entanto, mostraram-se transcricionalmente silenciadas. Além disso, as sublinhagens Y1FRs não expressam o principal RasGEF, GRP4, encontrado nas células parentais Y1, o que pode ter influenciado o surgimento do fenótipo resistente ao FGF2. As linhagens resistentes mostraram grande redução no número de cromossomos e aumento da frequência de fusões entre cromossomos não homólogos em relação às células parentais. FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) is a classic peptide growth factor that activates intracellular molecular signaling pathways promoting the G0 → G1 transition and cell cycle commitment. Not surprisingly, its pro-tumor and angiogenic roles are well characterized and established in the literature. However, a growing body of evidence has indicated that FGF2 may also exert anti-tumor effects in vitro and in vivo in murine and human models. In this context, our group reported in 2008 that FGF2 exerts a selective antiproliferative effect in murine cells dependent on high activity of K-Ras and H-Ras. Ras genes make up the most frequently mutated oncogene family in human malignant tumors, reaching approximately 30% of all cases. The development of therapies against Ras-dependent tumors has failed despite intense efforts and investments since the discovery in 1982 of its activating mutations in multiple cancers. The objective of this work was to uncover the molecular mechanisms by which FGF2 irreversibly inhibits the proliferation of malignant cells dependent on Ras activity, using as experimental models the Y1 murine lineage of adrenocortical malignant cells and 4 human lineages derived from Ewing sarcomas. We showed that the cytotoxic effect of FGF2 did not involve novel cell cycle regulatory pathways; instead, this cytotoxic effect is a result of sustainedhyper mitogenic stimulation by FGF2. Activation of the KRas/MAPK pathway, the major intracellular mitogenic signaling, at high and sustained levels provokes mitogenic stress, which is propagated to S phase as replicative stress. In this situation, the cell dependence on the ATR protective signaling is enhanced, so that the combination of stimulation with FGF2 and inhibition of ATR was highly lethal for the Ras dependent malignant cells employed in this work. We also analyzed the molecular basis of FGF2 resistance exhibited by Y1 cells previously selected for resistance to FGF2. We found that the selective pressure of FGF2 had no effect on the expression of its receptors but promoted the elimination of one of the two marker chromosomes that carry the K-ras amplified copies, while the second chromosome was maintained because it is the only source of active ribosomal genes; however, its K-ras amplified copies were transcriptionally silenced. In addition, the Y1FRs sublines did not express the main RasGEF, GRP4, found in the parental Y1 cells, which might have played a role in the emergence of the FGF2-resistant phenotype. The resistant Y1FRs sublines showed a large reduction in chromosome numbers and increased frequency of fusions between non-homologous chromosomes in relation to parental cells.

Não consta resumo na publicação. Abstract not available.

O aprimoramento das técnicas analíticas viabilizou a metabolômica, uma área da ciência que busca compreender, de forma comparativa, os metabólitos envolvidos nas vias bioquímicas. A metabolômica está inserida no contexto das \"ômicas\", que teve início na \"Era Genômica\", a qual permitiu a identificação de diversos genes. Em seguida, o interesse dos pesquisadores centrou no estudo dos metabólitos (metabolômica) mostrando ser uma ferramenta valiosa na pesquisa do transplante renal, que exige um tratamento medicamentoso por meio de imunossupressores. A combinação destes imunossupressores pode minimizar a rejeição do órgão transplantado, reforçando a necessidade de um estudo metabolômico, a fim de avaliar e comparar as mudanças ocorridas após o transplante em nível molecular, melhorando o conhecimento sobre a influência destes regimes e dando subsídios sobre prognósticos possíveis na área de transplante renal. Nesta tese foram avaliadas 2 terapias: Everolimo/ Prednisona/Tacrolimo (grupo 1) e Micofenolato mofetil/Prednisona/Tacrolimo (grupo 2) a partir de uma abordagem untargeted. No presente trabalho foram coletadas amostras de urina de pacientes ao longo de 6 meses. Foi necessário determinar a melhor condição para análise das amostras de urina dos pacientes. Desta forma, foram realizados estudos sobre alguns parâmetros que impactam no preparo de amostra abordando a influência da urease, tipos e proporção de solventes para precipitação de proteína, seleção do melhor agente derivatizante e tratamento de dados. A avaliação da medida de qualidade dos tratamentos com urease foi feita a partir do desvio padrão relativo (RSD) dos valores de intensidade de pico. A concentração de 10 mg mL-1 apresentou o melhor resultado. O estudo mostrou também que o teor de ureia na urina pode influenciar na identificação dos compostos. O número de compostos identificados foi menor quando a urina não foi tratada com urease, com aproximadamente 10 compostos a menos em relação à amostra tratada com a enzima, na mesma concentração de ureia adicionada. Dos solventes orgânicos testados para precipitação de proteínas nas amostras de urina, o isopropanol mostrou ser o solvente mais adequado na proporção 1:6 urina:solvente (v/v), utilizando-se 100 µL de urina. Foram testados dois protocolos de derivatização para análises por GC-MS: metoximação e sililação utilizando BSTFA e cloroformiato de metila. A comparação mostrou que o procedimento por BSTFA, com 40 metabólitos identificados, foi superior ao cloroformiato de metila, com 13 compostos identificados. No tratamento de dados com o software XCMS, os seguintes parâmetros foram avaliados: largura a meia altura do pico (fwhm), largura da banda (bw) e threshold (sntresh). Para avaliar a melhor combinação destes parâmetros, foi feita uma variação univariada destes valores. A qualidade do resultado de cada combinação foi monitorada pelos valores gerados de número de missing values, quantidade de picos com RSD

A doença de Chagas é uma doença causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, que afeta cerca de 10 milhões de pessoas, principalmente nas Américas. O T. cruzi utiliza aminoácidos como importante fonte de energia e em vários processos biológicos como diferenciação, resistência a condições de estresse e invasão de células hospedeiras. A serina está envolvida em muitas vias biosintéticas. Uma das funções relevantes da serina é a formação de compostos C1 para a biossíntese de nucleotídeos. O uso de serina para esse fim é iniciado pela Serina Hidroximetiltransferase, cuja atividade foi detectada em T. cruzi, mas seu papel na biologia do parasita permanece pouco explorado. Neste trabalho, identificamos um gene que codifica uma Serina Hidroximetiltransferase putativa com dupla localização (citoplasmática e mitocondrial). Por recombinação homóloga, obtemos parasitas knockouts heterozigotos nos quais um alelo de SHMT foi substituído pelo gene da neomicina fosfotransferase. Os parasitas knockouts não mostraram diferenças na taxa de crescimento das formas epimastigotas ou na metaciclogênese in vitro. Porém, os parasitas knockouts mostraram uma diminuição significativa tanto no índice de infecção como no número de tripomastigotas liberados de células CHO-K1 infectadas com formas metacíclicas knockout. Chagas disease is a disorder caused by the protozoa parasite Trypanosoma cruzi, which affects about 10 million people, mainly in the Americas. T. cruzi uses amino acids as an important energy source and in several biological processes such as differentiation, resistance to stress conditions and in the host-cell invasion. Serine is involved in many biosynthetic pathways. One of the relevant functions of serine is the formation of C1 compounds for the biosynthesis of nucleotides. The use of serine for that purpose is initiated by Serine Hydroxymethyltransferase, whose activity was detected in T. cruzi but its role in the biology of parasite remains poorly explored. In this work we identified a putative gene encoding a SHMT with dual localization, cytoplasmic and mitochondrial. We generated a single knockout cell line by homologous recombination in which one allele of SHMT was replaced by the neomycin phosphotransferase gene. Knockout parasites showed no difference in epimastigote growth rate or in in vitro metacyclogenesis. However, knockout parasites showed a significant decrease in both, infection index and in the number of trypomastigotes released from CHO-K1cells infected with knockout metacyclic forms.

Trypanosoma cruzi é capaz de incorporar histidina, um aminoácido essencial, através de um sistema de transporte saturável, de alta especificidade e dependente de ATP. Uma vez no citoplasma, a histidina amônio-liase (TcHAL), catalisa a deaminação não oxidativa da His a urocanato, quem é convertido pela urocanato hidratase (TcUH) ao intermediário 4-imidazolona-5-propionato. Posteriormente, duas enzimas (imidazolona propionase e formiminoglutamase) atúam para gerar glutamato. TcHAL e TcUH foram caracterizadas cinetica e bioquímicamente. O α-cetoglutarato, produto da deaminação do Glu gerado na degradação de His, ingressa ao ciclo de Krebs e os electrons gerados são capazes de restabelecer o potencial de membrana mitocondrial, promover a síntese de ATP e consumo de oxigênio na mitocôndria. Além disso, His é capaz de estimular a metaciclogênese: estudos metabolômicos mostraram que His é utilizada como fonte energética principalmente no inicio da diferenciação. Nossos dados mostram a relevância da His na bioenergética de T. cruzi, nos estágios presentes no inseto vetor. Trypanosoma cruzi incorporates histidine, an essential amino acid, through a saturable, highly specific and ATP dependent transport system. Once in the cytoplasm, a histidine ammonia-lyase (TcHAL) catalyzes the non-oxidative deamination of His to urocanate, which is converted by an urocanate hydratase (TcUH) to the intermediate 4-imidazolone-5-propionate. Afterwards, two enzymes (imidazolonepropionase and fomiminoglutamase) complete the glutamate formation. Kinetic and biochemical parameters of TcHAL and TcUH were determined. We observe that His degradation can feed Krebs cycle, and the electrons produced are able to restore the mitochondrial inner membrane potential, promote ATP biosynthesis and oxygen consumption at the mitochondrion. Furthermore, His was able to stimulate metacyclogenesis: a metabolomics approach shows that His is used as an energy source, mainly, in early stages of differentiation. Our data shows the relevance of His in T. cruzi bioenergetics, mainly in insect vector stages.

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p

Compostos α-aminocarbonilícos como ácido 5-aminolevulínico (ALA) e aminoacetona (AA) apresentam um grande potencial pró-oxidante, pois sofrem reações de enolização e subseqüente oxidação aeróbica, com a formação de espécies radicalares de oxigênio, íons NH4+ e α-oxoaldeídos potencialmente citotóxicos. A α-aminocetona 1,4-diamino-2-butanona (DAB), um análogo da putrescina, é um agente microbicida de vários parasitas incluindo Trypanosoma cruzi. Acredita-se que o mecanismo de morte desencadeado por DAB nos parasitas seja por meio da inibição competitiva da ornitina descarboxilase (ODC), importante enzima do metabolismo de poliaminas, muito embora tenha sido observado de igual forma danos oxidativos nestes parasitas quando tratados com DAB. O objetivo deste trabalho é esclarecer o mecanismo de oxidação química de DAB e sua ação pró-oxidante à cultura de células de mamíferos (LLC-MK2 e RKO), assim como sua atividade microbicida contra tripomastigotas de Trypanosoma cruzi. Demonstramos aqui que DAB, quimicamente similar ao ALA e AA, sofre reação de oxidação catalisada por íons fosfato, e por íons de metais de transição como Fe(II) e Cu(II), resultando na formação de radicais de oxigênio, H2O2, NH4+, 2-oxo-4-aminobutanal como produto principal da oxidação de DAB e de compostos ciclicos de caracter pirrólico. Danos oxidativos observados em ferritina, apotransferrina e liposomos de cardiolipina e fosfatidilcolina (20:80) contribuem para a nossa hipótese de ação pró-oxidante de DAB. O tratamento de células de mamíferos das linhagens LLC-MK2 (IC50 1,5 mM, tratamento de 24 h) e RKO (IC50 0,3 mM, tratamento de 24 h) com DAB levou à alteração do balanço redox celular, à ativação de resposta antioxidante e ao desencadeamento de morte celular via apoptose e parada de ciclo celular. Em culturas de tripomastigotas de T. cruzi o tratamento com DAB culminou na redução da motilitidade e viabilidade destes parasitas (IC50 0,2 mM, tratamento de 4 h), assim como depleção do conteúdo tiólico acompanhado pelo aumento da atividade de TcSOD. Além do mais, DAB mostrou-se eficiente em limitar a invasão de tripomastigotas às células hospedeiras (LLC-MK2) e reduzir a proliferação de amastigotas intracelulares, contudo fortemente relacionada à necrose das células hospedeiras infectadas, uma vez que são alvos mais susceptíveis de ação oxidativa. Estes resultados suportam nossa hipótese que DAB exerce ação pró-oxidante e contribui deste modo com o mecanismo já descrito de morte celular associada à inibição da biossíntese de poliaminas em vários microorganismos. α-Aminocarbonyl componds such as 5-aminolevunilic acid (ALA) and aminoacetone (AA) have been shown to exhibit pro-oxidant properties. These compounds undergo phosphate-catalyzed enolization in physiological pH and subsequent aerobic oxidation, yielding reactive oxygen species, NH4+ ions and an α-oxoaldehyde highly cytotoxic. The &#945-aminoketone 1,4-diamino-2-butanone (DAB) is a putrescine analogue and a microbicidal agent to various parasites including Trypanosoma cruzi. The mechanism of DAB toxicity to these parasites is attributed to DAB competitive inhibition of ornithine decarboxylase (ODC), a key enzyme on polyamine biosynthesis, although it has also been shown DAB isto implicated in oxidative damage to these parasites. Our aim is to clarify the mechanism of DAB aerobic oxidation and of its putative pro-oxidant activity to mammalian cell cultures (LLC-MK2 and RKO cell linages) and to Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Here we show that, similar to ALA and AA, DAB undergoes aerobic oxidation in presence of phosphate ions and of transition metal ions such as Fe(II) and Cu(II), yielding oxygen radicals, H2O2, NH4+ and 2-oxo-4-aminobutanal accompanied by its condensation cyclic products displaying pyrrolic characteristics. Oxidative alterations to ferritin, apotransferrin and liposomes of cardiolipin and phosphatidylcholine (20:80) were observed under DAB treatment strongly supporting our hypothesis of DAB pro-oxidative activity. DAB treatment of mammalian cultured cells LLC-MK2 (IC50 1.5 mM, 24 h incubation) and RKO (IC50 0.3 mM, 24 h incubation) resulted in redox imbalance, induction of antioxidant response, activation of apoptosis pathway and cell cycle arrest. DAB is shown here to trigger Trypanosoma cruzi trypomastigotes decreased parasite motility and viability (IC50 0.2 mM, 4 h incubation), as well as redox thiol imbalance parallel to increase TcSOD activity. In addition, DAB efficiently hampered host cell (LLC-MK2) invasion by trypomastigotes. In addition, intracellular amastigotes showed to be susceptible to DAB toxicity, although strongly related to necrosis of infected host cells, which are more vulnerable to oxidative stress. Altogether, these data support our hypothesis that oxidative stress contributes to DAB cytotoxicity.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.

Os nossos resultados demonstraram a atividade enzimática prolina desidrogenase (PRODH) do produto do gene anotado como codificante de uma prolina oxidase na base dados do genoma de Trypanosoma cruzi. A atividade da proteína codificada por esse gene foi avaliada inicialmente por complementação de uma linhagem de S. cerevisiae deficiente na expressão funcional da PRODH endógena, e posteriormente mediante a obtenção da enzima recombinante ativa expressa em um sistema bacteriano. Nos estudos feitos tanto com leveduras complementadas com o gene PRODH, quanto com as formas epimastigotas de T. cruzi, observamos que nesses organismos há uma correlação positiva entre o nível intracelular de prolina livre e a resistência ao estresse oxidativo. Através dos ensaios de RT-PCR quantitativo observamos que o RNAm do gene da PRODH é regulado ao longo do ciclo de vida do T. cruzi, com maior nível de expressão no estágio epimastigota intracelular, perfil apresentado também em experimentos de Western Blotting, o que é concordante com o papel fundamental desse aminoácido na diferenciação dessa forma para as forma tripomastigota. Nos diferentes ensaios de localização subcelular observou-se que a proteína PRODH está presente na mitocôndria. A seqüência da PRODH apresenta um sítio EF-hand de ligação a Ca2+. Mostramos experimentalmente a funcionalidade desse sítio e a sua função na regulação da atividade por Ca2+. Em ensaios de respiração mitocondrial, utilizando prolina como substrato, foi mostrado que a prolina fornece elétrons à cadeia respiratória através da PRODH, transferindo elétrons e gerando FADH2 no mesmo nível e com a mesma eficiência que o complexo II (succinato desidrogenase). O análogo de prolina T4C, inibidor do transporte de prolina, causa uma diminuição do conteúdo de prolina livre intracelular, o que foi relacionado com uma diminuição significativa da sobrevivência do parasito em combinação com o estresse nutricional e oxidativo, mostrando a participação do metabolismo de prolina na resistência a esses estresses. Todos esses dados sugerem ademais que o transportador de prolina do parasita pode ser um alvo para drogas terapêuticas de interesse quando combinada com outras drogas que agem via geração de espécies reativas de oxigênio. In the present work, we demonstrated the proline dehydrogenase enzymatic activity (PRODH) for the protein encoded by a gene annotated as a proline oxidase in the T. cruzi genome data base. This activity was shown firstly through complementation of a S. cerevisiae lineage lacking its endogenous PRODH gene. The PRODH gene was also expressed in a bacterial system and the active recombinant protein was obtained. Experiments performed with both, complemented yeasts and T. cruzi epimastigotes, showed a correlation between the intracellular free proline levels and the oxidative stress resistance. Quantitative RT-PCR assay revealed that the PRODH gene is differentially expressed across T. cruzi life cycle, being the highest expression level shown by the intracellular epimastigote form, this result was confirmed by Western blotting. Both results are in accordance with the fact that proline is essential for the differentiation of the intracellular epimastigote into trypomastigote. Subcellular localization assays showed that PRODH is present preferentially in the mitochondria. In silico analyses of the PRODH peptidic sequence indicated the presence of an EF-hand domain, wich is, usually, involved in Ca2+ binding. In fact, our results confirm not only the ability of such domain of binding Ca2+ but also its function in the activity regulation. Mitochondrial respiration assays using proline as substrate showed that PRODH transfers electrons and generates FADH2, with an eficience comparable to that of the complex II (Succinate dehydrogenase). Experiments using the T4C, an analogue of proline that inhibits the proline uptake, caused the depletion of the intracellular free proline, which was followed by the significantly decrement of the cellular viability of the parasites under nutritional and oxidative stresses. Taken together, this data suggest that proline transporters are promising drug targets when combined with other drugs that act by generating reactive oxygen species.

A regulação da expressão gênica é vital para todos os organismos se adaptarem rapidamente às mudanças ambientais. Estes mecanismos adaptativos são altamente complexos e a maioria deles não está completamente esclarecida. O fosfato inorgânico (Pi), um nutriente essencial para todos os organismos, é requerido em importantes processos celulares como a biosíntese de ácidos nucléicos e a sinalização metabólica. O sistema de aquisição de Pi no fungo filamentoso Neurospora crassa inclui pelo menos quatro genes regulatórios: nuc-2, preg, pgov e nuc-1. Em condições limitantes de Pi, NUC- 2, uma proteína com domínio de repetição de anquirina, inibe o funcionamento do complexo PREG-PGOV, ativando assim o fator de transcrição NUC-1 e a expressão de genes envolvidos na captação de fosfato, como fosfatases, fosfato permeases e nucleases. Visando entender a funcionalidade do gene nuc-2 na regulação da expressão gênica em resposta aos níveis de Pi exógeno, foram construídas duas bibliotecas de subtração de cDNA entre as linhagens selvagem St.L.74A e nuc-2A de N. crassa, cultivadas em Pilimitante. Obtivemos 52 transcritos induzidos e 16 reprimidos pela proteína NUC-2. A categorização funcional destas sequências revelou genes envolvidos em diversos processos celulares, como transporte, regulação transcricional, transdução de sinal, metabolismo, síntese protéica e desenvolvimento. Entre os genes modulados negativamente pela proteína NUC-2, foi identificado um gene que codifica a proteína MAK-2 (mitogen-activated protein kinase-2), envolvida em vias de sinalização intracelular. O papel funcional deste gene no monitoramento do Pi extracelular foi avaliado por microarranjos de oligonucleotídeos, comparando as linhagens selvagem e mutante mak-2, cultivadas em baixa concentração de Pi. Foram identificados 4.214 genes regulados pela proteína MAK- 2, dentre eles a ciclina codificada pelo gene preg. Além disto, genes regulados em função da concentração de Pi foram identificados, mostrando o envolvimento de 3.174 transcritos. Os resultados obtidos neste trabalho revelam novos aspectos moleculares envolvidos na adaptação à disponibilidade de Pi extracelular, sugerindo que o gene mak-2 constitui um novo componente da via de sinalização e monitoramento de fosfato em N. crassa. Gene expression regulation is crucial for all organisms to rapidly adapt to environmental changes. These adaptive mechanisms are highly complex and most of them have not been completely elucidated. The inorganic phosphate (Pi), an essential nutrient for all organisms, is required for important cellular processes, such as nucleic acids biosynthesis and metabolic signaling. The Pi acquisition system in the filamentous fungus Neurospora crassa includes at least four regulatory genes: nuc-2, preg, pgov and nuc-1. Under limiting Pi conditions, NUC-2, an ankyrin-like repeat protein, inhibits the functioning of the PREG-PGOV complex, allowing the activation of the transcription factor NUC-1 and the expression of genes involved in phosphate acquisition, such as phosphatases, phosphate permeases and nucleases. Aiming at a better comprehension of the nuc-2 functionality in gene expression regulation in response to exogenous Pi levels, two cDNA subtraction libraries were constructed comparing N. crassa wild type St.L.74A and nuc-2A strains, grown under Pi starvation. We obtained 52 NUC-2 up- and 16 downregulated genes. Functional categorization of these sequences revealed genes involved in several cellular processes, such as cellular transport, transcriptional regulation, metabolism, protein synthesis and development. Among the NUC-2 negatively modulated genes, we identified the MAK-2 (mitogen-activated protein kinase-2) protein coding gene, involved in the intracellular signaling pathway. The functional role of this gene in the extracellular Pi sensing was evaluated by oligonucleotide microarrays, comparing wild type and mak-2 strains responses under Pi starvation. We identified 4.214 MAK-2 regulated genes, among them the cyclin coding gene, preg. Furthermore, 3.174 genes regulated in response to Pi levels were identified. In a nutshell, the results obtained in this work reveal novel molecular aspects of the adaptation to extracellular Pi availability, suggesting that the mak-2 gene constitutes a novel component of the N. crassa phosphate sensing and signaling pathway.

Prions são definidos como partículas protéicas infecciosas compostas, quase que exclusivamente, por uma proteína conhecida como prion scrapie (PrPsc). O envolvimento dessas partículas na etiologia de doenças neurodegenerativas, tanto em homens como em animais, já está bem determinado. Acredita-se que o PrPsc seja sintetizado através de modificações pós-traducionais que ocorreriam na isoforma celular da proteína prion (PrPc), uma glicoproteína expressa constitutivamente na superfície de vários tipos celulares, principalmente de neurônios, ancorada na membrana plasmática por glicosil-fosfatidil inositol (GPI). Apesar de ser uma molécula conservada em várias espécies, a função de PrPc ainda permanece desconhecida. Interessados nos possíveis papéis fisiológicos desempenhados pelo PrPc, decidimos investigar certas interações que o PrPc poderia realizar com outras moléculas, na tentativa de se encontrar pistas sobre a função dessa proteína em células normais. Assim, nosso grupo identificou e vem caracterizando duas interações nas quais o PrPc está envolvido: com o seu receptor de 60-66 kDa e com a principal proteína não colagênica da matriz extracelular, a laminina (LN). Grande parte da caracterização dessas duas interações vem sendo desenvolvida graças ao uso de PrPc recombinante produzido em sistema heterólogo (em E.coli). O trabalho em questão trata principalmente da produção de PrPc recombinantes em sistema heterólogo e a utilização destes como importantes ferramentas para a melhor caracterização das interações identificadas. Alguns trabalhos na literatura vinham sugerindo a existência de um receptor para prions. Através da teoria da hidropaticidade complementar dos aminoácidos, nosso grupo foi capaz de identificar uma proteína de 60-66 kDa como sendo esse provável receptor. Ensaios de ligação in vitro utilizando PrPc recombinante, ou PrPc nativo (ancorado na superfície de células) confirmaram que a forma desse receptor presente na membrana (de 66 kDa) é capaz de se ligar ao PrPc. Com a ajuda de PrPc recombinante também foi possível verificar uma ligação específica, saturável e de alta afinidade (Kd da ordem de 10-8 M) entre PrPc e a LN. Através de ensaios de competição, utilizando peptídeos sintéticos correspondentes a domínios da LN já bem caracterizados e de funções estabelecidas, fomos capazes de mapear o sítio dessa molécula que se liga ao PrPc. A sequência identificada (RNIAEIIKDI) encontra-se na região C-terminal da cadeia γ1 da LN e, como demonstrado na literatura, esse domínio é responsável por estimular tanto a adesão celular, quanto o crescimento de neuritos em neurônios de cerebelo em cultura primária. De fato, resultados obtidos pelo nosso grupo indicam que a interação PrPc/LN participa no processo de neuritogênese. Experimentos de esquiva inibitória, realizados em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Ivan Izquierdo (UFRGS) indicaram que a ligação PrPc/LN também desempenha um importante papel nos processos de memória e aprendizado. Prions are defined as proteinaceous infectious particles that mediate the pathogenesis of certain neurodegenerative diseases, in humans and in animals. The prion particle is composed largely, if not entirely, by PrPsc (prion scrapie), a posttranslationaly modified isoform of the cellular host-encoded prion protein (PrPc). PrPc is a glycosylphosphatidylinositol anchored protein that is constitutively expressed by several cell types, mainly on neuronal cell surface. However, the physiological role of this conserved protein remains unclear. ínterested in this normal function of PrPc, our group decided to investigate some interactions that PrPc could be done with other molecules in order to find some clues about it. We have been identified and characterized two interactions that PrPc is involved: with its putative 60-66 kDa receptor and with laminin. In order to better characterize these interactions it was necessary to produce purified PrPc. In this work we will report the expression and the purification of mouse PrPc protein in heterologous system and its use as important tools to investigate the PrPc interactions. A specific cell surface receptor for PrPc has been predicted. Using the concept of complementary hydropathy, our group has identified a 60-66 kDa membrane protein in mouse brain, which seems to be a putative PrPc receptor. ln vitro binding assays using recombinant and native PrPc were able to confirm that the membrane receptor (66 kDa) binds PrPc. Recombinant PrPc was also useful to demonstrate a specific and high affinity (Kd around 10-8M) interaction between PrPc and laminin. In an attempt to map the PrPc binding site in this molecule, laminin peptides with established physiological functions were used in cornpetition binding assays. A peptide derived frorn C-terminal γ-1 chain of mouse laminin, RNIAEIIKDI, was the only one that was able to block the binding of laminin to PrPc, suggesting that this region comprises the PrPc binding site. It was reported in the literature that this peptide simulates the neurite outgrowth and cellular adhesion. In collaboration with Dr. Izquierdo\'s group (UFRGS) we demonstrated that the interaction characterized between this laminin\'s domain and PrPc is involved in the neuritogenesis process, as well as in learning and memory.

Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, macrófagos produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) em um processo chamado explosão respiratória. Diversos trabalhos têm tentado elucidar o papel das ROS durante a infecção pelo T. cruzi, mas os resultados obtidos algumas vezes são contraditórios. Embora o T. cruzi possua uma maquinaria antioxidante eficientemente regulada para lidar com a explosão respiratória, suas macromoléculas, particularmente seu DNA, ainda podem sofrer danos oxidativos. Devido ao seu baixo potencial redox, a guanina é a base mais vulnerável e sua oxidação resulta na formação de 8-oxoG, um marcador celular de estresse oxidativo. A fim de se verificar a contribuição das ROS na sobrevivência e infecção do parasito T cruzi, foram utilizados camundongos nocautes para a subunidade gp91phox da NADPH oxidase (Phox KO) e parasitos que superexpressam enzimas responsáveis pela remoção de 8-oxo-dGTP do conjunto de nucleotídeos. Os parasitos modificados apresentaram maior replicação em macrófagos de camundongos C57BL/6 WT quando comparados aos parasitos controle. Interessantemente, macrófagos de camundongos Phox KO infectados com estes parasitos, apresentaram um número reduzido de parasitos quando comparados com macrófagos de C57BL/6 WT. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam um papel paradoxal para as ROS, uma vez que parasitos modificados multiplicam-se melhor em macrófagos, mas têm sua capacidade de replicação significativamente reduzida quando a produção de ROS é inibida na célula hospedeira. Nossos resultados sugerem que baixas concentrações de ROS podem funcionar como moléculas sinalizadoras, contribuindo para o crescimento dos parasitos no interior das células. During Trypanosoma cruzi infection, macrophages produce reactive oxygen species (ROS) in a process called respiratory burst. Several works have aimed to elucidate the role of ROS during T. cruzi infection and the results obtained are sometimes contradictory. T. cruzi has a highly efficiently regulated antioxidant machinery to deal with the oxidative burst, but the parasite macromolecules, particularly DNA, may still suffer oxidative damage. Guanine (G) is the most vulnerable base and its oxidation results in formation of 8-oxoG, a cellular marker of oxidative stress. In order to investigate the contribution of ROS in T. cruzi survival and infection, we utilized mice deficient in the gp91phox (Phox KO) subunit of NADPH oxidase and parasites that overexpress the enzyme EcMutT (from Escehricha coli) or TcMTH (from T. cruzi), which is responsible for removing 8-oxo-dGTP from the nucleotide pool. The modified parasites presented enhanced replication inside murine inflammatory macrophages from C57BL/6 WT mice when compared with control parasites. Interestingly, when Phox KO macrophages were infected with these parasites, we observed a decreased number of all parasites when compared with macrophages from C57BL/6 WT. In Phox KO macrophages we did not observe exacerbation of the infection. Our results indicate a paradoxical role for ROS, since modified parasites multiply better inside macrophages, but its proliferation is significantly reduced when ROS production is inhibited in host cell. Our findings suggest that lower concentrations of ROS can work like a signaling molecule, contributing to growth of this parasite inside the cells.

Ligantes oxindolimínicos foram sintetizados através de procedimentos já desenvolvidos em nosso laboratório, a partir do 2,3-dioxindol (isatina) e aminas ou diaminas selecionadas, e em seguida metalados. Foram investigados dois complexos de cobre(II) com os ligantes isaepy, preparado a partir de 2-(2-aminoetilpiridina) e isapn, a partir de 1,2-diaminoetano, e os correspondentes complexos de zinco(II). Após caracterização por diversas técnicas, sua reatividade com relação a biomoléculas (HSA e DNA) foi verificada, através de medidas de fluorescência e dicroísmo circular. Posteriormente, sua reatividade antiparasitária frente a T. cruzi foi testada. Todos eles apresentaram atividade tóxica frente às formas tripomastigota e amastigota do parasita, com índices de seletividade bastante promissores, quando comparados à droga atualmente em uso (benzonidazol) e outras alternativas descritas na literatura. Anteriormente estes complexos já haviam demonstrado atividade pró-apoptótica frente a diversas células tumorais, baseado em sua capacidade de gerar espécies reativas (EROs) e de inibir proteínas específicas, como a topoisomerase humana IB. Os resultados aqui obtidos deram origem a um pedido de patente (BR10 2013 026558-6, depositado junto ao INPI em 15/outubro/2013) visando o possível desenvolvimento de novos fármacos para a doença de Chagas. Oxindolimine ligands were synthesized by procedures previously developed in our laboratory, from 2,3-dioxoindole(isatin) and amines or selected diamines, by condensation reactions, followed by metallation. Two copper(II) complexes with isaepy and isapn ligands, prepared from 2-(2-aminoethylpiridine) and 1,2-diaminoethane respectively, and their corresponding complexes of zinc(II) were investigated. After characterization by various techniques, their reactivity with respect to biomolecules (HSA and DNA) was verified, through measurements of fluorescence and circular dichroism. Subsequently, their antiparasitary reactivity against T. cruzi was tested. All complexes tested presents toxic activity against trypomastigote and amastigote forms of the parasite, with promising selectivity index, compared to drugs currently in use (benznidazole) and other alternative compounds described in literature. Previously, these complexes had shown pro-apoptotic activity against several tumor cells, based on their ability to generate reactive species and inhibit specific proteins, such as topoisomerases. The results obtained here gave rise to a patent application (BR10 2013 026558-6, deposited on INPI in October 15th, 2013), looking for a possible development of new drugs for Chagas disease.

Óxido nítrico (NO) é um segundo mensageiro biosintetizado a partir de L-Arginina e envolvido em sinalização celular por diferentes mecanismos: ativação da produção de cGMP pela Guanilil Ciclase; regulação de enzimas pela interação com seus centros metálicos; ou pela S-nitrosilação de cisteína e nitração de tirosina, modificações pós-traducionais, capazes de modular a atividade de diversas proteínas. Neste trabalho buscou-se investigar se a interação de Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, com a matriz extracelular (ECM) era capaz de modular a sinalização por NO em T. cruzi. Tripomastigotas de T. cruzi incubados com ECM apresentaram diminuição na atividade de NOS e menor produção de NO. Da mesma maneira, observou-se, por imunofluorescência indireta e imunoblotting, uma diminuição no padrão geral de S-nitrosilação e nitração de proteínas do parasita incubado com ECM. Além disto, os perfis de proteínas S-nitrosiladas e nitradas foram modificados, predominando a denitrosilação e denitração (de 40 para 22 proteínas nitradas após a adesão a ECM), embora em alguns casos tenha sido observado um aumento de nitração, como em proteínas de citoesqueleto (de 2,5% para 9,1% após adesão). O mesmo padrão foi observado em relação a proteínas nitradas, com diminuição de 48 para 20 proteínas após adesão a ECM e novamente com modificação no percentual de proteínas nitradas pertencentes a processos biológicos distintos, como proteínas relacionadas à síntese proteica (35,4% das proteínas nitradas no grupo controle e apenas 5,0% no grupo incubado com ECM). Apesar do perfil de denitração, algumas classes de proteínas têm aumento no número de alvos nitrados, como proteínas relacionadas a metabolismo (de 18,8% para 35,0%), além de alguns alvos específicos que têm aumento na nitração, como enolase. Em suma, os resultados sugerem que a sinalização intracelular por NO em tripomastigotas de T. cruzi é modulada durante a adesão do parasita a componentes da matrix extracelular, tanto através da via clássica de produção de óxido nítrico, quanto por modificações pós-traducionais induzidas por NO. Nitric oxide (NO) is a second messenger biosynthesized from L-Arginine and involved in cell signaling by different mechanisms: activation of cGMP production by guanilyl cyclase; regulation of enzymes by interaction with their metallic centers; or by S-nitrosylation of cysteine and nitration of tyrosine, posttranslational modifications capable of modulating the activity of several proteins. In this work, we sought to investigate whether the interaction between extracellular matrix (ECM) and Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas\' disease, was capable of modulating NO signaling in the parasite. Trypomastigotes incubated with ECM presented a decrease in NOS activity and NO production. Accordingly, a decrease in S-nitrosylation and tyrosine nitration of proteins from ECM-incubated parasites was also observed, as evidenced by indirect immunofluorescence and immunoblotting. In addition, S-nitrosylated and tyrosine nitrated proteins profiles were modified in ECM-incubated parasites, with an enhancement in protein denytrosylation and denitration. A decrease from 40 to 22 of S-nitrosylated proteins was detected after parasite adhesion to ECM, more evident in some protein groups (as for example 52.5% hypothetical proteins modified in the control group against 36.4% after adhesion). On the other hand, an increase of S-nitrosylation was detected in other groups of proteins, such as cytoskeleton proteins (from 2.5% of total S-nitrosylated proteins to 9.1% after adhesion). The same general pattern was observed in relation to tyrosine-nitrated proteins, with a decrease in the number of modified proteins from 48 to 20 after incubation with ECM, exemplified by those related to protein synthesis, with a contribution of 35.4% in the control group versus 5.0% after treatment with ECM. Despite this general denitration profile, some protein classes have an increase in nitration, such as metabolic proteins (from 18.8% to 35.0%), in addition to some specific targets, such as enolase. Taken together, the results suggest that NO signaling is modulated during adhesion of T. cruzi to components of the extracellular matrix, probably by the classical nitric oxide pathway and by NO-induced post translational modifications.

Em Leptospira interrogans algumas proteínas com capacidade de ligação aos componentes de matriz extracelular foram identificadas e, em sua maioria, são fatores de virulência. Phage display é considerada uma técnica poderosa na identificação de novos ligantes, inclusive de moléculas adesinas, importantes no primeiro estágio de infecção do hospedeiro. A técnica de shotgun phage display foi utilizada visando à obtenção de ligantes à células de mamíferos. Quatro bibliotecas, por inserção de fragmentos aleatórios obtidos por sonicação do DNA de L. interrogans nos fagomídeos pG8SAET (BBT1 e BBT2) e pG3DSS (BBT5 e BBT6), foram construídas. As bibliotecas BBT1 e BBT5 contém insertos maiores e as BBT2 e BBT6 contém insertos menores, com tamanhos médios de 1500 pb e 350 pb, respectivamente. Após ensaio de panning da BBT5 contra células de mamíferos e soro fetal bovino, as sequências de clones selecionados foram analisadas quanto a orientação correta e se a fusão estava em fase com a proteína pIII. As proteínas codificadas pelos genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 e LIC12976 foram selecionadas com estas características. Os genes que codificam a LIC12976, LIC10768, LIC10769 e LIC13418, tiveram sua conservação avaliada em diferentes sorovares da espécie patogênica L. interrogans e no sorovar Patoc da espécie de vida livre L. biflexa. As proteínas LIC12976 (selecionada pela técnica de phage display) e LIC13418 (selecionada por ferramentas de bioinformática) tiveram suas sequências amplificadas por PCR, clonadas em pGEM T easy, subclonadas em vetor de expressão pAE e expressas na fração celular correspondente ao corpúsculo de inclusão em E. coli BL21 (DE3) Star pLysS e E. coli BL21 SI, respectivamente. Após renaturação e purificação destas proteínas por cromatografia de afinidade a metal bivalente, um grupo de cinco animais BALB/c fêmeas foi imunizado. Ambas as proteínas se mostraram imunogênicas com títulos dos soros policlonais 1:256000 e 1:512000, respectivamente. Em ensaio de Western Blot os soros foram específicos no reconhecimento das proteínas recombinantes e as proteínas nativas foram verificadas em extratos de sorovares patogênicos de L. interrogans. Em ensaios de adesão, as proteínas recombinantes aderiram às células A31, LLC-PK1 e Vero e especificamente à laminina. Em ensaios de interferência em células usando laminina houve um aumento da adesão das proteínas recombinantes, o que pode ser explicado pela ligação da laminina às células e uma maior ligação das LICs estudadas. Em ensaio de localização celular usando imunofluorescência e microscopia eletrônica, foi observado que ambas as proteínas se encontram na superfície da L. interrogans. No experimento de desafio animal, a LIC12976 e a LIC13418 não se mostraram protetoras. Este trabalho contribuiu para a identificação das novas adesinas LIC13418 e LIC12976 que podem participar da virulência de leptospiras patogênicas envolvendo a primeira etapa da infecção na interação patógeno-hospedeiro In Leptospira interrogans, proteins capable to bind to extracellular matrix components have been identified and most of them are important virulence factors. Phage display is a powerful technique to identify new ligands, including adhesin molecules that are important in the first stage of host infection. A shotgun phage display technique was used in order to obtain cell ligands. Four libraries were constructed by inserting random fragments obtained by sonication of L. interrogans DNA into phagemids pG8SAET (BBT1 and BBT2) and pG3DSS (BBT5 and BBT6). The libraries BBT1 and BBT5 contain larger inserts and BBT2 and BBT6 contain smaller inserts, with 1500 bp and 350 bp average sizes, respectively. After panning of BBT5 against mammalian cells and bovine fetal serum, the sequences of selected clones were analyzed for correct orientation and fusion with pIII protein. The proteins encoded by genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 and LIC12976 were selected. The genes LIC12976, LIC10768, LIC10769 and LIC13418 were evaluated for their conservation in different pathogenic serovars of L. interrogans and free-living L. biflexa serovar Patoc. Proteins LIC12976 (selected by phage display technique) and also LIC13418 that was selected by bioinformatic tools, were amplified by PCR, cloned into pGEM T easy, subcloned into expression vector pAE and expressed in cellular fraction corresponding to the inclusion body in E. coli BL21 (DE3) Star pLysS and E. coli BL21 SI, respectively. After protein renaturation protocol and purification by affinity chromatography, a group of five BALB/c mice was immunized with the purified proteins. Both proteins were shown to be immunogenic with 1:256000 and 1:512000 polyclonal sera titers, respectively. In Western blot the sera were specific to recognize recombinant proteins and native proteins were detected in pathogenic L. interrogans serovars extracts. In binding assays, recombinant proteins bind to A31, LLC-PK1 and Vero cells and specifically to laminin. In interference cell assay using laminin there was an increase of recombinant protein bindings, which can be explained by the laminin binding to cells and further binding of the recombinant LICs. In cellular localization assay using immunofluorescence and electron microscopy, it was observed that both are surface proteins of L. interrogans. In the animal challenge, the LIC12976 and LIC13418 were not protective. As a whole, this work contributed to the identification of LIC12976 and LIC13418 as new adhesins and they can participate in the virulence of pathogenic Leptospira in the first stage of host pathogen interaction.

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

A caracterização da síntese de fosfatidilserina (PS) em Leishmania (Leishmania) amazonensis mostrou a presença de uma única via de síntese de PS, pela ação da enzima fosfatidilserina sintetase II (PSS II). A seqüência que codifica essa enzima, presente em cópia única no genoma, apresentou uma identidade de 38% e uma similaridade de 55% com seu homólogo humano. Tentativas de se nocautear esse gene não foram bem sucedidas, indicando que o gene é essencial à sobrevivência do parasita. Ensaios de incorporação de fosfolipídios marcados mostraram que o parasita captura do meio fosfatidiletanolamina, substrato da PSS II, mas a incorporação de PS se dá em uma taxa muito baixa. Também foi feita a caracterização do transporte de serina pelo parasita, que mostrou a existência de um único transportador com pH ótimo de 7,5, dependente da aitvidade metabólica da célula, com um Km de 0,826 +/- 0,183 mM e Vmax de 355,37 +/- 19,41 pmol/min * 2 * 107 promastigotas, que se mantém ativo a até 45 oC. The characterization of phosphatidylserine (PS) synthesis in Leishmania (Leishmania) amazonensis revealed a single pathway that presented phosphatidylserine synthase II (PSS II) activity. The single copy gene that encoded this enzyme showed 38% of identity and 55% of homology to the human homolog. Attempts for the gene knockout were not successful, indicating that the gene is essential for the parasite survival. Incorporporation assays of labeled phospholipids showed that the parasite take phosphatidylethanolamine, substract for the PSS II, from the medium, but the rate of incorporation of PS occurred at a very low rate. The biochemical characterization of the serine incorporation by the parasite showed the existence of a single transport system, with an optimum pH of 7.5, which was dependent of metabolic activity of the cell, that showed a Km of 0.826 +/- 0.183 mM and Vmax of 355.37 +/- 19.41 pmol/min *2 * 107 promastigotes, that remained active up to 45oC.

As formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi expressam as Tc-85, glicoproteínas de superficie. A Tc85-11, um dos membros da família da Tc-85, foi caracterizado como uma proteína de adesão, com os sítios de ligação a laminina e citoqueratina 18 localizados, respectivamente, nos domínios amino e carboxiterminal. Utilizando-se primers consensos, um produto de cerca de 2000 pb foi amplificado do cDNA de formas tripomastigotas de T cruzi da cepa Y. Uma biblioteca enriquecida em membros da família da Tc-85 foi construída utilizando-se esses primers e o plasmídeo pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen). O sequenciamento de cerca de 60 clones resultou em 30 ORFs completas. O sequenciamento de DNA foi realizado com o método dideoxi de terminação de cadeia e as seqüências foram analisadas. Por análise comparativa, identidades de 40-90% entres os clones sequenciados e 30-70% com membros da superfamília de proteínas das gp85/trans-sialidases foram encontradas. Os dados foram compilados nas seguintes ferramentas: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman, ClustalW, BioEdit e BLASTX/BLASTN (NCBI). Para a análise filogenética, foi utilizado o programa Paup empregando máxima parsimônia (MP), \"neighbor joining\" (NJ) e máxima probabilidade (MP). A árvore possuia dois grupos e foi submetida a análise de bootstrapping, com busca heurística completa e com 100 e 500 repetições. Os mesmos dois grupos apareceram quando a comparação de seqüências e análise filogenética foram correlacionadas. Em experimentos utilizando-se elementos de matriz extracelular - laminina e fibronectina- foi testada a ligação de proteínas recombinantes purificadas. A proteína codificada pelo inserto de cDNA Tc85-45 foi capaz de se ligar de maneira saturável a laminina e a fibronectina, mas não a albumina e gelatina. Os dados sugerem fortemente que, apesar da família da Tc-85- e por conseqüência a superfamília das gp85/trans-sialidases- codificarem proteínas com graus variáveis de seqüências similares, as seqüências específicas de peptídeos para a ligação a diferentes moléculas de matriz e receptores celulares variam entre membros da família, constituindo, assim, uma família multiadesiva de glicoproteínas que capacita o parasita a ultrapassar as barreiras impostas pelas membranas celulares, matrizes extracelulares e lâminas basais. Trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi express Tc-85 surface glycoproteins. Tc85-11, one member of the Tc-85 family, was characterized as an adhesion protein, with laminin and cytokeratin-18 binding sites localized, respectively, on the amino and carboxy terminal domains. Using consensus primers, a 2000 bp product was amplified from cDNA of trypomastigote forms of T. cruzi of the Y strain. A library enriched in Tc-85 cDNA was constructed using these primers and pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen) plasmid. Sequencing of about 60 clones gave 30 complete ORFs. DNA sequencing was performed by the dideoxi-chain termination method and the sequences have been analyzed. By comparative analysis, identity of 40-90% was found among the sequenced clones and 30-70%, with members of the gp85/trans-sialidase superfamily proteins. The data were compiled in the following tools: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman algorithm, ClustalW, BioEdit and BLASTX/BLASTN (NCBI). For phylogenetic analysis, the Paup program was employed using maximum parsimony (MP), neighbor joining (NJ), and maximum likelihood (ML). The inferred tree had two groups and was submitted to full heuristic bootstrapping with 100 and 500 repetitions. The same two groups appeared when comparative sequence and phylogenetic analyses were correlated. In experiments in which extracellular matrix elements - laminin and fibronectin- were tested for binding to purified recombinant proteins, the protein coded by the cDNA insert Tc85-45 was able to bind in a saturable manner to laminin and fibronectin, but not to albumin and gelatin. The data strongly suggest that although the Tc-85 family, and by extension the gp85/glycoprotein superfamily, encode glycoproteins with variable degrees of similar sequences, the peptide sequences specific for the binding to different matrix molecules and cell receptors varies among the family members, thus, constituting a multi-adhesion family of glycoproteins that enables the parasite to overcome the barriers imposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.

Capítulo 1 A transformação (metaciclogênese) das formas proliferativas epimastigotas do Trypanosoma cruzi em formas não proliferativas e infectivas - tripomastigotas metacíclicos - é um passo crucial que ocorre naturalmente no trato digestivo do inseto vetor reduviídeo. Este processo pode ser reproduzido in vitro em condições químicas definidas quando o meio de diferenciação TAU é suplementado com L-prolina e L-glutamato. Está bem estabelecido que prolina é uma fonte importante de energia e de carbono nos tripanossomatídeos, mas são poucas as evidências de sua participação na diferenciação intracelular do parasita no hospedeiro vertebrado. Este fato nos levou a desenvolver um modelo experimental para verificar se havia uma relação entre concentração de prolina e eclosão de formas tripomastigotas. Culturas mantidas sem L-prolina produziram consistentemente menos formas tripomastigotas quando comparadas a culturas mantidas em L-prolina, 20 - 200 µM. A atividade de transporte de L-prolina foi 15 vezes e 23 vezes maior nos epimastigotas intracelulares em relação a amastigotas e tripomastigotas, respectivamente. A concentração de prolina medida nos epimastígotas intracelulares (0,73 ± 0101 mM) é bem menor que a de amastigotas (6,61 ± 0,01 mM) e tripomastigotas (2,74 ± 0,02 mM). Todos os estágios, no entanto, apresentaram concentração de prolina bem maior do que as células hospedeiras, na ordem de 0,27 ± 0,03 mM. A análise do efeito de prolina sobre os diferentes estágios intracelulares mostrou a importância desse aminoácido na transformação de epimastigotas intracelulares a tripomastigotas. Capítulo 2 A diferenciação das formas infecciosas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi a formas amastigotas não-infectivas e replicativas ocorre normalmente no citoplasma de células infectadas. Um estudo sobre o envolvimento de proteínas fosfatase do tipo 1 e 2A na diferenciação extracelular a 37ºC e 33ºC de tripomastigotas a formas amastigotas foi realizado, utilizando-se o clone CL-14 de T cruzi. Demonstrou-se que Caliculina A (um inibidor de proteínas fosfatase 1 e 2A) desencadeia a transformação de tripomastigotas a amastigotas em pH neutro, através da passagem por formas intermediárias flageladas semelhantes aos epimastigotas. O tratamento de tripomastigotas com duas concentrações de Caliculina A (1nM e 5 nM) resultou, após 6 horas de incubação, em mais de 50% de formas epimastigota-símiles. Após 8 horas de tratamento, todos os tripomastigotas estavam diferenciados a formas amastigotas ou epimastigota símiles. Tripomastigotas metacíclicos do clone CL-14 submetidos ao mesmo tratamento com Caliculina A não apresentaram alterações morfológicos dentro do período de incubação de 8 horas. Capítulo 3 Fatores ambientais, como a temperatura, e a presença ou ausência de metabólitos tais como a L-prolina influenciam a diferenciação intracelular do Trypanosoma cruzi do clone CL-14. Estes fatos, juntamente com a ausência de dados na literatura sobre o perfil proteico de epimastigotas intracelulares levou-nos a estudar o perfil de expressão de proteínas durante a transformação de epimastigotas intracelulares a tripomastigotas em culturas celulares mantidas a 37ºC (temperatura restritiva), comparando-as com aquelas cuja manutenção foi feita a 33ºC (temperatura permissiva). Também foram comparados os perfis proteicos quando os parasitas foram obtidos de culturas celulares mantidas na ausência ou presença de diferentes concentrações de L-prolina. Para tanto, foram feitas preparações de frações enriquecidas em membranas e frações citossólicas dos diferentes estágios do parasita para posterior resolução por eletroforese bidimensional. Através desta análise foi possível identificar polipeptídeos comuns entre os diferentes estágios bem como polipeptídeos específicos de cada estágio de desenvolvimento. Chapter 1 The transformation of the proliferative epimastigotes of Trypanosoma cruzi into the non-proliferative and infective metacyclic trypomastigotes (metacyclogenesis) is a crucial step occuring naturally in the digestive tract of the reduviid insect vector. This process can be reproduced, in vitro, under chemically defined conditions. It is well established that L-proline is an important energy and carbon source for trypanosomatids but no evidence for its participation in the differentiation of vertebrate host stages of the parasite exists in the literature. This fact prompted us to develop an experimental model to study whether a correlation exits between proline concentration and trypomastigote bursting. In fact, cultures maintained in the absence of L-proline consistently produced fewer trypomastigote forms when compared to cultures maintained in 20 - 200 µM L-proline. The transport activity of L-proline was 15-fold and 23-fold higher in intracellular epimastigote-like forms as compared to amastigotes and trypomastigotes, respectively. Interestingly, proline concentration in intracellular epimastigote-like parasites was 0.73 ± 0.01 mM, as compared to 6.61 ± 0.01 mM for amastigotes and 2.74 ± 0.02 mM for trypomastigotes, while host cells showed an intracellular proline concentration of 0.27 ± 0.03 mM. The data suggest the importance of L-proline in the transformation of intracellular epimastigote-like forms to trypomastigotes. Chapter 2 Differentiation of the infective trypomastigote form of Trypanosoma cruzi to the non-infective and replicative amastigotes normally occurs in the cytoplasm of infected cells. A study about the envolvement of protein phosphatases type 1 and 2A in the extracellular differentiation at 37ºC and 33ºC from trypomastigotes to amastigotes was undertaken using the CL-14 clone of T. cruzi. Calyculin A (an inhibitor of protein phosphatases 1and 2A) triggers the transformation of trypomastigotes to amastigotes at neutral pH through epimastigote-like intermediate forms. Treatment of trypomastigotes for 6 hours with two Calyculin A concentrations (1 nM and 5 nM) resulted in more than 50% of epimastigote-like forms. After 8 hours, all trypomastigotes were differentiated to amastigotes or epimastigotes-like forms. Metacyclic trypomastigotes from the CL-14 clone submitted to the same treatment with Calyculin A showed no morphological changes.

A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi. β-D-galactofuranose is a component of several galactofuranose containing macromolecules of many organisms, including bacteria, protozoa and fungi. Interestingly, this unusual sugar is absent in mammalian glycoconjugates. An alternative and fast method for the purification of β-D-galactofuranosidase was developed using p-nitrophenyl-β-D-galactofuranoside as substrate. A concentrated culture medium from Penicillium fellutanum was chromatographed on DEAE-Sepharose CL 6B followed by an affinity chromatography column of 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose which yielded two separate peaks of enzyme activity when elution was performed with 10mM D-galactonic acid-γ-lactone in a 100-500 mM NaCl gradient. Both peaks rendered a single 70 kDa protein as detected by SDS-PAGE. Antibodies elicited against a mixture of the single bands excised from the gel were capable to immunoprecipitate 77 % units out of total units of the enzyme from the crude extract. One of the excised bands was submited to microsequencing and the sequence for 3 peptides (65, 73, 101) was obtained. Antibodies were raised against the corresponding synthetic peptides and used to immunoprecipitade a polypeptide with β-D-galactofuranosidase activity. To verify the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi we used the same 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose affinity column. An extract of epimastigotes metabolically labelled with 35S-methionine was applied on the affinity colunm. After washing, the putative enzyme was eluted by 10 mM D-galactonic acidy-γ-lactone and 100-500 mM NaCl gradient. SDS-PAGE analysis of the eluted material show a polypeptide with an apparent molecular mass of 50-60 kDa that is recognized by all the antibodies raised against β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum. Also the antibodies react with p-formaldehyde fixed parasites as detected by indirect immunofluorescence. The 50-60 kDa polypeptide was then employed in enzymatic assays. Almost no enzymatic activity was observed when p-nitrophenyl galactofuranoside was employed as substrate. LPPG (lipopeptidophosphoglycan), a galactofuranose-con taining glycoconjugate isolated from epimastigotes of T. cruzi was then employed as substrate. Galactopyranose, the product of the enzymatic activity, was detected by high pH anion-exchange chromatography, suggesting the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi.

Tripomastigotas, formas infectivas do T. cruzi, expressam em sua superfície uma família de glicoproteínas denominada Tc-85, que pertence à superfamília gênica das gp85/trans-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da família da Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila terminal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamíferos. O uso de peptídeos sintéticos, correspondendo em sequência à Tc85-1 possibilitou a caracterização do motivo mais conservado da superfamília gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVfLYNR), que não está relacionado com a adesão a laminina, como o domínio de adesão em células de mamíferos. Por cromatografia de extratos de membrana de células LLC-MK2 numa coluna de afinidade contendo o motivo de adesão, foi isolada uma molécula de 45 kDa identificada como citoqueratina 18 (CK18). Dados da literatura, de acordo com experimentos realizados em nosso laboratório, indicam que células epiteliais apresentam CK18 em sua superfície. Além disso, células K562, que não são infectadas pelo T. cruzi e não ligam ao motivo VTVxNVfLYNR nem à Tc85-1, não expõem CK18 em sua superfície. A adição de anticorpos anti-CK18 ao meio de cultura inibe a infecção de células epiteliais pelo T. cruzi, enquanto que a adição de pf-Tc85-11 ou VTVxNVfLYNR estimula a infecção. Esses dados sugerem que a adesão de membros da família das trans-sialidases a CK18 prepara a célula para invasão. Trypomastigotes, which are the infective form of Trypanosoma cruzi, express a set of surface glycoproteins known, collectively, as Tc-85, a subset of the gp85/transsialidase supergene family. A member of that family, Tc85-11, has been cloned, whose carboxy-terminal fragment (Tc85-1) showed adhesive properties to laminin and cell surfaces (Giordano et al., 1999). The use of synthetic peptides, corresponding to the Tc85-1 sequence, enabled us to characterize the most conserved motif of the Trypanosoma trans-sialidase supergene family (VTVxNVfLYNR) as the mammalian cell binding domain. Although Tc85-1 binds to laminin, this domain does not bind to laminin nor inhibits cell binding to it. Affinity chromatography experiments with LLC-MK2 cell membrane extract enabled us to isolate the VTVxNVfLYNR motif receptor as a 45 kDa molecule that was identified as cytokeratin 18 (CK18) after trypsin digestion. This result is in agreement with published data, showing that CK18 is exposed on the outer membrane surface of epithelial cells. Furthermore, K562 cells which are not susceptible to T. cruzi infection, did not bind to Tc85-1 nor showed CK18 on their surface. The addition of anti-cytokeratin antibodies to the culture medium significantly inhibited the infection of epithelial cells by T. cruzi, while addition of fusion proteinTc85-11 or VTVxNVFLYNR slightly stimulated the infection. These results indicate that, the binding of the trans-sialidase family members to CK18 may prepare the hostcell for parasite invasion. Furthermore, our data suggest that Tc85-11 is a multiadhesive glycoprotein, encoding at least two diferent binding sites, one for laminin and one for CK18 that help the parasite to overcome the barriers interposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.

Vários laboratórios descreveram moléculas que estão envolvidas na invasão do Trypanosoma cruzi à célula hospedeira. Nosso laboratório foi o primeiro a descrever moléculas de 85 kDa pertencentes a uma família de glicoproteínas (Tc-85) que possuem graus diferentes de homologia de seqüência com os membros da superfamília das gp85/transialidases. Um componente acídico (Tc85-11) da família Tc-85 que se liga à laminina e a receptores da célula hospedeira foi clonado e expresso (Giordano et al., JBC 274, 3461,1999). Nós levantamos a hipótese de que o polimorfismo dos diferentes membros da família Tc-85 poderiam determinar diferentes propriedades da adesão à célula hospedeira. Para provar tal hipótese, uma biblioteca genômica de Tc-85 utilizando o vetor pTEX e os seguintes primers: R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC e GPI-2(3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC, foi digerida com enzimas de restrição resultando em fragmentos de tamanho esperado (~2-2,5 kb) em 91% dos clones selecionados. Treze clones foram seqüenciados em suas extremidades 5\' e 3\'. Nenhum era idêntico entre si apesar da variabilidade da homologia de seqüência (40-70%). No entanto, quando comparadas as regiões codantes para o peptídeo sinal foi encontrada uma homologia de 90%. Para assegurar a clonagem de genes funcionais, uma biblioteca de cDNA foi construída com primers degenerados (5\'-ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG, 3\'ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) por transcrição reversa de seqüências conservadas da superfamília das gp85/transialidases, excluindo a seqüência codante para o peptídeo sinal e a seqüência codante para âncora de GPI (presença de aminoácidos hidrofóbicos). Os cDNAs foram amplificados e clonados no vetor de expressão pCR®T7/NT-TOPO. Foram selecionados 60 clones que foram submetidos à análise de restrição e 90% deles mostraram fragmentos com tamanho esperado. As proteínas de fusão de 4 destes clones foram reconhecidas em Western blot por um anticorpo policlonal feito contra um fragmento da Tc85-11 (H3.3). As seqüências obtidas da extremidade 5\' revelou que os quatro clones pertencem à superfamília das gp85/transialidase (GenBank). O alinhamento destas seqüências com a Tc85-11 mostrou uma homologia de 60-80% e uma identidade de 40-70% na seqüência de aminoácidos. Estes dados confirmam a heterogeneidade da família da Tc-85 que é expressa pelo parasita. Ademais, a expressão de elevadas quantidades das proteínas correspondentes permitirá a identificação dos ligantes respectivos para estas proteínas de superfície específicas de tripomastigotas. Several laboratories described molecules that are involved in Trypanosoma cruzi invasion of host-cells. Our laboratory was the first to describe molecules of 85 kDa belonging to a glycoprotein family (Tc-85) having different degrees of sequence homology with the members of the gp85/trans-sialidase supergene family. An acidic component (Tc85-11) of the Tc-85 family that binds to laminin and to host-cell receptors was cloned and expressed (Giordano et al., JBC 274, 3461, 1999). We raised the hypothesis that the polymorphism of different members of the Tc-85 family could specify different adhesion properties to host proteins. In order to prove the hypothesis, a genomic Iibrary of Tc-85 using the pTEX vector and primers R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC and GPI-2 (3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC was cut with restriction enzymes resulting in fragments of the expected size (~2-2.5 kb) in 91% of the clones. Thirteen clones were sequenced from their 5\' and 3\' terminal ends. None were identical in spite of a variable sequence homology (40-70%), as opposed to 90% of homology when the signal peptide coding regions were compared. In order to assure the cloning of functional genes, a cDNA Iibrary was constructed with degenerated primers ((5\') ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG / (3\') ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) for reverse transcription of conserved sequences from the gp85/trans-sialidase supergene family excluding the hydrophobic sequences from both extremities. The cDNAs were amplified by PCR and cloned into pCR ®T7/NT-TOPO expression vector. 60 clones were selected and were subjected to restriction analysis and 90% of the clones showed fragments with the expected size. The expressed fusion proteins of 4 of these clones were recognized in Western blots by a polyclonal antibody raised against a fragment of Tc85-11 (H3.3). The sequences obtained from the 5\' termini revealed that all four clones belong to the gp85/trans-sialidase supergene family (GenBank TM). The alignment of these sequences with Tc85-11 showed a homology of 60-80% and an identity of 40-70% in aminoacid sequence. These data confirm the heterogeneity of the Tc-85 family that is expressed by the parasite. Additionally, the expression of high amounts of the corresponding proteins will allow the identification of putative Iigands for these trypomastigote specific surface proteins.

Trypanosoma cruzi, causador da tripanossomíase americana, é um microrganismo exposto a uma variedade de espécies reativas de oxigênio, geradas como conseqüência do metabolismo de drogas tripanocidas, ou pelo hospedeiro como resposta fisiológica à invasão, além daqueles produzidos internamente em conseqüência dos processos oxidativos do parasita. Em qualquer circunstância, as células precisam proteger-se contra os produtos da redução parcial do oxigênio. Os tripanossomatídeos são aparentemente deficientes na defesa antioxidante. Embora possuindo uma superóxido dismutase, carecem de glutationa peroxidase e catalase, que são necessárias para a remoção do peróxido de hidrogênio. Além disso, glutationa, o maior composto sulfidrílico antioxidante em células de mamíferos, está presente em baixas concentrações nos tripanossomatídeos. No seu lugar, têm um composto sui generis, um conjugado de glutationa e de espermidina, conhecido como tripanotiona (N1, N8-bis(glutationil)espermidina), o qual junto com a tripanotiona redutase e o sistema peroxidase tripanotiona-dependente, parece estar envolvido no mecanismo de defesa antioxidante em Crithidia fasciculata. Este sistema parece existir em outros tripanossomatídeos, representando um importante alvo quimioterápico. A existência deste sistema metabólico em T. cruzi foi demonstrada inicialmente por uma baixa atividade peroxidásica tripanotiona-dependente, detectada em extratos celulares de formas epimastigotas e tripomastigotas. Imunoquimicamente, a existência deste sistema foi evidenciada ao se usar anticorpos heterólogos contra triparredoxina (Cf16) e triparredoxina peroxidase (Cf21) de C. fasciculata. Enquanto a reatividade em epimastigotas de T. cruzi é homogeneamente distribuída no citoplasma, as formas tripomastigotas apresentam uma reatividade descontínua localizada próxima à membrana plasmática. Os mesmos anticorpos policlonais foram utilizados para identificar por Western blot, as proteínas correspondentes em T. cruzi, sendo reconhecidas duas proteínas com massas moleculares aparente de 16 e 21 kDa, Tc16 e Tc21, respectivamente. Oligonucleotídeos foram então sintetizados baseados em regiões conservadas de seqüências codantes de DNA de peroxirredoxinas de tripanossomatídeos e de outros organismos e utilizados em ensaios de PCR com cDNA, amplificando-se um produto de 525 pb. Esta seqüência parcial apresentou uma homologia de 75% com o gene da triparredoxina peroxidase de C. fasciculata. No mesmo período foi depositada no GenBank (acc. n°. AJ012101) uma seqüência codante para uma proteína do tipo peroxirredoxina em T. cruzi e que apresentou uma homologia de 100% em relação à seqüência (correspondente às posições 1 a 525 de Acc. Nr. AJ012101). Utilizando a seqüência publicada, novos oligonucleotídeos correspondentes às regiões 5\' e 3\' foram desenhados, o gene putativo da triparredoxina peroxidase em T. cruzi (Tc21) foi amplificado a partir de DNA de T. cruzi por PCR, o produto clonado no vetor pET21b(+) e expresso em E.coli BL21(DE3). A proteína obtida apresentou atividade de tripanotiona peroxidase. Esta enzima, a triparredoxina peroxidase é membro de uma família de proteínas antioxidantes, denominadas de peroxirredoxinas, que são caracterizadas pela presença de dois domínios conservados - VCP, contendo as cisteínas envolvidas na catálise. Em relação à triparredoxina, apesar das várias tentativas empreendidas, o isolamento do respectivo gene foi infrutífero. No entanto, sua existência foi demonstrada por Western blot e imunofluorescência usando-se o anticorpo contra a triparredoxina de C. fasciculata. A triparredoxina de C. fasciculata é um membro da super-família das tiorredoxinas, com uma massa molecular de 16 kDa, maior que a tiorredoxina em vertebrados. Embora possuindo o motivo WCPPCR próximo à extremidade N-terminal, o qual é similar ao motivo WCGPCK(R), típico do sítio ativo das tiorredoxinas, a triparredoxina mostra uma baixa identidade em relação a estas últimas. A demonstração da existência de triparredoxina, triparredoxina peroxidase e tripanotiona redutase em T. cruzi sugere similaridade com o sistema de peroxidase descrito em C. fasciculata e que a defesa antioxidante em T. cruzi envolve um sistema enzimático mediado por tripanotiona e dependente de NADPH. As evidências disponíveis confirmam a existência do sistema peroxidase tripanotiona-dependente em T. cruzi, contrariando a afirmativa prévia da literatura que considerava a redução de peróxidos como uma reação não-enzimática. Esses resultados abrem a perspectiva de utilização do sistema como um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos. The American trypanosome Trypanosoma cruzi is exposed to a variety of toxic oxygen metabolites normally produced by endogenous processes as well as by responses to drugs or the action of the immune system. In either case, the cells need to be protected against the products of the partial reduction of oxygen. Trypanosomes are particularly weak in antioxidant defenses. Although possessing superoxide dismutase activity, they lack glutathione peroxidase and catalase which are necessary for the removal of hydrogen peroxide. Moreover, glutathione, the major antioxidant sulphydryl compound in mammalian cells, is present in low concentration in trypanosomes. Instead they contain a unique cofactor, a glutathione-spermidine conjugate, known as trypanothione (N1, N8-bis(glutathionyl)spermidine) which together with its ancillary enzymes, trypanothione reductase and trypanothione-dependent peroxidase system, appears to play a central role in the antioxidant defense mechanism in C. fasciculate. This system seems to be widespread among trypanosomatids, being an important target for a direct chemotherapeutic attack. The existence of this metabolic system in the human pathogen T. cruzi is supported by a low trypanothione-dependent peroxidase activity. It was found in crude extracts of epimastigote and trypomastigote forms using t-butyl hydroperoxide as oxidant. The existence of this metabolic pathway in T. cruzi is demonstrated by immunohistochemistry using antibodies raised against tryparedoxin (Cf16) and tryparedoxin peroxidase (Cf21) from C. fasciculate. Epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi display strong immunoreactivity by indirect immunofluorescence with these antibodies. White in epimastigotes immunofluorescence is homogeneously distributed in the cytoplasm, in trypamastigostes - the infective form for vertebrates - it appears in a discontinuous manner closer to the cytoplasmic side of the plasmic membrane. These polyclonal antibodies were employed to identify, by Western blot, the correspondening T. cruzi proteins. Two proteins with apparent molecular masses of 16 and 21 kDa, Tc16 and Tc21, were, respectively, recognized. In addition, oligonucleotides were synthesized using sequences based on the conserved regions of DNA coding sequence of peroxiredoxin from trypanosomatids and other organisms. Using these primers in PCR assays with cDNA, a product with 525 bp was amplified. This partial gene sequence shared identity with the homologous enzyme of C. fasciculate. The partial tryparedoxin peroxidase gene sequence of T. cruzi (Tc21) obtained up to this point (corresponding to positions 1 to 525) matched 100% with a published sequence presumed to encode a peroxiredoxintype protein in T. cruzi (acc. nr. AJ012101). Taking advantage of this full-length open reading frame, the putative Tc21 gene from T. cruzi was amplified from genomic DNA by PCR, cloned the PCR product into the vector pET21b(+) and expressed in E.colli BL21(DE3). Activity of tryparedoxin peroxidase was mesured by an heterologous coupled system monitoring the NADPH consumption upon hydroperoxide addition. This enzyme is a member of the peroxiredoxin family of antioxidant proteins and is characterized by the presence of two conserved domains - VCP - containing redox active cysteines. Although attempted, the isolation of the tryparedoxin gene was not successfull. Notwithstanding, the existence of the protein was apparent as seen by Western blot and immunofluorescence using the C. fasciculate heterologous antibody. Tryparedoxin is a new member of the thioredoxin superfamily of proteins isolated from C. fasciculate. With a molecular weight of 16 kDa, it is larger than thioredoxin from vertebrates. Moreover, apart from the sequence motif WCPPC near its N-terminus, which is similar to the thioredoxin-type active site motif WCGPCK(R), tryparedoxin display low similarity to the classical thioredoxin. The active motif WCPPCR is common to all known tryparedoxins. The demonstration of the existence of tryparedoxin, tryparedoxin peroxidase and trypanothione reductase in T. cruzi suggests that the antioxidant defense of this pathogenic protozoan also depends on the NADPH-fuelled, trypanothione-mediated enzymatic hydroperoxide metabolism, similarly to the C. fasciculate metabolic pathway. As oppsed to previous claims, the available evidence confirms the existence of trypanothione peroxidase activity in T. cruzi, making the enzymes system as molecular targets for the design of trypanocidal compounds.

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.

Lipossomos de cloreto de dioctadecildimetilamonio (DODAC) com 0,51µ de diâmetro externo médio e transição de fase ocorrendo em uma faixa estreita de temperaturas (0,5-1,0°C) foram obtidos por vaporização de clorofórmio e comparados com vesículas sonicadas de DODAC (cerca de 250 Å de diâmetro externo). Sacarose foi impermeante através de lipossomos grandes de DODAC ou de vesículas sonicadas de DODAC podendo ser utilizada para determinações de volume interno em ambas as preparações. Volume interno aparente para lipossomos grandes de DODAC foi 9,7 ± 1,3 1/mol e para vesículas sonicadas de DODAC, 0,33 ± 0,20 1/mol (adsorção de sacarose à bicamada de, respectivamente, 0,64 ± 0,30 e 0,20 ± 0,08 1/mol). Lipossomos grandes de DODAC comportaram-se como osmômetros em relação à sacarose e ao KCl (0-50mM KCl). Já as vesículas sonicadas de DODAC foram osmoticamente não-responsivas em relação à sacarose, floculando em presença de KCl. Essa não-responsividade osmótica foi interpretada como decorrente da presença única e exclusiva de água de hidrataçao no compartimento aquoso interno das vesículas sonicadas. Outras propriedades de lipossomos grandes de DODAC foram análogas às apresentadas por lipossomos de fosfolípides. Permeabilidades relativas (KCl como referência incorporado ao compartimento aquoso interno) do NaCl, HCl e sacarose foram similares às descritas para lipossomos de fosfatidilcolina; NaCl e sacarose sendo tão impermeantes quanto o KCl e HCl, sendo ligeiramente mais permeante que o KCl. Nas vizinhanças da temperatura de transição de fase, ocorreu um acentuado aumento da velocidade inicial de encolhimento e a extensão total de encolhimento chegou a um mínimo. A comparaçao de algumas propriedades físicas e funcionais de vesículas sonicadas e de lipossomos grandes de DODAC permitiu concluir que lipossomos grandes de DODAC constituem um modelo mais adequado para estudos de transporte. Adicionalmente, o método de vaporização de clorofórmio foi testado para o dihexadecilfosfato de Na+ (DCP) sendo obtidas dispersões homogêneas desse anfifílico capazes de incorporar um volume de 13 ± 4 1/mol e de responderem como osmômetros a gradientes osmóticos de sacarose, um soluto que praticamente nao é adsorvido à bicamada de DCP e que resultou impermeante através da mesma. Dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC) liposomes with 0.51µ mean external diameter and sharp phase transitions were obtained by chloroform vaporization and compared with (small) sonicated DODAC vesicles. Sucrose was impermeant through large DODAC liposomes and sonicated vesicles and was used for internal volume determinations. The apparent internal volumes for large DODAC liposomes and sonicated DODAC vesicles were, respectively, 9.7 ± 1.3 and 0.33 ± 0.20 1/mol. (External sucrose adsorption were, respectively, 0.64 ± 0.30 and 0.20 ± 0.08 l/mol). Ideal osmometer behaviour towards KCl over the 0-50mM concentrations range and towards sucrose were observed only for large DODAC liposomes. Sonicated DODAC vesicles were osmotically non responsive towards sucrose and floculate with KCl. Other properties of large DODAC liposomes closely resembled those of phospholipid liposomes. At temperatures near the phase transition temperature, a steep increase in the initial shrinkage rate and a minimum for the total extent of shrinkage occured. Relative permeabilities (KCl as reference entrapped inside) to NaCl, HCl and sucrose were similar to those of phosphatidyl choline liposomes. NaCl and sucrose were as impermeant as KCl, and HCl slighthly more permeant than KCl. Large DODAC liposomes are proposed as an adequate synthetic membrane model, in contrast to sonicated DODAC vesicles. In addition, the chlroform vaporization method was tested for sodium dihexadecylphosphate (DCP). Large DCP liposomes were demonstrated to be impermeant towards sucrose entrapping 13 ± 4 l/mol and behaving as an osmometer towards this solute.