1. Evaluation of angiogenic capacity of human adenocarcinoma cell line knockout for NF-kB1 protein
- Author
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Luiz Felipe Teixeira da Silva, Maria Helena Bellini Marumo, and Eliza Higuti Sousa
- Subjects
kidneys ,angiogenesis ,carcinomas ,neoplasms ,anoxia ,lymphokines ,protein engineering ,animal cells ,comparative evaluations - Abstract
O carcinoma de células renais (CCR) é o câncer epitelial renal adulto mais comum, sendo responsável por mais de 90% de todas as neoplasias renais. O subtipo mais frequente de CCR é o de células claras (CCRcc). A maioria dos pacientes com CCRcc possui mutação no gene supressor tumoral de Von Hippel-Lindau (VHL). O gene VHL codifica uma proteína, a VHL, que é capaz de regular negativamente uma série de proteínas intracelulares, dentre elas o fator induzível por hipóxia (HIF). Muitas moléculas têm sido apontadas como responsáveis pelo fenótipo agressivo desse tumor, uma delas é o fator de transcrição NF-kB, que é o nome coletivo para os fatores de transcrição da família Rel. Em mamíferos são conhecidos cinco membros desta família: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p105/p50) e o NF-kB2 (p100/p52). No CCR, o aumento da atividade do NF-kB correlacionava-se com o aumento de marcadores de angiogênese tais como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e Interleucina 6 (IL-6). Nos últimos anos vários grupos têm demonstrado o papel funcional do NF-kB1 na tumorigenicidade do CCR. Nesse projeto utilizamos a técnica CRISPR/Cas-9 para obtenção de uma linhagem celular de adenocarcinoma renal humano knockout para a proteína NF-kB1. Foi realizada a verificação do gene endógeno mais estável para condições de normóxia e hipóxia. Foi feita a quantificação dos níveis de VEGF e IL-6 em condição de normóxia e hipóxia. A técnica CRISPR/Cas9 foi eficaz para obtenção de células 786-0 nocaute para NF-kB1 (p105/p50). Dentre os oito genes endógenos analisados, o TRFC foi o mais estável e, consequentemente, o mais adequado para estudos com as células 786-0 em hipóxia. A supressão da expressão da p50 nos clones 786-0 sg1, 786-0 sg2 e 786-0 sg3 resultou na redução de VEGF e IL6 tanto em normóxia quando em hipóxia. A redução do diferencial hipóxia/normóxia demonstra uma alteração na responsividade celular à hipóxia no que diz respeito à Il-6. A redução dos níveis de IL-6, pode justificar a redução da MMP-9 e migração celular observados por nosso grupo. Renal cell carcinoma (RCC) is the most common adult renal epithelial cancer, accounting for more than 90% of all renal neoplasms. The most frequent subtype of RCC is clear cell (ccRCC). Most patients with ccRCC have a mutation in the Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene. The VHL gene encodes a protein, the VHL, which can down-regulate a series of intracellular proteins, including the hypoxia-inducible factor (HIF). Many molecules have been identified as responsible for the aggressive phenotype of this tumor, one of them is the transcription factor NF-kB, which is the collective name for the transcription factors of the Rel family. In mammals, five members of this family are known: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p105/p50) and NF-kB2 (p100/p52). In RCC, the increase in NF-kB activity was correlated with the increase in angiogenesis markers such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and Interleukin 6 (IL-6). In recent years, several groups have demonstrated the functional role of NF-kB1 in RCC tumorigenicity. In this project, we used the CRISPR/Cas-9 technique to obtain a human renal adenocarcinoma cell line knockout for the NF-kB1 protein. Verification of the most stable endogenous gene for conditions of normoxia and hypoxia was carried out. The quantification of VEGF and IL-6 levels was carried out under conditions of normoxia and hypoxia. The CRISPR/Cas9 technique was effective to obtain 786-0 knockout cells for NF-kB1 (p105/p50). Among the eight endogenous genes analyzed, TRFC was the most stable and, consequently, the most suitable for studies with 786-0 cells in hypoxia. Suppression of p50 expression in clones 786-0 sg1, 786-0 sg2 and 786-0 sg3 resulted in reduction of VEGF and IL6 in both normoxia and hypoxia. The reduction in the hypoxia/normoxia differential demonstrates a change in cellular responsiveness to hypoxia with respect to IL-6.
- Published
- 2021