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2. Purification and amino acid sequence of the insecticidal neurotoxin Tx4(6-1) from the venom of the 'armed' spider Phoneutria nigriventer (Keys)
- Author
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Suely G. Figueiredo, Carlos R. Diniz, Maria Elena De Lima Perez Garcia, Marta N. Cordeiro, Ana do Carmo Valentim, and Michael Richardson
- Subjects
chemistry.chemical_classification ,Insecticides ,Chromatography ,Edman degradation ,Toxin ,Diptera ,Molecular Sequence Data ,Neurotoxins ,Spider Venoms ,Peptide ,Venom ,Toxicology ,medicine.disease_cause ,Amino acid ,Mice ,chemistry ,Biochemistry ,medicine ,Neurotoxin ,Animals ,Amino Acid Sequence ,Phoneutria nigriventer ,Peptide sequence - Abstract
An insecticidal peptide referred to as Tx4(6-1) was purified from the venom of the spider Phoneutria nigriventer by a combination of gel filtration, reverse-phase fast liquid chromatography on Pep-RPC, reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) on Vydac C18 and ion-exchange HPLC on cationic columns. Tx4(6-1) is highly toxic to house flies. At levels of 0.5 ng/house fly it caused excitatory symptoms immediately after intrathoracical injection. However, in mice injections of 0.03 mg of the toxin intracerebroventricularly resulted in no apparent symptoms of intoxication. These results demonstrate that Tx4(6-1) of P. nigriventer has no toxicity for mice, and suggest that it is a specific anti-insect toxin. The mol. wt (5244.6) and purity of the toxin were determined by desorption mass spectroscopy. The complete amino acid sequence of this toxin was established by direct automated Edman degradation and manual 4-N,N′-dimethylaminoazobenzene-4′isothiocyanate/phenyl-isothiocyanate microsequence analyses of peptides obtained from digests with various proteases. The protein contains 48 amino acids including 10 Cys and 6 Lys. The N-terminal and C-terminal residues were Cys. The Tx4(6-1) sequence differs from that of previously characterized neurotoxins found in the same and other venom spiders, but exhibited sequence similarities in the location of the Cys residues.
- Published
- 1995
3. PEGuilação do peptídeo Lunatina-1 visando novo candidato à fármaco antimicrobiano
- Author
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Amanda Roberta Pereira da Silva, Carlota de Oliveira Rangel Yagui, Leandro Ramos Souza Barbosa, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Sabrina da Silva Sabo
- Abstract
As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) podem ser causadas por bactérias, vírus e fungos, sendo de extrema importância para o sistema de tratamento e pacientes. Com o alarmante avanço no surgimento de bactérias resistentes, tem havido uma preocupação crescente com as IRAS de origem bacteriana. Nesse sentido, várias pesquisas buscam alternativas para os fármacos antimicrobianos convencionais, sendo que os peptídeos antimicrobianos (AMPs), como a lunatina-1, aparecem como moléculas promissoras. No entanto, os AMPs geralmente apresentam rápida degradação proteolítica no trato gastrointestinal e meia-vida curta na corrente sanguínea, principais fatores limitantes para sua aplicação no tratamento de IRAS. Entre as estratégias empregadas para superar esses inconvenientes, a PEGuilação apresenta-se como alternativa eficaz que aumenta o tempo de circulação in vivo dos AMPs, resultando na melhora farmacocinética e, em alguns casos, também farmacodinâmica. A PEGuilação consiste na ligação covalente de cadeias de polietileno glicol (PEG) ao peptídeo, que pode ser efetuada por meio de uma reação aleatória ou sítio-específica. Neste trabalho, desenvolveu-se uma PEGuilação sítio-específica no N-terminal da lunatina-1 empregando-se mPEG-NHS de 2 kDa em tampão fosfato 100 mM, visando o aumento da solibilidade deste peptídeo, bem como para avaliar sua ação antimicrobiana. Com relação à reação de PEGuilação, avaliou-se a influência da razão molar PEG:peptídeo (10:1 ou 15:1) a pH 8,5. Foi obtido um rendimento de PEGuilação de 92%, através da análise por RP-HPLC quantitativo. Quanto à purificação da lunatina-1 PEGuilada, foi empregada a técnica semi-preparativa de RP-HPLC utilizando a coluna C18. A caracterização da lunatina-1 PEGuilada, incluindo determinação do grau de PEGuilação, foi realizada por MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker), mostrando que a molécula foi monoPEGuilada na região N-terminal. A atividade antimicrobiana de lunatina-1 livre e bioconjugada frente a diferentes cepas bacterianas, sendo duas Gram-negativas (ATCC 25922 de Escherichia coli e ATCC 9027 de Pseudomonas aeruginosa) e uma Gram-positiva (CECT 239 de Staphylococcus aureus), foi estudada por determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em microplaca, sendo que foram obtidos valores de CIM de 86 e 140 µM para o peptídeo liver e PEGuilado, respetivamente. O potencial hemolítico também foi estudado, sendo que a forma PEGuilada mostrou significativa redução da atividade hemolítica em comparação à forma livre. Em suma, a PEGuilação da lunatina-1, aumenta a sua solubilidade e reduz a atividade hemolítica. Porém, para viabilizar esta estratégia a PEGuilação deve ser reversível, pois a conjugação ao polímero reduz atividade antimicrobiana. Health care-related infections (HAIs) caused by bacteria, viruses and fungi are extremely important for patients and health systems. With the alarming advance in the emergence of resistant bacteria, a growing concern with HAIs of bacterial origin is observed. In this sense, several studies investigate alternatives to conventional antimicrobial drugs and antimicrobial peptides (AMPs), such as lunatin-1, appear as promising molecules. However, AMPs generally show rapid proteolytic degradation in the gastrointestinal tract and short half-life in the bloodstream, the main limiting factors for their therapeutic application to treat HAIs. Among the strategies used to overcome these drawbacks, PEGylation presents itself as an effective alternative that increases the in vivo circulation time of AMPs, resulting in improved pharmacokinetics and, in some cases, also pharmacodynamics. PEGylation consists on the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) chains to the peptide, which can be carried out by means of a random or site-specific reaction. In this work, a site-specific PEGylation was developed at the N-terminus of lunatin-1 using 2 kDa mPEG-NHS to increase the solubility of this peptide, as well as to evaluate its antimicrobial activity. Regarding the PEGylation reaction, the influence of the molar ratio PEG: peptide (10: 1 or 15: 1) at pH 8.5 was evaluated and a PEGylation yield of 92% was obtained, based on quantitative RP-HPLC analysis. As for the purification of PEGylated lunatin-1, semi-preparative RP-HPLC was used. The characterization of PEGylated lunatin-1, including determination of the degree of PEGylation, was performed by MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker), showing that the peptide was monoPEGylated in the N-terminal region. The antimicrobial activity of free and bioconjugated lunatin-1 against different bacterial strains, two Gram-negative (ATCC 25922 from Escherichia coli and ATCC 9027 from Pseudomonas aeruginosa), and one Gram positive (CECT 239 from Staphylococcus aureus), was studied by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) in a microplate, resulting in MIC values of 86 and 140 µM for the free and PEGylated peptide, respectively. The hemolytic potential was also studied and the PEGylated form showed a significant reduction in hemolytic activity compared to the free form. In short, the PEGylation of lunatin-1 increases its solubility and reduces hemolytic activity. However, to make this strategy feasible, PEGylation must be reversible, since the conjugation to the polymer reduces antimicrobial activity.
- Published
- 2021
4. Sequência de ensino investigativa sobre resistência bacteriana: aplicação em um ambiente virtual de aprendizagem
- Author
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Hortência Rodrigues de Castro, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Bruna Luiza Emerich Magalhães, Andréa Mara Macedo, and Karla Simone da Silva Fernandes
- Subjects
Ensino por investigação ,Antibacterianos ,Ensino - Biologia ,Ensino à distância ,Uso consciente dos antibióticos ,Farmacorresistência bacteriana ,Resistência bacteriana a antibióticos ,Ambiente virtual de aprendizagem ,Aprendizagem baseada em problemas - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A resistência antimicrobiana é um dos grandes problemas mundiais de saúde pública onde se faz necessário um trabalho de conscientização do uso adequado dos antibióticos. Neste contexto, é pertinente a abordagem deste tema no ambiente escolar, sendo a escola o local de aproximação dos estudantes com o conhecimento científico e de formação de indivíduos responsáveis por suas ações. Essa temática foi abordada com os estudantes do 3º ano do Ensino Médio de uma escola pública de Minas Gerais por meio de uma sequência de ensino que utiliza a abordagem investigativa. O trabalho teve como objetivo avaliar se o uso do ensino por investigação possibilita que os alunos explorem a temática e se esse contribui para a construção do conhecimento científico sobre o tema. As aulas estão suspensas em todas as escolas de Minas Gerais, devido à pandemia da COVID-19. Portanto, a sequência de ensino deste trabalho foi aplicada em um ambiente virtual de aprendizagem, por meio da ferramenta Google Sala de Aula. Durante a aplicação da sequência foi possível observar que o acesso a internet é um fator limitador para a participação dos estudantes nas atividades desenvolvidas no ambiente virtual. Em contrapartida, os resultados obtidos demonstram que é possível desenvolver uma sequência de ensino investigativa, como por exemplo, sobre resistência bacteriana, nesse ambiente. Sendo assim, é fundamental o papel do professor em criar atividades com a abordagem investigativa, a fim de que permita a construção crítica do conhecimento pelo estudante. Antimicrobial resistance is one of the major global public health problems where awareness work on the appropriate use of antibiotics is necessary. In this context, it is pertinent to approach this theme in the school environment, with the school being the place where students get closer to scientific knowledge and to the training of individuals responsible for their actions. This theme was approached with the students of the 3rd year of high school in a public school in Minas Gerais through a teaching sequence that uses the investigative approach. This work aimed to assess whether the use of teaching by investigation allows students to explore the theme and whether it contributes to the construction of scientific knowledge on the subject. Classes are suspended in all schools in Minas Gerais, due to the COVID-19 pandemic. Therefore, the teaching sequence was applied in a virtual learning environment, using the Google Classroom tool. During the application of the sequence, it was possible to observe that internet access is a limiting factor for the participation of students in activities developed in the virtual environment. On the other hand, the results obtained demonstrate that it is possible to develop an investigative teaching sequence, as for example, on bacterial resistance, in this environment. Therefore, the role of the teacher in creating activities with an investigative approach is essential, in order to allow the critical construction of knowledge by the student.
- Published
- 2020
5. Identificação e caracterização de proteína β-amiloide em camundongos bitransgênicos para Alzheimer através de espectroscopia Raman: primeiro passo para o estabelecimento de uma plataforma de espectroscopia intraocular para fins de diagnóstico precoce
- Author
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Emerson Alberto da Fonseca, Ado Jorio de Vasconcelos, Carlos Lenz Cesar, Alline Cristina de Campos, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Paulo Caramelli, and Carlos Alberto Tagliati
- Subjects
Inovações tecnológicas ,Cérebro - Doenças - Diagnóstico ,Raman spectroscopy (RS) ,Diagnóstico ,Retina ,Microscopia eletrônica de varredura ,Neurônios ,Raman, Espectroscopia de ,Alzheimer, Doença de ,Alzheimer's disease (AD) ,Alzheimer ,Retina - Doenças ,Espectroscopia Raman ,Demência - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos, Financiadora de Estudos e Projetos Nas últimas décadas, houve um aumento significativo da expectativa de vida da população mundial. Esse incremento em anos de vida trouxe uma maior incidência de doenças relacionadas ao envelhecimento, dentre elas, as doenças neurodegenerativas idade-dependente, com um aumento significativo dos pacientes com demência. A Doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência. Estima-se que represente de 60 á 80% dos casos de demência. No ano de 2019, pelo menos 50 milhões de pessoas viviam com algum tipo de demência em todo o mundo. Este número deverá aumentar para mais de 152 milhões até 2050. Com uma sobrevida de 6 à 8 anos após o diagnóstico clínico, a DA já ocupa o quinto lugar em maior número de mortes no mundo, entre pessoas acima dos 65 anos. A principal alteração histopatológica da doença é a deposição do peptídeo β-amiloide (βA), seguida dos emaranhados neurofibrilares, que se relacionam com a morte neuronal, levando ao défict cognitivo que caracteriza a doença. O βA se acumula em extensas placas (placas amiloides) extracelulares e a identificação dessas placas amiloides é usada para confirmação do diagnóstico, que se dá post mortem. Como é uma doença com origem no Sistema Nervoso Central (SNC), a DA apresenta alterações bioquímicas e histopatológicas na retina, um tecido composto principalmente por neurônios que, além de fazerem parte do SNC, conectam-se diretamente ao cérebro através do nervo óptico. Estudos mostram que a deposição de βA na retina antecede à deposição no cérebro, e em humanos, acredita-se que esse evento pode acontecer 15 a 20 anos antes das placas se acumularem no cérebro do paciente. Nesse sentido, um diagnóstico intraocular que detecte placas amiloides na retina, usando apenas uma fonte de luz, seria capaz de prover um diagnóstico precoce da DA de forma rápida e segura. Por isso, nós propomos o uso da espectroscopia Raman (ER) como uma alternativa para o diagnóstico precoce da DA. Essa técnica usa um laser como sonda para identificar uma determinada molécula de interesse, com alta especificidade, sem necessidade de corante ou contraste. Para tanto, desenvolvemos um trabalho de caracterização de placas amiloides, via espectroscopia Intraocular, para fins de diagnóstico precoce. Essa caracterização usando ER incluiu estudo de placas amiloides produzidas sinteticamente e previamente caracterizada com microscopia (eletrônica e de varredura), e naturalmente em cérebros de camundongos transgênicos específicos para a DA. Nossos resultados mostram que a placa amiloide tem, não um, mas um complexo de multi-frequências no espectro Raman que servem como marcadores molecular para fins de diagnóstico (fenilalanina, amida III, amida I, estiramento de CH2 e estiramento de CH 3 de proteína e lipídio). Também demonstramos que a ER é capaz de diferenciar a doença conforme seu estágio. Neste sentido, fomos capazes de identificar uma clara tendência que diferencia animais de 6 e 12 meses segundo as alterações bioquímicas do tecido cerebral nos camundongos bitransgênicos. Além disso, demonstramos que a ER é capaz de identificar, não só placas amiloides, mas também a neurodegeneração e neuroinflamação associadas à placa. Desenvolvemos caracterização baseadas em espectroscopia Raman espontânea e também estimulada, esta segunda intensa o suficiente para propiciar um imageamento completo da retina em segundos ou frações de segundos, um aspecto técnico importante para a implementação da técnica como método diagnóstico. Concluímos, portanto, a caracterização e identificação de placa amiloide em tecido cerebral. A próximo fase desse projeto será aplicar esse conhecimento adquirido na identificação de placas amiloides em retinas de animais transgênicos e humanos. In the last decades, there has been a significant increase in the life expectancy of the world population. This increase in years of life brought a greater incidence of diseases related to aging, among them, as age-dependent neurodegenerative diseases, with a significant increase in patients with dementia. Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia. It is estimated that it represents 60 to 80% of dementia cases. In 2019, at least 50 million people were living with some form of dementia worldwide. This number is expected to increase to more than 152 million by 2050. With a survival rate of 6 to 8 years after clinical diagnosis, AD is already the fifth leading cause of death in the world among people over 65 years of age. The main histopathological alteration of the disease is the deposition of the amyloid β (Aβ) peptide followed by the tangled neurofibrillary, which is related to neuronal death, leading to the cognitive deficit characteristic of the disease. The Aβ peptide accumulates in extensive extracellular plaques (amyloid plaques) and the identification of these amyloid plaques is used to confirm the diagnosis, which occurs post mortem. As a disease originating in the Central Nervous System (CNS), the AD exhibis the biochemical and histopathological changes also in the retina, a tissue composed mainly of neurons, which are part of the CNS and connect directly to the brain through the optic nerve. Studies show that the deposition of βA in the retina leads to deposition in the brain, and in humans, it is believed that this event can happen 15 to 20 years before plaques accumulate in the patient's brain. In this sense, an intraocular diagnosis that detects amyloid plaques in the retina, using only a light source, would be able to prove an early diagnosis in a fast and safe way. For this reason, we propose the use of Raman spectroscopy (RS) as an alternative for the early diagnosis of AD. This technique uses a laser as probe to identify a particular molecule of interest, with high specificity, without the need for dye or contrast. For this purpose, we developed a work to characterize amyloid plaques aiming at an early diagnosis protocol via Intraocular Spectroscopy. This characterization using RS included the study of synthetic amyloid plaques previously characterized with microscopy (electronic and scanning probe), and of naturally appearing plaques in the brains of transgenic mice specific for AD. Our results show that the amyloid plaque has, not one, but a complex multifeatured spectrum that serves as a molecular marker for diagnostic purposes (phenylalanine, amide III, amide I, CH2 stretch, and CH3 stretch of protein and lipid). We also demonstrated that an RS is able to differentiate its disease evolution stage. We were able to identify a clear trend that differentiates animals between 6 and 12 months according to biochemical changes in brain tissue in bitransgenic mice. In addition, we demonstrate that RS is able to identify, not only amyloid plaques, but also the eurodegeneration associated with plaque. We developed such characterization based on spontaneous and also stimulated Raman spectroscopy, this second intense enough to provide a complete imaging of the retina in seconds or fractions of seconds, an important technical aspect for the implementation of the technique as a diagnostic method. We conclude, therefore, the characterization and identification of the amyloid plaque in a brain tissue. The next phase of this project will be to apply this knowledge acquired in the identification of amyloid plaques in retinas of animal models and humans.
- Published
- 2020
6. Avaliação das atividades antimicrobiana e citotóxica de peptídeos derivados do veneno do anuro Pithecopus megacephalus e da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha
- Author
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Joaquim Teixeira de Avelar Júnior, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Elaine Maria de Souza Fagundes, Raquel Gouvêa dos Santos, Mariana de Souza Castro, Renata Toscano Simões, Miriam Teresa Paz Lopes, and Glória Regina Franco
- Subjects
Anuros ,Venenos ,Peptídeos ,Aranhas ,Venenos de aranha - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Peptídeos bioativos são uma grande classe de biomoléculas com diversos potenciais farmacológicos, destacando-se os peptídeos antimicrobianos que agem sobre diferentes organismos tais como bactérias, fungos, protozoários e vírus. Muitos desses peptídeos apresentaram também atividade antitumoral. Nesta tese, focamos na secreção de Pithecopus megacephalus, bem como no peptídeo LyeTx I-Des-His, uma variação sintética de LyeTx I, um peptídeo purificado da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha, com o objetivo de encontrar peptídeos ativos principalmente contra células de câncer, especificamente do tipo triplo negativo. O fracionamento da secreção de P. megacephala, apresentou rica variedade de peptídeos e 14 destes foram sequenciados. Desse grupo três peptídeos foram sintetizados e testados contra bactérias, fungos e três linhagens de células de câncer (MDA-MB-231, MCF-7, ambas de câncer de mama e HCT-116 de câncer colorretal) e uma linhagem não câncer (HEK-293), como controle. Os resultados sugeriram aumento da atividade proliferativa de dois peptídeos. sobre células de câncer, sem aparente atividade em células HEK-293. Numa segunda parte deste trabalho, propusemos testar LyeTx I-Des-His combinado com cisplatina, em três diferentes proporções molares. A proporção peptídeo:cisplatina (P:C) 1:1, na dose do IC50, apresentou efeito sinérgico, bem como um valor de índice de seletividade maior que o da cisplatina isolada. Quando investigados os possíveis mecanismos de morte envolvidos, observamos diversos indícios de morte celular por autofagia. Este mecanismo de morte foi suportado pelos seguintes resultados: células tratadas com as combinações P:C pararam na fase G2/M do ciclo celular, células foram marcadas em vermelho com o corante pH sensível laranja de acridina e quando pré tratadas com inibidor de autofagia (Bafilomicina A1) esta correlação foi revertida. Além do mais, experimentos de western blot indicaram uma possível redução da expressão de P21 e da fosforilação de AKT. A redução da fosforilação de AKT pode ser indício de autofagia, como já descrito. Entretanto, outros estudos são necessários para melhor elucidar as vias envolvidas nas atividades desse peptídeo. Além do mais, estudos de toxicidade são essenciais na possível validação de LyeTx I-Des-His como um candidato a droga terapêutica. Esses achados demonstraram que o peptídeo LyeTx I-Des-His parece um bom candidato para ser combinado com alguns fármacos já bem estabelecidos, melhorando o combate a células de câncer, por induzir outras cascatas de morte. Bioactive peptides are a vast class of molecules with diverse biopharmaceutical potentials, including antimicrobial activity over a broad organism classes such as bacteria, fungi, protozoa and viruses. Several of these peptides have also shown antitumoral activity. In this thesis we focused on Pithecopus megacephalus frog secretion, as well as the peptide LyeTx I-Des-His, a synthetic variation of LyeTx I, a peptide purified from the venom of the spider Lycosa erythrognatha, with the objective to find bioactive peptides mainly against cancer cells, more specifically of the triple negative type. The fractionation of the P. megacephala secretion showed a rich variability on peptides and 14 of them were sequenced. From this set, three peptides were synthesized and tested against bacteria, fungi and three cancer cell lines (MDA-MB-231, MCF-7, both from breast cancer and HCT-116 from colorectal cancer) and one non-cancer cell line (HEK- 293), as a control. The results suggested an increase on proliferative activity of two peptides over cancer cells, without apparent activity on HEK-293 cells. In a second part of this work, we proposed to test LyeTx I-Des-His combined with cisplatin, in three different molar proportions. The proportion peptide:cisplatin, (P:C) 1:1, in the IC50 dose, showed synergistic effect as well as a selectivity index value, greater than cisplatin isolated treatment. When investigating the possible cell death mechanisms involved, we observed several indications of autophagic cell death process. This mechanism was supported by the following results: cells treated with P:C combinations arrested in G2/M cell cycle phase, cells were marked in red with the pH sensitive dye acridine orange and when pretreated with an autophagy inhibitor (Bafilomycin A1) this coloration was reversed. In addition, western blot experiments indicated a possible reduction of P21 expression and of AKT phosphorylation. The decreasing of AKT phosphorylation could be indicative of autophagy, as already described. However, other studies are necessary to better clarify the involved pathways on these activities of the drugs. In addition, toxicity studies are essential in a possible validation of LyeTx I-DesHis as a therapeutic drug candidate These findings demonstrated that the peptide LyeTx I-Des-His seems a good candidate to be combined with some well-established drugs, improving the combat to cancer cells, by inducing other death cascades.
- Published
- 2019
7. Avaliação do efeito cardiovascular e antihipertensivo de peptídeos sintéticos similares às hipotensinas
- Author
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Érika Angela Oliveira, Thiago Verano Braga, Danielle Carvalho de Oliveira Coutinho, and Maria Elena de Lima Perez Garcia
- Subjects
Anti-Hipertensivos ,Bradicinina ,Hipertensão - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A Hipertensão arterial é um problema de saúde pública, e mesmo após a descoberta de várias classes de medicamentos, ainda existem pacientes que não respondem de forma eficiente aos tratamentos. Uma nova classe a ser estudada são os Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (PPB’s) não canônicos, o diferencial destes peptídeos, comparando com os PPB’s clássicos ou canônicos, é o mecanismo de ação, sendo que os PPB’s clássicos agem via inibição da enzima conversora de angiotensina, e os PPB’s não clássicos agem como agonistas dos receptores B2, potencializando os efeitos fisiológicos da bradicinina (BK), um peptídeo endógeno responsável, dentre outros efeitos, pela regulação da pressão arterial. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito cardiovascular de um peptídeo sintético similar ao peptídeo KPP, com a sua porção N-terminal acetilada e C-terminal amidada (H3CO-Lys-Pro-Pro-NH2 ou acKPPam), um Peptídeo Potenciador de Bradicinina (PPB) não clássico. Através de testes de reatividade vascular ex vivo foram verificados que o peptídeo é capaz de uma ação vasodilatadora, utilizando a cascata de síntese do óxido nítrico e endotélio dependente. Outro teste utilizado foi o de atividade anti-hipertensiva in vivo, onde foi possível verificar que o peptídeo acKPPam possui uma atividade anti-hipertensiva. Desta forma, o peptídeo acKPPam apresenta um potencial para, futuramente, servir como modelo para o desenvolvimento de uma nova classe de medicamentos anti-hipertensivos. Hypertension is a public health problem, and even after discovering various antihypertensive drugs, there are still patients that do not respond effectively to current treatments. A new class to be studied is the non-canonical Bradykinin Potentiating Peptides (BPPs). Unlike the canonical BPPs that are inhibitors of the angiotensin-converting enzyme (ACEi), the non-canonical BPPs act as B2 receptor agonists, enhancing the physiological effects of bradykinin (BK), an endogenous peptide responsible, among other effects, for regulating blood pressure. The aim of this study was to evaluate the cardiovascular effects of a synthetic peptide similar to the KPP peptide, a non-canonical BPP, with its Nterminal acetylated and C-terminal amidated (H3CO-Lys-Pro-Pro-NH2 or acKPPam). Using ex vivo vascular reactivity assays, it was verified that the peptide induces vasodilating in nitric oxide- and endothelium-dependent manner. In vivo antihypertensive assay was also done, where it was possible to verify that the acKPPam peptide has antihypertensive activity. Thus, the acKPPam peptide has the potential to serve as a model for future development of a new class of antihypertensive drugs.
- Published
- 2019
8. Where spiders and cone snails meet: development of novel sodium channel probes
- Author
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Steve Odette F. Peigneur, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Jan Tytgat, Lucas Bleicher, Paulo Sergio Lacerda Beirao, Russolina Benedeta Zingali, and Wamberto Antonio Varanda
- Subjects
Bioquímica ,Neurotoxinas ,Bioquímica e Imunologia - Abstract
Voltage-gated sodium (NaV) channels play crucial roles in a range of (patho)physiological processes. Much interest has arisen within the pharmaceutical industry to pursue these channels as analgesic targets following the overwhelming evidence that NaV channel subtypes NaV1.7- NaV1.9 are involved in nociception (Ahern et al., 2016; Luiz and Wood, 2016). More recently, also NaV1.1, NaV1.3 and NaV1.6 have been identified to be involved in pain pathways. Venom-derived disulphide-rich peptide toxins (1580 amino acids), isolated from spiders and cone snails, have been used extensively as probes to investigate these channels and have attracted much interest as drug leads for pharmaceutical development (Schroeder et al., 2012; Saez et al., 2010). However, few peptide drug leads have made it as drugs due to unfavourable physiochemical attributes including poor in vivo pharmacokinetics, rapid proteolytic cleavage and limited oral bioavailability. This project aims to bridge the gap in the development pipeline between drug leads and drugs candidates by downsizing these larger venom-derived NaV inhibitors into smaller, drug-like molecules. As a first step, we searched the venom of the spider Phoneutria nigriventer for promising NaV channel ligands. A first toxin sparking our interest was the toxin PnTx2-1. Based on the in vivo tests in mice and the sequence identity with PnTx2-5 and PnTx2-6, this peptide is classified as a NaV channel toxin. However, it has never been tested on any NaV channel isoform. Therefore, in this study the NaV channel subtype selectivity and species specificity of PnTx2-1 are investigated. We performed an in-depth functional characterization of the NaV channel modulating properties of PnTx2-1. Furthermore, analysis of the activity of PnTx2-1 on NaV1.5 reveals that this Phoneutria toxin modulates the cardiac NaV channel in a bifunctional manner, resulting in an alteration of the inactivation process and a reduction of the sodium peak current. The obtained results allowed to conclude that PnTx2-1 is an interesting insecticidal peptide but 5 it does not represent a promising lead compound for the development of novel NaV channel ligands with therapeutic potential. Another toxin potentially interesting as a NaV channel modulating ligand is the toxin PnTx1. PnTx1 was found to be the most interesting NaV channel toxin, considering its action in NaVs related to pain (Silva et al., 2012a). Following identification of common sequence motifs from NaV inhibitors PnTx1 (Diniz et al., 2006a) (78 residues, 14 cysteine) and -conotoxin KIIIA (Bulaj et al., 2005) (16 residue, 6 cysteine) from cone snail Conus kinoshitai, we have produced the smallest cyclic peptide-based NaV channel inhibitor known to date (10 residues, 2 cysteines) with demonstrated subtype selectivity across NaV channel subtypes including NaV1.7 and NaV1.9 (Luiz and Wood, 2016). The methodology used in this project, involved a two-pronged approach that incorporates sophisticated peptide engineering carrying out several rounds of small cyclic peptide design to aid in the determination of what drives subtype selectivity and molecular interactions of these downsized inhibitors across NaV subtypes. This allowed us to design small, stable and novel NaV probes with high subtype selectivity and potency coupled with improved biopharmaceutical properties, rendering these peptides suitable as analgesic drug candidates.
- Published
- 2019
9. Avaliação do peptídeo sintético LyeTx I-b derivado do veneno de aranha como um potencial protótipo antitumoral: estudos toxicológicos e farmacológicos
- Author
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Mostafa Abdellatif Abdelsalam Abdelrheem, Elaine Maria de Souza Fagundes, Juliana Carvalho Tavares, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Enio Ferreira, and Antônio Carlos Pinheiro de Oliveira
- Subjects
Glioblastoma multiform ,Breast cancer ,LyeTx I-b peptide ,Peptídeos ,Imunomodulação ,Neoplasias da mama ,Glioblastoma ,Necroptose ,Necroptosis and Immunomodulation - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Antimicrobial peptides present a broad spectrum of therapeutic applications, including their use as anticancer peptides. These peptides have as a target microbial, normal and cancerous cells. In this work we demonstrate for the first time the cytotoxic effects of the cationic alpha-helical antimicrobial peptide LyeTx I-b on glioblastoma lineage U87-MG. The anticancer property of this peptide was associated with a membranolytic mechanism in U87- MG. Loss of membrane integrity occurred after incubation with the peptide for 15 minutes, as shown by trypan blue uptake, reduction of calcein-AM conversion and LDH release. Morphological studies using scanning electron microscopy demonstrated disruption of the plasma membrane from cells treated with LyeTx I-b, including the formation of holes or pores. Transmission electron microscopy analyses showed swollen nuclei with mild DNA condensation, cell volume increase with an electron-lucent cytoplasm and organelle vacuolization, but without the rupture of nuclear or plasmatic membranes. Morphometric analyses revealed a high percentage of cells in necroptosis stage, followed by necrosis and apoptosis at lower levels. Necrostatin-1, a known inhibitor of necroptosis, partially protected the cells from the toxicity of the peptide in a concentration-dependent manner. Imaging flow cytometry confirmed that, 59% of the cells underwent necroptosis after 3-hour incubation with the peptide. In addition, LyeTx I-b showed cytotoxicity for non-tumor cell lines derived from kidney epithelial cells (Vero), Lung fibroblast (GM637), brain (Luhmes), PBMC and hemolytic activity in human erythrocytes. Additionally, other in vitro data also demonstrated cytotoxicity of this cationic peptide against human and mouse breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 and 4T1, respectively), at low micro molar concentration (
- Published
- 2018
10. Avaliação da potência neutralizante de antivenenos loxoscélicos através do uso de proteínas recombinantes do veneno de Loxosceles sp e avaliação do potencial imunoprotetor de uma proteína quimérica multiepitópica
- Author
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Natália Alves Souza Carvalhais, Liza Figueiredo Felicori Vilela, Camila Dias Lopes, Carlos Delfin Chavez Olortegui, Tatiani Uceli Maioli, and Maria Elena de Lima Perez Garcia
- Subjects
Potência neutralizante ,Venenos de Aranha ,Bioquímica e imunologia ,Loxoscelismo ,Antivenenos ,Proteínas Recombinantes - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Acidentes com animais peçonhentos são um problema de saúde de pública no Brasil, sendo a aranha-marrom a segunda maior causadora de tais acidentes. O envenenamento acidental causado pela picada da aranha marrom gera efeitos dermonecróticos que podem ser seguidos de manifestações sistêmicas. Ainda que estas manifestações sistêmicas ocorram em uma parcela pequena dos casos, esta pode ser fatal. A produção de antivenenos para o tratamento de tais acidentes é dependente de uma variedade de experimentos animais, desde a extração do veneno das aranhas, à produção do antiveneno em cavalos, e até à avaliação in vivo do potencial neutralizante destes antivenenos, que é feita em coelhos. O presente trabalho apresenta tentativas de minimizar e otimizar experimentos com animais na produção de antivenenos com duas abordagens. A primeira se baseia na construção e produção de uma proteína quimérica, a Lil, contendo epitopos imunodominantes, previamente mapeados, da principal proteína do veneno de Loxosceles, a Esfingomielinase D. A proteína quimérica Lil contém epitopos encontrados nas Esfingomielinases D das três principais espécies brasileiras. Esta proteína se mostrou capaz de produzir anticorpos com o potencial de neutralizar parcialmente os efeitos tóxicos do veneno de Loxosceles intermedia, em um modelo animal. Por esta razão, de modo a reduzir o uso de aranhas e otimizar a vida útil dos cavalos produtores de antiveneno, a proteína Lil se mostrou um candidato promissor para uso em processos de imunização. A segunda abordagem foi a elaboração de um teste in vitro para a discriminação de soros com alto e baixo potencial neutralizante. A Smase I de Loxosceles laeta se mostrou capaz de discriminar a potência neutralizante dos soros de alta e baixa potência avaliados, em um teste de ELISA. Então, é sugerida a utilização deste teste como uma alternativa aos protocolos in vivo que utilizam coelhos. Accidents with venomous animmals represent a health issue in Brazil, and the brown spider’s accidents are pointed out as the second most frequent ones. The accidental envenomation by brown spiders (Loxosceles sp.) cause a strong local dermonecrotic effect which can be followed by systemic manifestations, and even though the systemic loxoscelism occurs in a small portion of the cases, it can be fatal. The production of antivenoms for the treatments of such accidents relies on a variety of animal experiments, from the spider venom extraction to the production of antivenom in horses and its in vivo neutralizing potency evaluation, which is performed in rabbits. In the present work, there is an attempt to reduce and optimize animal experiments with two different approaches. The first approach relies in the construction and production of a chimeric protein, named Lil, containing immunodominant epitopes that were previously mapped from the main protein of the Loxosceles venom, the Sphingomyelinase D. The Lil protein contains epitopes from Sphinomyelinases D of the three main species found in Brazil. The Lil protein was found capable of inducing antibodies with the potential to partialy neutralize the toxic effects of Loxosceles intermedia venom in an animal model. Therefore, in order to reduce spider usage and to provide a less harmfull life to the horses used for immunization we suggest the Lil protein as a potential candidate to replace the venom usage in the antivenom production protocols. The second approach was to elaborate an in vitro test for the distinction of high and low potency sera. The Loxosceles laeta Smase I was able to correctly diagnose the neutralizing potency of the evaluated sera, in an ELISA test. Thus, we suggest the use of such test as means to discriminate the neutralizing potency of the antiloxosceles sera as an alternative to the in vivo protocols relying on rabbits.
- Published
- 2018
11. Estudo da atividade antinociceptiva do peptídeo sintético PnPP-19
- Author
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Ana Cristina Nogueira Freitas, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Daniela da Fonseca Pacheco, Márcia Renata Mortari, Célio José de Castro Júnior, Janetti Nogueira de Francischi, and Fabiana Simão Machado
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PnTx2-6 ,Neprilisina ,Canabinoides ,PnPP-19 ,Antinocicepção ,Aranhas ,Analgésicos opioides ,Opioides ,Phoneutria nigriventer ,Óxido nítrico - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência A toxina PnTx2-6, isolada da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer, é muito tóxica (DL50 = 0,7 μg/camundongo) e tem sido estudada como uma molécula potenciadora da função erétil. Entretanto, esta toxina induz hiperalgesia local e sistêmica em baixas doses (3 μg/animal). O peptídeo PnPP-19 representa um epitopo descontínuo da estrutura primária da toxina PnTx2-6. Este peptídeo, assim como a toxina nativa, potencia a função erétil de ratos e camundongos. O presente estudo propôs a investigação do peptídeo PnPP-19 na modulação da via nociceptiva, uma vez que a toxina que lhe deu origem, PnTx2-6, induz hiperalgesia. Os resultados deste trabalho demonstram que o peptídeo PnPP-19 tem atividade antinociceptiva central e periférica, dose e tempo-dependentes. Esta antinocicepção deve-se à ativação concomitante dos receptores μ- e δ-opioides, e dos receptores canabinoides do tipo CB1. O efeito anti-hiperalgésico do peptídeo parece também envolver a liberação de endocanabinoides, uma vez que a administração de doses não-analgésicas de inibidores da recaptação de endocanabinoides e da degradação da anandamida pontencializaram o efeito antinociceptivo de uma baixa dose do peptídeo. O aumento dos níveis de opioides endógenos também parece estar correlacionado com o efeito antinociceptivo de PnPP-19, uma vez que este pode atuar como inibidor da enzima neprilisina. Esta enzima é responsável por hidrolisar vários peptídeos no espaço extracelular, dentre eles o opioide endógeno encefalina. Além disso, a administração do peptídeo ativa a isoforma neuronial e endotelial da óxido nítrico sintase, aumentando os níveis de óxido nítrico nos tecidos. Ainda, a antinocicepção desencadeada por PnPP-19 parece depender dos níveis de GMPc e da ativação dos canais para potássio sensíveis ao ATP. PnPP-19 pode também atuar como um agonista de receptores μ-opioides e modular o influxo de cálcio em neurônios DRG pela ativação destes receptores. A ativação dos receptores μ-opioides desencadeada por PnPP- 19 parece não induzir o recrutamento de β-arrestina2. Este trabalho demonstrou o papel do peptídeo sintético PnPP-19 na via nociceptiva, detalhando seu mecanismo de ação. Sugere-se que o PnPP-19 possa ser utilizado como uma possível ferramenta para o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos. The toxin PnTx2-6, isolated from the venom of the spider Phoneutria nigriventer, is very toxic (LD50 = 0.7 μg/mouse) and has been studied as a molecule that improves erectile function. Besides this effect, this toxin induces local and systemic hyperalgesia in low doses (3 μg/animal). The synthetic peptide PnPP-19 represents a discontinuous epitope of the primary structure of the spider toxin PnTx2-6. PnPP-19 improves erectile function of rats and mice. This effect is similar of what is observed for the native toxin PnTx2-6. The present study investigated the role of PnPP-19 in the nociceptive pathway, since the toxin, of which the peptide originates from, induces hyperalgesia. Our data demonstrate that PnPP-19 induces a dose and timedependent central and peripheral antinociception. This antinociception is mediated by activation of CB1 cannabinoid receptors and μ- and δ-opioid receptors. The antihyperalgesic effect of the peptide may also involve the release of endocannabinoids, since the administration of non-analgesic doses of inhibitors of endocannabinoid reuptake and anandamide degradation have potentialized the antinociceptive effect of a low dose of the peptide. Increased levels of endogenous opioids might also be correlated with the antinociceptive effect of PnPP-19. This peptide may act as an inhibitor of the enzyme neprilysin, which is responsible for hydrolyzing several peptides in the extracellular site, among them, the endogenous opioid enkephalin. In addition, PnPP-19 administration may activate the neuronal and endothelial isoform of nitric oxide synthase, which causes an increase of nitric oxide levels. Furthermore, the antinociception triggered by PnPP-19 seems to be depending on cGMP levels and on the activation of ATP sensitive potassium channels. PnPP-19 may also act as a μ-opioid receptor agonist and it might modulate the influx of calcium in DRG neurons by the activation of these receptors. Activation of μ-opioid receptors induced by PnPP-19 does not appear to stimulate β- arrestin recruitment. Our results have shown the role of the synthetic peptide PnPP-19 in the nociceptive pathway, demonstrating at least part of the mechanism of action by which the peptide induces antinociception. Taking into account all our data, we suggest that PnPP-19 might be a useful tool for the development of new drug cadidates for pain treatment.
- Published
- 2018
12. Cardiomiócitos humanos derivados de células tronco pluripotentes induzidas: aspectos morfológicos e funcionais
- Author
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Rebeca Peres Moreno Maia Joca, Jader dos Santos Cruz, Gordon F. Tomaselli, Brian O’Rourke, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Ludmila Pinto Rodrigues Camargo, and Danilo Roman Campos
- Subjects
Bioquímica ,Acoplamento excitação-contração ,Cardiomiócitos ,Células-Tronco Embrionárias Humanas ,Manejo de cálcio ,Miócitos Cardíacos ,Maturação ,Célulastronco humanas pluripotentes induzidas - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O advento das células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC ou iPSC's) causou uma grande expectativa no campo científico e clínico, pois são derivadas de células somáticas, crescem indefinidamente in vitro sem perder sua "pluripotenticidade" e tem enorme potencial de diferenciação, podendo produzir diversos tipos celulares tais como miócitos cardíacos. Apesar dos imensos esforços para desenvolver uma terapia baseada em células tronco, os cardiomiócitos derivados de iPSC's (iPSC’s-CM’s) possuem função basal ainda aquém de células adultas do tecido cardíaco. Nesse trabalho propomos que o protocolo de maturação que consiste da simples suplementação do meio de cultura com hormônio triiodotironina (T3), fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) e dexametasona, aqui chamado de TDI seja suficiente para o amadurecimento celular. O tratamento com TDI induziu um aumento na área celular, alongamento das células e melhor organização dos sarcômeros. Além disso, foi observado um aumento na expressão de mRNA para alguns marcadores de maturação como MYH7, FKBP5 e PPARα. Quando comparadas com células sem o tratamento, as células expostas ao TDI tinham um transiente de cálcio de maior amplitude e um decaimento mais rápido do mesmo, além de um potencial de ação mais prolongado. Foi observado que essas células também tinham maior carga de cálcio no reticulo sarcoplasmático. Isso pode estar associado ao aumento nos níveis de mRNA para a SERCA2A que foi observado nas iPSC’s-CM’s tratadas com o TDI. Essas células expostas ao TDI foram usadas para construção de microtecidos cardíaco, junto com células endoteliais e fibroblastos. Esses tecidos apresentaram maior força passiva e também maior força durante a contração desse tecido, corroborando com os dados obtidos da morfologia celular e manejo de cálcio. Em conclusão, o uso do TDI se provou um simples e robusto método de maturação de iPSC’s-CM’s e pode ser uma alternativa para obtenção de tecidos in vitro com maiores chances de integração funcional após sua enxertia em coração de pacientes. The advent of induced pluripotent human stem cells (hiPSC or iPSCs) has caused great expectations in the scientific and clinical field. Since they are derived from somatic cells, they can grow indefinitely in vitro without losing their pluripotency and have enormous potential of differentiation, being able to differentiate in many cell types such as cardiac myocytes. Despite the vast efforts to develop therapies based in stem cells, iPSC-derived cardiomyocytes (iPSCs-CMs) have impaired basal function compared with the adult cells in cardiac tissue. In this work, we propose a maturation protocol consisting of the simple supplementation of the culture medium with triiodothyronine (T3) hormone, insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) and dexamethasone, here called TDI, is sufficient for cell maturation. Treatment with TDI induced an increase in cell area, cell elongation and better sarcomere organization. In addition, was observed an increase in mRNA expression for some maturation markers such as MYH7, FKBP5 and PPARα. When compared to non-treated cells, the cells exposed to TDI had a calcium transient larger in amplitude and with faster decay kinetics, with prolonged action potential as well. Also, these cells had larger calcium content on the sarcoplasmic reticulum. This may be associated with the increase in mRNA levels for SERCA2A that was observed in iPSC's-CM's treated with TDI. Furthermore, TDI-treated cells were used to mount cardiac microtissues (CMT), along with endothelial cells and fibroblasts. These tissues had enhanced static force and increase in dynamic force during the contraction of this tissue, corroborating with the data obtained from their cellular morphology and calcium handling. In conclusion, use of TDI has proved a simple and robust method of maturation of iPSC's-CM's and may be an alternative to obtaining cardiac tissues in vitro with better chance to successful engraftment in patients' hearts.
- Published
- 2017
13. Síntese e estudo da atividade antinociceptiva de Pep13, peptídeo derivado de PnTx4(6-1), uma toxina da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer
- Author
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Bruna Luiza Emerich Magalhães, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Igor Dimitri Gama Duarte, Marie France Martin-Eauclaire, Mariana Torquato Quezado Magalhães, Daniele Cristina de Aguiar, Célio José de Castro Júnior, and Márcia Renata Mortari
- Subjects
PnTx4(6-1) ,Pep13 ,Antinocicepção ,Aranhas ,Phoneutria nigriventer ,Venenos de aranha - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A peçonha da aranha "armadeira" Phoneutria nigriventer possui diversos componentes biologicamente ativos, dentre eles a toxina PnTx4(6-1), um peptídeo composto por 48 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 5,2 kDa. PnTx4(6-1), também denominada δ-ctenitoxin-Pn1a, foi inicialmente descrita como uma neurotoxina inseticida que se liga ao sítio 3 de canais para sódio em sinaptossomas de corda nervosa de barata. Quando injetada por via intracerebroventricular em camundongos (30 μg), PnTx4(6-1) não provocou toxicidade aparente, além disso, esta toxina não apresentou efeito em canais para sódio de músculo esquelético (rSKM1) e de cérebro (rBIIA) de ratos. Posteriormente demonstramos que PnTx4(6-1) possui efeito antinociceptivo frente a três modelos de dor: i) inflamatório, evocado por carragenina; ii) nociceptivo, evocado por prostaglandina E2 e iii) neuropático, evocado por constrição do nervo ciático. Utilizando-se antagonistas verificamos que o sistema canabinoide, via receptor CB1, e o sistema opioide, via receptores μ e δ, estão envolvidos no efeito antinociceptivo evocado por PnTx4(6-1). No presente trabalho baseado na sequencia de aminoácidos de PnTx4(6-1), propusemos e sintetizamos um peptídeo linear, de 13 resíduos de aminoácidos denominado Pep13, na tentativa de reproduzir ou aumentar os efeitos antinociceptivos da toxina nativa. Verificamos que, assim como a toxina nativa, Pep13 apresenta ação antinociceptiva quando administrado por via intratecal e este efeito, também, relaciona-se aos sistemas canabinoide e opioide. Além disto, quando o efeito periférico foi avaliado, por administração intraplantar, Pep13 foi capaz de reverter o limiar hiperalgésico evocado por prostaglandina E2. Relacionada, ainda, ao efeito antinociceptivo periférico foi observada a participação do sistema opioide, uma vez que o antagonista não específico (naloxona) foi capaz de prevenir parcialmente o efeito de Pep13. Com relação ao sistema canabinoide, com a utilização de antagonistas específicos, observou-se a participação dos receptores CB1. Diferentemente da inseto-toxina nativa, Pep13 não causou nenhum efeito aparente quando administrado em moscas. Em conclusão, o peptídeo sintético Pep13, cuja sequência possui 35 resíduos de aminoácidos a menos que a toxina nativa PnTx4(6-1), reproduz os efeitos antinociceptivos apresentados pela mesma, sem entretanto, apresentar toxicidade para insetos e podendo assim, se tornar um bom modelo para novos analgésicos. The venom of the “armed” spider Phoneutria nigriventer has several biologically active peptides, one of them the toxin PnTx4(6-1) is a peptide composed of 48 amino acid residues and molecular mass of 5.2 kDa. PnTx4(6-1), also named δ-ctenitoxin-Pn1a, was initially described as a insecticidal neurotoxin, that binds to site 3 of sodium channels, in nerve cord synaptosomes of cockroach. When intracerebral injected in (30 μg) in mice, PnTx4(6-1) caused no apparent toxicity, moreover this toxin did not affect sodium channels of skeletal muscle (rSKM1) and brain (rBIIa), both of rats. Subsequently, we demonstrated that PnTx4(6-1) has antinociceptive effect in three pain models: i) inflammatory, evoked by carrageenan; ii) nociceptive, evoked by prostaglandin E2 and iii) neuropathic, evoked by constriction of the sciatic nerve. Using diverse receptors antagonists, we verified that the cannabinoid system, via the CB1 receptor, and the opioid system, through the μ and δ receptors, are both involved in the antinociceptive effect of PnTx4(6-1). In the present work, based on PnTx4(6-1) amino acid sequence we proposed and synthesized a linear peptide, with 13 amino acid residues named Pep13, based on the amino acid sequence of PnTx4(6-1) in order to try to reproduce or increase the analgesic effect of the toxin, with a simpler molecule. We verified, similarly to the toxin, the peptide has antinociceptive activity, when intrathecally administered, and this effect is also related to the cannabinoid and opioid systems. In addition, when the peripheral effect was evaluated, by intraplantar admistration, Pep13 was able to reverse the hyperalgesic threshold evoked by prostaglandin E2. Still related to the peripheral antinociceptive effect, the participation of the opioid system was observed, since the nonspecific antagonist (naloxone) was able to partially prevent the effect of Pep13. Regarding the cannabinoid system, by using specific antagonists, the participation of CB1 receptors was observed. Differently from the native toxin, which has a high toxicity to insects, the peptide caused no apparent effect when administered in flies. In conclusion, the synthetic peptide Pep13, which has 35 amino acid residues less than the native toxin PnTx4(6-1), reproduces the antinociceptive effects presented therein, without presenting however insect toxicity and may become a good model for new analgesics.
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- 2017
14. Efeito antimicrobiano do peptídeo LyeTx-I associado à B-ciclodextrina em biofilmes de bactérias patógenas periodontais: estudo in vitro
- Author
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Edison Andres Cruz Olivo, Maria Esperanza Cortes Segura, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Luís Otávio de Miranda Cota, Adolfo Contreras Rengifo, and Karina Imaculada Rosa Teixeira
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LyeTx I ,Peptídeos Catiônicos Antimicrobianos ,Infecções bacterianas ,Periodontopatógenos ,Bactérias ,Periodontite ,Ciclodextrina ,Ciclodextrinas ,Biofilmes/efeito de drogas - Abstract
Biofilmes bacterianos estão associados como fator etiológico da doença periodontal, uma vez que são difíceis de controlar por meio da terapia mecânica e antibiótica convencional. As células bacterianas dos biofilmes possuem mecanismos de resistência bacteriana tornando-as difíceis de neutralizar tanto pela resposta imune do hospedeiro quanto à ação dos antibacterianos. Uma alternativa para o controle dos biofilmes bacterianos, é o uso de peptídeos antimicrobianos, uma vez que tem amplo espectro e baixa incidência de resistência bacteriana. O presente estudo investigou a atividade antibacteriana do peptídeo sintético denominado LyeTx I, originário do veneno de uma aranha (Lycosaerithognata), em sua forma livre ou associado em -ciclodextrina (CD) contra bactérias periodontopatógenas colonizadoras iniciais etardias tanto em estado planctônico quanto em biofilme. A mistura entre LyeTx I e a CD foi caracterizada por espectroscopia de infravermelho. Para conhecer a cinética das bactérias testadas, foram feitas curvas de crescimento bacteriano tanto em estado planctônico quanto em biofilmes formados sobre pinos de polietileno no dispositivo de biofilme da Universidade de Calgary. Para confirmar a formação e estrutura dosbiofilmes, os pinos foram examinados por microscopia eletrônica de varredura em diferentes tempos (2, 5, 10 dias). Em seguida, foram determinadas as concentrações inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM) dos S. mutans, S. oralis, S. sanguinis, E. corrodens, L. acidophilus, L. casei, F. nucleatum e P. intermedia. Inicialmente, o efeito da cinética do LyeTxI nas bactérias foi determinado por meio do ensaio de curva de morte usando as CIMs. Adicionalmente, foram determinadas a concentração mínima de erradicação do biofilme (CMEB) e a porcentagem de redução da atividade metabólica tanto em biofilme jovem (2 dias) quanto para biofilme maturo (4 dias). As CIMs tanto do LyeTxI quanto do LyeTx I/CD foram entre 7,81- 62,5 g/mLem estado planctônico sendo que o S. mutans, S. oralis, S. sanguinis e E. corrodens foram as mais sensíveis ao LyeTx I e ao LyeTx I/CD. O efeito antibacteriano do LyeTx I começou dentro dos primeiros 15 minutos e se manteve durante 10 horas de acordo com os resultados obtidos nas curvas de morte das bactérias testadas. A porcentagemde redução da atividade metabólica das células do biofilme foi determinada usando resazurina e leitura da fluorescência (ex570 nm/ em 590 nm). Os resultados mostraram que tanto o LyeTx I quanto o LyeTx I/CD quando comparados à clorexidina (controle), apresentaram uma redução da atividade metabólica das células dos biofilmes de 2 dias na maior concentração (250 g/mL), porém não houve diferença estatisticamente significativa após análise da variância e o teste Tukey de multiplex comparações entre os tratamentos testados (p>0,05). Contudo, dentre os agentes testados nenhum foi capaz de reduzir a atividade metabólica das células do biofilme de 4 dias, sendo que a clorexidina diminuiu levemente a atividade metabólica do biofilme maturo (p< 0,05). Os resultados do presente trabalho sugerem que, opeptídeo LyeTx I e o composto de inclusão LyeTx I/CD possuem efeito antibacteriano contra bactérias patógenas periodontais, agindo de forma bacteriostática por um período de até 10 horas. LyeTx I e LyeTx I/CD possuem efeito antibacteriano em biofilmes jovens (2 dias), indicando o potencial uso destes como coadjuvantes na terapia mecânica periodontal. Biofilms are involved as etiology of bacterial infections such as periodontal disease, once they difficult to control with conventional mechanic and antibiotic therapy. Biofilms cells display mechanism of resistance making them tolerant against immune response and antibiotics. Antimicrobial peptides (AMPs) are an alternative to control bacterial biofilms because their wide spectrum and low rate of bacterial resistance. Therefore, the aim of this study was to evaluate the antibacterial activity of the synthetic peptide LyeTx I (originary of the poison of a spider Lycosaerithognata), free and associated with beta-cyclodextrin (CD) against both, first and late colonizer bacteria in planktonic state and in biofilms. The mixture of LyeTx I and CDwas characterized by infrared absorption spectroscopy. Planktonic and biofilm growth curves were done to identify the kinetics of tested bacteria. Biofilms were formed on polyethylene pegs using the calgary biofilm device (CBD) of the University of Calgary. To determine whether differences in biofilm architecture and composition exist between immature biofilms to mature biofilms formed on pegs, we examined biofilms by scanning electron microscopy at 2, 5 and 10 days. Then, the minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were determined for S. mutans, S. oralis, S. sanguinis, E. corrodens, L. acidophilus, L. casei, F. nucleatum and P. intermedia. Killing kinetics assays were performed for each species at MICs to determine the kinetic of LyeTx I. Additionally, the minimal biofilm eradication concentration (MBEC) and the percent of reduction in metabolic activity were determined for young (2-day) and mature (4-day) multispecies biofilms. The band detected between 1200-1700 cm-1 regions shows a decrease of functional group C-H aliphatic stretching vibrations that may be attributed to the formation of van der Waals interactions between CD and LyeTx I, thus confirming the presence of the association compound LyeTx I/CD. The MICs of the LyeTx I and the LyeTx I /CD were found between 62.5 - 7.81 g /mL in planktonic state. S. mutans, S. oralis, S. sanguinis and E. corrodens were the most sensitive to LyeTx I and LyeTx I /CD. The antibacterial effect of LyeTx I started within the first 15 minutes and continued for 10 hours according to results of death curves on tested bacteria. The percentage reduction of metabolic activity of biofilm cells was determined using resazurin and fluorometry (ex 570 nm / of 590 nm). LyeTx I, LyeTx I/CD and chlorhexidine (control) decreased the metabolic activity of 2-day biofilm cells at 250 g/mL and there were no statistically significant difference between the treatments (p> 0.05). In contrast, any of the tested agents decreased metabolic activity of 4-day biofilm cells. Chlorhexidine was able to slightly reduce metabolic activity of mature biofilm (p
- Published
- 2016
15. Produção da toxina recombinante PnTx4(5-5) e caracterização de sua ação farmacológica sobre canais para sódio de inseto e de mamífero
- Author
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Ana Luiza Bittencourt Paiva, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Alessandra Cristine de Souza Matavel, and Marcelo Ribeiro Vasconcelos Diniz
- Subjects
Canal para sódi ,Canais de sódio ,Veneno Phoneutria ,PnTx4 (5-5) ,Aranha Veneno ,Toxinas recombinantes ,Bioquímica e imunologia ,Toxina recombinante - Abstract
O veneno da aranha Phoneutria nigriventer contém vários polipeptídeos neurotóxicos que agem em canais iônicos e outros receptores de insetos e de mamíferos. A capacidade dessas toxinas de discriminar entre diferentes tipos de canais iônicos as tornam potenciais modelos para o desenvolvimento de novas moléculas para aplicação médica e biotecnológica. A toxina PnTx4(5-5) possui alta atividade inseticida, mas não apresenta efeitos comportamentais macroscópicos quando injetada pela via intracerebral em camundongos. No entanto, esta toxina é capaz de inibir o subtipo NMDA de receptores de glutamato de neurônios hipocampais de rato. Além disso, foi demonstrado também um efeito antinociceptivo central e periférico em camundongos e ratos. PnTx4(5-5) possui 63% de identidade de sequência com a toxina PnTx4(6-1), que possui ação em canal para sódio de insetos. Assim, propusemos investigar se PnTx4(5-5) poderia ter efeitos tanto sobre os canais para sódio de insetos, quanto de mamíferos. No entanto, a dificuldade em obter grandes quantidades de veneno e de isolar suas toxinas representa um fator limitante para a realização de estudos com toxinas de P. nigriventer. Assim, nesse estudo, a toxina PnTx4(5-5) foi expressa de forma heteróloga em E. coli e demonstrou ter estrutura secundária e a atividade biológica semelhante à toxina nativa. Os resultados dos experimentos eletrofisiológicos demostraram que rPnTx4(5-5) é uma modificadora de "gating" e apresenta diferentes afinidades e modo de ação sobre os canais para sódio de inseto e de mamífero. A toxina retardou de forma notável a inativação do canal para sódio de barata, aumentando o pico da corrente de sódio. A mesma também inibiu a corrente de sódio dos canais para sódio de mamífero, o que pode ser devido a mudança no potencial de ativação para potenciais mais despolarizados, como observado nos canais Nav1.3 e Nav1.5. Além disso, foram produzidos alguns mutantes de PnTx4(5-5) para estudos de relação estrutura-função. O mutante R32A demonstrou ter uma menor atividade nos canais de sódio de insetos do que a toxina original, sugerindo que este aminoácido pode estar envolvido na afinidade da toxina para os canais para sódio. Este estudo poderá contribuir para o melhor entendimento da relação estrutura/função de toxinas anti-inseto e anti-mamífero em canais para sódio. The venom from the spider Phoneutria nigriventer contains several neurotoxic polypeptides, which act on ion channels and other receptors of insects and mammals. The ability of such toxins to discriminate between different ion channels renders them potential models for the development of new biologically active tools of medical or biotechnological applications. Identifying their molecular binding targets and elucidating their mechanism of action are the first challenges to overcome, before considering toxins as potential lead compounds for drug discovery. The toxin PnTx4(5-5) have high insecticidal activity and no macroscopic behavioral effects when injected by intracerebral via in mice. Nevertheless, it can inhibit the NMDA - subtype of glutamate receptors of cultured rat hippocampal neurons. Furthermore, it was demonstrated to have peripheral and central antinociceptive effect in mice and rats. PnTx4(5-5) shares 63% sequence identity with toxin PnTx4(6-1), that was previously shown to act on the insect sodium channel. Thus, we proposed to investigate if the PnTx4(5-5) could have effects both on insect and mammalian sodium channels. However, the difficulty in obtaining large amounts of venom and isolating its toxins represent a limiting factor for carrying out studies on P. nigriventer toxins. To overcome this problem, in this study we have cloned and expressed the toxin PnTx4(5-5) in E. coli. The recombinant toxin, rPnTx4 (5-5), demonstrated to have secondary structure and biological activity similar to the native one. Results from electrophysiological experiments showed that rPnTx4(5-5) is a sodium channel gating modifier and has different affinity and mode of action on insect and mammalian sodium channels. The toxin strongly slowed down the inactivation of the cockroach sodium channel, increasing the peak current. Besides that, the toxin inhibited the sodium current on mammalian sodium channels, which is probably due to the small, but significant shift in the activation potential to more depolarized potentials, as observed on the channels Nav1.3 and Nav1.5. In addition, we produced some mutants of PnTx4(5-5) for structure-function relationship studies. The mutant R32A demonstrated to have lower activity on insect sodium channels than the original toxin, suggesting that this amino acid can be involved in the affinity of the toxin for sodium channels. This study can contribute to better understanding the structure/function relationship of mammal and insect toxins on sodium channels.
- Published
- 2015
16. Desenvolvimento de uma formulação lipossomal de uso tópico contendo o peptídeo sintético PnPP-19 para o tratamento da disfunção erétil & análise de patentes em biotecnologia, na área de fármacos e medicamentos, que exploram venenos e toxinas provenientes da fauna brasileira
- Author
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Flávia De Marco Almeida, Monica Cristina de Oliveira, Lucas Antonio Miranda Ferreira, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Paulo Gustavo Sampaio Lacativa, Alvaro Dutra de Carvalho Junior, Elaine Amaral Leite, and Ruben Dario Sinisterra Millan
- Subjects
Peptídeo ,Permeação Cutânea ,Lipossomos ,Lipossomas ,Peptídeos ,Impotência sexual ,Penis Ereção ,Disfunção erétil ,Lipossomas Deformáveis ,Patentes - Abstract
A Parte I deste trabalho descreve o desenvolvimento de uma formulação lipossomal contendo PnPP-19, derivado da toxina PnTx2-6 da aranha Phoneutria nigriventer, para o tratamento tópico da disfunção erétil (DE). PnPP-19 é um peptídeo sintético de 19 aminoácidos, previamente descrito como uma nova substância bioativa para o tratamento da disfunção erétil. O objetivo desse trabalho foi avaliar as propriedades físico-químicas de lipossomas deformáveis catiônicos contendo PnPP-19 e a permeação cutânea de PnPP19, tanto livre quanto encapsulado nesses lipossomas. Três preparações lipossomais diferentes foram avaliadas. Os lipossomas deformáveis catiônicos continham fosfatidilcolina de ovo, estearilamina e Tween 20. A concentração lipídica variou de 20 mM a 40 mM. O teor de encapsulação, o diâmetro médio, o potencial zeta e a estabilidade a 4oC das formulações foram avaliados. Os experimentos de permeação cutânea foram realizados com pele abdominal humana em células de Franz, com área de difusão de 3 cm2 a 32ºC. Um derivado fluorescente do peptídeo, contendo 5-TAMRA ligado à região Cterminal de PnPP-19, onde uma lisina adicional foi inserida, foi utilizado para estes experimentos. Os resultados mostram que os diferentes métodos de preparação apresentaram diferentes teores de encapsulação, de 6% a 30%, e o método de evaporação em fase reversa na concentração lipídica de 40 mM apresentou o melhor teor de encapsulação (30,2 + 4,5 %). PnPP-19 livre foi capaz de permear a pele, na velocidade de 10,8 ng/cm2/h. Porém, PnPP-19 sofreu possivelmente uma hidrólise específica pelas enzimas proteolíticas presentes na pele, gerando um fragmento de 15 resíduos de aminoácidos. PnPP-19 encapsulado permeou a pele na velocidade de 12,6 ng/cm2/h. A encapsulação de PnPP-19 em lipossomas deformáveis catiônicos protegeu o peptídeo contra degradação, favorecendo sua administração tópica. O desenvolvimento de fármacos a partir da exploração da biodiversidade brasileira vem passando por uma fase de regulamentação no Brasil. A aplicação da medida provisória MP 2.186-16, de agosto de 2001, revogada pela lei Nº 13.123, de 20 de maio de 2015, gerou discussões importantes, com reflexos na produção científica e tecnológica brasileira. Nesse contexto, a Parte II do presente trabalho compreende o levantamento das patentes produzidas no Brasil e no exterior, entre 2000 e 2011, que descrevem fármacos ou medicamentos desenvolvidos a partir de venenos e toxinas da fauna brasileira. Nossos resultados mostraram que apenas 8 gêneros da fauna brasileira estão envolvidos em documentos de patente. As invenções geradas envolvem, em sua maioria, composições antitumorais, antimicrobianas, vacinas e agentes hipotensivos. Os inventores brasileiros detêm 49% dos documentos de patente, sendo os outros documentos depositados por inventores da América do Norte e Europa. Desta forma, ainda há um grande arsenal de moléculas provenientes de venenos da rica fauna brasileira a serem exploradas para o desenvolvimento de novas substânias bioativas. As leis brasileiras que regem a investigação e a exploração comercial de produtos provenientes do patrimônio genético brasileiro são também discutidas. In Part I, this work describes the development of a liposomal formulation containing PnPP-19, derived from the toxin PnTx2-6 from Phoneutria nigriventer spider, for the topical treatment of erectile dysfunction (ED). PnPP-19 is a 19-amino-acid synthetic peptide previously described as a novel bioactive compound for the treatment of erectile dysfunction. The aim of this work was to evaluate the physicochemical properties of cationic transfersomes containing PnPP-19 and the skin permeation of PnPP-19, whether free or encapsulated. Three different liposomal preparation methods were evaluated. Cationic transfersomes contained egg phosphatidyl choline, stearylamine and Tween 20. Lipid concentration varied from 20mM to 40mM. We evaluated the entrapment efficiency, mean diameter, zeta potential and stability at 4oC of the formulations. The skin permeation assays were performed with abdominal human skin using Franz diffusion cell with 3 cm2 diffusion area at 32oC and a fluorescent derivative of the peptide, containing 5-TAMRA, bound to PnPP-19 C-terminal region, where an extra lysine was inserted. Our results showed variable entrapment efficiencies, from 6% to 30%, depending on the preparation method and the lipid concentration used, and reversed phase evaporation at 40 mM lipid concentration led to the best entrapment efficiency (30,2 + 4,5 %). Free PnPP-19 was able to permeate skin at a rate of 10.8 ng/cm2/h. However, PnPP-19 was specifically hydrolyzed by skin proteases, generating a fragment of 15 amino acid residues. Encapsulated PnPP-19 permeated skin at a rate of 12.6 ng/cm2/h. The encapsulation in cationic transfersomes protected the peptide from degradation, favoring its topical administration. The use of drugs developed from the exploitation of the Brazilian biodiversity, as in the present work, is in a stage of regulamentation in Brazil. The provisional measure MP 2.186-16, into force since August 2001, revogated by the law 13.123, on May 20, 2015, was extensively questioned by Brazilian researchers, and has affected scientific and technological production. In this context, Part II involves a search at patent banks for inventions developed in Brazil and abroad, filed between 2000 and 2011, that describe drugs or medicines developed after venoms, toxins or their derivatives from the Brazilian fauna. Our results show that only 8 Brazilian genera are involved in patent applications. The inventions mostly involve anticancer compositions, antimicrobials, vaccines and hypotensives. Brazilian inventors hold 49% of the patent applications, and the other applications were filed by American and European inventors. Therefore, there is still a great arsenal of venom molecules from the rich Brazilian fauna to be explored for the development of new bioactive compounds. Brazilian laws that rule the investigation and commercial exploitation of products comprising the use of Brazilian genetic resources are also discussed herein.
- Published
- 2015
17. Investigação de algumas atividades biológicas da peçonha da serpenteMicrurus lemniscatus (Linnaeus, 1758)
- Author
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Thiago Geraldo Soares, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Marcia Helena Borges
- Subjects
Micrurus lemniscatu ,Micrurus lemniscatus ,Peçonhas ,Ml-LAAO ,Atividades biológicas ,Venenos de serpentes ,Atividade antimicrobiana ,Bioquímica e imunologia ,Anti-Infecciosos - Abstract
O estudo das peçonhas de serpentes é importante para o desenvolvimento de terapias contra acidentes ofídicos e também porque estas peçonhas são fontes de moléculas com potencial terapêutico, uma vez que podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e de outros produtos biotecnológicos.Neste contexto, no presente estudo, realizamos uma caracterização bioquímica parcial e investigamos algumas atividades biológicas da peçonha de M. lemniscatus e das frações obtidas por fracionamento por exclusão molecular (Superose 12). As frações (EM-F1 - EM-F11) obtidas foram submetidas à SDS-PAGE e à espectrometria de massas (MALDI-TOF), o que mostrou que a peçonha é composta principalmente, por componentes com massas moleculares de 6 - 8 kDa e 12 - 14kDa. O screening de atividades biológicas demonstrou que a peçonha apresentou atividades fosfolipásica A2 (EM-F3 a EM-F10), hialuronidásica (EM-F1 e EM-F2) e hemaglutinante (EM-F6 e EM-F7), além de ter induzido perda da adesão celular em adenocarcinoma de mama em cultura (EM-F1 e EM-F2). Adicionalmente, a peçonhainduziu atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (ATCC® 6538) (EM-F1 e EM-F2). Frente ao surgimento de bactérias super-resistentes aos antibióticos comerciais e ao interesse em investigar agentes antimicrobianos a partir de fontes naturais, isolamos e caracterizamos química e farmacologicamente, a enzima L-aminoácido oxidase, Ml-LAAO. Esta enzima foi purificada porcromatografia de troca aniônica (Synchropack AX300) e apresentou Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) de 1,56 g/mL contra Staphylococcus aureus (ATCC® 6538). Adicionalmente, a toxicidade celular desta molécula foi avaliada em três linhagens celulares (THLE-2, WI26-VA4 e HEK- 293), o que mostrou que esta não é tóxica para estas células quando testada nas concentrações de CIM/CBM obtidos contra Staphylococcus aureus. Além disso, Ml-LAAO não causou hemólise em eritrócitos de coelho e não induziu lise de lipossomos. A análise por espectrometria de massas MALDI-TOF mostrou uma massa molecular aparente de aproximadamente 69 kDa para Ml-LAAO. Nosso trabalho mostrou a primeira L-aminoácido oxidase isolada da peçonha de M. lemniscatus. No entanto, novos estudos são necessários para caracterizar a atividade enzimática de Ml-LAAO e compreender seu mecanismo de ação em bactérias. The study of snake venoms is useful to development of therapies against snakebites and these venoms are also source of molecules with therapeutic potential. Therefore it can be used as prototypes for the development of drugs and other biotechnological products. In this context, we performed a partial biochemical characterization and investigated some biological activities of M. lemniscatus venom and its fractionsobtained by fractionation by size exclusion (Superose 12). The fractions (EM-F1 - EM-F11) obtained were submitted to SDS-PAGE and to mass spectrometry (MALDITOF) analysis. The results showed that this venom consists mainly of components with molecular weights of 6 - 8 kDa and 12 - 14 kDa. The screening of biological activities demonstrated that the venom displayed phospholipase A2 (EM-F3 to EMF10), hyaluronidase (EM-F1 and EM-F2) and hemagglutinating (EM-F6 and EM-F7) activities and causes loss of cell adhesion in mammary adenocarcinoma in culture (EM-F1 and EM-F2). Additionally, this venom induced antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC® 6538) (EM-F1 and EM-F2). Due to the emergence of super-resistant bacteria to commercial antibiotics and to the interest in investigating antimicrobial agents from natural sources, we isolated and characterized chemically and pharmacologically Ml-LAAO. This enzyme was purified by anion exchange chromatography (Synchropack AX300) and showed a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and a Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of1.56 g/mL against Staphylococcus aureus, (ATCC® 6538). In addition, cellular toxicity of this molecule was assessed in three cell lines (THLE-2, WI-26 VA4 and HEK-293), which showed that it is not toxic for these cells, when tested at the MIC/MBC concentrations obtained against Staphylococcus aureus. Furthermore, Ml-LAAO did not cause hemolysis in rabbit erythrocytes and did not induce liposome lysis. The MALDI-TOF mass spectrometric analyses showed an apparent molecular mass of approximately 69 kDa to Ml-LAAO. Our results showed the first L-amino acid oxidase isolated from the M. lemniscatus venom. However, more studies are need to characterize the enzymatic activity of Ml-LAAO and to understand its mechanism of action in bacteria.
- Published
- 2015
18. Estudo de três peptídeos sintéticos com atividade antimicrobiana, derivados da toxina LyeTx I da aranha Lycosa erythrognatha (Lucas, 1836)
- Author
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Joaquim Teixeira de Avelar Júnior, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Daniel Moreira dos Santos, Vera Lúcia dos Santos, and Valbert Nascimento Cardoso
- Subjects
Doenças transmissíveis ,Anti-infecciosos ,Peptídeos ,Bioquímica e imunologia - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Doenças infecciosas é uma significativa causa de morte e, infecções bacterianas aparecem entre as 10 principais causas de mortes no mundo. Os fungos também podem causar graves infecções, especialmente em pessoas imunossuprimidas. No entanto, apesar de existir um grande arsenal de antimicrobianos como os antibacterianos e antifúngicos é importante o desenvolvimento de novos fármacos, considerando-se o aparecimento de linhagens resistentes aos medicamentos existentes. Os peptídeos com atividade antimicrobiana, encontrados em diversos organismos multicelulares, são potenciais candidatos para modelos de novos antibióticos. Neste trabalho o peptídeo antimicrobiano denominado LyeTx I, obtido da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha, foi utilizado como modelo de estudo. Sintetizou-se, pelo método de Fmoc, um peptídeo representando parte da sequência de LyeTx I, mas com diferentes modificações, obtendo-se três diferentes derivados: LyeTxImn, LyeTxImnΔK e LyeTxImnΔKAc. Estes peptídeos derivados apresentaram diferentes atividades antimicrobianas, bem como diferentes atividades hemolíticas. Esta última é um importante indicador da atividade dos peptídeos antimicrobianos em células de mamífero, isto é, peptídeos com alta atividade hemolítica em geral não são bons candidatos para antibióticos. Dos peptídeos derivados obtidos, somente LyeTxImnΔK foi mais eficaz do que o peptídeo original, LyeTx I, quando seus índices terapêuticos foram comparados.Investigou-se ainda, a estruturação desses peptídeos em meios miméticos tais como trifluoretanol, dodecil sulfato de sódio e dodecil fosfocolina, sendo encontrado padrões de estruturação condizentes com perfis de α-hélice, semelhante ao peptídeo LyeTx I original. Em conclusão, obtivemos por síntese química, um peptídeo menor, derivado da estrutura da toxina original (LyeTxI), com mais alta atividade para alguns fungos e bactérias, menos hemolítico bem como, com menor custo de produção, características fundamentais para um candidato a novo fármaco. Infectious disease is one big cause to death, where bacterium infections show among some 10 mainly death´s causes in the world. Fungi can cause severe diseases too, particularly in imunossupressed people. However, although there are a vast antimicrobial arsenal, as antibiotics antimicrobials and antimycotic against fungi is important to develop new medicines, considering the growing of resistence by microorganisms. Antimicrobial peptides found in many multicellular organisms could be good candidates to this aim. In this work, the antimicrobial peptide, LyeTx I, from the spider Lycosa erythrognatha´s venom was used as a model. Part of this molecule (LyeTxI minimized) was synthesized by the Fmoc method. Three derivatives were obtained: LyeTxImn, LyeTxImnΔK and LyeTxImnΔKAc. They showed different antimicrobial activities as well as different hemolytic activities. This last activity is an important indicator to verify if the antimicrobial peptide is also active in cells from mammals. A high hemolytic activity is not a good indicator for a peptide as a good antibiotic. But only LyeTxImnΔK was more effective than the native peptide (LyeTx I), when compared therapeutic index among them. The structuration of these peptides was also investigated in mimetic media such as trifluorethanol, sodium dodecyl sulfate and dodecyl phosphocholine, being found structuration patterns consistent with α-helix profiles, similar to the original peptide LyeTx I. Therefore, was possible the synthesis of a peptide derivative from the a spider toxin LyeTxI with higher antimicrobial activities, as well as with lower production cost, some, essential characteristics to a candidate to newtherapeutic drugs.
- Published
- 2015
19. Novas abordagens na produção de anticorpos monoclonais e caracterização de epitopos lineares e conformacionais de metaloproteases de venenos de serpentes de classe P-I
- Author
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Francisco Santos Schneider, Carlos Delfim Chávez Olórtegui, Eládio Oswaldo Flores Sanchez, Franck Molina, Rodrigo Novaes Ferreira, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Jonas Enrique Aguilar Perales, and Ana Maria Moura da Silva
- Subjects
Bioquímica ,Venenos de serpentes ,Imunologia ,Metaloproteases ,Anticorpos monoclonais ,Formação de anticorpos ,Epitopos - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Este trabalho apresenta-se na forma de três artigos publicados em revistas internacionais indexadas. Cada artigo está contido em um capítulo da parte de RESULTADOS. Cada capítulo apresenta seu resumo individualizado. Aqui, faremos a descrição do conteúdo de cada capítulo: O primeiro artigo (Artigo 1 – The novel metalloproteinase atroxlysin-I from Peruvian Bothrops atrox (Jergón) snake venom acts both on blood vessel ECM and platelets) descreve a caracterização bioquímica da primeira metaloprotease de classe P-I do veneno de Bothrops atrox a ser purificada. No segundo capítulo dos RESULTADOS (Artigo 2 – Use of a Synthetic Biosensor for Neutralizing Activity-Biased Selection of Monoclonal Antibodies Against Atroxlysin-I, an Hemorrhagic Metalloproteinase from Bothrops atrox Snake Venom), descrevemos a produção de anticorpos monoclonais anti-atroxlisina-I baseada em um novo método funcional de seleção de clones produtores de anticorpos monoclonais neutralizantes, assim como suas caracterizações imunoquímicas, além da identificação de epitopos lineares de atroxlisina-I utilizando o IgG policlonal anti-atr-I. Finalmente, o terceiro capítulo dos RESULTADOS (Artigo 3 – Mimotopes of mutalysin-II from Lachesis muta snake venom induce hemorrhage inhibitory antibodies upon vaccination of rabbits) descreve a caracterização dos epitopos conformacionais reconhecidos pelo anticorpo monoclonal LmmAbB2D4. A identificação de mimotopos de Mutalisina-II foi feita a partir da técnica de phage display aliada à técnica de SPOT síntese. Cada artigo apresenta sua discussão em separado. Ao final do terceiro artigo uma discussão ampla e integrada dos três artigos é apresentada. This work is presented in format of three published manuscripts in indexed international journals. Each article is located in one separated chapter within RESULTS. Once each paper presents its own ABSTRACT, here we briefly describe the content of the chapters: The first article (Artigo 1 – The novel metalloproteinase atroxlysin-I from Peruvian Bothrops atrox (Jergón) snake venom acts both on blood vessel ECM and platelets) describes for the first time the purification and biochemical characterization of a P-I class metalloproteinase from Bothrops atrox venom. In the second chapter of our RESULTS (Artigo 2 – Use of a Synthetic Biosensor for Neutralizing Activity-Biased Selection of Monoclonal Antibodies Against Atroxlysin-I, an Hemorrhagic Metalloproteinase from Bothrops atrox Snake Venom), we produce monoclonal antibodies against atroxlysin-I using a new functional method for the selection of clones able to produce neutralizing monoclonal antibodies, as well as their immunochemical characterization and the identification of continuous epitopes of atroxlysin-I. Finally, the third manuscript presented in our RESULTS (Artigo 3 – Mimotopes of mutalysin-II from Lachesis muta snake venom induce hemorrhage inhibitory antibodies upon vaccination of rabbits) characterizes conformational epitopes recognized by the monoclonal antibody LmmAbB2D4 against mutalysin-II. Mimotopes of mutalysin-II was identified using the phage display and SPOT synthesis techniques. Every article presents an individual discussion. At the end of the last manuscript a comprehensive and integrative discussion of the three papers is presented.
- Published
- 2014
20. Avaliação da liberação de L-glutamato por sinaptosomas cérebro-corticais de rato, pela ação da peçonha da serpente coral sul-americana, Micrurus lemniscatus (linnaeus, 1758), e por algumas de suas frações semi-purificadas
- Author
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Alessandra de Castro Montandon and Maria Elena de Lima Perez Garcia
- Subjects
Micrurus lemniscatus ,Síndromes neurotóxicas ,PLA2s ,Neurotoxicidade ,Fisiologia ,Ácido glutamico ,Liberação de L-glu ,Fosfolipases A2 ,Micrurus lemmiscatus - Abstract
Os acidentes ofídicos atribuídos ao gênero Micrurus sp., apesar de raros, são extremamente severos e podem levar à morte por parada respiratória. As manifestações clínicas do envenenamento decorrem principalmente, da atividade neurotóxica da peçonha. O glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC (sistema nervoso central), quando liberado em excesso, causa uma série de efeitos neurotóxicos, conhecidos como excitotoxicidade. Esses efeitos estão relacionados à patogênese de inúmeras doenças neurodegenerativas. Neste trabalho, investigou-se pela primeira vez, o efeito da peçonha da serpente Micrurus lemniscatus, bem como de algumas de suas frações semi-puras, sobre a liberação de L-glu (Lglutamato) de sinaptosomas cérebro-corticais de rato. Após screening da atividade das frações semi-purificadas da peçonha, verificou-se que aquelas contendo PLA2s foram responsáveis pela maior parte da liberação de L-glu. Duas destas frações, 20 e 31, constituídas segundo análise de massas, por - NTxs e PLA2s, respectivamente, induziram a liberação tempo-dependente de Lglu dos sinaptosomas. Das frações que não continham PLA2s, apenas a fração 20 induziu aumento da liberação de L-glu. Essa fração, diferentemente da peçonha e da fração 31, não promoveu lise de sinaptosomas nem ruptura de lipossomos. Bloqueadores de canais para sódio e potássio não alteraram a liberação de L-glu induzida pela peçonha e fração 20; no entanto, essa liberação foi parcialmente afetada na presença de cádmio, um bloqueador de canais para cálcio voltagem-dependente. Também não foram observadas alterações na liberação de L-glu induzida pela peçonha na presença de Dtubocurarina, atropina e carbacol. Entretanto, a liberação induzida pela mesma e pela fração 20, foi completamente abolida quando o cálcio foi substituído por estrôncio no meio de incubação. A peçonha de M. lemniscatus, bem como a fração 31, exibiram alta atividade fosfolipásica quando comparadas à peçonha de C. durissus terrificus. Já a fração 20, sugerida ser uma -NTx de cadeia curta, não mostrou atividade fosfolipásica. Assim, os resultados do presente trabalho sugerem que a neurotoxicidade central exercida in vitro pela peçonha de M. lemniscatus, pode estar relacionada à liberação excessiva de L-glu no SNC, ocasionada essencialmente pela atividade de PLA2s presentes na mesma. Já a fração 20, pode estar associada aos sintomas de neurotoxicidade central apresentados por pacientes envenenados por esta serpente, uma vez que as PLA2s, aparentemente, não atravessam a barreira hematoencefálica. A liberação de L-glu induzida pela peçonha e por esta fração, parece envolver, pelo menos parcialmente, a participação de canais para cálcio voltagemdependentes, considerando-se a inibição parcial deste efeito pelo cádmio. Além do mais, a presença de cálcio parece ser essencial nesse processo, considerando-se a inibição total da liberação de L-glu pelo estrôncio. The ophidic accidents attributed to the genus Micrurus sp., despite rare, are extremely severe and can led to death by respiratory arrest. The clinical manifestations of envenoming arise mainly from venom neurotoxic activity. Glutamate, the main exitatory neurotransmitter in CNS (central nervous system), when released in excess, causes neurotoxic effects, known as excitotoxicity. These effects are related to the pathogenesis of many neurodegenerative diseases. In this work, we investigated for the first time, the effect of Micrurus lemniscatus snake venom, as well as some of its semipurified fractions, on the release of L-glu (L-glutamate) from rat brain synaptosomes. After an screening of the activity of venom semi-purified fractions, it was found that those containing PLA2s were responsible for the most part of L-glu release. Two of these fractions, 20 and 31, composed according to mass analysis by -NTxs and PLA2s, respectively, induced the release time- dependent of L-glu from synaptosomes. Between the tested fractions having no PLA2s, only fraction 20, induced increased L-glu release. This fraction, unlike the venom and fraction 31, did not cause synaptosomes lysis or liposomes rupture. Sodium and potassium channels blockers, did not change L-glu release by venom and fraction 20; however, this release was partially affected in the presence of cadmium, an inespecific voltage-dependent calcium channels blocker. Also, it was not observed changes in L-glu release induced by the venom in the presence of D-tubocurarine, atropine and carbachol. However, L-glu release induced by venom and by fraction 20, was completely abolished when calcium was replaced by strontium in the incubation medium. M. lemniscatus venom, as well as fraction 31 exhibited high phospholipasic activity when compared to C. durissus terríficus venom. The fraction 20, suggested to be a possible short chain -NTx, showed no phospholipase activity. Thus, the results of this study suggest that the central neurotoxicity exerted in vitro by M. lemniscatus venom may be related to excessive release of L-glu in the CNS, caused mainly by the activity of PLA2s present in it. The fraction 20, may be associated with the central neurotoxicity symptoms found in patients envenomed by this snake, since the PLA2s, apparently, do not cross the blood brain barrier. The increased L-glu release induced by the venom and by this fraction, seems to involve, at least in part, the contribution of voltage-dependent calcium channels, considering the partial inhibition of this effect by cadmium. Moreover, the presence of calcium ions seems to be essential in this process, considering the total inhibition of L-glu release by strontium.
- Published
- 2013
21. Investigação da atividade muscarínica do veneno da serpente Micrurus lemniscatus (Linnaeus, 1758) em íleo isolado de cobaia
- Author
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Marcela Cristine Silva, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Bagnolia Araujo da Silva, Marcio Flavio Dutra Moraes, and Maria Aparecida Ribeiro Vieira
- Subjects
Receptor muscarínico ,Micrurus ,Micrurus Veneno ,Fisiologia ,Veneno ,Íle ,Músculo longitudinal do íleo de cobaia ,Micrurus lemmiscatus - Abstract
Apesar da grande diversidade de espécies do gênero Micrurus (Elapidae) nas Américas, incluindo o Brasil, poucos estudos foram feitos utilizando o veneno bruto (VB) ou toxinas purificadas do mesmo. Algumas neurotoxinas presentes nesses venenos atuam sobre os receptores muscarínicos, envolvidos na neurotransmissão colinérgica. Estas toxinas, chamadas toxinas muscarínicas (6-8 kDa), são as moléculas mais frequentes em venenos de Micrurus lemniscatus. No presente trabalho, propôs-se investigar a atividade muscarínica do VB e de suas frações semi-purificadas no músculo liso longitudinal (MLL) de íleo de cobaia. O VB foi cedido pela Fundação Ezequiel Dias (Funed, Belo Horizonte, Brasil) e fracionado por fase reversa-HPLC ou troca-iônica CIEX, seguido de uma fase reversa. As massas foram avaliadas por espectrometria de massa MALDI-TOF e as proteínas totais foram estimadas de acordo com o método de Lowry e colaboradores (1951). Segmentos de MLL de íleo de cobaia foram dissecados e suspensos em banho de órgãos isolado, em tampão Krebs-Ringer-Henseleit sob aeração com mistura carbogênica. As contrações isométricas foram monitoradas na presença de VB ou de frações semi-purificadas, bem como destes componentes na presença dos antagonistas (atropina, 4-DAMP e metoctramina). O agonista muscarínico carbacol (CCh) foi utilizado como controle positivo. Trinta e quatro frações semi-purificadas foram obtidas, sendo que 18 dessas frações, com massa molecular entre 7-7,6 kDa foram testadas sobre a preparação de MLL. As concentrações de antagonistas foram definidas de acordo com as respostas observadas em ensaios de padronização. VB, testado em diferentes concentrações (0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 e 30 g/mL), induziu contração da preparação MLL, que foi completamente antagonizada pela atropina, metoctramina e de 4-DAMP, testados separadamente na concentração de 10-9 M. Entre as 18 frações semi-purificadas testadas, nas concentrações (0,1; 0,3; 1 e 3 g/mL), apenas quatro induziram contração da preparação de MLL. Dentre estas, duas frações semi-purificadas apresentaram uma toxina com mesma massa molecular (7,232 kDa). Esta toxina isolada, MT-Ml1, foi purificada e testada em MLL. Curvas contrações-resposta cumulativas foram construídas com as seguintes concentrações: 0,01; 0,03; 0,1 e 0,3 g/mL. A maior concentração testada desta toxina (0,3 g/mL) induziu contração de 27,25%, comparada à contração máxima obtida pelo CCh, e foi parcialmente antagonizada quando pré-incubada com atropina (10-9 M). O veneno de M. lemniscatus apresentou atividade agonista muscarínica, sugerindo a presença de toxinas muscarínicas. Esta atividade foi antagonizada pelos antagonistas muscarínicos clássicos utilizados. Estudos estão em andamento para melhor caracterizar a atividade da toxina MT-Ml1 e determinar seus mecanismos de ação no MLL do íleo de cobaia. Esta peçonha parece ter várias moléculas ativas e representa um material valioso a ser estudado, podendo fornecer boas ferramentas para o estudo da atividade muscarínica do sistema nervoso. Despite of the great diversity of species in the genus Micrurus (Elapidae) in Americas, including Brazil, few studies have been done using the venom of these species or their purified toxins. Some neurotoxins present in these venoms act on muscarinic receptors involved in cholinergic neurotransmission. These toxins, called muscarinic toxins (6-8 kDa), are the most frequent molecules in venoms of M. lemniscatus. In the present work, we propose to make a screening of the muscarinic activity of the crude venom (CV) and of their semi-purified fractions on longitudinal smooth muscle (LSM) preparation of guinea pig ileum. The CV, assigned by Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, Brazil), was fractionated by HPLC, using reverse phase or ionic exchange-CIEX, followed by reverse phase. The masses were evaluated by MALDI-TOF mass spectrometry and total protein was estimated according to the method of Lowry et al (1951). Segments of LSM of guinea-pig ileum were removed, suspended in isolated organ bath in Krebs-Ringer-Henseleit buffer, under aeration with carbogenic mixture. Isometric contractions elicited by CV or semi-purified fractions, were monitored in the presence of muscarinic antagonists (atropine, 4-DAMP and metoctramine). The muscarinic agonist carbachol (CCh) was used as a positive control. Thirty four semi-purified fractions were obtained from CV and 18 thereof, with molecular masses between 7-7,6 kDa were tested on LSM preparation. Concentrations of antagonists were defined according to the responses observed on standardization assays. CV, assayed in various concentrations (0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 and 30 g/mL), induced a contraction of the LSM preparation, which was inhibited by atropine, metoctramine and 4-DAMP concentration of 10-9 M. Among the 18 tested semi-purified fractions in the following concentrations: 0,1; 0,3; 1; and 3 g/ml, only four of these fractions induced contraction of the preparation of LSM. Among them, two showed a toxin with the same molecular masses (7.232 kDa). The purified toxin, MT-Ml1 was tested in LSM. Cumulative curve were constructed with the following concentrations: 0.01, 0.03, 0.1 and 0.3 g/mL. The highest tested concentration (0.3 mg/mL) induced contraction of 27.25% (comparing to maximum contraction obtained by the charbacol) and was partially blocked when pre-incubated with atropine (10-9 M). In conclusion, the venom from M. lemniscatus presented agonist muscarinic activity, suggest the presence of muscarinic toxins, among them the MT-Ml1. This activity was antagonized by classical muscarinic antagonists. Studies are in progress to better identify the toxin MT-M11 and to determine their action mechanisms in LSM from guinea pig illeum. Indeed this venom seems to have several active molecules and represents a rich material to be studied and may provide good tools to study the muscarinic activity of nervous system.
- Published
- 2013
22. Efeito antinociceptivo da toxina PnTx4(6-1), isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer (Keyserling, 1891)
- Author
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Bruna Luiza Emerich Magalhães, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Igor Dimitri Gama Duarte, Janetti Nogueira de Francischi, and Alessandra Cristine de Souza Matavel
- Subjects
PnTx4(6-1) ,Venenos de Aranha ,Nocicepção ,Nociceptividade ,Toxina de aranha ,Phoneutria nigriventer - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo A peçonha da aranha Phoneutria nigriventer, conhecida como “aranha armadeira”, possui diversos componentes biologicamente ativos. Entre os sintomas decorrentes da picada desse animal destacam-se dor local, excitação, salivação, lacrimejamento, priapismo, convulsão e paralisia flácida e espástica dos membros anteriores e posteriores. A toxina PnTx4(6-1) foi isolada da fração PhTx4 deste veneno, sendo um polipeptídeo de cadeia única composto por 48 resíduos de aminoácidos, cuja massa é de 5244,6 Da. PnTx4(6-1) foi inicialmente descrita como uma neurotoxina inseticida, que liga-se ao sítio 3 de canais para sódio em sinaptossomas de barata (Periplaneta americana). Entretanto, canais para sódio de músculo esquelético (rSKM1) e cérebro (rBIIA), ambos de ratos, não foram alvos da toxina PnTx4(6-1). Estes resultados corroboraram resultados anteriores em que a injeção intracerebral da toxina purificada (15 e 30 μg), em camundongos, não provocou toxicidade aparente. O presente estudo avaliou o efeito antinociceptivo da toxina PnTx4(6-1) frente a hiperalgesia evocada por carragenina, prostaglandina E2 e por constrição do nervo ciático. A atividade antihiperalgésica foi avaliada pelo teste de retirada da pata do rato submetida à compressão, descrito originalmente por Randall & Selitto, em 1957. A hiperalgesia no modelo de dor inflamatória foi causada pela injeção intraplantar de 250 μg de carragenina. Quando administrada no mesmo local, após intervalo de duas horas e trinta minutos, a toxina PnTx4(6-1) (5 μg) foi capaz de restaurar o limiar nociceptivo da pata dos animais. A hiperalgesia, no modelo de dor nociceptiva, foi evocada pela injeção intraplantar de 2 μg de prostaglandina E2. A administração central da toxina, por injeção intratecal, causou um efeito antinociceptivo dose-dependente. As doses de 200 e 400 pmoles reverteram totalmente o efeito hiperalgésico evocado por prostaglandina E2, tendo duração de 20 minutos. Medidas na pata contralateral revelaram que PnTx4(6-1), quando administrada pela via intratecal, não altera o limiar nociceptivo da pata não tratada. Com relação ao modelo de dor neuropática a toxina na dose de 100 pmoles reverteu, com duração de dez minutos, a hiperalgesia evocada por constrição do nervo ciático. A investigação das propriedades biológicas das toxinas animais e a perspectiva de sua utilização para o alívio da dor demonstram forte potencial terapêutico. The venom of the “armed” spider Phoneutria nigriventer has several biologically active components including peptides, proteins, amino acids, salts etc. The symptoms resulting from this animal’s bite comprise local pain, arousal, salivation, lacrimation, priapism, seizures and spastic and flaccid paralysis of the anterior and posterior limbs. The toxin PnTx4(6-1), isolated from the PhTx4 fraction of these venom, is a single chain polypeptide composed of 48 amino acid residues, with a mass of 5244.6 Da. This polypeptide was initially described as a neurotoxin insecticide. PnTx4(6-1) appears to bind to site 3 of sodium channels in nerve cord synaptosomes of cockroach (Periplaneta americana) and slow down inactivation of sodium current in isolated axon of insect, without affecting sodium channels of skeletal muscle (rSKM1) and brain (rBIIA), both of rats. This result corroborated previous assays in which the intracerebral injection of the toxin (up to 30μg) in mice caused no apparent toxicity. The present study evaluated the antinociceptive effect of the PnTx4(6-1) in three experimental pain models, using the test paw withdrawal, subjected to compression (Randall & Selitto, 1957). The hyperalgesia in inflammatory pain model was caused by intraplantar injection of 250 μg of carrageenan. When administered in the same place, after an interval of two hours and thirty minutes, PnTx4(6-1) (5 μg) was able to restore the nociceptive threshold of the animals. The hyperalgesia in nociceptive pain model, was evoked by intraplantar injection of 2 μg of prostaglandin E2 (PGE2). The central administration of PnTx4(6-1) by intrathecal injection caused a dose-dependent antinociceptive effect against the hyperalgesia induced by PGE2. Briefly, a dose of 100 pmoles was able to raise the nociceptive threshold of the paw of rats, and the doses of 200 and 400 pmoles totally reversed the hyperalgesic effect evoked by PGE2, with duration of 30 minutes. The measurements in the contralateral paw revealed that PnTx4(6-1), when centrally administered, does not alter the nociceptive threshold of the paw untreated. Concerning to the neuropathic pain model the toxin (100 pmoles) reversed, lasting ten minutes, the hyperalgesia evoked by constriction of the sciatic nerve. This research with PnTx4(6-1) indicates a strong therapeutic potential to this molecule as a possible model to new analgesic.
- Published
- 2013
23. Efeito inibitório da rPnTx1 em canais de sódio ativados por voltagem
- Author
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Anita de Oliveira Silva, Paulo Sergio Lacerda Beirao, Demetrius antonio machado de araujo, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Christopher Kushmerick, and Marília Zaluar Passos Guimarães
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Bioquímica ,Canais de sódio ,Bioquímica e Imunologia ,Toxina recombinante ,Phoneutria nigriventer - Abstract
A toxina PnTx1 representa aproximadamente 0,45% da proteína total do veneno da aranha Phoneutria nigriventer e foi expressa em forma recombinante (rPnTx1). Por causa de seus efeitos fisiológicos semelhantes aos da PnTx1, a rPnTx1 torna-se uma nova e interessante ferramenta para o estudo da fisiologia molecular dos canais de sódio. O objetivo do presente estudo é caracterizar o efeito eletrofisiológico da rPnTx1 em diferentes isoformas dos canais de sódio ativados por voltagem de mamíferos e artrópodes. Para experimentos eletrofisiológicos com neurônios dos Gânglios da Raiz Dorsal de ratos, era utilizada a técnica de patch clamp na modalidade whole cell. Ocorreu inibição das correntes de sódio de 38,4+6,1% em perfusão com solução contendo 1,5 M de rPnTx1. Para o registro das correntes iônicas em ovócitos de Xenopus laevis, foi utilizada a técnica de voltage clamp com dois microeletrodos. Após testar o efeito da rPnTx1 em diferentes isoformas de canais de sódio ativados por voltagem, a seguinte ordem de seletividade foi encontrada: rNaV1.2 > rNaV1.7 rNaV1.4 > rNaV1.3 > mNaV1.6 > hNaV1.8. Nenhum efeito foi observado na isoforma hNaV1.5 e em isoformas de canais provenientes de artrópodes. A dependência de concentração da rPnTx1 foi comparada com a toxina nativa na isoforma rNaV1.2, mostrando a mesma inibição máxima (PnTx1: 85 + 0,8%; rPnTx1: 83,3 + 1,9%), mas o IC50 da toxina recombinante (IC50: 33,7 nM) é significativamente menor que o IC50 de toxina nativa (IC50: 104,8 nM). Por ter uma alta seletividade relativa para canais de sódio neuronais, a rPnTx1 torna-se uma ferramenta importante para estudos estruturais e farmacológicos. Toxin PnTx1 represents approximately 0.45% of the total protein of the spider Phoneutria nigriventer venoms and was expressed in recombinant form (rPnTx1). Because of its physiological effects similar to PnTx1, rPnTx1 becomes a new interesting tool for study of the molecular physiology of sodium channels. The aim of this study is characterize electrophysiologicaly the effect of rPnTx1 in different isoforms of sodium channels of mammals and arthropods. To measure the sodium current in DRG, the patch clamp technique was used in the modality of whole cell. The inhibition of sodium currents was 38,4 + 6,1% when perfused with solution containing 1,5 M rPnTx1. In Xenopus oocytes, two-electrode voltage clamp recordings were performed. The observed order of potency for rPnTx1 was rNaV1.2 > rNaV1.7 rNaV1.4 > rNaV1.3 > mNaV1.6> hNaV1.8 while no effect was seen on hNav1.5 and arthropod isoforms. The concentration-dependence of rPnTx1 inhibition was compared with that of the native toxin in the isoform NaV1.2 and showed the same maximal effect (PnTx1: 85 + 0,8%; rPnTx1: 83,3 + 1,9%), whereas the IC50 of the recombinant toxin (IC50: 33,7nM) was significantly lower than the IC50 of native toxin (IC50:104,8 nM). For its high relative selectivity to neuronal type sodium channels, rPnTx1 becomes an important tool for structural and pharmacological studies.
- Published
- 2012
24. Caracterizações farmacológicas e bioquímicas de peçonhas de aranhas dos gêneros Lasiodora e Loxosceles
- Author
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Carolina Campolina Rebello Horta, Evanguedes Kalapothakis, Olga Meiri Chaim, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Christopher Kushmerick, and Ieso de Miranda Castro
- Subjects
LPA ,ADP ,Aranha ,Peçonha ,Fisiologia ,Vasodilatação ,Antiveneno ,Loxosceles ,Lasiodora - Abstract
As peçonhas de aranhas são constituídas de uma mistura complexa de substâncias. As pesquisas com peçonhas de aranhas investigam os mecanismos do envenenamento, novas estratégias terapêuticas e o imenso potencial farmacológico dos componentes das peçonhas. No presente trabalho, serão apresentados estudos realizados com as peçonhas de duas aranhas distintas: Loxosceles similis, pertencente à subordem Araneomorphae, e Lasiodora sp., pertencente à subordem Mygalomorphae. O trabalho é dividido em dois capítulos, para melhor entendimento. CAPÍTULO 1 - As aranhas do gênero Loxosceles podem provocar envenenamentos graves em humanos, descritos como loxoscelismo. O loxoscelismo cutâneo caracteriza-se por dermonecrose, que pode levar semanas para cicatrizar. O loxoscelismo sistêmico é uma complicação mais rara que pode levar a vítima a óbito por falência renal aguda. Recentemente, descobriu-se que a espécie L. similis, até então pouco estudada, é amplamente encontrada em ambientes antrópicos, principalmente no estado de Minas Gerais. As primeiras caracterizações dessa peçonha mostraram que possui efeitos biológicos similares às peçonhas de aranhas Loxosceles de importância médica no Brasil. O objetivo geral do primeiro capítulo deste trabalho foi caracterizar o soro específico anti-L. similis e avaliar a participação do LPA nos efeitos da peçonha de L. similis e de uma proteína dermonecrótica de L. intermedia (recLiD1). Análises histológicas de pele de coelho após 2, 4 e 8 horas da injeção intradérmica de peçonha de L. similis (3 µg) mostraram denso infiltrado inflamatório, edema, degeneração e necrose musculares, dissociação de fibras colágenas e reticulares. A pré-incubação da peçonha com o soro anti-L. similis reduziu de forma significativa todos esses efeitos. O principal componente tóxico da peçonha de Loxosceles possui atividade de fosfolipase D (PLD) e atua sobre vários alvos lipídicos. Há um interesse atual em investigar o papel do ácido lisofosfatídico (LPA) no loxoscelismo. O LPA é um dos produtos da ação enzimática de PLD, e sabe-se que o LPA induz agregação plaquetária, hiperpermeabilidade endotelial e respostas pró-inflamatórias. Os tratamentos de fibroblastos humanos HFF-1 com peçonha de L. similis ou recLiD1 (10 µg/mL, ambas pré-incubadas com o precursor de LPA lisofosfatidilcolina) promovem liberação das citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-8, CXCL1 e CXCL2 após 12 horas, bem como morte celular por apoptose após 48 horas de incubação. O co-tratamento das células com Ki16425 (15 µM), que é um antagonista de receptores para LPA (LPA1/LPA3), reduziu significativamente a produção de mediadores inflamatórios, porém não alterou os efeitos apoptóticos da peçonha e da recLiD1. Em células endoteliais humanas HUVEC, o Ki16425 também não reduziu a apoptose causada pela peçonha e pela recLiD1 após 48 horas de incubação. Com isso, o presente trabalho mostrou, pela primeira vez, que o LPA formado por ação enzimática de PLD da peçonha de L. similis e da recLiD1 exerce papel na liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias em fibroblastos humanos. No entanto, pelo menos in vitro e nas condições experimentais aplicadas, os receptores para LPA não participam da morte celular promovida por esses agentes em HFF-1 e HUVEC. CAPÍTULO 2 - As aranhas do gênero Lasiodora são amplamente distribuídas no Brasil, onde são conhecidas vulgarmente como caranguejeiras. A peçonha de Lasiodora sp. é pouco tóxica a humanos. Os acidentes causam apenas dor, edema e eritema no local da picada. No entanto, essa peçonha pode ser fonte de ferramentas farmacológicas importantes. Nosso grupo de pesquisa descreveu previamente os efeitos cardiovasculares da peçonha de Lasiodora sp. Em ratos, a peçonha promove hipotensão e bradicardia agudas, diminuição da frequência cardíaca em coração isolado, vasodilatação dependente de óxido nítrico (NO) e ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) em anéis de aorta. O objetivo geral do segundo capítulo deste trabalho foi isolar e caracterizar um ou mais componentes vasodilatadores a partir da peçonha bruta da aranha Lasiodora sp. Utilizando-se técnicas de fracionamento da peçonha em combinação com ensaios biológicos em aorta de rato, uma fração vasoativa foi isolada. Ensaios de espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear identificaram dois compostos na fração: adenosina difosfato (ADP, 88%) e adenosina monofosfato (AMP, 12%). Sabe-se que o ADP, assim como a peçonha bruta, causa hipotensão, vasodilatação dependente de NO e ativação de eNOS. Constatamos que a peçonha de Lasiodora sp. contém ADP em quantidade suficiente para causar relaxamento em anéis de aorta de rato. Os efeitos vasodilatadores da peçonha total e do ADP foram inibidos significativamente por suramina, que é antagonista de receptores purinérgicos P2. Os resultados do presente trabalho indicam que o ADP é um importante componente vasodilatador da peçonha da aranha Lasiodora sp. Spider venoms are complex mixtures of substances. Research into spider venoms investigates the mechanisms underlying envenomation, new therapeutic strategies and the huge pharmacological potential of the venom components. The present work studied the venoms of two distinct spiders: the Araneomorphae spider Loxosceles similis and the Mygalomorphae spider Lasiodora sp. In order to provide a better understanding of the study, this manuscript is divided into two chapters. CHAPTER 1 - Members of the spider genus Loxosceles can cause severe envenomation in humans, described as loxoscelism. Cutaneous loxoscelism is characterized by dermonecrosis which can require weeks to heal. Systemic loxoscelism is a rare complication marked by acute renal failure that leads to death in a few cases. Recently, the poorly studied L. similis species has been found in anthropic environments, mainly in the State of Minas Gerais. The first characterizations of the venom from this species showed that its main biological effects had a similar intensity to other medically important Loxosceles species. The aim of the first chapter of the present work was to characterize the specific anti-L. similis-venom serum and to evaluate the participation of LPA in the effects of both L. similis venom and L. intermedia dermonecrotic protein (recLiD1). Histological analysis of rabbit skin 2, 4 and 8 hours after intradermal injection of L. similis venom (3 µg) showed a dense inflammatory infiltrate, edema, muscle degeneration and necrosis, dissociation of collagen and reticular fibers. Pre-incubation of the venom with anti-L. similis-venom serum significantly decreased all of these effects. The main toxic component of Loxosceles spider venom presents phospholipase D (PLD) activity towards many lipid targets. There is current interest in investigating the role of lysophosphatidic acid (LPA) in loxoscelism. LPA is one of the products of PLD enzymatic action and it is described to induce platelet aggregation, endothelial hyperpermeability and pro-inflammatory responses. Treatment of HFF-1 human fibroblast cells with L. similis venom or recLiD1 (10 µg/mL, both pre-incubated with lysophosphatidylcholine, a precursor for LPA formation) provokes the release of pro-inflammatory cytokines and chemokines IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL2 after 12 hours, as well as cell death by apoptosis after 48 hours of incubation. The concomitant treatment of the cells with Ki16425 (15 µM), an antagonist of LPA receptors (LPA1/LPA3), significantly decreased the production of inflammatory mediators; however, it did not reduce the apoptotic effects of venom and recLiD1. On HUVEC human endothelial cells, Ki16425 did not reduce apoptosis caused by venom and recLiD1 after 48 hours of incubation either. Thus the present work has showed for the first time that LPA formed by PLD-dependent enzymatic activity of L. similis venom and recLiD1 has an important role in the release of pro-inflammatory cytokines and chemokines from human fibroblasts. Nevertheless, LPA receptors do not participate in HFF-1 and HUVEC cell death caused by these agents, at least in vitro and under our experimental conditions. CHAPTER 2 - Members of the spider genus Lasiodora are widely distributed in Brazil, where they are commonly known as caranguejeiras. Lasiodora sp. spider venom is slightly toxic to humans. The bite of this spider causes local pain, edema and erythema. However, Lasiodora venom may be a source of important pharmacological tools. Our research group has previously described the cardiovascular effects of Lasiodora sp. venom. In rats, this venom produces acute hypotension and bradycardia, decreased heart rate in the isolated heart, nitric oxide (NO)-dependent vasodilation and activation of endothelial nitric oxide synthase enzyme (eNOS) in aortic rings. The aim of the second chapter of the present work was to isolate and characterize one or more vasodilator components from Lasiodora sp. crude venom. We isolated one vasoactive fraction using fractionation techniques combined with biological assays in rat aorta. Mass spectrometry and nuclear magnetic resonance assays identified that the fraction is a mixture of two compounds: adenosine diphosphate (ADP, 88%) and adenosine monophosphate (AMP, 12%). It is known that ADP, as well as the crude venom, causes hypotension, NO-dependent vasodilation and eNOS activation. We determined that Lasiodora sp. venom contains enough amount of ADP to cause relaxation in rat aortic rings. The vasodilator effects of ADP and Lasiodora crude venom were significantly inhibited by suramin, which is a P2-purinergic receptors antagonist. The results of the present work indicate that ADP is an important vasodilator component of Lasiodora sp. spider venom.
- Published
- 2012
25. Análise peptidômica de venenos animais
- Author
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Breno Rates Azevedo, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Maria Elena de Lima Perez Garcia, André Junqueira Zaharenko, Daniel Carvalho Pimenta, Evanguedes Kalapothakis, and Dawidson Assis Gomes
- Subjects
Phasmahyla jandaia ,peptídeos biologicamente ativos ,Bioquímica #x ,seqüenciamento de novo ,espectrometria de massa ,Acanthoscurria natalensis ,Tityus serrulatus - Abstract
O presente estudo visou à prospecção e caracterização de peptídeos biologicamente ativos em venenos de animais representantes da biodiversidade brasileira, nomeadamente, Tityus serrulatus (Arachnida, Scorpiones, Buthidae), Acanthoscurria natalensis (Arachnida, Araneae, Theraphosidae) e Phasmahyla jandaia (Anura, Hylidae, Phyllomedusinae). Para tanto, empregou-se espectrometria de massa como ferramenta central. Destacam-se o seqüenciamento de novas famílias ou variantes peptídicos do veneno de T. serrulatus e dasecreção dérmica de P. jandaia, o que permitiu inferências sobre a biologia desses sistemas defensivos, e a determinação da estrutura primária completa da toxina -TRTX-An1a do veneno de A. natalensis. Ademais, demonstrou-se que a -TRTX-An1a, em preparação deneurônios DUM de Periplaneta americana, provoca aumento na freqüência de descargas espontâneas e diminuição da amplitude dos potenciais de ação. The present study aimed at the prospection and characterization of biologically active peptides in venoms of animal representatives of the Brazilian biodiversity, namely Tityus serrulatus (Arachnida, Scorpiones, Buthidae), Acanthoscurria natalensis (Arachnida, Araneae, Theraphosidae) and Phasmahyla jandaia (Anura, Hylidae, Phyllomedusinae). For the attainment of such goal, mass spectrometry was employed as the central tool. The sequencing of new peptidic families or variants from the venom of T. serrulatus and from theskin secretion of P. jandaia, which allowed inferences on the biology of these defensive systems, and the complete determination of the primary structure of the toxin -TRTX-An1a from the venom of A. natalensis are highlighted. Moreover, it has been demonstrated that - TRTX-An1a elicits an increase in the spontaneous discharges frequency and a diminishment in the action potential amplitude in Periplaneta americana DUM neuron preparation.
- Published
- 2011
26. Estudos estruturais e funcionais da toxina Gi-Tx1 da peçonha da aranha caranguejeira brasileira Grammostola iheringi (MYGALOMORPHAE: Theraphosidae)
- Author
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Gabriela Gontijo Montandon, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Alfredo Miranda de Goes, Dawidson Assis Gomes, Miriam Martins Chaves, and Evanguedes Kalapothakis
- Subjects
Grammostola ,Aranha caranguejeira ,Fisiologia e Farmacologia ,Aranha ,Fisiologia - Abstract
A maioria dos trabalhos com venenos de aranhas é dedicada ao estudo de peçonhas de espécies de importância médica. Venenos de baixa toxicicidade, antes negligenciados, hoje tem mostrado grande interesse científico porque são importantes fontes de sondas bioquímicas para dissecação molecular de processos farmacológicos.Peçonhas de caranguejeiras são ricas misturas de sais, nucleotídeos, aminoácidos livres, neurotransmissores, poliaminas, peptídeos, proteínas e enzimas. Este trabalho, iniciou-se com o veneno bruto de Grammostola iheringi, uma caranguejeira brasileira encontradaprincipalmente no sul do país, que foi purificado gerando várias frações e toxinas. O foco de nosso estudo foi uma nova toxina pura, com massa molecular de 3.585 Da, cuja sequência foi resolvida e chamada de Gi-Tx1. As atividades biológicas desta toxina foram caracterizadas via bioensaios de toxicidade, triagem eletrofisiológica realizada emneurônios obtidos de gânglio da raiz dorsal (DRG) de ratos e em subtipos de canais para sódio e potássio dependentes de voltagem, transfectados em ovócitos de Xenopus laevis. Estes estudos mostraram que Gi-Tx1 é capaz de bloquear parcialmente as correntes de entrada (40%) e de saída (20%) dos neurônios DRG, a 2 M e é capaz de bloquear totalmente os canais Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4 e Nav1.6 e parcialmente, os canais Nav1.5, DmNav, além de bloquear totalmente, os canais Kv4.3 e hERG nesta mesma concentração. Em células tumorais de fígado e mama, a toxina foi capaz de reduzir aproliferação (células SKHep-1 e MGSO3, respectivamente) mas não afetou as taxas de proliferação de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC's, não tumorais). Estes resultados em conjunto, revelam a ação promíscua de Gi-Tx1 em canaisiônicos para sódio e para potássio, bem como seu efeito antitumoral. Será interessante verificar se os efeitos bloqueadores em canais iônicos pela toxina, estariam relacionados ao seu efeito antitumoral e se esta toxina poderia concorrer para indicações de possíveis modelos de fármacos para o combate a determinados tipos de câncer. Most of the initial work on spider venoms has been devoted to the study of medically important species. Venoms of apparent lower toxicity, before neglected, have shown increased interest for scientific studies, because they are sources of important biochemical probes for the pharmacological dissection of molecular processes. Tarantulavenoms are rich mixtures of salts, nucleotides, free amino acids, neurotransmitters, polyamines, peptides, proteins and enzymes. Grammostola iheringi is a Brazilian tarantula spider found mainly in southern part of Brazil. Here, we studied the poison fractions and mainly a new toxin of 3.585 Da, named Gi-Tx1. The activities of this toxin werecharacterized by bioassays, electrophysiological screening performed on dorsal root ganglia neurons (DRG) and in voltage-gated sodium and potassium channels subtypes that have been transfected in ovocites of Xenopus leavis. Our results shows that Gi-Tx1 causes a partial block of inward (40%) and outward (20%) currents in DRG cells at 2 M and it is able to block Nav 1.2-.4, 1.6 subtypes, partially blocks Nav1.5 andDmNav, and fully blocks currents from Kv 4.3 subtypes and hERG channels at 2 M. In tumor cells, the toxin was able to reduce the proliferation (specifically on SKHep-1 and MGSO3 cells) but did not affect proliferation rates of normal cells (human PBMC's). These results reveal thepromiscuous action of Gi-Tx1 on ion channels and indicate its possible antiproliferative effects. It would be interesting to verify if exist a correlation of the effects of this toxin in ionic channels and its antitumoral activity.
- Published
- 2011
27. Clonagem e expressão heteróloga de PnTx2-6, uma toxina ativa na função erétil: obtenção e caracterização parcial de seus mutantes
- Author
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Fernanda Silva Torres, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Marcelo Ribeiro Vasconcelos Diniz, Suely Gomes de Figueiredo, Joaquim Coutinho Netto, Gloria Regina Franco, and Andre Ricardo Massensini
- Subjects
RPnTx2-6 ,Bioquímica ,Ereção peniana ,Mutantes ,Penis Ereção ,Mutação (Biologia) ,Escherichia coli ,Liberação de glutamato ,Toxinas recombinantes ,Toxinas Aplicações científicas ,Ácido glutâmico - Abstract
A peçonha da aranha brasileira Phoneutria nigriventer, conhecida popularmente como armadeira, é composta por diversas toxinas ativas em canais iônicos e outros receptores de mamíferos e insetos. Os envenenamentos envolvendo seres humanos são caracterizados por vários sintomas, incluindo neurotoxicidade, dor intensa, sudorese, agitação, salivação, priapismo, perturbações cardíacas, como taquicardia, arritmia e morte. Priapismo é uma ereção dolorosa e involuntária do pênis, também verificada na presença das toxinas purificadas, PnTx2-5 e PnTx2-6. Estudos eletrofisiológicos mostraram que estas toxinas deslocam a corrente de inativação de canais para sódio para potenciais hiperpolarizantes. Nosso grupo vem estudando o efeito da toxina PnTx2-6 na função erétil de ratos e camUongos. O tratamento com esta toxina potenciou a função erétil de ratos normotensos e reverteu total ou parcialmente, a disfunção erétil de ratos hipertensos DOCA-sal, e de camUongos idosos e diabéticos. O seu efeito mostrou-se ser mediado pelo NO, que aumenta na presença desta molécula. Estes resultados sugerem que a PnTx2-6 pode ser uma importante ferramenta para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos para o tratamento de disfunção erétil. Esta toxina é produzida em baixa quantidade na glândula de peçonha da aranha e isto é um fator limitante para estes estudos. Desta forma, houve um grande interesse na produção da proteína recombinante, de modo a provê-la para uma ampla investigação. Neste estudo, a região codificadora da toxina PnTx2-6 foi clonada e expressa como uma proteína de fusão à tiorredoxina, no citoplasma de E. coli. Após purificações e clivagens, testes in vivo indicam que a toxina recombinante apresenta atividade similar à toxina nativa e análises de Western-Blot revelaram que anticorpos anti-peçonha de Phoneutria nigriventer foram reativos contra esta molécula. O efeito da rPnTx2-6 na função erétil foi avaliado através de mudanças na razão entre a pressão intracavernosal e pressão arterial média (PIC/PAM) sob estimulação elétrica do gânglio pélvico maior de ratos normotensos. Injeções subcutâneas de rPnTx2-6 (12g/kg), como verificado para a toxina nativa, potenciaram a relação PIC/PAM sob estimulação gangliônica. A proteína de fusão recombinante foi efetiva, por sua vez, aumentando a liberação de glutamato em sinaptosomas cérebro-corticais de rato. Obtivemos também mutantes da toxina recombinante, visando-se verificar o papel chave de certos resíduos de aminoácidos para a ação desta toxina, conforme previsto por estudos prévios de modelagem molecular. Os mutantes foram construídos por síntese in vitro usando-se iniciadores específicos que continham em seus flancos as regiões de mutação. O vetor recombinante pET32c (+)-PnTx2-6, anteriormente clonado, foi usado como um molde para as mutações. Os plasmídeos mutantes foram transformados em E. coli, sequenciadas e expressas como proteínas de fusão à tiorredoxina. Estas foram purificadas (por cromatografia de afinidade e gel filtração). Até o momento, 6 mutantes foram idealizados (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35NW37L; Y35AW37A), dois quais 5 foram sequenciados (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) purificados e suas massas moleculares foram determinadas. Em comparação com a toxina nativa e a proteína de fusão recombinante, as proteínas de fusão mutantes foram testadas quanto à liberação de glutamato e foram menos ativas. Em conclusão, neste trabalho expressaram-se rPnTx2-6 e alguns de seus mutantes (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A), evidenciando-se o papel chave de alguns de seus resíduos de aminoácidos implicados na atividade biológica desta toxina. The venom of Brazilian armed spider, Phoneutria nigriventer, contains several toxins; many of them are active on ion channels and other receptors of mammals and insects. Accidents involving humans are characterized by various symptoms including: neurotoxicity, intense pain, sudoresis, agitation, salivation, priapism, cardiac perturbations characterized by tachycardia, arrhythmia and death. Priapism is a painful and involuntary erection of the penis that is also induced by the purified toxins PnTx2-5 and PnTx2-6. In addition, electrophysiological studies have shown that these toxins slow down the inactivation current of sodium channels. Our group has studied the effects of PnTx2-6 in erectile function of rats and mice. It has shown that PnTx2-6 potentiates the erectile function in normotensive rats and fully or partially restored the erectile function of DOCA-salt hypertensive rats, stz-diabetics and old mice. The effects of PnTx2-6 on erectile function are shown to be mediated by NO that increases in the presence of this toxin. These results suggest that PnTx2-6 could be an important tool for the development of new pharmacological agents for the treatment of erectile dysfunction. As the toxin is produced in low quantity in the spiders venom gland, this is a limiting factor for studies. Therefore, the recombinant production of this toxin is of great interest providing it to a range of experimental approaches. In this study, the encoding region of the PnTx2-6 toxin was cloned and expressed as thioredoxin fusion protein in the cytoplasm of E. coli. After purification and cleavage, tests in vivo indicated that the recombinant toxin presents activity similar to that of the native toxin and the Western-Blotting analysis revealed that the anti-venom antibody of Phoneutria nigriventer is reactive against recombinant toxin. The effect of rPnTx2-6 in the erection function was evaluated through changes in intracavernosal pressure/mean arterial pressure ratio (ICP/MAP) during electrical stimulation of the major pelvic ganglion of normotensive rats. Subcutaneous injection of rPnTx2-6 (12g/kg), as the natural peptide, potentiated the ICP/MAP induced by ganglionic stimulation. The rPnTx2-6 fusion protein increased the glutamate release by cortical synaptosomes in the rat brain. We also obtained mutant fusion proteins to check for the key role of certain amino acid residues in the toxin action, as previously suggested by molecular modeling. The mutants were constructed from in vitro synthesis by using specific primers that flanked the regions of mutations. The recombinant vector pET32c(+)-PnTx2-6, previously cloned, was used as a template for mutations. The mutant plamids were transformed in E. coli, sequenced, and expressed as thioredoxin fusion proteins. The mutant fusion proteins were purified (affinity and gel filtration chromatographies). To date, six mutants were idealized (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35NW37L; Y35AW37A). Five (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) were sequenced (DNA), purified, and their molecular masses were determined. The mutant fusion proteins, comparative with native toxin and recombinant fusion proteins, were tested for their effect on glutamate release. All the mutants were less effective in releasing glutamate compared to the native toxin PnTx2-6 and recombinant fusion protein rPnTx2-6. In conclusion,we expressed the rPnTx2-6 active and some of its mutants (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) evidencing the key role of some amino acid residues implied in the biological activity of this toxin.
- Published
- 2011
28. Indução de edema de boca em ratos como modelo de detecção de drogas anti-inflamatórias de ação local
- Author
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Paula Ladeira Ortolani, Janetti Nogueira de Francischi, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Igor Dimitri Gama Duarte
- Subjects
Boca Inflamação ,Inflamação ,Inovação Biofarmacêutica ,Agentes antiinflamatórios - Abstract
O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo experimental de inflamação aguda na cavidade oral de ratos, tendo como padrão de comparação o edema da pata de ratos. A avaliação do edema, medido por um paquímetro, foi realizada em paralelo ao extravasamento do azul de Evans, outro indicador de atividade inflamatória nos tecidos, sob as mesmas condições. A inflamação foi induzida em ratos, machos da raça Holtzman, no lábio superior na porção média do músculo masséter (bochecha) do lado direito por uma injeção subcutânea (na boca), externamente ou internamente (via mucosa oral) de 500 g de -carragenina (CG) e do lado contralateral foi injetado uma solução salina 0,9% no mesmo volume. Como controle, as medições do volume de edema foram realizadas antes da administração do agente flogogênico (0 hora) e após nos tempos ½, 1, 2, 3, 4 e 6 horas. Enquanto que a permeabilidade vascular foi avaliada pelo extravasamento do corante azul de Evans para o espaço intersticial da mucosa oral, em dois tempos, sendo um previamente ao efeito máximo da carragenina (15 min), e no outro no momento em que ocorria o pico do edema (1 hora). Para a avaliação da ação de antiinflamatórios, drogas convencionais de diferentes classes foram administradas, 30 minutos antes o estímulo flogogênico, sendo elas: indometacina (2 mg/kg), ibuprofeno (20 mg/kg) celecoxibe (12 e 30 mg/kg) e dexametasona (1 mg/kg). Todas apresentaram uma redução significativa do edema em relação ao grupo controle. A avaliação de possíveis mediadores inflamatórios também foi realizada através da administração do maleato de pirilanina (10 mg/kg, antagonista do receptor H1 da histamina) e maleato ácido de pizotifeno (2 mg/kg, antagonista misto da histamina e serotonina) que por inibir em significativamente a inflamação na primeira hora, confirmaram a ação dos principais mediadores inflamatórios envolvidos no edema de pata traseira e já descritos na literatura. Ao final do trabalho foi possível concluir que o edema de boca responde com a mesma sensibilidade que o edema de pata às drogas antiinflamatórias esteroidais e não-esteroidais, podendo detectar drogas com atividade anti-inflamatória potenciais ainda na primeira hora, sendo dessa forma um modelo mais rápido do que o edema de pata de ratos. The present study aimed to develop an experimental model of acute inflammation in oral cavity of rats, it has been considered as a standard of comparison the hind paw edema of the rats. The edema rating was performed in parallel to the extravasation of Evans blue, another indicator of inflammatory activity in tissues with the same conditions. The inflammation was induced in rats, Holtzman male, in the upper lip into the middle portion of the masseter muscle (cheek) on the right by a subcutaneous injection of 500 mg of -carrageenan (CG) and the hand side saline solution 0.9% was injected in the same volume. Measurements of the volume of edema was rated before edematogenic agent (0 hour) administration and after in ½, 1, 2, 3, 4 and 6 hours. While vascular permeability was estimated by extravasation of Evans blue onto the interstitial space, occurred on two occasions, with a previously to the maximum effect of carrageenan (15 min), and another occurred at the time of peak edema (1 hour). For the evaluation of anti-inflammatory action, conventional drugs of different types were administered: indomethacin (2 mg / kg), ibuprofen (20 mg / kg), celecoxib (12 and 30 mg / kg) and dexamethasone (1 mg / kg) 30 minutes before stimulation with the CG. All theses drugs showed a significant reduction of edema if it was compared with the control group. The rating of possible inflammatory mediators was also achieved through the administration of maleate pyrilamine (10 mg / kg, the antagonist of histamine H1 receptor) and maleate pizotifen acid (2 mg / kg, mixed antagonist of histamine and serotonin) whose had a significant inhibition of the inflammation in the first hour, confirming the action of the major mediators involved in the inflammatory edema in the hind paw. At the end of the study, it was possible to conclude that the oral edema responds with the same sensitivity of the hind paw edema to inflammatory drugs, non-steroidal and steroidal, and can detect drugs with potential anti-inflammatory activity even in the first hour, so thus a faster model.
- Published
- 2011
29. Investigação do efeito neuroprotetor da toxina tx3-4 da aranha phoneutria nigriventer na isquemia cerebral em ratos
- Author
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Maira de Castro Lima, Andre Ricardo Massensini, Marcio Flavio Dutra Moraes, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Antonio Lucio Teixeira Junior, Edson Amaro Junior, and Ionara Rodrigues Siqueira
- Subjects
Fisiologia e Farmacologia ,Fisiologia #x ,Aranha Veneno - Abstract
Os acidentes vasculares encefálicos são a principal causa de morte e incapacidade funcional no Brasil e na América do Sul. A busca por uma droga neuroprotetora que evite a morte neuronal e conseqüente dano neurológico é intensa na comunidade científica. O objetivo desse estudo foi investigar o potencial neuroprotetor da toxina Tx3-4, antagonista de canais para cálcio voltagem dependente, em casos de isquemia cerebral em ratos. Foi investigado o efeito da injeção central da toxina através de registros eletroencefalográficos, eletrocardiográficos e de pressão arterial nas doses de 0,16g; 0,32g; 0,75g e 1,5g por animal. O modelo de isquemia cerebral focal e transitória utilizado foi o de oclusão da artéria cerebral média. Para investigação do efeito neuroprotetor da toxina foram utilizadas as doses 0,16g; 0,32g; 0,75g por animal. Registros de EEG foram realizados para confirmar a interrupção do fluxo sanguíneo para o hemisfério submetido à isquemia. Testes sensoriais e motores foram utilizados para avaliar desempenho funcional dos animais. Imagens de ressonância magnética foram feitas para o acompanhamento do volume de infarto ao longo de 5 semanas. Foram testadas doses e tempos de tratamento diferentes. A injeção central da toxina não alterou os valores de freqüência cardíaca. No entanto, todas as doses causaram alterações significativas na pressão arterial e em parâmetros do EEG. Essas alterações não induziram sérias alterações fisiológicas ou morte dos animais. Todas as doses de toxina utilizadas no estudo de isquemia promoveram neuroproteção funcional e estrutural. Imagens de ressonância magnética confirmaram que a toxina é capaz de proteger o tecido neural quando injetada 30 minutos e 2 horas após o início da lesão isquêmica. A xii toxina Tx3-4 apresenta baixa toxicidade, promove neuroproteção funcional e estrutural. Essa proteção é mantida a longo prazo e obtida com a toxina sendo injetada 2 horas após o início de lesão isquêmica. Stroke is the leading cause of death and disability in adults in South America and Brazil. Lots of research groups in the world try to find a neuroprotective drug that avoid neuronal death and consequent functional incapacity after stroke. The main objective of this study was investigating the neuroprotective effect of the toxin Tx3-4, antagonist of calcium channel voltage dependent, after cerebral ischemia in rats. The effect of central injection of toxin was studied using electroencephalographic, electrocardiographic and arterial pressure records to the doses 0.16g; 0.32g; 0.75g e 1.5g per animal. The focal and transient experimental ischemic model used was the middle cerebral artery occlusion (MCAo). Doses 0.16g; 0.32g; 0.75g were used to investigate the neuroprotective effect of the toxin Tx3-4 after cerebral ischemia in rats. Electroencephalographic records showed the interruption of blood to the left hemisphere after MCA left occlusion. Sensorial and motor tests were done to evaluating functional status of the animals after lesion. Magnetic resonance images were used to assessing infarct volume and functional status for 5 weeks. Different doses and time treatment were evaluated. Central injection of toxin did not change the heart rate of the animals. However, all studied doses changed mean arterial pressure and total energy of EEG, though these changes have not leaded the rats to death. All tested doses could protect cerebral tissue of death. Functional and structural protections were seen in all doses. Magnetic resonance images showed strutuctural protection by Tx3-4 injected 30 minutes e 2 hours after the beginning of xiv ischemia. Tx3-4 toxin showed low toxicity, functional and structural neuroprotective effect injected 30 minutes or 2 hours after beginning of cerebral ischemia.
- Published
- 2010
30. Peptidoma parcial do veneno do escorpiao da amazonia Brotheas amazonicus
- Author
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Ivanildce Cristiane Ireno, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Marcelo Matos Santoro, and Marcia Helena Borges
- Subjects
Bioquimica ,Bioquímica ,Escorpião Veneno ,Imunologia ,Escorpião Amazônia - Abstract
O Brotheas amazonicus é um escorpião endêmico da região norte do Brasil. Por viver em região de floresta os casos de acidentes com esta espécie acontecem esporadicamente. No presente estudo, foi empregada cromatografia líquida bidimensional (2D-LC), MALDI-TOF-TOF, seqüenciamento de novo e pesquisa por similaridades em bancos de dados a fim de conhecer a diversidade peptídica do veneno de Brotheas amazonicus. Os perfis de 2D-LC e composição de massas moleculares são apresentados. Um total de 201 espécies moleculares foi identificado com massas entre 800 e 17000 Da. Oito peptídeos foram seqüenciados, sendo que nenhum deles apresentou similaridade com outras moléculas conhecidas. Dois deles apresentaram amidação C-terminal. As moléculas com massas entre 6 e 7,5 KDa equivaleram à aproximadamente 8% do total de moléculas detectadas, as moléculas com massas entre 2 e 7 KDa equivaleram à 43%. O restante das moléculas apresentaram massas variando de 0,8 KDa à 2 KDa e de 7 KDa à 17 KDa. Este trabalho demonstra que muito se tem a descobrir a respeito desses animais e a composição de suas peçonhas. Brotheas amazonicus is an endemic scorpion from the northern Brazil. Since it dwells the Amazon forest, human accidents involving this species occur sporadically. In this study, two-dimensional liquid chromatography (2D-LC), MALDI-TOF-TOF, de novo sequencing and similarities searches were employed in assessment of the peptide diversity of the Brotheas amazonicus venom. The chromatographic profiles and the mass compositions of the venom are provided. A total of 201 molecules were detected with molecular masses between 800 and 17000 Da. Eight peptides were de novo sequenced which did not present significative similarity with other known molecules. The molecules with masses between 6 and 7.5 KDa corresponded to approximately 8% of all detected molecules and molecules with masses between 2 and 7 KDa corresponded to 43%. Other molecules have masses ranging from 0.8 KDa to 2 KDa and 7 KDa to 17 KDa. This work shows that much has yet to be discovered regarding these animals and the composition of their venoms.
- Published
- 2009
31. Minimização da estrutura primária do peptídeo TsHpt-I: Identificação dos resíduos de aminoácidos cruciais e da estrutura peptídica mínima para a manutenção de seus efeitos anti-hipertensivos
- Author
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Thiago Verano Braga, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Ronaldo Alves Pinto Nagem, Anderson Jose Ferreira, Daniel Carvalho Pimenta, and Marcelo Porto Bemquerer
- Subjects
Bioquimica ,Bioquímica ,Bradicinina Fisiologia ,Imunologia ,Peptídios ,Vasodilatadores - Abstract
Após a descoberta dos primeiros peptídeos potenciadores de bradicinina (PPBs) no início dos anos 70, por Sérgio Ferreira e colaboradores, várias moléculas similares foram identificadas na peçonha de artrópodes e vertebrados. Utilizando ferramentas proteômicas, uma nova família de peptídeos foi isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e denominada T. serrulatus Hipotensinas (TsHpts). Estes peptídeos são lineares e capazes de potenciar os efeitos hipotensivos da bradicinina (BK). Foi realizado um estudo de minimização da estrutura primária de TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA), um membro desta família, para inferir os resíduos de aminoácidos cruciais para a atividade biológica das Hipotensinas, além de avaliar a estrutura primária mínima capaz de manter esta atividade. Utilizando a extremidade C-terminal de TsHpt-I como molde, foram sintetizados os peptídeos TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) e TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), que não contém uma carga positiva na sua cadeia lateral. Todos os peptídeos que apresentam as duas prolinas C-terminais foram capazes de potenciar a BK, sendo que a carga positiva do radical da lisina se mostrou crucial para que estes peptídeos induzam uma hipotensão imediata e transiente, quando administrados intravenosamente. O efeito vasodilatador, dependente de endotélio e da síntese de NO, também foi afetado pela ausência da carga positiva deste resíduo de aminoácido. Diferentemente da grande maioria dos PPBs descritos, TsHpt-I e seus análogos sintéticos não foram capazes de inibir a ECA. Este estudo também revelou que a minimização estrutural de TsHpt-I não alterou significativamente os seus efeitos cardiovasculares, muito importante do ponto de vista biotecnológico, pois peptídeos de baixa massa molecular apresentam poucos, ou nenhum ponto de clivagem proteolítica, além de terem baixo custo de síntese. Using a proteomic approach, a new structural family of peptides was put in evidence in the venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus. T. serrulatus Hypotensins (TsHpt) are random-coiled linear peptides that act as bradykinin potentiating peptides (PPBs). Aiming to better understand the relationship between the primary structure of TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA) and its capacity to potentiate the hypotensive effect of BK, some synthetic peptides were constructed using the C-terminal portion of TsHpt-I as model; TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) and TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), which do not have the positive charge in the lysine radical. All synthetic peptides holding the doublet PP at the C-terminal could potentiate the hypotensive effect of BK, but only the analogs that have the lysine residue, could induce a transient hypotension when intravenously administrated in male rats, indicating that the positive charge located towards the radical of this amino acid residue is crucial for this cardiovascular effect. The capacity of these peptides to induce an endothelium and NO dependent vasorelaxating effect was either affected by the absence of this positive charge. Despite several PPBs inhibit ACE, TsHpt-I and the synthetic analogs could not inhibit this enzyme. This study has also demonstrated that the reduction of the primary structure of TsHpt-I does not significantly alter the biological effects of this native peptide, which could be interest by biotechnological purpose, as minimization of enzymatic hydrolysis points, as well as lowering production costs.
- Published
- 2009
32. Plasticidade sináptica e sobrevivência neuronal após avulsão de raízes motoras e tratamento com células tronco mesenquimais
- Author
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Rafaela Chitarra Rodrigues Hell, Alfredo Miranda de Goes, Alexandre Leite Rodrigues de Oliveria, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Jader dos Santos Cruz, Antonio de Castro Rodrigues, and Luiz Eugenio Araujo Melo
- Subjects
Bioquímica ,Neuroplastia ,Neurônios ,nervous system ,Imunologia ,Neuroimunologia ,Sistema nervoso central - Abstract
A avulsão de raízes motoras, na interface do sistema nervoso central e periférico, promove uma significativa perda sináptica com degeneração de até 80% dos motoneurônios afetados, não havendo, até o presente momento, estratégias eficazes que propiciem uma reversão ou amenização deste quadro. Recentes estudos atribuem um potencial neuroprotetor à produção de fatores neurotróficos por células tronco mesenquimais (CTM). Porém, pouco se sabe sobre o impacto deste tratamento na sobrevivência neuronal e plasticidade sináptica no sistema nervoso central (SNC). Com o intuito de investigar processos relacionados com esse tratamento, o presente trabalho propôs a análise da sobrevivência de motoneurônios medulares em ratos submetidos a avulsão de raízes motoras, após terapia utilizando CTM, nos períodos agudo (2 semanas) e crônico (6 semanas) após a lesão. Foi realizada uma análise da dinâmica das sinapses e da reação astroglial. A fim de identificar condições que promovessem a sobrevivência e regeneração de motoneurônios axotomizados, foram determinadas a produção de RNAm para fatores neurotróficos (BDNF e GDNF) in vitro e in vivo, bem como a detecção das proteínas in vivo. Dessa forma, foi observado que o tratamento com CTM promoveu um significativo efeito neuroprotetor sobre os motoneurônios lesados e conseqüente aumento da sobrevivência neuronal nos períodos agudo e crônico pós-lesão. Tal proteção pôde ser atribuída a produção local de BDNF e GDNF pelas CTM e por sua ação sobre células residentes do SNC. A presença das CTM no microambiente medular promoveu estabilização sináptica, redução da astrogliose reativa, o que transcendeu a necessidade de diferenciação em neurônios ou glia, uma vez que estas asseguraram uma síntese local dos fatores neurotróficos. The ventral root avulsion, in the interface of the central and peripheral nervous system, promotes a significant synaptic loss with degeneration up to 80% of the affected motoneurons. Until the present moment, there are not effective strategies that propitiate a reversion or assuage this clinical. Recent studies attribute a neuroprotective potential of mesenchymal stem cells (MSC) to the production of neurotrophic factors. However, little is known about the impact of this treatment in the neuronal survival and synaptic plasticity in the central nervous system (CNS). With the intention of investigating processes related with this treatment, the present study proposed the analysis of the survival of medullary motoneurons in rats subjected to the ventral root avulsion, after therapy using MSC, in the acute (2 weeks) and chronic (6 weeks) periods after the lesion. An analysis of the synaptic inputs dynamics and the astroglial reaction was accomplished. In order to identify conditions to promote the survival and regeneration of axotomized motoneurons, the production of RNA for neurotrophic factors (BDNF and GDNF) was determined in vitro and in vivo, as well as the detection of these proteins in vivo. Thus, it was observed that the treatment with MSC promoted a significant neuroprotective effect on the harmed motoneurons and consequent increase of the neuronal survival in the acute and chronic periods after the lesion. Such protection could be attributed to the local production of BDNF and GDNF by MSC andfor their action on resident cells of CNS. The presence of MSC in the spinal cord microenvironment promoted synaptic stabilization, reduction of the glial reaction, what transcended a need for differentiation in neurons or glia, once these assured a local synthesis of the neurotrophic factors.
- Published
- 2008
33. Prospecção dos inibidores de fosfolipases A2 das classes alfa e gama (PLI e PLI) endógenos no plasma de serpentes Crotalidae brasileiras: caracterização molecular e propriedades biológicas
- Author
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Maria Inacia Estevao Costa, Gloria Regina Franco, Consuelo Latorre Fortes-dias, Jonas Enrique Aguilar Perales, Marta do Nascimento Cordeiro, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Carlos Renato Machado
- Subjects
Bioquímica ,Serpentes ,Fosfolipase A2 Inibidores ,Cobra Veneno ,Bioquímica e imunologia ,Inibidores enzimáticos - Abstract
A presença de inibidores plasmáticos de fosfolipase A2 (PLA2) no plasma de serpentes tem sido relatada por vários pesquisadores. Estes inibidores atualmente são classificados em três classes: alfa, beta e gama, de acordo com sua estrutura (Ohkura e cols., 1997). Inibidores alfa apresentam domínios semelhantes ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) das lectinas tipo-C, enquanto inibidores da classe gama apresentam em sua estrutura, repetições ricas em leucina (LRR), como a 2-macroglobulna humana. Já a classe gama mostram um padrão de resíduos cisteína similar ao do receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (u-PAR). Neste trabalho investigamos a presença de cDNAs codificadores de inibidores de PLA2 (PLIs) das classes alfa e gama no fígado de seis espécies de serpentes do gênero Bothrops (B. alternatus, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi), além de Lachesis muta muta e Crotalus durissus terrificus. Os cDNAs foram obtidos por RT-PCR a partir do RNA total do fígado de cada espécime. A amplificação do DNA foi realizada por PCR na presença de oligonucleotídeos desenhados com base na sequência de nucleotídeos publicados na literatura (inibidor alfa de Agkistrodon blomhoffii siniticus e no inibidor gama de C. d. terrificus). Os produtos de amplificação foram clonados em vetores do tipo TA e colônias recombinantes positivas foram confirmadas por PCR. Os DNAs de pelo menos quatro clones positivos para cada inibidor alfa e dois clones para cada inibidor gama foram completamente sequenciados. As sequências nucleotídicas, assim como as estruturas primárias deduzidas foram alinhados com sequências de inibidores conhecidos para pesquisa de homologia. Utilizando ferramentas de bioinformática foram realizadas análises detalhadas para cada proteína. Foram derivadas árvores filogenéticas para cada classe de PLIs brasileiros descritos, assim como a sugestão de modelos tridimensionais. A expressão de uma proteína recombinante da classe alfa foi realizada com sucesso em sistema de expressão procariota. The presence of phospholipase A2 (PLA2) inhibitors in the blood plasma of snakes has been reported by several authors. These inhibitors are, presently, classified in three structural classes named alfa, beta and gamma. Alfa-inhibitors contain a domain similar to the carbohydrate recognition domain (CRD) of C-type lectins, whereas beta-inhibitors display leucine-rich repeats (LRR) such as those present in the human alpha2- macroglobulin. In the gamma-class members, in turn, the cystein pattern resembles that found in the uroquinase-type plasminogen activator receptor (u-PAR). In the present study we investigated the presence of mRNA codifying for alfa- and gamma-PLA2 inhibitors (PLIs) in the liver tissue of of six Brazilian snake species in the genus Bothrops (B. alternatus, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni and B. neuwiedi) besides Lachesis muta and Crotalus durissus terrificus, by RT-PCR. DNA amplification was performed in the presence of primers designed based on PLIs already published in the literature (an alpha-PLI from Agkistrodon blomhoffii siniticus and a gamma-PLI from C. d. terrificus). The amplification products were cloned in TA-kind plasmid vector and a number of putative positive clones was confirmed by PCR. The DNAs of a minimum of four and two positive clones for alfa- and gamma- PLIs, respectively, were completely sequenced. The nucleotide sequences as well as the deduced primary sequences obtained were aligned with known PLIs looking for homology. A detailed analysis of each novel PLI-homologous protein was performed using bioinformatics tools. Phylogenetic trees were derived for the alpha- and gamma-PLIs from Brazilian snakes described, so far, and the tridimensional structure of an alpha-PLI (from L. muta) was modelled by homology. The obtention of a representative recombinant protein alpha-PLI (in procariote) are described.
- Published
- 2008
34. Análise da institucionalização do comitê de ética em pesquisa daUniversidade Federal de Minas Gerais (1997-2007): complexidades e desafios
- Author
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Marcia dos Santos Pereira, Dirceu Bartolomeu Greco, Marilia Novais da Mata Machado, Elma Lourdes Campos Pavone Zoboli, Germano Cord Neto, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Claudio de Souza
- Subjects
Ciências da Saúde ,Experimentação humana/ética ,Violações dos direitos humanos ,Participação comunitária ,Comitês de ética em pesquisa/história ,Medicina tropical ,Termos de consentimento ,Universidades ,Pesquisa qualitativa ,Infectologia e Medicina Tropical ,Pesquisadores ,Ética em pesquisa ,Comitês de ética em pesquisa/tendências ,Bioética - Abstract
No século XXI, especialmente nos países pobres, os impactos sociais do acelerado desenvolvimento científico sinalizam para a necessidade de se ampliar o debate sobre um dos pilares da reflexão bioética: a questão da ética nas pesquisas em seres humanos. Extremamente coerente com essa discussão, no Brasil, e com a Resolução196/1996, cresce de forma significativa o número de comitês de ética em pesquisa (CEPs). Em todo o país, até maio de 2007, registram-se 546 CEPs ligados à Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Conep). Sobre o funcionamento dos CEPs no Brasil, Freitas (2006, p. 51) observa:Não se tem ainda uma bibliografia ampla o suficiente para trazer uma visão clara da realidade, especialmente considerando a diversidade de experiências. Assim, o objetivo geral desta tese, foi o de compreender o fenômeno da institucionalização do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG (Coep/UFMG) no período de 1997-2007. Neste estudo de caso qualitativo, fundamentado em conhecimentos das chamadas ciências da complexidade, com dados coletados mediante observações e entrevistas semi-estruturadas, com 19 membros do Coep, as informações foram analisadas, principalmente, a partir de conceitos chave da análise institucional, como os de instituído, instituinte, fato analisador e imaginário social. A análise institucional, uma das práticas de pesquisa ligadas à pesquisa-ação, ao trazer àtona as interações sociais e as relações entre os atos fundadores e as questões atuais do Coep/UFMG, foi fundamental para a compreensão do processo de institucionalização do comitê em seu estado ativo e dinâmico e permitiu concluir que o grande desafio hoje para o Coep/UFMG é o de avançar para além do seu regimento, da aquisição de orçamento e da área física própria, condições exigidas pelaResolução196/96 e evidentemente necessárias, mas não suficientes para o verdadeiro exercício de sua função de proteção dos sujeitos voluntários das pesquisas. Entre outras considerações, a análise do discurso evidenciou que os membros do Coep/UFMG o consideram um colegiado interdisciplinar, independente, de interesse público, que tem estimulado o debate sobre a ética nas pesquisas em seres humanosnessa universidade. Entretanto, para eles, nem todos os pesquisadores dessa Universidade têm uma visão clara das atribuições desse comitê e consideram que o peso da normatização e da burocracia podem estar influenciando negativamente no processo de institucionalização do Coep/UFMG e, neste sentido, sugerem que esse comitê precisa aprimorar sua relação com os pesquisadores, rever seus protocolos,agilizar seus processos de trabalho, acompanhar os projetos aprovados e expandir sua função educativa. Nessa reflexão, a autonomia surge como questão central da ética na pesquisa em seres humanos. Não a autonomia individualista tão destacada na atualidade, mas a autonomia que emancipa, pressuposto necessário para se falar deética, ou seja, da capacidade que as pessoas têm de se autodeterminar em função da própria realização e de sustentar a luta pela transformação social, pela ética da defesa da vida e da dignidade humana. Desse modo, não se fala de uma ética moralista, masda idéia de implicação ética de sujeitos autônomos, aqui representados pelos sujeitos voluntários, pelos pesquisadores e pelo Coep/UFMG. In the twenty-first century, especially in poor countries, the social impacts of the rapid scientific development signalize for the need to broaden the debate on one of the pillars of bioethics: the issue of ethics in research in humans. Extremely consistent with this discussion, in Brazil, the resolution 196/1996 increases in a significant way the numberof Institutional Research Ethics Committees (RECs). Throughout the country, until May 2007, 546 RECs were registered linked to the National Commission for Research Ethics (CONEP). About the functioning of the RECs in Brazil, Freitas (2006, p. 51) notes: There is no a bibliography wide enough to bring a clear vision of reality, especially considering the diversity of experiences. Thus, the overall purpose of this thesis was tounderstand the phenomenon of institutionalization of the Committee on Ethics in Research at the Minas Gerais Federal University (COEP/UFMG) in the period of 1997- 2007. In this qualitative case study, based on knowledge of the called sciences of complexity, with data collected through observations and semi-structured interviews with 19 members of COEP, the information was analyzed, primarily from key conceptsof the institutional analysis, such as the instituted, instituting, the fact analyzer and social imagination. The institutional analysis, a search practice linked to the searchaction, to bring up the social interactions and relationships between the founding acts and the current issues of COEP/UFMG, was fundamental to the understanding of theprocess of institutionalization of the committee in its active and dynamic state and indicated that the great challenge today for the COEP/UFMG is to move beyond its bylaws, the acquisition of the budget and its own physical area, conditions of the resolution 196/1996 and obviously necessary, but not sufficient for the real exercise of its function to protect the research volunteers. Among other considerations, thediscourse analysis showed that members of COEP/UFMG is one interdisciplinary collegiate, independent of public interest, which has stimulated the debate on ethics in research in humans in that University. However, for them, not all of that University researchers have a clear vision of the tasks of this committee and believe that the weight of standardization and bureaucracy may be negatively influencing the process of institutionalization of COEP/UFMG and, in this respect, suggest that this committee needs to improve its relationship with the researchers, revise its protocols, streamline their work processes, monitor the projects approved and expand its educationalfunction. In this reflection, autonomy emerges as key issue of ethics in research in humans. Not the "individualistic autonomy" as highlighted at the present times, but the autonomy that emancipates, assumption necessary to speak on ethics, or the ability that people have to self determinate depending on the actual implementation and to sustain the struggle for social transformation, the ethics of the defense of life andhuman dignity. Thus, there is no mention of a moral ethics, but the idea of ethical implication of autonomous people, represented here by volunteers, by researchers and by the COEP/UFMG.
- Published
- 2007
35. Marcação de antiveneno escorpiônico com tecnécio-99m e a suabiodistribuição em ratos de 21-22 dias
- Author
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Dayana Sampaio Cardoso, Elziria de Aguiar Nunan, Consuelo Latorre Fortes-dias, and Maria Elena de Lima Perez Garcia
- Subjects
Tecnécio-99m e a sua ,Escorpião Veneno ,Radioisótopos ,Biodistribuição em ratos de 21-22 dias ,Marcação de antiveneno escorpiônico ,Imunoterapia ,Farmácia ,Toxicologia ,Tityus serrulatus - Abstract
A freqüência com que ocorrem acidentes por escorpiões em algumas regiões do Brasil constitui um problema de saúde pública, principalmente em Minas Gerais e São Paulo. A espécie Tityus serrulatus, o escorpião amarelo, é considerada a mais venenosa daAmérica do Sul, devido à alta toxicidade do seu veneno, sendo acidentes com crianças os mais graves. A imunoterapia, considerada o único tratamento realmente específico para o envenenamento, tem sido vista por vários pesquisadores e estudiosos como indispensável, mas ineficiente para outros, principalmente em relação à prevenção ebloqueio das manifestações cardiovasculares induzidas pelo veneno, que acometem crianças. A tityustoxina, uma das proteínas mais tóxicas do veneno do escorpião T. serrulatus, se distribuiu diferentemente no organismo de ratos adultos (150-160 dias) e de ratos jovens (21-22 dias). Considerando-se a ausência de informações sobre abiodistribuição do antiveneno escorpiônico em animais jovens, efetuou-se a marcação do antiveneno produzido pela Fundação Ezequiel Dias (Funed) com 99mTecnécio e realizou-se estudos de biodistribuição do mesmo em ratos jovens (21-22 dias). A marcação foi feita empregando-se dois agentes redutores, o cloreto estanoso e oborohidreto de sódio. A purificação do produto marcado foi feita por filtração usando membrana de éster de celulose. Foi obtido um rendimento de marcação com 99mTecnécio de 98,32±0,69%, após purificação. O rendimento de marcação permaneceu constante após incubação com PBS pH 7,4 a 37°C por até 24 h, indicandoestabilidade do soro marcado por no mínimo 24 h. A manutenção da atividade do antiveneno após marcação com 99mTc foi verificada in vivo e in vitro. In vivo a potência foi determinada e comparada com a do antiveneno não marcado. Não se observou diferença estatística significativa entre as potências do antiveneno não marcado (1,21mg/mL) e marcado (1,12 mg/mL). In vitro, a manutenção da imunorreatividade de 99mTc- F(ab)2 foi verificada usando cromatografia de imunoafinidade, e esta apresentou ligação específica com o veneno. As condições de marcação não promoveram fragmentação do anticorpo como demonstrado por eletroforese SDS-PAGE. O processo de marcação foi eficiente e o antiveneno marcado com 99mTecnécio pôde ser utilizado com segurança nos estudos de biodistribuição. A captação do antiveneno escorpiônico marcado com 99mTc nos órgãos de ratos de 21-22 dias foi maior no rim, seguido do baço, fígado, coração, pulmão, tireóide e cérebro. Apesar de não esperado, observousecaptação da fração específica pelo cérebro. As AUC 0 - 24 h dos rins e sangue foram bem maiores e a do cérebro bem menor quando comparadas com as dos outros órgãos. O único órgão que apresentou valor de Kp maior que um foi o rim. Esses resultados indicam que o antiveneno permanece mais tempo no sangue e que suaeliminação deve ser via renal. Foram verificadas diferenças quando foram comparados os perfis de captação de F(ab)2 antiescorpiônica e da tityustoxina nos mesmos órgãos de animais jovens. A comparação dos valores de tmáx e Kp para F(ab)2 e para tityustoxina mostrou que a F(ab)2 antiescorpiônica se distribui mais lentamente para osórgãos. Após 24 horas de administração da fração específica, esta ainda está em fase de decaimento, em contraposição com o veneno que já foi quase completamente eliminado. Verificou-se que F(ab)2 se distribui do sangue para os órgãos alvos do envenenamento, inclusive o cérebro, porém em quantidades e tempos diferentes do veneno o que poderá comprometer a eficácia da neutralização dependendo daconcentração da fração que se liga especificamente ao veneno e o tempo decorrido após a picada. The frequency that accidents with scorpions occur in some regions of Brazil constitutes a problem of public health, mainly in Minas Gerais and São Paulo. The species Tityus serrulatus, the yellow scorpion, is considered the most venomous of South America, due to high toxicity of its venom, showing serious damage in accidents with children. Theimmunotherapy, considered the only specific treatment for the envenomation, has been considered for some researchers as indispensable, but inefficient for others in relation to the prevention and blockade of venom-induced cardiovascular manifestations, mostly inchildren. Due to the tityustoxin, the highest venom toxic protein of T. serrulatus, shows different body distribution between adult rats (150-160 days-old) and young rats (21-22 days-old), and the absence of information about body distribution of the antivenom in young animals, the antivenom produced by Fundação Ezequiel Dias (Funed) waslabeled with 99mTechnetium to study of body distribution in young rats (21-22 days-old). The labeling was made using two reducing agents, the stannous chloride and sodium borohydride. The purification was made by filtration using cellulose ester membrane. A labeling yield of 98.32±0.69% was obtained after the purification. The labeling yield afterincubation with PBS pH 7.4 at 37 °C remained constant showing that stability of 99mTc- F(ab) 2 was preserved. The maintenance of the antivenom activity after labeling with 99mTc was verified in vivo and in vitro. In vivo, the potency was determined and compared with unlabeled antivenom. It was not observed any statistical difference between potencies of unlabeled (1.21 mg/mL), and labeled (1.12 mg/mL) antivenom. In vitro the immunoreactivity of 99mTc-F(ab)2 was verified using affinity chromatograph. 99mTc-F(ab)2 presented specific bound with venom. The process of labeling did not cause protein fragmentation as demonstrated by SDS-PAGE electrophoresis. The labeling process was efficient and the technetium99m labeled scorpion antivenomcould be safely used for body distribution studies. The labeled scorpion antivenom in 21- 22 days-old rats reached a maximum uptake in kidneys, followed by spleen, liver, heart, lung, thyroid and brain. The uptake of the specific fraction was unexpectedly observed in brain. AUC 0 - 24 h were larger to kidneys and blood, and smaller to brain when comparedwith other organs. Just kidneys showed value of Kp larger than one. These results indicated that the antivenom stays more time in blood and has a renal elimination. Differences were verified between profiles of uptake of F(ab')2 and of the tityustoxin in the same organs of young animals. The comparison of the tmax values and Kp for F(ab')2and tityustoxin showed that F(ab')2 is distributed slower for the organs than the tityustoxin. The decline phase still is happening after 24 hours of specific fraction administration, differently of the venom that was almost completely eliminated. In conclusion, F(ab')2 was distributed from the blood to target organs of the envenomation, including the brain, however in different amounts and periods than the venom. It may compromise the antivenom effectiveness, depending on the concentration of the fractionthat specifically binds to the venom and the time elapsed after the sting.
- Published
- 2007
36. Venoma comparativo de escolopendromorfos (Chilopoda, Scolpendromorpha)
- Author
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Breno Rates Azevedo, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Gloria Regina Franco, and Marcelo Matos Santoro
- Subjects
Bioquímica ,Artropode ,Scolpendromorpha ,escolopendromorfos ,Chilopoda - Abstract
Os escolopendromorfos são artrópodes venenosos, responsáveis por um significante número de acidentes com humanos, ainda que não letais. Apesar disso, informações sobre a composição e atividades biológicas dos venenos desses animais são bastante escassas. No presente estudo, foi empregada uma abordagem proteômica bottom-up combinando 2D-LC, ESI-Q-TOF/MS, seqüenciamento N-terminal e procuras por similaridades, para melhor entender as complexidades dos venenos de duas espécies de escolopendromorfos brasileiros: Scolopendra viridicornis nigra e Scolopendra angulata. Comparações entre os perfis de LC e composição de massas moleculares são apresentadas. Ainda, as seqüências N-terminais de dez famílias de peptídeos ou proteínas foram determinadas com sucesso. Entretanto, nove das dez famílias de peptídeos, cujas seqüências N-terminais foram determinadas, não apresentaram quaisquer similaridades com outras seqüências depositadas no banco de dados do Swiss-Prot. Uma prospecção de atividades inseticidas em frações do veneno de S. viridicornis nigra também foi realizada. Seis das 12 frações testadas foram responsáveis por claros efeitos tóxicos sobre moscas domésticas. Este trabalho demonstra que os venenos de escolopendromorfos são uma fonte latente para a descoberta de novas moléculas com potencial aplicação biotecnológica. Centipedes are venomous arthropods responsible for a significant but non-lethal number of human envenomations. Despite this, information about the composition and function of their venom contents is scarce. In this study we have used a bottom-up proteomic approach combining 2D-LC, ESI-Q-TOF/MS, N-terminal sequencing and similarity searching to better understand the complexities of the venoms from two Brazilian centipede species: Scolopendra viridicornis nigra and Scolopendra angulata. Comparisons between the LC profiles and the mass compositions of the venoms of the two species are provided. Also, the N-termini of representatives of 10 protein/peptide families were successfully sequenced where nine of them showed no significant similarity to other protein sequences deposited in the Swiss-Prot database. A screening for insetotoxic activity in fractions from S. viridicornis venom has also been performed. Six of the 12 tested fractions were responsible for clear toxic effects in house flies. This work demonstrates that centipede venoms might be a neglected but important source of new bioactive compounds.
- Published
- 2006
37. Adaptação metabólica em granulócitos humanos induzida pelo processo de envelhecimento e Diabetes Mellitus: papel das vias de sinalização cAMP/PKA, Akt/PKB, p38 MAPK e fosfoinositídeos
- Author
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Daniela Caldeira Costa, Miriam Martins Chavez, Jose Augusto Nogueira Machado, Irene da Silva Soares, David Nasciemto Silva Teixeira, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Mauro Martins Teixeira
- Subjects
Bioquímica ,Envelhecimento ,Diabetes ,Diabetes Mellitus ,p38 MAPK e fosfoinositídeos ,cAMP/PKA ,Akt/PKB - Abstract
O envelhecimento biológico é um processo complexo caracterizado por diferenças espécies-específicas bem como tecidos-específicos e por mecanismos de mudanças moleculares e fisiológicas relacionadas à idade. Evidências têm sido obtidas de que o envelhecimento biológico abrange diversos parâmetros intimamente relacionados, como: taxa metabólica, ingestão calórica, genética, estilo de vida e fatores ambientais (SHONEICH, 1999). Várias são as definições para tal processo, destacando-se dentre elas, a definição clássica de Comfort (1960) de que o envelhecimento é caracterizado por um aumento da susceptibilidade de morrer, ou uma perda de vigor, com aumento cronológico de idade ou com a passagem do ciclo da vida.Arking (1991) propôs que o envelhecimento é uma série de mudanças estruturais e funcionais cumulativas, universais, progressivas e deletérias que usualmente começam a se manifestar mais tarde na vida de um indivíduo. Dentre todas as definições, observa-se uma tendência geral em caracterizar tal processo como heterogêneo, complexo e multifatorial (McCLEARN, 1997). O envelhecimento é um processo biológico inevitável e caracterizado por declínio geral das funções fisiológicas, isto é contrabalançado por reparo e fatores de manutenção que contribuem para a longevidade do organismo. Assim, Beckman e Ames (1998) definiram o envelhecimento como um fenômeno multifatorial associado com a diminuição das funções fisiológicas e celulares, ao aumento na incidência de numerosas doenças degenerativas e à diminuição da capacidade para responder ao estresse.Segundo Medvedev (1990) existem mais de 300 teorias para explicar o envelhecimento, muitas das quais não se contradizem e até mesmo apóiam umas às outras, exatamente por tratarem o assunto de forma diferente e independente.
- Published
- 2006
38. Adaptação metabólica em granulócitos humanos induzida pelo processo envelhecimento e Diabetes Mellitus: papel das vias de sinalização cMP/PKA, AKt/PKB, p38 MAPK e fosfoinositídeos
- Author
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Daniela Caldeira Costa, Miriam Martins Chaves, Jose Augusto Nogueira Machado, Irene da Silva Soares, David Nascimento Silva Teixeira, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Mauro Martins Teixeira
- Subjects
Bioquímica ,envelhecimento ,Diabetes ,Diabetes Mellitus - Abstract
O envelhecimento biológico é um processo complexo caracterizado por diferenças espécies-específicas bem como tecidos-específicos e por mecanismos de mudanças moleculares e fisiológicas relacionadas à idade. Evidências têm sido obtidas de que o envelhecimento biológico abrange diversos parâmetros intimamente relacionados, como: taxa metabólica, ingestão calórica, genética, estilo de vida e fatores ambientais (SHONEICH, 1999). Várias são as definições para tal processo, destacando-se dentre elas, a definição clássica de Comfort (1960) de que o envelhecimento é caracterizado por um aumento da susceptibilidade de morrer, ou uma perda de vigor, com aumento cronológico de idade ou com a passagem do ciclo da vida.Arking (1991) propôs que o envelhecimento é uma série de mudanças estruturais e funcionais cumulativas, universais, progressivas e deletérias que usualmente começam a se manifestar mais tarde na vida de um indivíduo. Dentre todas as definições, observa-se uma tendência geral em caracterizar tal processo como heterogêneo, complexo e multifatorial (McCLEARN, 1997). O envelhecimento é um processo biológico inevitável e caracterizado por declínio geral das funções fisiológicas, isto é contrabalançado por reparo e fatores de manutenção que contribuem para a longevidade do organismo. Assim, Beckman e Ames (1998) definiram o envelhecimento como um fenômeno multifatorial associado com a diminuição das funções fisiológicas e celulares, ao aumento na incidência de numerosas doenças degenerativas e à diminuição da capacidade para responder ao estresse.Segundo Medvedev (1990) existem mais de 300 teorias para explicar o envelhecimento, muitas das quais não se contradizem e até mesmo apóiam umas às outras, exatamente por tratarem o assunto de forma diferente e independente. A maioria das conceitualizações descritas como teorias gerontológicas são, na verdade, aplicações de teorias de vários domínios da ciência da vida para explicar o processo de envelhecimento. Neste contexto, dentro da genética molecular surgem as propostas das teorias das proteínas alteradas ou da catástrofe do erro elaborada por Orgel em 1963 que previa uma diminuição na fidelidade da transferência de informação que se aceleraria à medida que o envelhecimento progredisse, até que macromoléculas, em funcionamento apropriado, não fossem mais produzidas. A teoria da mutação somática (VIJG, 2000), predizia que o envelhecimento podia ser o resultado de exposições em longo prazo a níveis baixos e naturais de radiação e outros agentes ambientais capazes de danificar o DNA. Goyns em 2002 elaborou a teoria do encurtamento dos telômeros, que define que a maquinaria de replicação do DNA não é capaz de replicar completamente o fim de cromossomos lineares, de forma que, a cada rodada de síntese de DNA, o telômero (região terminal dos cromossomos) sofre um encurtamento. Tal encurtamento pode ser revertido pela ação da enzima telomerase, que, no entanto, encontra-se ausente ou presente em baixos níveis em várias células replicativas. O próprio estresse oxidativo, ao qual as células são expostas, também induz encurtamento nos telômeros. O conseqüente fenótipo de senescência replicativa poderia contribuir para perdas funcionais em diversas células durante o envelhecimento (Ex: cura de feridas menos eficiente devido à senescência replicativa de fibroblastos e ao enfraquecimento da resposta imune devido à perda de capacidade proliferativa em linfócitos). Já as teorias evolutivas enfocam o envelhecimento não no indivíduo e sim no contexto da evolução (KIRKWOOD, 2002). Weismann, em 1981, elaborou a teoria do gene para o envelhecimento que determina o envelhecimento como sendo uma forma geneticamente programada de limitar o tamanho das populações, desta forma, evitando lotação. Dentro da bioquímica, a teoria dos radicais livres, proposta por Harman, em 1956, atribui danos não específicos a macromoléculas (DNA, lipídeos, proteínas) por radicais livres durante o processo de envelhecimento. O rápido desenvolvimento na biologia dos radicais livres e tecnologia molecular têm permitido a aquisição de resultados que suportam o papel do estresse oxidativo como o principal contribuidor do processo do envelhecimento e da patogênese de um grande número de doenças. Sabe-se que os oxidantes são produzidos como subprodutos do metabolismo normal (exemplo, cadeia transportadora de elétrons, vários sistemas enzimáticos que utilizam oxigênio), por células fagocíticas e a partir da peroxidação lipídica. Eles induzem danos oxidativos a ácidos nucléicos, lipídeos, e proteínas e conduzem a danos celulares e algumas das características do envelhecimento (AMES, B. et al., 1992; YU, B. et al., 1996). Numerosos estudos têm sido conduzidos na última década para elucidar os mecanismos bioquímicos e moleculares do envelhecimento (SOHAL, R. et al., 1995; YU, B. et al., 1993). O consenso geral parece ser que o processo de envelhecimento é um processo multifatorial e as espécies reativas de oxigênio são um fator contribuidor (FUKAGAWA, N. et al., 1999). Entretanto, a extensão desta contribuição permanece incerta. Assim, torna-se de grande interesse a avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio durante o processo de envelhecimento e as vias de sinalização a elas relacionadas.As espécies reativas de oxigênio (ROS) são produtos do metabolismo celular normal, visto que de 1 a 2% do oxigênio utilizado para a respiração mitocondrial é convertido em ROS (durante a cadeia respiratória, podem ocorrer reações colaterais envolvendo principalmente os complexos mitocondriais I e III e que culminam na redução monoeletrônica do oxigênio a íon superóxido) (TURRENS, J. et al., 1997; LIU, S. et al., 1997; KOWALTOWSKI, A. et al., 1999). Estas espécies são geradas tanto enzimaticamente por oxidoredutases quanto não enzimaticamente como produtos colaterais de reações que utilizam a transferência de elétrons. Assim, a mitocôndria, o citocromo P450 e suas redutases são responsáveis pela geração de ROS. Outra reserva abundante de ROS é a enzima de multicomponentes NADPH oxidase. Em células não estimuladas, a NADPH oxidase é formada por um componente associado à membrana, o citocromo b558 constituído de duas sub-unidades gp91phox e p22 phox e por três componentes citosólicos p47phox/p67phox/p40phox formando um complexo (FORMAN, H. et al., 2001). A glicoproteína gp91phox contém dois hemes e um sítio de ligação ao NADPH que interage com p22phox para formar o complexo do citocromo b558. A ativação dos polimorfonucleares conduz a translocação de GTPase Rac, p47phox e p67phox para a membrana plasmática, onde p67phox interage através de seu domínio de ativação com as sub-unidades ligadas a membrana. Esta interação é requerida para a ativação da oxidase e facilita a transferência de elétrons do NADPH para o oxigênio. Duas proteínas adicionais têm sido demonstradas interagir com o citocromo b558: rap1a e p40phox, estando envolvidas no recrutamento de p47phox e p67phox a membrana (BRANDES, R. et al., 2005).Assim, o acúmulo de biomoléculas danificadas pela ação dos radicais livres durante a extensão de vida de um indivíduo contribuiria ou resultaria no envelhecimento. Cada espécie reativa age de maneira diferente sobre os seus alvos apresentando diferentes graus de toxicidade e seletividade para com os substratos. Desta forma, a produção destas espécies oxidantes durante a senescência poderia ser um fator contribuidor para o desencadeamento de vários eventos relacionados ao envelhecimento, como o declínio progressivo da imunidade em indivíduos idosos, ocasionando o aumento da incidência de processos auto-imunes, neoplasias e da susceptibilidade a infecções (KNIGHT, J. et al., 1995). A causa exata deste declínio, e as sub-populações celulares diretamente envolvidas, ainda são desconhecidas (FULÖP, T. et al., 1994). Entretanto, alguns estudos têm relacionado alterações nos mecanismos de sinalização celular com o avanço da idade. Não existem relatos da identificação da etapa crítica, mas sim de uma série de deficiências que contribuem para o declínio da competência de linfócitos e granulócitos em serem adequadamente ativados (FULOP, T. et al., 1994). Neste contexto, sabe-se que leucócitos polimorfonucleares têm um papel crucial na defesa do organismo contra bactérias, fungos e protozoários, constituindo a principal célula efetora da imunidade inata. Em resposta a um patógeno invasor, os neutrófilos constituem o primeiro tipo celular a migrar para o tecido afetado, formando a primeira linha de defesa do organismo contra infecções (FAURSCHOU, M et al., 2003). Sabe-se ainda, que altas taxas de mortalidade e morbidade em idosos são principalmente causadas por infecções fúngicas e bacterianas, assim, a maior taxa de infecção em idosos pode ser causada por desordens nestas células relacionadas à idade. Sabe-se que 60-70% dos leucócitos sanguíneos são granulócitos, e destes aproximadamente 90% são neutrófilos, sendo assim, sua função não deve ser subestimada durante a resposta imune (SCHRÖDER, A. et al., 2003). Desta forma, os granulócitos tornam-se excelentes ferramentas para o estudo e a compreensão das vias de sinalização envolvidas na geração de espécies reativas de oxigênio podendo nos trazer subsídios para uma melhor compreensão dos mecanismos imunorregulatórios decorrentes durante o processo de envelhecimento fisiológico. Assim, a desregulação ou o não balanço entre as vias de sinalização deveria ser vista como prioridade, uma vez que a as alterações funcionais nestas vias deveriam ser induzidas em células senescentes de maneira via-específica e agonista-específica (FUKAGAWA, N. et al., 1999). A capacidade das células para comunicar com outras e responder estímulos em mecanismos biológicos permitem que a informação seja transmitida da superfície celular ao núcleo (Barthel, A., 2005). Estes mecanismos referem-se às vias de sinalização celular. Componentes destas vias incluem segundos mesangeiros, cinases, fosfolipases, e fosfatases, entre outros. Alguns segundos mensageiros, como AMPc e IP3 e várias cinases como PKA, PKB e P38MAPK são alvos de intenso estudo. O entendimento dos mecanismos de atuação destes componentes sobre as vias de sinalização de geração de ROS, através da ativação da NADPH oxidase em granulócitos de indivíduos em diferentes faixas etárias, poderá nos trazer subsídios para uma melhor compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos no processo de senescência fisiológico, uma vez que a geração de ROS por granulócitos pode refletir um estado de estresse oxidativo crônico que é característico do processo de envelhecimento. Sabe-se que o segundo mensageiro adenosina 3, 5-monofosfato ciclíco (AMPc) é considerado um modulador fisiológico da produção de superóxido por neutrófilos ativados (REIBMAN, J. et al., 1990). Tem sido amplamente documentado em estudos in vitro com suspensões de neutrófilos que a elevação de AMPc intracelular por agonistas fisiológicos da adenilato ciclase (prostaglandinas tipo E, histamina ou drogas beta adrenérgicas) inibem a geração de íon superóxido em resposta a estimulação com peptídeos quimiotáticos (fMLP) (SEDGWICK, J. et al., 1985; SELIGMANN, B. et al., 1983; NIELSON, C. et al., 1987).Em muitas células pró-inflamatórias e imunes, um aumento na concentração intracelular deste nucleotídeo geralmente conduz à inibição de resposta. Por esta razão, agentes que elevam os níveis intracelulares de AMPc apresentam um potencial como drogas anti-alérgicas e anti-inflamatórias, além de inibir a expressão de IL-12 e IFN-, mas não a expressão de IL-4, IL-10 e IL-5. AMPc é produzido a partir da estimulação de receptores específicos acoplados via proteína G a adenilato ciclase (SHAMES, B.D. et al., 2001). Existem dois receptores intracelulares para o AMPc, PKA e EPAC, os quais são responsáveis pelos diferentes efeitos de AMPc sobre as células. PKA é constituída de duas subunidades regulatórias e duas subunidades catalíticas que interagem para formar uma holoenzima inativa (TAYLOR, S. et al., 1990; MEI, F. et al., 2002). A ativação de PKA depende da ligação do AMPc a subunidade regulatória, a qual induz uma mudança conformacional nesta subunidade e conduz a uma dissociação da holoenzima em suas subunidades constituintes. A subunidade catalítica ativa pode afetar uma ampla variedade de eventos celulares por fosforilação de proteínas citoplasmáticas e nucleares, incluindo enzimas e fatores de transcrição (KOPPERUD, R., 2003). Dentre eles, destaca-se CREB que é um dos principais substratos nucleares para PKA. A fosforilação de um único resíduo de serina aumenta a atividade de CREB ligado ao elemento de resposta CRE, o qual é encontrado em genes nos quais a transcrição é induzida por AMPc (LEE, E. et al., 1998; HYUN et al, 1998; ZIDEK, Z., 1999). Um dos genes em que a transcrição é induzida por AMPc é o da citocina imunomoduladora IL-10. Interleucina 10 (IL-10) possui uma estrutura com quatro domínios globulares -helicoidais e liga-se ao receptor de citocinas do tipo II. Em humanos, IL-10 é produzida por macrófagos ativados, linfócitos T CD8+, Th0, linfócitos CD4+ Th1 e Th2 e por alguns tipos de células não linfóides (como queratinócitos) (MORIKAWA et al., 2002). IL-10 inibe a síntese de um número de citocinas como IFN-y, IL-2 e fator de necrose tumoral (TNF-). IL-10 humana também é quimioatrativa para linfócitos T CD8+ e um inibidor da migração de linfócitos T CD4+ induzido por IL-8. Em leucócitos polimorfonucleares, IL-10 inibe a produção de IL-1, IL-1, IL-8 e TNF- (DESCHNER et al., 2000). IL-10 participa da downregulation da secreção de IL-12, uma citocina crítica para a diferenciação de Th1. IL-10 tem outro potente efeito imunossupressor sobre a linhagem de monócitos-macrófagos: ela suprime a produção de óxido nítrico e outros metabólitos bactericidas envolvidos na destruição de patógenos e também na produção de vários mediadores inflamatórios (ex: IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF e TNF-) (KUBY et al., 2000). Ademais, IL-10 tem um papel na supressão do processo inflamatório e a diminuição desta citocina imunossupressora deve amplificar o local do processo inflamatório (DESCHNER et al., 2000) em diversas patologias. Além disso, sua produção pode estar envolvida em uma resposta biológica comum em linfócitos que sofrem apoptose (TOMIMORI et al., 2000). IL-10 também é capaz de suprimir a produção de interferom gama por células Th1 (TOMIMORI et al., 2000). O outro receptor recentemente descoberto de AMPc é o EPAC (proteína de troca diretamente ativada por AMPc). EPAC contém um domínio de ligação a AMPc que é homólogo a subunidade R de PKA e um domínio de fator de troca (GEF). EPAC liga a AMPc com alta afinidade e ativa Rap1. Tanto EPAC quanto PKA são amplamente expressos em muitos tecidos (MEI, F. et al., 2002), e um aumento nos níveis intracelulares de AMPc irá conduzir a ativação de ambas as enzimas, e possivelmente outros alvos potenciais de AMPc. Deste modo, o efeito celular de AMPc pode variar dependendo da abundância celular e a distribuição de EPAC e PKA. Assim, o controle dinâmico da expressão celular de EPAC e PKA associados a mudanças na dinâmica da concentração de AMPc constituem mecanismos regulatórios que determinam os efeitos de AMPc específicos em cada tipo celular.Um outro alvo downstream do AMPc é a proteína cinase B (Akt/PKB), uma enzima crucial na via de sinalização para a sobrevivência celular (HILL, M., 2002). Assim, AMPc pode ativar PKB através de uma via de sinalização mediada por EPAC de maneira dependente de PI3K (WHITEMAN, E., 2002; RICHARDS, J., 2001). PKB é uma cinase serina/treonina de 60-kDa, que contêm um domínio amino terminal de homologia a plequistrina (PH), um domínio catalítico central e domínio regulatório hidrofóbico C-terminal (FILIPPA, N. et al., 1999). O domínio PH é requerido para seu recrutamento na membrana plasmática através de sua ligação de alta afinidade a PIP3 produzido por PI3K ativado. PKB contêm dois sítios de fosforilação regulatórios, a fosforilação de Thr 308 parcialmente ativa a cinase, enquanto a fosforilação de ambos os sítios (Thr 308 e Ser 473) são requeridos para a ativação total (FILIPPA, N. et al., 1999; HILL, M., 2002). Uma vez ativada por fosforilação tem sido mostrada proteger as células da apoptose que é induzida por estímulo externo em diferentes tipos celulares, uma vez que é responsável pela fosforilação de BAD, membro da família Bcl. PKB fosforila BAD no resíduo de Ser 136 promovendo a associação de BAD com proteínas do citosol, deste modo inativando sua função pró-apoptótica (LAWLOR, M., 2001). Assim, além de sua função anti-apoptótica, parece que PKB está envolvido no desenvolvimento de alguns tipos de câncer, no controle do ciclo celular, bem como no controle da entrada de glicose estimulada por insulina nos músculos e adipócitos, podendo estar relacionado com a resistência à insulina e o diabetes (WHITEMAN, E. 2002; HILL, M., 2002).Uma outra cinase de relevância para o estudo do estresse oxidativo é a P38MAPK, assim chamada por causa de seu peso molecular de 38 kDa, sendo classificada como uma proteína cinase ativada por estresse. P38MAPK é uma serina/treonina cinase da família das MAPKs e sua importância em leucócitos polimorfonucleares foi recentemente demonstrada (YAMAMORI, T. et al., 2000). Geradores do estresse oxidativo, como toxinas e estímulos pró-inflamatórios, incluindo lipopolissacarideo (LPS) e N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) são responsáveis pela ativação de p38MAPK (POMERANCE, M., 2000). Algumas publicações têm sugerido que P38MAPK está envolvida na sinalização da produção de O2- (YAMAMORI, T. et al., 2000; LI, J. et al., 2004). A literatura relata que algumas características bioquímicas de tecidos velhos são causados por um aumento do estado pró-oxidante e isto afeta a função de proteínas chaves que regulam genes de resposta ao estresse como P38 MAPK e JNK. Assim, a atividade ou função dos componentes das vias de sinalização e fatores de transcrição específicos que regulam os genes de resposta ao estresse são alvos potenciais de ROS, a conseqüência resulta em um nível basal aumentado da atividade da via de sinalização de estresse, fatores de transcrição de resposta ao estresse, e genes de resposta ao estresse. Níveis aumentados de mediadores do estresse como citocinas circulantes ocorrem em animais e humanos senescentes, sendo fatores que contribuem para mudanças nestas vias de sinalização, indicando um desenvolvimento de estado de estresse crônico (CARUSO, et al., 2004).Um outro segundo mensageiro intensamente estudado é o inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DG) produzidos primariamente pelo metabolismo da fosfolipase C (PLC) a partir de fosfatidil inositol 4,5 bisfosfato (PIP2) em resposta à estimulação de receptores ligados a proteínas G ou receptores tirosina cinases (CATZ, S., 1998). IP3 rapidamente libera cálcio dos estoques intracelulares de Ca2+ dentro do retículo endoplasmático e outras membranas celulares por ligação ao receptor de IP3, o qual amplifica o sinal celular, muito dos quais são gerados na membrana plasmática (PENDARIES, C. et al., 2003; MICHELL, R. et al., 2002). O receptor de IP3 é fosforilado por múltiplas cinases. A fosforilação do receptor de IP3 pela proteína cinase dependente de AMPc (PKA) regula a atividade do canal. Em células intactas e permeabilizadas, ativadores de PKA como forscolina ou dibutiril AMPc estimulam a liberação de cálcio e a fosforilação do receptor mediada por PKA (SOULSBY, M. et al., 2005). Da mesma forma, a proteína cinase dependente de GMPc (PKG) fosforila o receptor de IP3 no mesmo sítio que PKA, gerando oscilações de cálcio similares como o obtido pela fosforilação de PKA (HAUG, L. et al., 1999). Já o diacilglicerol (DG) liga diretamente a PKC e a ativa, a qual fosforila uma série de proteínas, algumas das quais podem estar envolvidas na ativação da NADPH oxidases. A ativação de fosfolipase D (PLD) resulta na formação de ácido fosfatidico (PA) a partir de fosfatidilcolina. PA tem um importante papel na sinalização celular por atuar como ionóforo endógeno facilitando a mobilização de cálcio ionizável para o citosol e como o principal ativador da NADPH oxidase (GOMES-CAMBRONERO, et al., 1998).Assim diante do exposto acima verifica-se que o processo de envelhecimento, por si só, apresenta alterações que podem ser detectadas por estudos metabólicos, e a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no envelhecimento poderia nos ajudar a desenvolver estratégias efetivas no controle de doenças relacionadas à idade, aumentando a qualidade de vida do idoso. Na população humana é difícil distinguir entre a expressão fenotípica do envelhecimento devido ao processo de envelhecimento por si só e as doenças sabidamente conhecidas ocorrer com maior prevalência em populações idosas, como doenças cardiovasculares, artrite, osteoporose e diabetes (BOREN, E. et al., 2004). Sabe-se que a senescência pode estar relacionada com alterações nos mecanismos de regulação da insulina, uma vez que se sabe da existência de uma intolerância à glicose em humanos relacionado ao processo de envelhecimento (SCHEEN, A., 2005). Durante o envelhecimento, a regulação do metabolismo da glicose apresenta-se diminuído como resultado de complexas alterações associadas à idade (FULÖP, T., 2003). Nas últimas décadas alguns mecanismos têm sido propostos com o objetivo de relacionar alterações nos mecanismos de sinalização da insulina e no processo de envelhecimento. Sabe-se que a própria hiperglicemia pode alterar várias vias de sinalização celular através da ativação da proteína cinase ativada por AMPc (XU, Y. et al., 2005), aumento da síntese de diacilglicerol (HINK, U. et al., 2003) bem como a capacidade prejudicada da insulina em ativar Akt/PKB (BLOCK-DAMTI e BASHAN, 2005). Da mesma forma, o aumento na geração das espécies reativas de oxigênio interfere com a sinalização das vias JNK e P38, as quais estão envolvidas na cascata de sinalização de PI3K (FINKEL, T., 2003). Sabe-se também que condições hiperglicemiantes são responsáveis por danos celulares através de modificações não enzimáticas de macromoléculas, um evento ocorrido durante o envelhecimento fisiológico e na maioria das doenças relacionadas à idade, como o diabetes. Os produtos finais de glicação avançado (AGEs), bem como os radicais livres podem diretamente influenciar ou interferir com o funcionamento do receptor de insulina e a sinalização celular por diminuir a fosforilação da tirosina do substrato do receptor de insulina (IRS). Isto resulta na diminuição da atividade de PKB, o que por sua vez altera o metabolismo de glicose e glicogênio (FULÖP, 2003; SUJI e SIVAKAMI, 2004). Assim como ocorre no envelhecimento, sabe-se que o diabetes mellitus também é um processo multifatorial de intensos estudos. Várias são as abordagens e uma grande massa de resultados está disponível na literatura a respeito dos fatores genéticos, celulares e metabólicos. Contudo, poucos são os artigos que enfocam as alterações nas vias de sinalização no diabético idoso. Assim, torna-se de grande interesse aprofundar o conhecimento no sentido de entender estas prováveis alterações nas vias de sinalização celular, uma vez que os resultados que serão obtidos facilitarão o entendimento destes dois complexos fenômenos e subsidiar novos estudos nestas áreas.O termo diabetes mellitus descreve uma desordem metabólica de múltiplas etiologias caracterizadas por hiperglicemia crônica com distúrbios no metabolismo de carboidratos, lipides e proteínas, como resultado do defeito na secreção de insulina ou em sua ação ou ambos. (OMS, 1999; CONGET, I., 2002). Há mais de 100 milhões de pessoas em todo mundo com diabetes (5 a 8% da população mundial), e este número tende a aumentar significativamente num futuro próximo (GIUSEPPE, G. et al., 2003; POLADIA, D. et al., 2004). A classificação do diabetes recomendada atualmente inclui tanto estágios do diabetes mellitus baseado no critério descritivo clínico bem como a classificação etiológica complementar e outras categorias de hiperglicemia, como sugerido por Kuzuya e Matsuda (OMS, 1999). A etiologia do tipo 1 inclui os casos que são atribuídos a um processo auto-imune, bem como aqueles que envolvem a destruição das células beta pancreáticas com propensão a cetoacidose mas que nem a etiologia e nem a patogênese são conhecidos (idiopática) (ROEP, B., 2003). Não inclui aquelas formas onde as causas da destruição das células betas são conhecidas (ex: fibrose cística e defeitos mitocondriais). O tipo 2 inclui a maioria das formas do diabetes, os quais resultam em um defeito na secreção de insulina, quase sempre com uma resistência desta (SHAW, J. et al., 2000). A terceira categoria, outros tipos específicos de diabetes, inclui aqueles causado por um defeito sabidamente identificado e específico, como defeitos genéticos e doenças do pâncreas exócrino. (Conget, I., 2002).
- Published
- 2006
39. Estudos bioquímicos, farmacológicos e de minimização da estrutura do peptídeo TsHpT-I isolado do veneno do escorpião Tityus serrulatus
- Author
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Thiago Verano Braga, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Marcelo Porto Bemquerer, Mauro Martins Teixeira, and Marcelo Matos Santoro
- Subjects
Bioquímica ,Peptídios ,Bioquímica e Imunologia ,Tityus serculatus Venenos - Abstract
O veneno de escorpião é uma rica fonte de peptídeos biologicamente ativos que atuam em diferentes alvos nos sistemas nervoso e cardiovascular. Uma nova família estrutural de peptídeos foi encontrada no veneno do escorpião amarelo Tityus serrulatus. Essa família, denominada TsHpTP (Tityus serrulatus HypoTensive Peptides), possui uma assinatura estrutural típica dos peptídeos potenciadores de bradicinina (PPB) na sua porção C-terminal. TsHpT-I, um peptídeo de 2722 Da, foi capaz de potencializar o efeito hipotensor da bradicinina (BK) em ratos normotensos, quando injetado via intravenosa. Foi verificado que este peptídeo possui na sua porção C-terminal, dois sítios de resistência à hidrólise por carboxipeptidase Y (Lys17-Glu18 e Pro23-Pro24), o que norteou a construção de dois peptídeos sintéticos (TsHpT17-25 e TsHpTac17-25am, um análogo que possui uma acetilação N-terminal e uma amidação C-terminal), utilizando a porção C-terminal de TsHpT-I. O efeito hipotensor da bradicinina foi mantido nestes dois análogos sintéticos, indicando que a porção C-terminal do peptídeo nativo é essencial para sua ação farmacológica. Ainda, um importante efeito hipotensor independente da injeção de BK foi verificado, o que mostra que estes peptídeos são, intrinsecamente, agentes hipotensores. Para estudar este efeito hipotensor causado por estes peptídeos, o peptídeo TsHpT17-25 foi testado em ratos de linhagens hipertensas (SHR - Spontaneous Hypertensive Rats - e TGR - Transgenic Rats) sendo demonstrada, portanto, a capacidade de induzir uma hipotensão de longa duração. O peptídeo TsHpT17-25 foi também capaz de causar uma bradicardia nestes animais. Os mecanismos de ação dos peptídeos estudados não foram elucidados até o presente momento. Entretanto, é possível que a enzima conversora de angiotensina - um alvo conhecido dos PPB - não seja o alvo primário destes peptídeos. Experimentos preliminares obtidos por meio de estudo de microscopia confocal utilizando células CHO transfectadas com o receptor B2 de bradicinina, indicam que estes peptídeos são capazes de potenciar a liberação de óxido nítrico mediada por bradicinina, muito embora os mecanismos moleculares desta potenciação não tenham sido elucidados ainda. Scorpion venom is a rich source of biologically active peptides that act in different systems, such as nervous and cardiovascular. A new structural family of peptides was found in the venom of the Brazilian yellow scorpion Tityus serrulatus. This family, named TsHpTP (Tityus serrulatus HypoTensive Peptides), has a typical bradykinin-potentiating peptide (BPP) amino acid signature at its C-terminal extremity. TsHpT-I, a 2722 Da peptide, was able to potentiate the hypotensive effects of bradykinin (BK) in normotensive rats. It was observed that this peptide has two carboxypeptidase Y cleavage-resistance sites at its C-terminal portion (Lys17-Glu18 e Pro23-Pro24). Therefore, two synthetic analogs were constructed using TsHpT-I C-terminal as template (TsHpT17-25 and TsHpTac17-25am, which is acetylated at N-terminal and amidated at C-terminal). The bradykinin-potentiating effect was maintained in these two analogs suggesting that the C-terminal portion of the native peptide is important to the pharmacological activity. Also, a relevant hypotensive effect, which is independent on BK, was observed in all of these peptides, indicating that these peptides are themselves hypotensive agents. To study this hypotensive effect, TsHpT17-25 was tested in hypertensive SHR (Spontaneous Hypertensive Rats) and TGR (Transgenic Rats) rat strains and it has been shown that this peptide induce a strong and long-lasting hypotensive effect. Interestingly, this peptide was also able to slow down the heart rate (HR) of these animals. The mode of action of these peptides is yet to be solved, but it seems that angiotensin converting enzyme - a well known BPP target - is not the primary target. Instead, preliminary data using CHO cells with transfected B2 receptor - carried out in confocal microscopy - has shown that these peptides are able to potentiate the nitric oxide release induced by BK, although the molecular mechanism of this potentiation is not clear yet.
- Published
- 2005
40. Cinética de interação da toxina TX1, da aranha phoneutria nigriventer, com o sistema nervoso central de rato
- Author
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Stefania Cotta Done, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Marcelo Porto Bemquerer, Paulo Sergio Lacerda Beirao, and Marcelo Matos Santoro
- Subjects
Bioquímica ,Bioquímica e Imunulogia ,Aranha Veneno eses ,Sistema nervoso central - Abstract
As aranhas são animais pertencentes ao filo Arthropoda, sub-filo Chelicerata, classe Arachnida. Os aracnídeos constituem a classe mais ampla e mais importante dentro dos qeulicerados. Além das aranhas, esta classe inclui exemplares familiares como os ácaros e os escorpiões. A classe Arachnida compreende 11 ordens, dentre as quais destacamos a ordem Araneae, que é mais ampla dos aracnídeos, com aproximadamente 32 mil espécies descritas (Barnes, 1990).
- Published
- 1999
41. Tx2-6, uma toxina da aranha Phoneutria nigriventer que modifica os canais de Na+ sensíveis à voltagem
- Author
-
Alessandra Cristine de Souza Matavel, Paulo Sergio Lacerda Beirao, Jader dos Santos Cruz, Maria Elena de Lima Perez Garcia, and Christopher Kushmerick
- Subjects
Bioquímica ,Canais ionicos ,Canais de sódio ,Aranha Veneno ,Bioquímica e Imunologia ,Phoneutria nigriventer - Abstract
Muitos organismos produzem polipeptídeos com atividade tóxica sobre outros organismos. Os canais de sódio dependentes de voltagem são os principais alvos de muitas toxinas estudadas até o momento. Dois sítios de ligação específicos de toxinas polipeptídicas têm sido particularmente caracterizados sobre o canal de sódio. Toxinas que se ligam ao sítio 3 causam ativação persistente do canal de sódio por inibir sua inativação. Toxinas que se ligam ao sítio 4 deslocam a dependência de voltagem da ativação para potenciais mais negativos. A toxina Tx2-6, obtida da fração PhTx2 do veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer, é um peptídeo básico que apresenta 48 resíduos de aminoácidos, rico em cisteínas. Este peptídeo é muito tóxico para camundongos e reproduz os principais sintomas do veneno total. A proposta deste estudo é a caracterização do efeito da Tx2-6 sobre os canais de sódio de músculo esquelético de rã, utilizando a técnica modificada do loose patch clamp como método para o estudo das correntes de sódio macroscópicas. Nossos resultados mostram que a Tx2-6 modifica a cinética dos canais de sódio de maneira dose-dependente. A Tx2-6 na concentração de 1 ìM prolonga a constante de tempo da inativação e desloca a dependência de voltagem da ativação e da inativação para valores mais negativos (-7,4 e -10 mV, respectivamente). A toxina também diminui o potencial de reversão em 10 mV e reduz o pico da corrente de sódio em 48%. No entanto, a toxina não mostrou nenhum efeito sobre a recuperação da inativação ou sobre a desativação da corrente de sódio. Estas complexas alterações podem explicar o efeito tóxico da Tx2-6.Esta toxina apresentou pouca identidade na sequência primária com toxinas que atuam nos sítios 3 e 4 dos canais de sódio. Many organisms produce polypeptides with toxic activity against other organisms. The voltage-gated sodium channels are the main targets of many toxins studied so far. Two specific binding sites of polypeptide toxins have been particularly characterized on the sodium channels. Toxins which bind to the site 3 cause persistent activation of sodium channel by inhibiting the inactivation. Toxins which bind to the site 4 shift the voltage dependence of activation to more negative potentials. The toxin Tx2-6, obtained from PhTx2 fraction of the Brazilian Phoneutria nigriventer spider venom, is a basic peptide that features 48 amino acids, rich in cysteines. This peptide is very toxic to mice and reproduces the predominant symptoms produced by the whole venom. The purpose of this study is to characterize the effect of Tx2-6 on the sodium channels of frog skeletal muscle, using the modified technique of loose patch clamp as a method for the study of the macroscopic sodium currents. Our results show that the Tx2-6 modifies the kinetics of sodium channels in a dose-dependent manner. The Tx2-6 at 1 ìm prolongs the inactivation time constant and shifts the voltage dependence of both activation and steady-state inactivation to more negative values ( -7.4 and -10 mV, respectively). The toxin also decreases the potential for reversal in 10 mV and reduces the sodium current peak by 48%. However, the toxin showed no effect on recovery from inactivation or the deactivation of the sodium current. Together, these complex changes can explain the toxic effect of Tx2-6. This toxin shows little primary sequence identity with toxins that acts on site 3 and 4 of the sodium channels.
- Published
- 1999
42. Peptídeo antimicrobiano PEGuilado como potencial biofármaco para o tratamento de pneumonia causada por Acinetobacter baumannii
- Author
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Julio Cesar Moreira Brito, Maria Elena de Lima Perez Garcia, Jorge Almeida Guimarães, Carlos Alberto Tagliati, Glória Regina Franco, and Rachel Basques Caligiorne
- Subjects
Inovações tecnológicas ,Peptídeos ,PEGylation ,Meta-análise ,Acinetobacter baumannii resistant ,Pneumonia ,Pneumonia by A. baumannii ,Peptídeo antimicrobiano ,Meta-analysis ,Acinetobacter baumannii resistente ,Drogas – Resistência em microorganismos ,Biofarmacêutica ,Produtos de ação antimicrobiana ,PEGuilação ,Antimicrobial peptide ,Infecções por Acinetobacter ,L. erythrognatha toxina 1-b PEGuilada LyeTx I-b ,Pneumonia por A. baumannii - Abstract
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Os relatos de infecções e óbitos por bactérias resistentes aos antimicrobianos vêm crescendo diariamente no mundo e a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem alertado sobre a importância do desenvolvimento de novos fármacos efetivos contra essas superbactérias. Nesse contexto, os peptídeos antimicrobianos surgem como uma alternativa, pois muitos, além de estarem envolvidos na imunidade inata, também mostram sinergismo com antimicrobianos comerciais. LyeTx I é um peptídeo linear com 25 resíduos de aminoácidos, inicialmente isolado da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha, e posteriormente obtido por síntese química, que apresentou potente atividade antimicrobiana. Um de seus derivados, LyeTx I-b, similar ao LyeTx I, mas sem o resíduo Hys16, foi ativo frente a diversas bactérias multirresistentes, dentre elas a Acinetobacter baumannii, resistente aos carbapenêmicos. Entretanto, sabe-se que esses peptídeos, em geral, apresentam elevada atividade hemolítica e citotóxica, bem como reduzida atividade in vivo. Visando minimizar essas limitações, propôs-se neste trabalho modificar e PEGuilar LyeTx I-b, e avaliar sua atividade e toxicidade em modelos in vitro e in vivo. O modelo in vivo foi o de pneumonia bacteriana causada por A. baumannii resistente aos carbapenêmicos. Paralelo a isso, um estudo de revisão sistemática e meta-análise foi feito para verificar a taxa de resistência de A. baumannii às polimixinas. Este estudo mostrou que a taxa de infecção dessa bactéria no período de 2010 a 2018 foi de 13% em todo o mundo, e, para a América do Sul, o valor chegou a 60%. A PEGuilação do peptídeo (LyeTx I-bPEG) levou à diminuição de atividade antimicrobiana in vitro para diversas bactérias, sendo essa redução menor em A. baumannii. LyeTx I-bPEG foi mais ativo que LyeTx I-b na atividade antibiofilme e na prevenção de indução de resistência. Comparando a segurança de LyeTx I-bPEG e LyeTx I-b, o primeiro apresentou redução de até doze vezes nos valores de hemólise, e cerca de dez e duas vezes na toxicidade in vitro para as células VERO e HEK-293, respectivamente. A diminuição da toxicidade in vivo para LyeTx I-bPEG em relação à LyeTx I-b foi de quatro vezes em camundongos. Os valores encontrados mostraram que a PEGuilação foi fundamental para a redução da toxicidade e para a atividade in vivo em modelo de pneumonia por A. baumannii, pois a administração endovenosa de LyeTx I-bPEG em animais combateu eficazmente a infecção em todas as concentrações testadas, enquanto LyeTx I-b não foi ativo nas concentrações de 0,5mg.kg-1 e 1mg.kg-1, sendo possivelmente degradado e/ou eliminado antes de alcançar seus alvos. Estes resultados mostraram que a PEGuilação do peptídeo LyeTx I-b possibilitou seu uso in vivo, mantendo atividade significativa contra a pneumonia causada por A. baumannii resistente aos carbapenêmicos. Reports of bacterial infections and deaths caused by resistant bacteria have increased globally over time. The World Health Organization (WHO) has been warning about the importance of developing new drugs effective against these superbugs. In this context, antimicrobial peptides are considered an alternative since most of them are involved in innate immunity, acting in different ways, and some also show synergism with commercial antimicrobials. LyeTx I is a linear peptide, with 25 amino acid residues isolated from the spider venom Lycosa erythrognatha. Later, it was also obtained by chemical synthesis and has shown potent antimicrobial activity. LyeTx I-b, the LyeTx I derivative that lacks the Hys16 residue, was active against several multidrug-resistant bacteria, including A. baumannii resistant to carbapenems. However, it is known that, LyeTx I-b has high hemolytic, cytotoxic, and reduced in vivo activities. To overcome these limitations, this work proposes the conjugation of LyeTx I-b with mPEG-MAL and tested its activity and toxicity in vitro and in vivo models. The in vivo model was based on multi-resistant bacterial pneumonia caused by Acinetobacter baumannii. In a review study and meta-analysis, there was a significant rate of resistance of A. baumannii to colistin, one of the most potent and toxic antimicrobials registered and used against this bacterium. This analysis showed that the infection rate of this polymyxin-resistant bacterium in the evaluated period (2010 to 2018) was 13% worldwide, with the value reaching 60% in South America. LyeTx I-bPEG showed decreased activity in vitro for several bacteria; however, this reduction was smaller in A. baumannii. In antibiofilm activity and resistance induction, LyeTx I-bPEG was more active than LyeTx I-b. Additionally, LyeTx I-bPEG reduced by up to 12 times the values of hemolysis and, approximately 10 and 2 times, the in vitro toxicity for VERO and HEK-293 cells, respectively. The decrease in toxicity for LyeTx I-bPEG in vivo, compared to LyeTx I-b, was 4-fold in mice. The values found showed that PEGylation was fundamental for the reduction of toxicity and for in vivo activity in a model of A. baumannii pneumonia, considering that LyeTx I-bPEG, injected in the animals effectively fought the infection. At the same time, LyeTx I-b was not active at 0,5mg.kg-1 e 1mg.kg-1 in this model, possibly due to its degradation/elimination before reaching its targets. These results show that the PEGylation of the LyeTx I-b peptide enabled its use in vivo, maintaining significant activity against pneumonia caused by multidrug-resistant A. baumannii.
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