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I difetti ossei sono un problema clinico irrisolto. Per promuovere la rigenerazione ossea, l'ingegneria tissutale sviluppa scaffold per aiutare la guarigione dei tessuti. Gli caffold porosi tridimensionali composti da alginato e idrossiapatite aiutano la rigenerazione dell'osso danneggiato. Gli scaffold tuttavia dovrebbero essere dotati anche di proprietà antimicrobiche, ma evitando l'uso di antibiotici ordinari. La resistenza batterica agli antibiotici, infatti, rende inutili la maggior parte degli attuali antibiotici. La necessità di nuovi antimicrobici è evidente e i peptidi antimicrobici (AMP) attirano sempre più attenzione a causa delle loro proprietà antibatteriche. Tra gli AMP, quelli ricchi di prolina (PrAMP) sono interessanti perché combinano potenza antimicrobica ed elevata biocompatibilità. Lo scopo di questo progetto era caricare un PrAMP ottimizzato su scaffold di alginato / idrossiapatite (Alg / HAp) per fornire loro un effetto antimicrobico mantenendo la loro capacità di promuovere la rigenerazione ossea. Per potenziare e adattare l'attività antimicrobica dei PrAMP, il Bac7 (1-16) è stato modificato sostituendo alcuni residui e aggiungendo quindi una frazione lipidica al suo N-terminale. Solo il primo approccio ha avuto successo fornendo il B7-005, un nuovo PrAMP che mostra una migliore attività antimicrobica. Per contro, la lipidizzazione di B7-005 è stata dannosa. Gli scaffold Alg / HAp sono stati prodotti e caricati in modo efficiente con B7-005. Tuttavia, una volta adsorbito sullo scaffold, il peptide non poteva essere rilasciato a causa della forte interazione tra alginato e B7-005. I tentativi di modulare l'interazione furono inutili. Le strutture a base di alginato non erano compatibili con gli AMP cationici. Per preparare scaffold compatibili con B7-005, l'alginato è stato sostituito con agarosio. Sono stati preparati scaffold tridimensionali porosi di agarosio/idrossiapatite (Aga/HAp). Essi hanno mostrato porosità simile agli scaffold Alg / HAp. Tali strutture si sono rivelate quindi idonee per scopi di rigenerazione ossea. Gli scaffold di Aga/HAp sono stati caricati con B7-005 e hanno mostrato un rilascio efficace di peptide. Gli scaffold Alg/HAp erano compatibili anche con le cellule umane, che proliferavano su di esse in presenza e in assenza di B7-005. Gli scaffold Aga / HAp hanno mostrato un rigonfiamento limitato e una resistenza meccanica molto bassa. Tuttavia non hanno mostrato segni di degrado dopo 2 mesi. Infine, gli scaffold B7-005 Aga/HAp hanno inibito la crescita di patogeni batterici, sebbene le loro proprietà antimicrobiche possano essere migliorate. L'agarosio è quindi più adatto dell'alginato ad essere utilizzato in combinazione con peptidi antimicrobici cationici. Tale polimero può sostituire l'alginato in un protocollo per produrre scaffold porosi tridimensionali, mantenendo le proprietà desiderabili degli scaffold Alg / HAp. Bone defects are an unsolved clinical problem. To promote the bone regeneration tissue engineering for develops scaffolds to assist the healing of tissues. Porous three-dimensional scaffolds composed by alginate and hydroxyapatite help the regeneration of damaged bone. Scaffolds should also be endowed with antimicrobial properties, but avoiding the use of ordinary antibiotics. The bacterial antibiotic resistance, in fact makes useless most of the current antibiotics. The need of new antimicrobials is evident, and antimicrobial peptides (AMPs) attract increasing attention because of their antibacterial properties. Among AMPs, the proline-rich AMPs (PrAMPs) are interesting because they combine antimicrobial potency with high biocompatibility. Aim of this project was to load an optimized PrAMP on alginate/hydroxyapatite (Alg/HAp) scaffolds to provide them with antimicrobial effect retaining their capability to promote bone regeneration. To boost and tailor the antimicrobial activity of PrAMPs, the Bac7(1-16) was modified replacing some residues and adding then a lipid moiety to its N-terminus. Only the first approach was successful providing the B7-005, a new PrAMPs displaying better antimicrobial activity. On the other hand, the lipidation of B7-005 was detrimental. Alg/HAp scaffolds were produced and efficiently loaded with B7-005. However, once adsorbed on the scaffold, the peptide could not be released due to the strong interaction between alginate and B7-005. The attempts to modulate the interaction were useless. Alginate-based structures were not compatible with cationic AMPs. To prepare scaffolds compatible with B7-005, the alginate was replaced with agarose. Agarose/Hydroxyapatite (Aga/HAp) porous three-dimensional scaffolds were prepared. They displayed porosity similar to Alg/HAp scaffold. Aga/HAp were then suitable for bone-regeneration purposes. Aga/HAp scaffolds were loaded with B7-005 and they displayed effective release of peptide. Alg/HAp scaffolds were also compatible with human cells, that proliferated on them in the presence and in the absence of B7-005. Aga/HAp scaffolds displayed limited swelling and very low mechanical resistance. However they showed no signs of degradation after to 2 months. As last, B7-005 Aga/HAp scaffold inhibited the growth of bacterial pathogens, although their antimicrobial properties may be improved. The agarose is therefore more suitable than alginate to be used in combination with cationic antimicrobial peptides. Agarose can replace alginate in a protocol to produce three-dimensional porous scaffolds, maintaining desirable properties of Alg/HAp scaffolds.

2011/2012 Bac7(1-35) is the smallest fragment of the proline-rich cathelicidin Bac7 that shows the same antibacterial activity as the whole natural peptide of 60 residues. In this work, we remarked that the unique gene whose deletion can confer resistance to E. coli against Bac7(1-35) is sbmA, coding for an inner membrane protein involved in the penetration of this peptide into bacterial cells. Moreover, we provided evidence that SbmA is also involved in the transmembrane transport of a fragment of another proline-rich antimicrobial peptide, arasin1(1-23), isolated from the spider crab. These findings suggest a general role of this membrane protein in the uptake of proline-rich antimicrobial peptides (PR-AMPs) into Gram-negative bacteria. We then measured the intrabacterial concentration reached by Bac7(1-35) in E. coli, and observed that this increases from micromolar in the medium to millimolar within the bacterial cell, suggesting that it may bind to cytosolic structures. For this reason, we looked for possible interactions between Bac7(1-35) and macromolecules involved in viable processes of bacteria. These studies showed that Bac7(1-35) completely inhibits in vitro the transcription/translation process starting from a concentration of 50 μM. Then we demonstrated that inhibition is: i) specific for Bac7(1-35), since it is not exerted by other cathelicidin-derived AMPs not belonging to the Prorich group, and ii) not stereo-specific, since it is exerted at the same level by the all-D isomer of Bac7(1-35). We also demonstrated the ability of Bac7(1-35) to bind DNA in vitro, but we excluded that this binding may represent the primary mechanism of bactericidal action. We also showed that the peptide does not significantly affect in vitro the transcription process, deducing that the inhibition of the transcription/translation targets primarily the translation process. We verified these data in vivo on E. coli cells measuring the incorporation of radioactive precursors of bacterial macromolecules. We observed that the exposure of bacteria to Bac7(1-35) inhibited the incorporation of radioactive leucine, but not of radioactive thymidine and uridine, indicating a specific block at the protein synthesis level and not of DNA and RNA synthesis. In the near future, a clearer definition of the intrabacterial target(s) of Bac7(1-35) would hopefully lead to the experimentation of this molecule or of its derivatives as a new generation antibiotic drug. Bac7(1-35) è il più breve frammento del peptide Bac7, una catelicidina ricca in prolina di 60 residui, dotato della stessa attività battericida del peptide intero. In questo lavoro di tesi, abbiamo rimarcato che sbmA è l’unico gene la cui delezione conferisce ad E. coli una resistenza a Bac7(1- 35). Tale gene codifica per una proteina della membrana interna coinvolta nell’ingresso del peptide nel citoplasma della cellula batterica. Inoltre, abbiamo dimostrato che SbmA è coinvolta anche nel trasporto transmembrana di un frammento di un altro peptide antimicrobico, l’arasina1(1-23). Tali risultati suggeriscono che questa proteina giochi un ruolo generale nell’internalizzazione di peptidi antimicrobici ricchi in prolina nei batteri Gram-negativi. Abbiamo quindi misurato la concentrazione intrabatterica raggiunta da Bac7(1-35) in E. coli e abbiamo osservato che questa aumenta da valori micromolari nel terreno di coltura a millimolari nel citosol batterico, suggerendo un suo legame a strutture interne della cellula. Per questo abbiamo cercato possibili interazioni tra il peptide e macromolecole coinvolte in processi vitali del batterio. Con questi studi abbiamo appurato che Bac7(1-35) in vitro inibisce completamente il processo di trascrizione/traduzione a partire da una concentrazione di 50 μM. Successivamente abbiamo dimostrato che questa inibizione è una peculiarità di Bac7(1-35), in quanto altri AMP derivati da catelicidine ma non ricchi in prolina non hanno dimostrato un’attività comparabile. Inoltre, questa inibizione non è stereo-specifica, in quanto anche l’isomero D di Bac7(1-35) blocca tale processo esattamente come il suo isomero L. Abbiamo inoltre dimostrato la capacità di Bac7(1-35) di legare in vitro il DNA, ma abbiamo escluso che tale legame rappresenti il meccanismo primario della sua attività battericida. Abbiamo anche dimostrato che il peptide non interferisce in vitro in maniera significativa con il processo di trascrizione, deducendo che l’effetto osservato sul processo di trascrizione/traduzione fosse da attribuirsi prevalentemente all’inibizione della traduzione. Abbiamo verificato tali dati in vivo su cellule di E. coli misurando l’incorporazione di precursori radioattivi delle macromolecole batteriche. Abbiamo osservato che l’esposizione di batteri a Bac7(1-35) bloccava l’incorporazione di leucina radioattiva ma non di timidina ed uridina, indicando un blocco specifico della sintesi proteica ma non di quelle di DNA e RNA. In futuro, una definizione ancora più chiara del target intrabatterico di Bac7(1-35) potrebbe portare alla sperimentazione di tale molecola o di suoi analoghi come farmaci antibiotici di nuova generazione. XXV Ciclo 1985