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Dendritic cells (DCs) are critical for the differentiation and activation of type 2 T helper (Th2) cells, which provide protection from parasitic worm infections, yet also aggravate inflammation as seen in asthma and other allergic diseases. Yet little is known concerning the mechanisms employed by DCs to induce Th2 cells in the draining lymph node (LN) or to sustain activation of the T cells in the tissue during ongoing inflammation. In the lymph node, we show that DC induction of Th2 cells depends on the MARCH1 ubiquitin ligase. This pro-Th2 effect of MARCH1 relied on LN-resident DCs, which triggered T cell receptor (TCR) signalling and induced GATA-3 expression from naïve CD4+ T cells independent of tissue-driven migratory DCs. Mice with mutations in the ubiquitin acceptor sites of the antigen presenting molecule MHCII and costimulatory ligand CD86, the substrates of MARCH1, failed to develop Th2 cells. In the allergen-exposed tissue, we also found that MARCH1 in DCs played an essential role in sustaining effector CD4+ T cells. MARCH1-mediated turnover of MHCII and CD86 restrained exhaustion of effector CD4+ T cells, permissive with the robust proliferation of the T cells and the establishment of allergic inflammation. MARCH1 ablation in mice with established asthma reduced tissue infiltration of disease-associated eosinophils and Th2 cells. Thus, Th2 cell development and function in the lymph node and tissue depend on MARCH1-mediated turnover of antigen presenting and costimulatory molecules by DCs to control TCR signalling and T cell exhaustion. MARCH1 may serve as a novel therapeutic target in asthma and other allergic diseases.

Les cellules présentatrices d'antigène (CPAs) font le lien entre le système immunitaire inné et adaptatif en présentant des antigènes (Ags) étrangers aux cellules T CD4+. Pour être efficace, cette présentation nécessite que les Ags soient apprêtés et chargés de manière adéquate dans le sillon des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII). C'est uniquement dans ce contexte que les cellules T CD4+, via leur récepteur (TCR), peuvent reconnaître l'Ag et engager pleinement la réponse immunitaire adaptative. Ce processus doit être finement contrôlé pour diminuer les risques de réaction auto- immune. L'expression de CMHII est régulée à la fois au niveau transcriptionnel par le trans- activateur du CMHII (CIITA) et au niveau post-traductionnel via l’ubiquitination d'un seul résidu de lysine, situé dans la queue cytoplasmique de sa chaîne b. Dans les cellules dendritiques (DCs) et les cellules B, cette ubiquitination est dépendante de la E3 ubiquitine ligase MARCH1. La baisse d’expression de MARCH1 contribue à l'acquisition de propriétés immuno-stimulatrices qui accompagnent la maturation des DCs humaines. De plus, il a été démontré que l'absence d'ubiquitination du CMHII entraîne son accumulation excessive au niveau de la membrane plasmique, ce qui perturbe les radeaux lipidiques et les réseaux de tétraspanines chez les DCs de souris. Ces structures membranaires sont connues pour interagir avec des molécules de signalisation régulant de nombreux processus biologiques dans les cellules B, comme le récepteur des cellules B (BCR) et CD19. De surcroît, dans les cellules B naïves, les molécules de CMHII sont fortement exprimées à la surface cellulaire, même si elles sont constitutivement ubiquitinées par MARCH1. Il est également intéressant de noter que les lymphocytes B présentent l'expression la plus élevée de MARCH1 parmi toutes les cellules immunitaires et que cette expression augmente au cours de leur développement. L'impact qu’a l’ubiquitination des molécules de CMHII à la surface membranaire des lymphocytes B sur leur développement, leur activation et leurs fonctions n'a pas encore été pleinement étudié. Ici, nous montrons d'abord que l'absence d'ubiquitination du CMHII modifie fortement le pool de cellules B de la zone marginale (MZBs). Nous soutenons que cette altération peut résulter en partie de la protéotoxicité du CMHII sur les réseaux de tétraspanines contenant CD81, ce qui influe sur la dynamique de CD19 à la surface cellulaire et affecte sa capacité à activer la cascade PI3K / Akt induite par les signaux BCR dits « toniques ». L’altération du pool de cellules MZBs a également des répercussions sur la réponse immunitaire aux Ags T-indépendants de type 2 (TI-2 Ags) et sur la formation de centre germinatifs (GCs) dans la rate. Ensemble, ces effets atténuent la réponse humorale et peuvent conférer un effet protecteur contre les infections. Par exemple, nous montrons ici que les infections parasitaires à Leishmania donovani, dont l’établissement nécessite la présence de cellules B pleinement fonctionnelles, sont beaucoup mieux contrôlées en l’absence de MARCH1. Ces résultats démontrent qu’un contrôle fin de l'expression de surface du CMHII est nécessaire pour l'établissement d'un pool de cellules B variées et pleinement fonctionnelles pouvant répondre à une large gamme d'Ags. En second lieu, nous avons décrit une approche expérimentale que nous avons adaptée pour produire des outils moléculaires permettant d’identifier des partenaires d’interaction potentiels de MARCH1 dans des lignées cellulaires et des cellules B primaires. Cette approche repose sur la production de protéine de fusion qui pourront être utilisées dans des tests de liaison de proximité (BioID2). Ce projet a permis de mettre en lumière les effets importants de l'ubiquitination du CMHII sur le développement, l'activation et les fonctions des lymphocytes B. Il a également permis d’établir des bases solides pour de futures études sur de nouvelles cibles de MARCH1 qui permettront de mieux comprendre les effets biologiques de cette E3 ubiquitine ligase et leurs impacts sur la santé et les maladies., Antigen-presenting cells (APCs) link the innate and adaptive immune system by presenting foreign antigens to CD4+ T cells. To be efficient, this presentation requires antigens to be adequately processed and loaded in the peptide groove of the major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules. It's solely in this context that CD4+ T cells, via their T cell receptor (TCR), can recognize the antigen and fully engage the adaptative immune response. This process needs to be tightly regulated to avoid autoimmunity. MHCII expression is regulated both transcriptionally by the MHCII transactivator (CIITA) and post- translationally by ubiquitination of a single lysine residue located in the cytoplasmic tail of its b-chain. This is carried out by the MARCH1 E3 ubiquitin ligases in dendritic cells (DCs) and B cells. The down-regulation of MARCH1 contributes to the acquisition of potent immunostimulatory properties that coincides with the maturation of human DCs. Accordingly, the lack of MHCII ubiquitination has been shown to result in its excessive accumulation at the plasma membrane and in the disruption of lipid rafts and tetraspanin webs in mice DCs. These membrane structures are known to interact with signaling molecules that regulate numerous biological processes in B cells, such as the B cell receptor (BCR) and CD19. Moreover, in naïve B cells, MHCII molecules are highly expressed at the cell surface even if they are constitutively ubiquitinated by MARCH1. Interestingly, B lymphocytes exhibit the highest expression of MARCH1 among all immune cells and this expression is increasing during B cells development. The impact of the ubiquitin-dependent MHCII turnover on B lymphocytes development, activation, and functions have yet to be fully addressed. Here, we first show that the absence of MHCII ubiquitination strongly alter the marginal zone (MZ) B cell pool. We provide evidence that this alteration may in part be due to the previously described MHCII proteotoxicity on the CD81-containing tetraspanin web, which impacted CD19 surface dynamic and its capacity to activate the PI3K/Akt cascade during “Tonic” BCR signaling. The altered MZ B cell pool also affected the immune response to a type 2 T-independent antigen (TI-2 Ag) and the germinal center (GC) reaction in the spleen, which dampens humoral response and may confer a protective effect against infections. As per example, we show here that parasitic infections with Leishmania donovani, the establishment of which requires the presence of fully functional B cells, are better controlled in the absence of MARCH1. These results demonstrate the need for a tight control over MHCII surface expression for the establishment of a varied and fully functional B cell pool, which are mandatory for proper responses to a broad range of antigens. Secondly, we described an experimental approach that we adapted to produce molecular tools that will allow the identification of potential interacting partners of MARCH1 in cell lines and primary B cells. This approach is based on the production of fusion proteins that can be used in proximity binding assays (BioID2). This project shed light on the important effects of MHCII ubiquitination on the development, activation, and function of B lymphocytes. It also laid the groundwork for valuable future studies on novel MARCH1 targets which will provide a better understanding of the biological effects of this E3 ubiquitin ligase and their impact on health and disease.

Background Circular RNAs have been widely explored as potential biomarkers and therapeutic targets in bladder cancer; however, few have been functionally characterized. Results ciRs-6 is expressed at low levels in cancer tissues and advanced tumor grades and stages, and its expression correlates with better outcomes for bladder cancer patients. In vitro and in vivo, ciRs-6 was shown to suppress bladder cancer growth by sponging miR-653 to elevate March1 levels. March1 is an E3 ubiquitin ligase that has been proven to suppress bladder cancer growth; knocking down March1 in ciRs-6 overexpressed bladder cancer cells reversed the tumor suppressive effect of ciRs-6. Conclusions Our study identifies an oncogenic role of ciRs-6 and suggests its usefulness as a novel biomarker for bladder cancer diagnosis and prognosis and as a therapeutic target for bladder cancer. Methods ciRs-6 was identified by RNA-seq and qPCR; CCK8 assays, clone forming assays and cell cycle analyses were performed to evaluate the in vitro effect of ciRs-6 in bladder cancer; further, a mouse subcutaneous tumor model was designed for in vivo analysis. RNA pulldown assays, miRNA capture experiments and dual luciferase assessments were applied for mechanistic studies.

Membrane‐associated RING‐CH‐1 (MARCH1) is a membrane‐anchored E3 ubiquitin ligase that is involved in a variety of cellular processes. MARCH1 was aberrantly expressed as a tumour promoter in ovarian cancer, but the signalling about the molecular mechanism has not yet been fully illuminated. Here, we first determined that MARCH1 was obviously highly expressed in human hepatocellular carcinoma samples and cells. In addition, our findings demonstrated that the proliferation, migration and invasion of hepatocellular carcinoma were suppressed, but the apoptosis was increased, as a result of MARCH1 knockdown by either siRNA targeting MARCH1 or pirarubicin treatment. Conversely, the proliferation, migration and invasion of hepatocellular carcinoma were obviously accelerated, and the apoptosis was decreased, by transfecting the MARCH1 plasmid to make MARCH1 overexpressed. Moreover, in vivo, the results exhibited a significant inhibition of the growth of hepatocellular carcinoma in nude mice, which were given an intra‐tumour injection of siRNA targeting MARCH1. Furthermore, our study concluded that MARCH1 functions as a tumour promoter, and its role was up‐regulated the PI3K‐AKT‐β‐catenin pathways both in vitro and in vivo. In summary, our work determined that MARCH1 has an important role in the development and progression of hepatocellular carcinoma and may be used as a novel potential molecular therapeutic target in the future treatment of hepatocellular carcinoma.

Promotion of apoptosis and suppression of proliferation in tumor cells are popular strategies for developing anticancer drugs. Sinomenine (SIN), a plant-derived alkaloid, displays antitumor activity. However, the mechanism of action of SIN against hepatocellular carcinoma (HCC) is unclear. Herein, several molecular technologies, such as Western Blotting, qRT-PCR, flow cytometry, and gene knockdown were applied to explore the role and mechanism of action of SIN in the treatment of HCC. It was found that SIN arrests HCC cell cycle at G0/G1 phase, induces apoptosis, and suppresses proliferation of HCC cells via down-regulating the expression of membrane-associated RING-CH finger protein 1 (MARCH1). Moreover, SIN induces cell death and growth inhibition through AMPK/STAT3 signaling pathway. MARCH1 expression was silenced by siRNA to explore its involvement in the regulation of AMPK/STAT3 signaling pathway. Silencing MARCH1 caused down-regulation of phosphorylation of AMPK, STAT3 and decreased cell viability and function. Our results suggested that SIN inhibits proliferation and promotes apoptosis of HCC cells by MARCH1-mediated AMPK/STAT3 signaling pathway. This study provides new support for SIN as a clinical anticancer drug and illustrates that targeting MARCH1 could be a novel treatment strategy in developing anticancer therapeutics.

March1 joue un rôle essentiel dans la régulation de la réponse immunitaire. Cette ubiquitine ligase régule à la baisse l’expression de certaines protéines intervenant dans les fonctions des cellules présentatrices des antigènes, telles que le CMH de classe II et le CD86. March1 ubiquitine aussi quelques protéines impliquées dans le métabolisme cellulaire, comme le transporteur des acides aminées CD98 et le récepteur de l’insuline. L'ubiquitination du CMH de classe II et du CD98 par March1 affecte les fonctions de présentation des antigènes par les cellules dendritiques et la capacité de prolifération des TCD8+, respectivement. Cependant, le rôle de l’ubiquitination de CMH de classe II dans le développement et la migration des cellules dendritiques, n’est pas connu, et les implications physiologiques liées au rôle de March1 dans d’autres cellules, telles que les lymphocytes T CD8+, ne sont pas encore claires. Nos travaux démontrent que l'ubiquitination de CMH de classe II par March1 est spécifiquement requise pour la migration des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs) de la peau. L’effet de March1 sur la migration est intrinsèque à ces cellules et corrèle avec les niveaux d’expression des protéines impliquées dans la migration, notamment l’IRF4 et le CCR7. Dans un modèle de mélanome chez la souris, la déficience en ubiquitination du CMH de classe II est associée à une exacerbation de la croissance des tumeurs et un défaut de migration des moDCs vers les ganglions drainant les tumeurs. L’utilisation de cellules tumorales exprimant le GM-CSF augmente l’expression de l’IRF4 et du CCR7 dans les moDCs et la migration celles-ci vers les ganglions. D’autre part, nous avons démontré que la déficience en March1 exacerbe la résistance à l’insuline induite par l’obésité. Cet effet est associé à un enrichissement en lymphocytes T CD8+ ayant un phénotype effecteur/mémoire dans le tissu adipeux des souris obèses. Les expériences de transfert adoptif de lymphocytes T CD8+ montrent que March1 exacerbe la résistance à l’insuline en affectant intrinsèquement le phénotype de ces cellules. Nos résultats indiquent une augmentation de l’activité métabolique des lymphocytes T CD8+ est en absence de March1, ce qui est en accord avec le rôle de ce dernier dans l’ubiquitination de CD98 et du récepteur de l’insuline. Dans l’ensemble, nos travaux montrent que March1 régule la capacité migratoire des moDCs et le métabolisme des lymphocytes T CD8+. L’implication de cette régulation dans le développement du cancer de mélanome et du diabète de type de II suggère que March1 pourrait être ciblé dans le cadre de stratégies thérapeutiques contre ces pathologies., March1 plays a critical role in the immune response regulation. This ubiquitin ligase downregulates the expression of antigen presentation and costimulatory proteins, such as MHC class II and CD86, as well as other proteins involved in the cellular metabolism, such as the amino acid transporter CD98 and the insulin receptor. The ubiquitination of these proteins by March1 alters the antigen presentation and proliferative capacities of dendritic cells and CD8+ T cells, respectively. However, the effect of MHC class II ubiquitination by March1 on the development and the migration of dendritic cells are not known, and the physiological implications of March1 in other cells, such as CD8+ T cells, are not completely understood. In this thesis, we show that MHC class II ubiquitination by March1 is specifically required for the migration of monocyte-derived dendritic cells (moDCs) from skin to skin draining lymph nodes (sdLN). This effect is cell intrinsic and correlates with the expression level of proteins involved in immune cell migration, IRF4 and CCR7. In a melanoma mouse model, the deficiency of MHC class II ubiquitination is associated with exacerbated tumor growth and impaired moDCs migration from tumor to tumors-draining LNs. Using GM-CSF producing tumors, we found that this cytokine increases the expression of IRF4 and CCR7 in moDCs and improves their migration. On the other hand, we show that March1 deficiency exacerbates obesity-induced insulin resistance. Adipose tissue from these mice was enriched in CD8+ T cells with an effector/memory phenotype. Adoptive transfer of splenic CD8+ T cells showed that March1 intrinsically affects the phenotype of these cells in obese adipose tissue and exacerbates insulin resistance. Consistent with the role of March1 in the ubiquitination of CD98 and insulin receptor, the metabolic activity of CD8+ T cells was increased in absence of March1. Overall, we showed that March1 regulates the migratory capacity of moDCs and the metabolic activity of CD8+ T cells. The involvement of these effects in the development of melanoma cancer and type II diabetes suggests that March1 can be a target for therapeutic strategies against these pathologies.

Le métabolisme des cellules immunitaires est assujetti à un contrôle étroit. L’inflammation, la présentation antigénique et l’expansion clonale sont des évènements qui demandent un changement rapide dans le métabolisme des cellules. Notamment, la glutamine est grandement sollicitée lors de la maturation des cellules dendritiques, les macrophages et les lymphocytes B et T pour son rôle dans la synthèse des protéines et son implication dans la phosphorylation oxydative. Au repos, les cellules présentatrices d’antigènes (CPAs) expriment l’ubiquitine ligase E3 MARCH1. MARCH1 est une protéine membranaire qui régule la réponse immunitaire en ubiquitinant, entre autres, le complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH II) et CD86. Lors de l’activation des cellules immunitaires, son expression est réprimée, ce qui permet l’accumulation du CMH II et de CD86 sur leur membrane. Nous pensons que MARCH1 régule négativement le métabolisme des cellules immunitaires. Parmi les protéines membranaires sous le contrôle de MARCH1 pourraient se trouver des transporteurs de glutamine. La baisse rapide de MARCH1 serait nécessaire pour permettre aux cellules de modifier leur métabolisme en augmentant le transport de la glutamine. Dans le mémoire présent, nous nous sommes intéressés à l’interactôme de MARCH1. Afin de découvrir de nouvelles cibles de MARCH1, nous avons utilisé la méthode du BioID dans des cellules HEK293T. Le BioID est une méthode innovatrice permettant l’identification d’interactions interprotéines. La protéine de fusion BioID2 permet la biotinylation et l’isolation des protéines adjacentes in vivo. Ces essais de proximité nous ont permis d’identifier 41 cibles potentielles de MARCH1. Nous avons analysé l’expression de 13 de ces protéines par cytométrie en flux. Nos résultats démontrent que MARCH1 induit la dégradation de NKCC1, CD147 et SNAT2. L’expression de MARCH1 dans les cellules HEK293T engendre une diminution de SNAT2 en surface. S’il avère que MARCH1 régule le métabolisme de la glutamine dans les cellules immunitaires, il s’agirait alors d’un nouveau mécanisme par lequel cette ubiquitine ligase E3 module la réponse immunitaire. SNAT2 est nécessaire dans l’adaptation des cellules pour leurs besoins en glutamine. Nous discuterons du rôle que joue cette protéine dans l’adaptation du métabolisme et la glutaminolyse., Immune cell metabolism is subjected to a tight control. Inflammation, antigen presentation and clonal expansion are all events that comes with a rapid change in metabolism. Glutamine is highly solicited during dendritic cells, macrophages and B and T lymphocytes maturation, due to its role in protein synthesis and oxidative phosphorylation. At steady-state, antigen presenting cells express the ubiquitin ligase E3 MARCH1. MARCH1 is a membrane protein involved in the immune response through major histocompatibility II and CD86 ubiquitination and degradation. During their activation, MARCH1 expression is repressed. This allows for accumulation of MHC II and CD86 on the cell surface, but other membrane-bound receptors and transporters are also increased during that time. Among those, proteins involved in glutamine transport are increased and thus help immune cells to adjust their intracellular nutrient pool for their new metabolic needs. We propose that MARCH1 negatively regulates immune cell metabolism through the regulation of nutrient transporters. The rapid stop in the transcription of MARCH1 induces an increase in receptors on the cytoplasmic membrane. Here, we aimed to identify the MARCH1 interactome. In order to identify new MARCH1 targets, we used the BioID proximity assays in HEK293T cells. BioID is an innovative method for the identification of protein interactions. BioID2 protein fusion can be used for in vivo biotinylation and isolation of promiscuous proteins. These proximity assays allowed us to identify 41 potential MARCH1 targets. We analyzed the expression of 13 of these proteins and found that 3 were affected by MARCH1 expression. Our results show that MARCH1 induces the degradation of NKCC1, CD147 and SNAT2. More specifically, MARCH1 expression in HEK293T induces the internalisation of the glutamine transporter SNAT2. If MARCH1 proves to regulate glutamine transport in immune cells, this would be a novel mechanism by which this ubiquitin ligase regulates adaptive immune system. Indeed, SNAT2 is required for the cellular adaption of amino acids during maturation, including glutamine. We will discuss the implications of MARCH1 as a metabolic switch and the role this would have in glutaminolysis and antigen presentation.

Resveratrol is a common, naturally occurring polyphenol confirmed with inhibited the cellular effects of carcinogenesis. However, the molecular mechanism underlying resveratrol's action against hepatocellular carcinoma (HCC) is still unclear. In addition, MARCH1 promotes the initiation and progression of HCC, but it is unclear whether resveratrol exerts antitumor efforts by regulating MARCH1 expression. This study determined the molecular mechanisms underlying the antitumor effects of resveratrol in HCC. Resveratrol induced apoptosis and inhibited the proliferation, migration, and invasion of HCC cell lines (HepG2 and Hep3B). In addition, it inhibited MARCH1 and phospho-protein kinase B (p-AKT) expression but upregulated the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN) dose-dependently both in vitro and in vivo. MARCH1 knockdown by small interfering RNA (siRNA) also increased PTEN expression. Meanwhile, MK2206 (an AKT inhibitor) and bisperoxovanadium (BPV; a PTEN inhibitor) combined with resveratrol decreased MARCH1 expression more than the single-treatment HCC group. These results suggested that resveratrol affects the biological characteristics of HCC via downregulation of MARCH1 expression.

Membrane-associated RING-CH (MARCH) belongs to the family of RING-CH type E3 ubiquitin ligases. MARCH1 ubiquitinates and downregulates MHC class II expression in APCs and targets major players of the immune system. However, the role of MARCH1 in ovarian cancer has not been elucidated. The present study investigated the function of MARCH1 in ovarian cancer and the potential mechanisms involved. MARCH1 expression was examined in human ovarian cancer tissue specimens by immunohistochemistry. The role of MARCH1 in ovarian cancer cells was assessed by cell proliferation, migration and invasion assays with MARCH1 gene silencing. To investigate the mechanism by which MARCH1 functions, correlation between MARCH1 and the cell signaling pathways were analyzed using a luciferase reporter assay, real-time RT-PCR, western blot assay and immunofluorescence. MARCH1 was found to be overexpressed in ovarian cancer tissues when compared to adjacent non-tumor and normal ovarian tissues. Silencing MARCH1 inhibited SKOV3 cell proliferation, invasion and migration, as well as inhibiting the NF-κB and the Wnt/β‑catenin pathways. MARCH1 functions as a tumor promoter by upregulating the NF-κB and the Wnt/β-catenin pathways, indicating that MARCH1 may be a therapeutic target for patients with ovarian cancer.

Liver cancer is a very common and significant health problem. Therefore, powerful molecular targeting agents are urgently needed. Previously, we demonstrated that secalonic acid-F (SAF) suppresses the growth of hepatocellular carcinoma (HCC) cells (HepG2), but the other anticancer biological functions and the underlying mechanism of SAF on HCC are unknown. In this study, we found that SAF, which was isolated from a fungal strain in our lab identified as Aspergillus aculeatus, could inhibit the progression of hepatocellular carcinoma by targeting MARCH1, which regulates the PI3K/AKT/&beta, catenin and antiapoptotic Mcl-1/Bcl-2 signaling cascades. First, we confirmed that SAF reduced the proliferation and colony formation of HCC cell lines (HepG2 and Hep3B), promoted cell apoptosis, and inhibited the cell cycle in HepG2 and Hep3B cells in a dose-dependent manner. In addition, the migration and invasion of HepG2 and Hep3B cells treated with SAF were significantly suppressed. Western blot analysis showed that the level of MARCH1 was downregulated by pretreatment with SAF through the regulation of the PI3K/AKT/&beta, catenin signaling pathways. Moreover, knockdown of MARCH1 by small interfering RNAs (siRNAs) targeting MARCH1 also suppressed the proliferation, colony formation, migration, and invasion as well as increased the apoptotic rate of HepG2 and Hep3B cells. These data confirmed that the downregulation of MARCH1 could inhibit the progression of hepatocellular carcinoma and that the mechanism may be via PI3K/AKT/&beta, catenin inactivation as well as the downregulation of the antiapoptotic Mcl-1/Bcl-2. In vivo, the downregulation of MARCH1 by treatment with SAF markedly inhibited tumor growth, suggesting that SAF partly blocks MARCH1 and further regulates the PI3K/AKT/&beta, catenin and antiapoptosis Mcl-1/Bcl-2 signaling cascade in the HCC nude mouse model. Additionally, the apparent diffusion coefficient (ADC) values, derived from magnetic resonance imaging (MRI), were increased in tumors after SAF treatment in a mouse model. Taken together, our findings suggest that MARCH1 is a potential molecular target for HCC treatment and that SAF is a promising agent targeting MARCH1 to treat liver cancer patients.

Les mécanismes de l’immunosurveillance des tumeurs commencent à être compris et sont appuyés par un multitude de données expérimentales et cliniques. Il est évident que la coopération entre tous les bras du système immunitaire est requise pour une réponse anti-tumorale optimale. Cependant, le rôle inhabituel des cellules T CD4+ dans l’éradication des tumeurs est maintenant bien démontré. Ce concept était initialement problématique, car la plupart des tumeurs non-hématopoïétiques n’expriment pas de CMH de classe II, qui est nécessaire pour la reconnaissance par les cellules T CD4+. Il est probable que cette réponse dépende des cellules présentatrices d’antigènes qui infiltrent la tumeur et présentent aux cellules T CD4+ des antigènes tumoraux via leur CMH de classe II. Ici, nous cherchons à étudier le rôle de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH de classe II et le relocalise vers les endosomes de recyclage, dans le contexte du modèle expérimental de mélanomes B16. Ainsi, nous comparerons la souris sauvage et la souris MARCH1 KO dans ce modèle. Nous proposons que l’inoculation des tumeurs B16 chez la souris MARCH1 KO génèrera de plus grosses tumeurs que chez la souris sauvage, car l’expression de surface stabilisée du CMH de classe II génère des dysfonctions intrinsèques chez les cellules dendritiques. Nos résultats démontrent que la souris MARCH1 KO développe des tumeurs plus agressives et plus larges que la souris sauvage, associé avec une infiltration réduite de cellules T CD4+ dans les tumeurs. Ceci semble être associé à une activation déficiente des cellules T CD4+ dans les ganglions lymphatiques par les cellules dendritiques., The mechanisms of cancer immunosurveillance are beginning to be understood and the concept is being supported by tremendous experimental and clinical data. While all arms of the immune system are required for maximal anti-tumor responses, the importance of CD4+ T cells in tumor eradication is now well established. However, this concept was initially problematic, as most non-hematopoietic tumors do not express MHC class II molecules at their surface, which are necessary for recognition by CD4+ T cells. It is most likely that the early response is dependent on infiltrating APCs that uptake tumor antigens and present them to CD4+ T cells via their MHC class II molecules. We thus sought to study the impact of MARCH1, an E3 ubiquitin ligase which interacts with MHC class II molecules and limits their cell surface exposure, in the context of the B16 melanoma model. Comparing wild-type mice and MARCH1-deficient mice, we posited that MARCH1-deficient mice would react poorly to the B16 tumor challenge as stabilized MHC class II expression leads to severe impairments in DCs. Our findings demonstrate that MARCH1 KO mice developped more aggressive and larger tumors than their wild-type littermates. This was seemingly due to an defective DC-mediated priming of CD4+ T cells in the lymph nodes, resulting in a significantly reduced CD4+ TIL population.

In addition to their classical antigen presenting functions, MHC class II molecules potentiate the TLR-triggered production of pro-inflammatory cytokines. Here, we have addressed the effect of Tollip and MARCH1 on the regulation of MHC II trafficking and TLR signaling. Our results show that MARCH1-deficient mice splenocytes are impaired in their capacity to produce pro-inflammatory cytokines in response to poly(I:C) and that TLR3 and MHC II molecules interact in the endocytic pathway. Knocking down Tollip expression in human CIITA+ HeLa cells increased expression of HLA-DR but reduced the proportion of MHC II molecules associated with the CLIP peptide. Truncation of the HLA-DR cytoplasmic tails abrogated the effect of Tollip on MHC class II expression. While overexpression of Tollip did not affect HLA-DR levels, it antagonized the function of co-transfected MARCH1. We found that Tollip strongly reduced MARCH1 protein levels and that the two molecules appear to compete for binding to MHC II molecules. Altogether, our results demonstrate that Tollip regulates MHC class II trafficking and that MARCH1 may represent a new Tollip target.

La relocalisation et la dégradation médiée par ubiquitination sont utilisées par la cellule pour contrôler la localisation et l’expression de ses protéines. L’E3 ubiquitine ligase MARCH1 est impliqué dans la régulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce mémoire, on propose un rôle additionnel à MARCH1. Nos résultats expérimentaux nous portent à croire que MARCH1 pourrait moduler le métabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la dégradation d’enzymes impliquées dans la glycolyse. La grande majorité des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP en présence d’oxygène. Dans un environnement hypoxique, cette dernière est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaérobique pour produire son ATP. Une cellule cancéreuse à des besoins énergétiques supérieurs en raison de l’augmentation de sa biomasse et de sa prolifération incontrôlée. Pour subvenir à ces besoins, elle maximise sa production d’énergie en modifiant son métabolisme; c’est l’effet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au métabolisme cellulaire suite à un signal d’activation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la réserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuées dans les cellules présentatrice d’antigènes qui expriment MARCH1. Nous avons montré que MARCH1 était localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet d’interagir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifié l’expression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de l’expression de ces enzymes en absence de MARCH1. À la lumière de ces résultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de l’expression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite à l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Ce phénomène permettrait une présentation antigénique plus efficace, une augmentation de la production d’énergie et une meilleure résistance aux ROS produits lors de la réponse inflammatoire., Relocation and degradation mediated by ubiquitination are used by the cell to control the localization and the expression of proteins. E3 ubiquitin ligase MARCH1 is known to be involved in post-translational regulation of MHC-II and CD86. In this thesis, we suggest an additional role to MARCH1. Our experimental results lead us to believe that MARCH1 may modulate cellular metabolism by promoting the relocation and degradation of enzymes involved in glycolysis. The vast majority of cells generate ATP from oxidative phosphorylation in presence of oxygen. In a hypoxic environment, the latter is non-functional and the cell must use the anaerobic glycolysis to produce ATP. A cancerous cell requires more energy due to increased biomass and its uncontrolled proliferation. To meet these needs, it maximizes its energy production regardless of oxygen concentrations. Many studies have shown that aerobic glycolysis is preferred to oxidative phosphorylation in cancer cells, even if the two pathway are used simultaneously; it is described as the Warburg effect. Similar modification of the cellular metabolism is also found in immune cells after an activation signal to fulfill the cell functions. Here we show that the maximal mitochondrial respiration, the respiratory reserves and the maximal glycolysis are reduced in antigen-presenting cells that express MARCH1. Furthermore, we showed that MARCH1 can be localized on the mitochondria to interact with it’s target. Finally, we quantified the expression of Eno1 and LDHB by Western blot to show an increased expression of these enzymes in the absence of MARCH1. Thus, we discuss the benefits of the expression reduction of MARCH1 in an inflammatory context, following the activation of antigen presenting cells. This phenomenon would allow a better antigen presentation, an increased energy production and a greater resistance to ROS, produced during the inflammatory response.

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II., Classical MHC class II molecules are responsible for the presentation of exogenous peptides to CD4+ T cells, which is essential for the establishment of the adaptive immune response. However, problems with recognition of auto-antigens and the subsequent cell elimination are at the root of numerous autoimmune diseases. Manipulation of the antigen presentation pathway in order to eliminate cells that present self-antigens could serve as potential treatments of many autoimmune disorders. It is therefore essential to deepen our knowledge regarding the mechanisms regulating antigen presentation. Antigen presentation is regulated both transcriptionally and post-translationally. Whereas many cytokines affect the latter, IL-10, an anti-inflammatory cytokine, causes the intracellular retention of MHC II molecules. This phenotype is the result of the ubiquitination of MHC II -chain cytoplasmic tail by MARCH1. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase expressed in secondary lymphoid organs. Until recently, little was known about the structure-function and the targets of MARCH1. Considering its major impact on antigen presentation, we were interested to study this E3 ligase in order to reveal how it is regulated and what are the required conditions for its function. In a first report, we have investigated the regulation of MARCH1’s protein expression. Our results revealed its autoregulation via dimer formation and autoubiquitination. In addition, we have demonstrated the involvement of MARCH1’s transmembrane domains for dimerization and MHC II interaction. In a second article, we highlighted the importance of MARCH1 localization for its function. Our results indicated that localization motifs in the C-terminal portion of MARCH1 were functional and revealed the presence of some sorting elements in the N-terminal portion of the molecule. A panel of mutant were used and allowed us to identify a ‘’VQNC’’ motif, located in the C-terminal cytoplasmic portion of MARCH1, in which the valine is central for the molecule’s function. Indeed, point-mutation of the valine led to a decrease in MARCH1 ability to relocate MHC II whereas BRET experiments revealed a modification in the spatial organization of the cytoplasmic tails. Moreover, a blast of sequence homology showed the presence or that same motif in others ubiquitine ligases, one of which is Parkin. Parkin is highly expressed in the brain and seems to be implicated in protein aggregates’ degradation. It was reported that malfunction of Parkin leads to the accumulation of aggregates, called Lewy bodies, responsible for the neural functions deficiencies observed in patients with Parkinson disease. Interestingly, a family for which the sickness was genetically transmitted has a mutated valine in the VQNC motif. We believe that the importance of this motif is not restricted to MARCH1 and could be generalized to others E3 ubiquitin ligases. This project enabled us to characterize the regulation mechanisms of MARCH1. In addition, we discovered various structural elements required for its function. Altogether, our data allows for a better understanding of the mechanisms controlling MHC II molecules antigen presentation.

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes., Increasing evidence suggests a major role for B cells in the onset of auto-immune diseases. B cells present self-antigens to auto-reactive T cells which leads to the production of pro-inflammatory cytokines and auto-immune antibodies. Here we look at the process of antigen presentation and at post-transcriptional modifications of the MHC-II molecule. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase which targets MHC-II and re-localises the complex into recycling endosomes. Thus, MARCH1 is a direct inhibitor of exogenous antigen presentation. Here we show that only follicular B cells express MARCH1 and that upon germinal center entry, these cells lose all traces of MARCH1. We propose that MARCH1 may establish a threshold for germinal center creation. Moreover we demonstrate that the well-established increase in surface MHC-II induced by IL-10 on murine B cells is a result of a decrease in MARCH1 expression. We tested different B cell activation stimuli and showed that upon activation, MARCH1 mRNA is decreased in a time-dependent manner. In addition, we demonstrate the implication of the canonical NF-κB pathway in this regulation. Finally, we developed a lentiviral vector system expressing MARCH1 which enables us to force the expression of our target protein in non-transfectable cell types. We discuss the implication of MARCH1 in the presentation of self-antigens to auto-reactive T cells and the generation of auto-immunity.

La chaîne invariante forme un complexe nonamérique avec les molécules classiques du CMH de classe II. HLA-DM et HLA-DO, des molécules non-classiques de classe II, sont aussi impliquées dans la présentation des peptides antigéniques aux lymphocytes T. Ces molécules chaperones de la présentation antigénique modulent la capacité d’une cellule à présenter des antigènes par les moloécules classiques du CMH de classe II. La régulation transcriptionnelle des molécules chaperones, tout comme celle des autres molécules du CMH de classe II, est assurée par le transactivateur CIITA. La molécule HLA-DR peut être régulée négativement de manière post-traductionnelle par ubiquitination grâce à l’enzyme E3 ubiquitine ligase MARCH1. Celle-ci est induite par l’interleukine-10 dans les monocytes. L’objectif de ce projet était de déterminer si l’ubiquitination par MARCH1 peut aussi réguler l’expression des molécules chaperones de la présentation antigénique. Les expériences furent réalisées dans le contexte de co-transfections en cellules HEK293T. L’expression des molécules fut évaluée par immunomarquages et cytométrie de flux. Il a été montré que l’isoforme p33 de la chaîne invariante est régulé négativement en présence de MARCH1 à partir de la surface cellulaire, causant ainsi sa dégradation. Tel que démontré par l’utilisation d’un mutant dépourvu de queue cytoplasmique, cette dernière région n’est pas indispensable à ce phénomène. Une hypothèse est qu’une molécule non-identifiée, associée à Ii, serait ubiquitinée par MARCH1, l’entraînant dans sa régulation négative. Il fut déterminer que cette molécule n’était pas CXCR2, un récepteur pouvant être impliqué, avec la chaîne invariante et CD44, en tant que récepteur de MIF (Macrophage Inhibitory Factor). Il fut aussi montré que HLA-DO peut être ciblé par MARCH1 mais ceci ne semble pas être un phénomène dominant; l’expression des complexes DO/DM n’étant pas affectée bien qu’ils entrent en interaction avec MARCH1. L’expression de HLA-DM n’est pas affectée par MARCH1. Il n’a toutefois pas été déterminé hors de tout doute si MARCH1 peut modifier DM; des résultats obtenus avec une queue cytoplasmique de DM possédant une lysine laissant suggérer qu’il est possible que MARCH1 interagisse avec DM. Dans l’ensemble, les travaux démontrent que l’ubiquitination par MARCH1 joue un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle de la chaîne invariante p33 mais pas HLA-DO et HLA-DM., The invariant chain, which form a nonameric complex with the classical MHC class II molecules. HLA-DM and HLA-DO (non-classical class II molecules) are involved in the presentation of antigens to T lymphocytes. The chaperons molecules of the antigenic presentation can modulate the capacity of the cells to present antigens. The transcriptional regulation of the chaperons and all of the other molecules linked to the MHC is assured by the CIITA transactivator. Little is know of the post-transcriptional mechanisms, other than the fact that HLA-DR molecule can be down-regulated by ubiquitination due to E3 ubiquitin ligase MARCH1. MARCH1 is induce by interleukin-10 in monocytes. The goal of this project is to figure out if ubiquitination by MARCH1 can also regulate the expression of the antigenic presentation chaperons. The experiences were performed in the context of co-transfections in HEK293T cells and the expression of the diverses molecules was evaluated by cell stainings and FACS analysis. The p33 isoform of the invariant chain was found to be down-regulated and degraded in the presence of MARCH1. The invariant chain cytoplasmic tail is not completely essential to this phenomenon; a non-identified molecule, associated with Ii, is probably ubiquitinated by MARCH1 and is then down-regulated, together with Ii. It was shown tha CXCR2, a reeptor involved with the invariant chain and CD44 in the reception of the MIF signal, is not that molecule. HLA-DO can ben targetd by MARCH1 but this does not seem to be a general phenomenon; the expression of the DO/DM complexes remaning unaffected even with the interaction of those complexes with MARCH1. Therefore, a certain protection seem to be provided by HLA-DM to HLA-DO. The expression of HLA-DM itself is not affected by the presence of MARCH1. However, it was not cleary demonstrated if MARCH1 can modify DM. Some results obtained with a cytoplasmic tail of DM comprising an additional lysine suggest that there is a possibility that MARCH1 interact with DM. Generally, the work presented here show that ubiquitination by MARCH1 is involved in post-transcriptionnal regulation of the p33 isoform of the invariant chain but not in the regulation of HLA-DO and HLA-DM.