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Trabajo presentado en la 13ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAL), celebrada en Madrid (España) del 17 al 18 de junio de 2019, El uso de probióticos o compuestos bacterianos se ha propuesto como un mecanismo para modular la respuesta inmune del hospedador y remodelar el microbioma humano. Sin embargo, actualmente existe una falta de información sobre las vías moleculares inducidas por las bacterias probióticas, o sobre la interacción entre los probióticos y el sistema inmunológico. Lactobacillus es un género del filo Firmicutes que incluye cepas probióticas y representativas de la microbiota gastrointestinal humana. Estudios independientes han demostrado las propiedades antiinflamatorias de diferentes cepas de Lactobacillus, aunque estamos lejos de comprender la interacción molecular subyacente. En este trabajo, demostramos que una administración diaria de 5e10 células viables de Lactobacillus acidophilus DSM 20079T (DSM20079) a lechones sanos produjo un aumento plasmático de la interleucina antinflamatoria IL10, disminuyendo, a su vez, la interleucina IL12 y la ratio proinflamatorio IL12 + TNF α / IL10. Además, las células mononucleares de sangre preriféricas (PBMCs) extraídas de estos lechones se volvieron menos reactivas contra el lipopolisacárido de Escherichia coli (LPS) y la fitohemaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA), cuando se ven afectadas por la cepa DSM20079. Se identificó la fracción proteica extracelular de DSM20079 como la responsable de esta modulación. El efecto tolerogénico ejercido por las proteínas extracelulares de esta cepa sugiere su uso potencial como coadyuvante para aplicaciones terapéuticas dirigidas a enfermedades inflamatorias crónicas., Este trabajo fue respaldado por el >Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Inovación Orientada a los Retos de la Sociedad> (AGL2016-78311- R); la Asociación Española Contra el Cáncer (>Obtención de péptidos bioactivos contra el Cáncer Colo-Rectal a partir de secuencias genéticas de microbiomas intestinales>, PS-2016).

The unceasing emergence of antibiotic-resistant strains and resilient biofilm-related infections is pressing researchers to develop novel antimicrobial strategies. Quorum sensing (QS) is a key communication mechanism that holds promise as target to control clinical pathogens. QS allows bacteria to regulate gene expression, and thus many physiological activities, such as virulence, motility, and biofilm formation. Available information about anti-QS drugs is scattered in the vast ever-growing biomedical bibliome. Therefore, bioinformatics techniques, such as text mining and network mining, can greatly assist in the condensation and organization of such information, allowing researchers to readily identify relevant drug-QS interactions and generate new hypothesis for antimicrobial research. In this work, an automated workflow that automatically extracts key information on P. aeruginosa anti-QS studies from PubMed records was implemented. The workflow outputs an integrated network, capturing the effect of drugs over QS genes, QS signals and virulence factors. Moreover, these drug-QS interactions are contextualised by additional information on the experimental methods employed, details on the drugs, QS entities and strains. The public Web-based interface (http://pcquorum.org) enables users to navigate through the interactions and look for indirect, non-trivial associations. Currently, the P. aeruginosa drug-QS network contains 958 interactions encompassing 238 different drugs and 133 different QS entities; but it is in continuous, semi-automated growth. The web-based interface also has available a regulatory network for P. aeruginosa so users can have a comprehensive picture of emerging anti-QS findings and thus gain novel understandings and select new antimicrobial experiments., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Antimicrobial research is increasingly being focused on the problem of microbial resistance and biofilm formation. Alternative mechanisms of action, as those of antimicrobial peptides (AMP), and synergic antimicrobial combinations can lead to more effective therapeutic strategies for this ever-growing world-wide problem. Hence, this work aimed to evaluate the antimicrobial and cytotoxic potential of combinations of colistin (CST) with other AMP against planktonic and biofilm cultures of two major pathogens, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. CST was combined with the AMP temporin A (TEMP-A), citropin 1.1 (CIT-1.1) and a linear analogue of tachyplesin I (TP-1-L) and tested against planktonic, single- and double-species biofilm cultures of P. aeruginosa and S. aureus, comprising a reference and a clinical isolated strain for each bacteria. The methods applied encompassed checkerboard assays, statistical and biological significance analysis of biofilm-cell viability and cytotoxicity evaluation. Results showed overall synergy for planktonic P. aeruginosa and synergy (CST + TP-1-L) and additiveness for planktonic S. aureus. Biofilm growth was successfully prevented with overall synergic and additive effects for both bacteria. The eradication of already pre-established 24-h biofilms proved challenging, especially for S. aureus and for the double-species biofilms. Interestingly, CST revealed low toxicity against mammalian cells but its combinations were toxic for high concentrations. In summary, CST-AMP combinations showed promising results and other strategies are being investigated to improve effectiveness and reduce toxicity against pre-established biofilms, notably by adding a third antimicrobial agent., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Ventilator associated pneumonia (VAP), an usual nosocomial infection in the intensive care units and the most common in mechanically ventilated patients, is a serious problem due to high mortality and morbidity rates associated. The presence of the endotracheal tube is the principal risk factor for developing VAP because its surface is prone to microbial adhesion and the formation of biofilms, deserving thus high attention in clinical settings. Cell-to-cell communication is an important mechanism of interaction between VAP microorganisms, being involved in the process known as quorum-sensing (QS) that regulate the expression of virulence. To evaluate bacteria fungi cross-talk in co-infection, the biofilm-forming ability of Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, individually or jointly, before and after antibiotic and antifungal co-treatment was tested. Biofilms were characterized in terms of total mass and cell viability. Results showed that no antimicrobial combination was successful in the binary biofilms eradication. In some cases, the tolerance of the polymicrobial consortia was higher than that of single biofilms, highlighting that P. aeruginosa and C. albicans established synergistic relationships. To gain knowledge helping to explain those interactions, a quantitative real-time PCR approach was followed to inspect the expression profiles of some cell-cell communication genes involved in biofilm resistance. To overcome the tolerance issues, new antimicrobial combinatorial approaches using QS-inhibitors are being tested. Some combinations involving chlorogenic acid and ciprofloxacin displayed promising anti-biofilm potential.

[Excerpt] Introduction The solution to clinically relevant biofilms and antimicrobial resistance may lie in alternative products with new mechanisms of action. Antimicrobial peptides (AMPs) may be good replacements for current antibiotics because their action is low in specificity, reducing the chance of acquiring resistance, and they have a broad spectrum of activity against Gram-negative and -positive bacteria, including drug-resistant strains. Biofilms of Pseudomonas aeruginosa, a multidrug-resistant Gram-negative pathogen, are the second most common cause of nosocomial pneumonia and are also related to infections in medical devices. Synergic interrelationships between AMPs could be a promising perspective to treat these biofilm-associated infections., The financial support from IBB-CEB, Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and European Community fund FEDER, through Program COMPETE, in the ambit of the FCT PTDC/SAU-SAP/113196/2009/FCOMP-01-0124-FEDER-016012 are gratefully acknowledged, info:eu-repo/semantics/publishedVersion

[Excerpt] Introduction Antimicrobial peptides (AMPs) are nowadays importantly recognized, mostly due to the raise of infections caused by multi-resistant pathogens, and have been hailed as a potential solution to the shortage of novel antibiotics, due to their general unspecific mechanism of action which impairs the acquiring of resistance., The financial support from IBB-CEB, Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and European Community fund FEDER, through Program COMPETE, in the ambit of the FCT PTDC/SAU-SAP/113196/2009/FCOMP-01-0124-FEDER-016012 are gratefully acknowledged., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

This paper recommends a new approach to the detection and containment of Web crawler traverses based on clickstream data mining. Timely detection prevents crawler abusive consumption of Web server resources and eventual site contents privacy or copyrights violation. Clickstream data differentiation ensures focused usage analysis, valuable both for regular users and crawler profiling. Our platform, named ClickTips, sustains a site-specific, updatable detection model that tags Web crawler traverses based on incremental Web session inspection and a decision model that assesses eventual containment. The goal is to deliver a model flexible enough to keep up with crawling continuous evolving and that is capable of detecting crawler presence as soon as possible. We use a real-world Web site case study as a support for process description, as well as, to evaluate the accuracy of the obtained classification models and their ability for discovering previously unknown Web crawlers., (undefined)

Dissertação de mestrado em Bioengenharia, Bacterial colonisation of biomedical devices frequently leads to biofilm formation on its surface, originating biomaterial-associated infections (BAI). Antibiotherapy is the most common BAI treatment, however with development of antibiotic resistance, antimicrobial peptides (AMP) are emerging as potential alternatives. However, salinity, an intrinsic condition of the human body, may impair AMP action. Moreover, the hypoxic conditions characteristic of BAI can modulate the establishment and control of the infection. Thus, the main goals of this work were to understand how different oxygen and salt concentrations can affect single and polymicrobial biofilm establishment and the efficiency of the AMP colistin in a prophylactic approach. The microbial composition of the mixed biofilms and the potential development of resistance phenomena were also assessed. The experimental work was conducted using Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa as models of infection, testing different NaCl and oxygen conditions. Colistin minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations against single and polymicrobial planktonic cultures were determined. Biofilm formation and susceptibility to colistin was also evaluated through the determination of biomass production and biofilm-cells viability. Relative distributions of microorganisms within polymicrobial biofilms were assessed and colony morphology was observed. A population analysis profile was conducted in planktonic and biofilm cultures of K. pneumoniae in order to access the occurrence of heteroresistance. Sodium chloride seemed to impair colistin action in P. aeruginosa planktonic cultures. In biofilms, it seemed to promote biomass production namely in P. aeruginosa, however the effect of NaCl on colistin action was highly dependent on the microorganism. Prevalence of P. aeruginosa in polymicrobial biofilms was significantly reduced in the presence of NaCl. In general, oxygen deficiency impaired P. aeruginosa biofilm formation and the antibacterial action of colistin both in planktonic and biofilm lifestyles, which was more notorious in presence of NaCl. K. pneumoniae revealed to possess a sub-population resistant to colistin exclusively associated with biofilms and characterized by small colony morphologies. In conclusion, colistin appeared to be an antimicrobial with a questionable efficacy in the treatment of BAI. It was not possible to establish a relationship between the presence of NaCl and the action of colistin, however NaCl seemed to modulate P. aeruginosa biofilm formation exerting a bactericidal effect or by interfering with its motility. In hypoxic conditions, colistin action is impaired and biofilm formation is significantly lower. K. pneumoniae was found to be a strain heteroresistant to colistin and this phenomenon seemed to be closely linked to biofilm formation. To our knowledge this is the first report linking heteroresistance to biofilm formation and to a morphological distinct sub-population., A colonização bacteriana de dispositivos biomédicos conduz frequentemente à formação de biofilmes na sua superfície originando as infecções associadas aos biomateriais (IAB). A antibioterapia é o tratamento mais comum, no entanto, com o desenvolvimento da resistência aos antibióticos, os péptidos antimicrobianos (PAM) estão a emergir como potenciais alternativas. No entanto, a salinidade, uma condição intrínseca do corpo humano, pode prejudicar a acção dos PAM. Além disso, a hipoxia, característica das IAB, pode modular o estabelecimento e o controlo da infecção. Os principais objectivos deste trabalho foram compreender como diferentes concentrações de oxigénio e sal podem afectar a formação de biofilmes simples e mistos, e a eficiência do PAM colistina, numa abordagem profiláctica. A composição microbiana dos biofilmes mistos e o potencial desenvolvimento de fenómenos de resistência foram também estudados. O trabalho experimental foi realizado utilizando Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, e Pseudomonas aeruginosa como modelos de infecção testando diferentes condições de NaCl e de oxigénio. A concentração mínima inibitória e bactericida da colistina em culturas planctónicas simples e mistas foi determinada. A formação de biofilme e a sua susceptibilidade à colistina foi também avaliada recorrendo à determinação da produção de biomassa e da análise da viabilidade celular do biofilme. As distribuições relativas de microorganismos dentro de biofilmes mistos foram determinadas e a morfologia das colónias foi observada. Uma análise ao perfil populacional (APP) foi realizada em culturas planctónicas e de biofilme de K. pneumoniae de modo a detectar a ocorrência de heterorresistencia. O NaCl pareceu prejudicar a acção da colistina nas culturas planctónicas de P. aeruginosa. Em biofilmes, pareceu promover a acumulação de biomassa nomeadamente em P. aeruginosa, no entanto o efeito do NaCl sobre a acção da colistina foi altamente dependente do microrganismo. A prevalência de P. aeruginosa em biofilmes mistos foi significativamente reduzida em presença de NaCl. No geral, a deficiência de oxigénio inibiu a formação de biofilme em P. aeruginosa e a acção antibacteriana da colistina tanto nos ensaios planctónicos como nos de biofilme, o que foi potenciado na presença de NaCl. K. pneumoniae revelou possuir uma sub-população resistente à colistina exclusivamente associada a biofilmes e caracterizada por morfologias de colónia pequena. Em conclusão, a colistina parece ser um agente antimicrobiano com uma eficácia discutível no tratamento de IAB. Não foi possível estabelecer uma relação entre a presença de NaCl e a acção da colistina, no entanto, o NaCl parece modular a formação de biofilmes em P. aeruginosa, exercendo um efeito bactericida ou por interferir com a sua motilidade. Em condições de hipoxia, a acção da colistina é prejudicada e a formação e biofilme é significativamente menor. K. pneumoniae revelou-se uma estirpe heterorresistente à colistina e este fenómeno parece estar intimamente ligado à formação de biofilme. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a associar a heterorresistencia à formação de biofilme e a uma sub-população morfologicamente distinta.

Dissertação de mestrado em Bioinformática, Um biofilme é uma comunidade de microrganismos envoltos por uma matriz extracelular produzida pelos próprios, que lhes garante proteção. Os biofilmes representam um problema para a saúde pública pois facilmente encontram-se em dispositivos médicos, podendo causar problemas graves para os pacientes. Estudos prévios indicam algumas alterações observáveis do aspeto físico e bioquímico das comunidades microbianas na resposta à resistência e à virulência. Assim a morfologia da comunidade pode ser um indicativo da reação regulatória associada com fenómenos de patogenicidade microbiana. O objetivo deste trabalho é por um lado a criação de um novo sistema de classificação de morfologia de colonia com medidas extraídas de softwares de imagem por outro lado, o estudo da classificação morfológica existente e do novo sistema de classificação, através de técnicas de mineração de dados com o objetivo de ajudar nestas classificações. Apresentamos vários softwares como solução que vão desde a caraterização da estrutura dos biofilmes até a caraterização de morfologia de colonia, Biofilms are communities of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix, adherent to an inanimate, biotic surface that provides them with protection. Biofilms are a healthcare problem since they can be found in several medical devices and end up causing problems for the patients. Previous studies have reported observable physical and biochemical changes of microbial communities associated with resistance and virulence response. This suggests that the morphology of a biofilm is a marker for regulatory interplays associated with the microbial phenomenon of pathogenicity. The aims of this work are on the one hand, create a novel system of colony morphological classification with measurements extract from image software on the other hand study the current manual morphological classification and the novel one through data mining techniques. Here we present several software solutions to facilitate the process, from the determination of biofilm structure to the characterisation of colony morphology.

Dissertação de mestrado em Engenharia de Informática, Os corpora textuais são um recurso importante no processamento de linguagem natural e em áreas relacionadas, tais como a mineração de textos biomédicos, a linguística de corpus, aprendizagem máquina e recuperação de informação. A preparação de documentos para inclusão num corpus envolve vários passos distintos e uma rede complexa de dependências e condições, que resulta num fluxo difícil de gerir manualmente. Esta dissertação foca-se nos diversos desafios encontrados no processo de construção de corpora, e propõe métodos para ultrapassar essas questões. O primeiro problema abordado foi a limpeza de documentos de texto –remoção de resíduos estruturais, normalização de formatos e notações e deteção de delimitadores de secção– tornando os documentos passíveis de serem processados. Outra questão abordada foi a deteção de documentos duplicados e de pares de documentos candidatos a alinhamento, tendo sido introduzido e implementado um método para medição da similaridade entre documentos. Posteriormente, introduziu-se o conceito de sincronização de documentos, seguido da descrição de uma implementação baseada nos delimitadores de secção. Dois casos de estudo reais foram utilizados para guiar a implementação das ferramentas desenvolvidas: alinhamento multi-língua de documentos para inclusão em corpora paralelos alinhados e a construção de corpora de textos biomédicos para mineração de texto. Um protótipo de um sistema de gestão da construção de corpora foi desenvolvido – um sistema de corpora-flow. Este sistema incorpora mecanismos que facilitam a implementação do fluxo necessário para a construção de um corpus. Uma avaliação comparativa do conjunto de ferramentas desenvolvido foi realizada através do alinhamento de documentos com e sem a intervenção das ferramentas desenvolvidas. Um pequeno conjunto de ferramentas foi desenvolvido para avaliar os resultados de alinhamentos., Text corpora are important resources on natural language processing and related areas such as biomedical text mining, corpus linguistics, machine learning and information extraction. Preparing documents to be included in a corpus involves several different steps and a complex network of dependencies and conditions, which results in a workflow difficult to manage manually. This dissertation focuses on different challenges which can be found when building corpora, and proposed methods to overcome such questions. cleaning of text documents – removing structural residues, normalizing encodings and notations and finding section delimiters – to make the documents suitable for further processing. Another question addressed was the detection of duplicated documents and candidate document pairs for alignment. A method for measuring the similarity between documents was introduced and implemented. Then, the concept of document synchronization was introduced, followed by the description of an implementation based on section delimiters. Two real-world scenarios were used to guide the implementation of the tools developed: multi-language document alignment for inclusion in parallel aligned corpora and building corpora of biomedical texts for text mining. A prototype of a corpora building management system was developed – a corpora-flow system. This system includes mechanisms which facilitate the implementation of the workflow needed to build a corpus. A comparative evaluation of the set of tools developed was performed by aligning documents with and without using the tools developed. A small set of auxiliary tools was created to evaluate the results of alignments.

Dissertação de mestrado em Bioinformática, Transcription factors (TFs) are proteins that mediate the cellular response to the changes of the surrounding environment. Studying their functional domains and protein structure is fundamental in order to gain insight of the way they are triggered and how they shape genetic transcription. The current work aimed for classifying both TFs and functional domains, understanding which features can be related to the different functions of the TFs. By using UniProtJAPI, a JAVA library that allows remote access to UniProt, the information of 200 Escherichia coli’s (E. coli) TFs has been retrieved. This data was manually curated, in order to remove domain duplicates and other excess information, and to add missing domains. The obtained functional domains were classified according to their molecular function, while the TFs were classified according to their regulatory function. TFs that exclusively induce gene expression were classified as activators, while TFs that only perform gene repression were classified as repressors. On the other hand, TFs that perform both the activation and repression of transcription were classified as duals. The information was then analysed altogether in order to understand what relationships between the TFs’ function and functional domains could exist. Several analysis were performed, which include statistical tests and clustering methods. Along with the analysis of the full list of TFs, TFs that are part of two-component signal transduction systems and global TFs were given special focus, due to their important role in cellular function. The results showed that there is a relationship between the functional domains and the regulatory function of the different TFs. This may be related to the evolutionary relationships between repressors and activators. It is also understandable that dual regulators are closely related to activators and repressors than what activators and repressors are to each other. Moreover, TFs of two-component signal transduction systems are similar to each other, given that they perform similar functions. Their domain architectures are also predictable and do not vary from what was expected of these TFs. However, in global TFs the results are opposite of the ones obtained for two-component system TFs: their structures are very different from each other and each TF is specific. The amount of different domains is high when comparing to the full sample of TFs, since the number of domains exceeds the number of TFs. Domains of all classification types are present in their structure and the domain architectures are varied, which reflects their different activities within the cell., Os factores de transcrição (TFs) são proteínas que mediam resposta celular perante alterações do meio em que se inserem. Estudar os seus domínios funcionais e estrutura proteica é fundamental para compreender a forma como as suas funções são desencadeadas e como moldam a regulação da transcrição. Este trabalho teve como objectivos a classificação dos TFs de acordo com a sua função, assim como a classificação dos domínios funcionais. Através do uso da UniProtJAPI, uma biblioteca de JAVA que permite o acesso remoto à UniProt, foi recolhida informação de 200 TFs da Escherichia coli (E. coli). Estes dados foram curados manualmente, com o objectivo de remover domínios duplicados e outra informação em excesso, assim como de adicionar domínios em falta. Os domínios funcionais obtidos foram classificados de acordo com a sua função molecular, enquanto que os TFs foram classificados de acordo com a sua função regulatória. TFs que exclusivamente induzem a expressão genética foram classificados como activadores, enquanto que TFs que apenas reprimem a expressão genética foram classificados como repressores. Por usa vez, TFs que tanto induzem como reprimem a expressão genética foram classificados como duais. A informação dos domínios e dos TFs foi considerada como um todo de forma a compreender quais as possíveis relações entre a função regulatória dos TFs e os domínios funcionais. Várias análises foram efectuadas, das quais testes estatísticos e métodos de clustering. Para além da análise de todos os TFs, foi também feita uma análise de TFs que fazem parte de two-component transduction systems e TFs globais, devido à sua importância na actividade celular. Os resultados demonstram que existe uma relação entre os domínios funcionais e a função regulatória dos TFs. Esta pode ter a ver com as relações evolucionárias dos activadores e repressores. É, também, perceptível que os reguladores duais relacionam-se com mais proximidade dos activadores e dos repressores do que os activadores e os repressores se relacionam entre si. Para além disso, TFs de two-component transduction systems têm estruturas semelhantes , uma vez que desempenham funções idênticas. As duas arquitecturas de domínios também são previsíveis e não variam do que era esperado. Contudo, para os TFs globais, os resultados são antagónicos: as suas estruturas são diferentes umas das outras e cada TF é específico. A quantidade de domínios diferentes é elevada em comparação com a amostra completa de TFs, uma vez que o número de domínios excede o número de TFs. Domínios de todas as classificações estão presentes na estrutura dos TFs globais e as arquitecturas de domínios são variadas, o que reflecte as suas actividades específicas na célula.

Dissertação de mestrado integrado em Biomedical Engineering, Numerous studies have described that bacteria display higher resistance to antimicrobials when growing in biofilm mode of growth, however the phenotypic and virulence factors changes associated with this increased resistance are still poorly understood. The goal of this study was to enlarge the knowledge about the augmented biofilmrelated resistance of Pseudomonas aeruginosa characterizing phenotypically P. aeruginosa biofilms formed by different strains in order to find whether these bacterial biofilms display a common profile. This bacterium is a common opportunistic pathogen that is often related with persistent infections that cause high rates of patient morbidity and mortality due to its intrinsic resistance to several antimicrobials and great adaptive resistance to environmental stimuli. The experimental analysis consisted of a phenotypical examination comprising biofilm formation ability, susceptibility to antibiotics (ciprofloxacin and colistin), expression of several virulence factors (motility, toxin production, and slime production), and phenotypic switching. To best replicate real-world circumstances this work comprised the study of several P. aeruginosa strains: four reference strains (PAO1, ATCC 10145, CECT 111, and PA14) and three clinical isolates (PAI1, PAI2, and PAI3). Biofilms are often related with augmented resistance to antimicrobial agents and are usually associated with chronic infections, which are difficult to eradicate. Therefore, in this study, antibiotic susceptibility was tested and related with P. aeruginosa strains biofilm-forming ability. Results showed that an improved biofilm-forming ability does not seem to be related with biofilm resistance since the seven P. aeruginosa strains showed identical resistance and susceptibility profiles against ciprofloxacin and colistin, respectively, with the exception of PAI3 which exhibited higher resistance to ciprofloxacin. P. aeruginosa motility has been pointed out as a relevant factor for adhesion and biofilm development and also increased virulence. Thus, the swimming, swarming and twitching abilities of P. aeruginosa were evaluated. P. aeruginosa strains presented specific ability to move along surfaces. However, it was not found a clear relationship between higher motility and biofilm-forming ability and increased resistance. Similarly, slime production also contributes to biofilm development and is often implied in increased biofilm-resistance. Considering the results obtained, it was not found a evident relationship between slime production and both biofilm-forming ability and increased resistance. The ability to produce and release extracellular toxins by P. aeruginosa is frequently related with higher levels of bacterial pathogenicity which can lead to severe consequences and even death. Among the several extracellular toxins, hemolysin and pyocyanin production were assessed in this study. Each P. aeruginosa strain displayed a different expression of these virulence factors. It was not possible to conclude if any P. aeruginosa strain was more virulent than other based only on these results. Phenotypic switching is an usual adaptive mechanism used by P. aeruginosa to increase their diversity and overcome exposure to stress conditions and environmental changes. Because colony morphology variation is the most visible characteristic of phenotypic switching, both planktonic and biofilm colonies were observed in order to establish where there is a relationship between bacterial mode of growth and colony morphology and also biofilm resistance. It was observed that phenotypic switching occurred when the P. aeruginosa strains changed their way of growth to biofilm-form. The rising of small-colony morphotypes was recorded for some P. aeruginosa strains (PAO1, ATCC 10145, PA14, PAI1, and PAI3) when growing in biofilm-form, a morphotype usually associated with biofilm resistance. However it was not found a clear relationship with the rising of these small-colony variants and biofilm resistance and further studies are needed to better understand and establish the relationship of biofilm resistance and these morphotype variants. This work contributed to a further understanding of P. aeruginosa biofilm characteristics, including resistance features, virulence factors expression and phenotypic variation. It was concluded that there is not a general P. aeruginosa biofilm profile. Although resistance and susceptibility profiles against ciprofloxacin and colistin, respectively, of all strains were very similar, all virulence factors evaluated showed to be variable characteristic among all strains tested. In addiction it was not verified direct correlations between all virulence factors studied. Because there was recorded a variability in the virulence factors studied among all strains, no strain was considered more virulent than other given strain. Furthermore, results also show that there is an urgent necessity to reexamine the current clinical guidelines. These guidelines should regard phenotypic switching, intrinsic responses of biofilms and virulence factors presented by P. aeruginosa biofilms, characteristics with therapeutical impact., Ao longo dos últimos anos, vários estudos têm descrito que as bactérias demonstram uma maior resistência quando crescem em biofilmes. No entanto, as mudanças fenotípicas e os factores de virulência que apresentam e que se encontram associados com o aumento desta resistência são ainda pobremente compreendidos. O objectivo do presente estudo foi alargar o conhecimento acerca do aumento da resistência associada aos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e caracterizando fenotipicamente biofilmes formados por diferentes estirpes com o intuito de compreender se estes apresentavam um perfil de biofilme idêntico. P. aeruginosa é um agente patogénico oportunista muito comum que frequentemente se encontra associado a infecções persistentes que causam elevadas taxas de morbidade e mortalidade nos pacientes infectados devido à sua resistência intrínseca e à sua elevada resistência adaptativa a estímulos ambientais. A análise experimental consistiu na caracterização fenotípica de biofilmes, nomeadamente, a capacidade de formação de biofilme, susceptibilidade a antibióticos (ciprofloxacina e colistina), a expressão de vários factores de virulência e variação fenotípica. Para melhor replicar as condições reais este trabalho incluiu o estudo de várias estirpes de P. aeruginosa: quatro estirpes de referência (PAO1, ATCC 10145, CECT 111 e PA14) e três isolados clínicos (PAI1, PAI2 e PAI3). Os biofilmes encontram-se frequentemente associados com resistência aumentada a antimicrobianos e estão tipicamente relacionadas a infecções crónicas, muito difíceis de erradicar. Assim, neste trabalho, a susceptibilidade a dois antibióticos de uso clínico (ciprofloxacina e colistina) foi testada e relacionada com a habilidade de formação de biofilme das estirpes de P. aeruginosa de maneira a melhor compreender a resistência associada a biofilmes. No entanto, os resultados observados demonstraram que uma melhor habilidade de formação de biofilme não confere uma maior resistência a antibióticos, pois todas as estirpes de P. aeruginosa estudadas apresentaram perfis de susceptibilidade idênticos relativamente a ambos os antibióticos testados, com a excepção da estirpe PAI3 que revelou maior resistência à ciprofloxacina do que as restantes estirpes. A motilidade da P. aeruginosa tem sido apontada como um factor relevante para adesão, desenvolvimento de biofilme e virulência aumentada desta bactéria. Três tipos de motilidade comummente exibidos pela P. aeruginosa foram avaliados neste trabalho. Todas as estirpes de P. aeruginosa estudadas apresentaram habilidades específicas de se mover ao longo de superfícies. No entanto, não foi estabelecida uma relação clara entre uma maior motilidade e habilidade de formação de biofilme e resistência aumentada. A produção de matriz (“slime”) está também envolvida no desenvolvimento do biofilme e muitas vezes é implicada na resistência aumentada a antimicrobianos. Considerando os resultados obtidos, não foi encontrada evidência que relacione a produção de matriz com formação de biomassa de biofilme e um aumento da resistência. A capacidade de produzir e libertar toxinas extracelulares pela P. aeruginosa é frequentemente relacionada com níveis mais elevados de patogenicidade que podem conduzir a graves consequências e ainda à morte do hospedeiro. Entre estas toxinas extracelulares foram estudadas as produções de hemolisina e piocianina. Cada estirpe de P. aeruginosa estudada demonstrou uma diferente expressão destes factores de virulência. A variação fenotípica é um mecanismo adaptativo muito comum utilizado pela P. aeruginosa para aumentar a sua diversidade e ultrapassar a exposição a condições de stress e mudanças ambientais. Como a variação da morfologia de colónias é a característica da variação fenotípica mais visível, foram observadas colónias formadas por células planctónicas e de biofilme com o objectivo de estabelecer se há uma correlação entre o modo de crescimento bacteriano e variação da morfologia de colónias e, até, resistência associada a biofilmes. Foi observado que, de facto, a variação fenotípica ocorria quando as estirpes de P. aeruginosa cresciam em biofilme. Relativamente à resistência associada a biofilmes, foi registado o aparecimento de pequenas colónias (small-colony variants) em algumas estirpes de P. aeruginosa (PAO1, ATCC 10145, CECT 111, PA14, PAI1 e PAI3), um morfotipo usualmente relacionado com a resistência associada a biofilmes. No entanto, não foi encontrada a relação entre o aparecimento destes morfotipos com a resistência associada a biofilmes e são necessários estudos adicionais para melhor entender e estabelecer a relação entre a resistência associada a biofilmes e estes morfotipos. Este trabalho contribuiu para uma melhor compreensão das características dos biofilmes formados pela P. aeruginosa, incluindo resistência, expressão de factores de virulência e variação fenotípica. Foi concluído que não existe um perfil de biofilme da P. aeruginosa universal. Apesar dos perfis de resistência e susceptibilidade contra a ciprofloxacina e a colistina, respectivamente, terem sido muito idênticos entre todas as estirpes, todos os factores de virulência avaliados demonstraram ser características variáveis entre todas as estirpes estudadas. Para além disso, não foi verificada uma correlação directa entre todos os factores de virulência estudados. Devido à variabilidade encontrada na expressão dos diferentes factores de virulência estudados, nenhuma estirpe foi considerada mais virulenta do que outra. Em adição, os resultados demonstram que há uma necessidade urgente de rever as directrizes clínicas actuais. Estas directrizes devem ter em conta a variação fenotípica, a resposta intrínseca dos biofilmes e os factores de virulência expressos pelos biofilmes de P. aeruginosa, características que têm maior impacto a nível terapêutico., Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - project PTDC/SAUESA/ 646091/2006/FCOMP-01-0124-FEDER-007480FCT., The Strategic Project PEst-OE/EQB/LA0023/2013., Project “BioHealth - Biotechnology and Bioengineering approaches to improve health quality", Ref. NORTE-07-0124-FEDER-000027, cofunded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte)., QREN, FEDER, The project “RECI/BBB-EBI/0179/2012 - Consolidating Research Expertise and Resources on Cellular and Molecular Biotechnology at CEB/IBB”, Ref. FCOMP-01-0124-FEDER-027462, FEDER.

Dissertação de mestrado de Bionformática, O estudo do fenómeno de cross-talking entre P. aeruginosa e C. albicans tem sido focado essencialmente nos processos de quorum sensing e formação de biofilmes, identificando-se os genes e proteínas envolvidas. Contudo, mesmo já existindo um grande conhecimento dos genes e proteínas envolvidas, ainda existe uma lacuna na integração dos mesmos nas redes biológicas dos respectivos microorganismos. O número e qualidade das redes biológicas existentes (Transcriptional Regulatory Network - TRN and Protein-protein Interactions - PPI) para os fenómenos chave tais como, quorum sensing, formação de biofilmes, resistência a antibióticos e patogenecidade, não evidenciam a importância de alguns destes genes no fenómeno de crosstalking. Esta tese apresenta-se como a primeira tentativa de colocar em evidência os genes e proteínas envolvidos em cross-talking, associando-os aos parceiros de interacção nas respectivas redes biológicas de cada microorganismo. Primeiramente, utilizou-se um processo de integração de redes para os dois microrganismos, levando ao aumento do conhecimento geral sobre os processos de patogenecidade dos dois microorganismos, e por fim os genes envolvidos em cross-talking, identificados na literatura, foram evidenciados nestas redes integradas. Com esta tese pretende-se dar algumas pistas sobre como é que estes genes de cross-talking estão envolvidos em importantes processos biológicos e também de algum modo apontar novos potenciais drug targets., The study of the cross-talking phenomenon between P. aeruginosa and C. albicans has been focus on the processes of quorum sensing and biofilm formation, identifying the genes and proteins involved in this relationship. Although, there is a present knowledge on the genes and proteins involved, there is still a lack in the understanding on how these genes are integrated into biological regulatory networks of the respective microorganisms. The number and quality of the existing biological networks (i.e. Transcriptional Regulatory Network - TRN and Protein-protein Interactions - PPI) for key phenomena, such as quorum sensing, biofilm formation, antibiotic resistance and pathogenesis does not highlights the importance of some genes and proteins in the cross-talking phenomenon. In this thesis, constitutes the first attempt to put in evidence the genes involved in cross-talking, associating them to the interacting partners within the biological networks of the two microorganisms. First, the two microorganisms passed through a process of network integration, leading to an augmentation in the general knowledge on pathogenic processes, and then over those networks the cross-talking genes identified in literature were highlighted. With this thesis we expect to give some new perspectives on how these cross-talking genes are interconnected to important biological processes of the two microorganisms and to point some new potential drug targets.

Dissertação de mestrado em Bioengenharia, Novel antimicrobial products, such as antimicrobial peptides (AMPs), are being investigated to combat clinically relevant biofilms and their growing antimicrobial resistance. These relevant studies, however, lack protocol standardization. Acknowledging the importance of standardized methodologies to ensure the quality of experimental results, this dissertation initiates the establishment of a standardized operational procedure (SOP) for the growth of P. aeruginosa biofilms. The proposed SOP was evaluated statistically, firstly in terms of repeatability and ruggedness. The method showed a repeatability greatly influenced by between experimental variance. The variability of the live organism at study or other uncontrollable or yet unknown variable could be the cause. The ruggedness of the protocol showed that slight variations to some of the SOP conditions cause differences in the results, meaning that these variables are important in the biofilm growth and must be tightly controlled. Furthermore, this thesis evaluated the P. aeruginosa biofilms’ response to prophylactic and therapeutic control approaches using the AMPs colistin, tachyplesin III and lactoferricin B, alone or combined. The analysis conjugates information from biomass, respiratory activity and cell viability measurements. Results show that the prophylactic approach revealed that combinations of colistin and tachyplesin III with lactoferricin B are capable of inhibiting biofilm formation at low concentrations. In the preliminary therapeutic tests, although the results were not as good, the colistin and lactoferricin B combination was able to eradicate most of the biofilm for the strain P. aeruginosa ATCC 10145., Novos compostos antimicrobianos, tais como os péptidos antimicrobianos (AMPs), estão a ser investigados para combater biofilmes de relevância clínica e a sua crescente resistência a antimicrobianos tradicionais; no entanto, estes estudos carecem de protocolos padronizados. Reconhecendo a sua importância para garantir a qualidade dos resultados experimentais, esta dissertação inicia o estabelecimento de um procedimento operacional padronizado (SOP) para o crescimento de biofilmes de P. aeruginosa. O SOP proposto foi avaliado estatisticamente em termos de repetibilidade e robustez. O método mostrou uma repetibilidade muito influenciada pela variância entre experiências. A variabilidade do organismo vivo estudado ou outra variável incontrolável ou desconhecida pode ser a causa. Por sua vez, a robustez do protocolo mostrou que pequenas variações em algumas condições do SOP causam diferentes resultados, o que significa que estas variáveis são importantes no crescimento do biofilme e devem ser bem controladas. Esta dissertação também avaliou a resposta dos biofilmes de P. aeruginosa a abordagens profiláticas e terapêuticas usando os AMPs colistina, taquiplesina III e lactoferricina B, isolada ou combinadamente. A análise conjugou informação da biomassa, da atividade respiratória e da viabilidade celular. Os resultados mostram que na abordagem profilática, as combinações de colistina e taquiplesina III com lactoferricina B são capazes de inibir a formação de biofilme em concentrações baixas. Nos ensaios preliminares terapêuticos, ainda que os resultados não sejam tão bons, a combinação de colistina e lactoferricina B foi capaz de erradicar a maior parte do biofilme para a estirpe P. aeruginosa ATCC 10145., Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - The financial support from IBB-CEB and FCT and European Community fund FEDER, through Program COMPETE (FCT PTDC/SAUSAP/113196/2009/ FCOMP-01-0124-FEDER-016012) is also gratefully acknowledged.