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Orientador: Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari Coorientadora: Dra. Carla Andreia Lorscheider Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/04/2019 Inclui referências: p. 97-115 Área de concentração: Genética Resumo: Anostomidae é uma família de peixes neotropicais rica em número de espécies e presente na grande maioria das bacias hidrográficas sul-americanas. Citogeneticamente é proposto que seus representantes têm 2n conservado de 54 cromossomos meta e submetacêntricos. Apesar da sua estabilidade cariotípica, os anostomídeos possuem diferentes padrões quanto à distribuição de heterocromatina e de sequências repetitivas de DNA. Além disso, nas espécies do gênero Megaleporinus, são encontrados cromossomos sexuais diferenciados do tipo ZZ/ZW. Estudos realizados com enfoque nos DNAs repetitivos são restritos a algumas espécies desta família; e também são relacionados com o processo de evolução dos cromossomos sexuais em diversos grupos de peixes. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi analisar o papel dos DNAs repetitivos no processo de diversificação cariotípica dos anostomídeos, além de avaliar a participação destes DNAs na origem e diferenciação dos cromossomos sexuais de Megaleporinus. Neste estudo foram analisados populações/espécies de Leporellus vittatus, Leporinus friderici, Megaleporinus obtusidens e Megaleporinus reinhardti por meio de citogenética clássica (coloração convencional com Giemsa e Bandamento C), e aplicação de hibridização in situ fluorescente (FISH), para mapear cromossomicamente as famílias multigênicas dos DNA ribossômico (rDNA)18S e 5S e pequenos RNAs nucleares (snRNA) U1 e U2, expansões de repetições in tandem ((TTAGGG)n, (GATA)n, (GA)15, (CA)15, (A)30) e os elementos transponíveis (Rex1, Rex3 e Gypsy). Todas as populações e espécies avaliadas demonstraram o conservadorismo do 2n, com fórmula cariotípica de (32m + 22sm) para L. friderici, (28m + 26sm) em L. vittatus e (? 28m + 26sm) (? 28m+25+1st) para Megaleporinus obtusidens e M. reinhardti, nestas duas últimas espécies foi verificada a presença de sistema ZW, onde o W é subtelocêntrico destacadamente maior que o Z e quase totalmente heterocromático, e o Z um submetacêntrico de tamanho médio. Foram observadas variações no número e na localização dos sítios de rDNA e acúmulos diferenciais do retrotransposon Rex1 nas regiões terminais dos cromossomos das quatro espécies estudadas. Sequências teloméricas intersticiais (ITS) não foram evidenciadas nos cromossomos autossomos, somente no cromossomo W de Megaleporinus. Diferenças intra e interespecíficas com relação a localização cromossômica e a acumulação de snRNAs U1 e U2, TEs Rex1, Rex3 e Gypsy e as expansões in tandem foram evidenciados para os cromossomos autossomos e sexuais Z e W de M. obtusidens e M. reinhardti. O conjunto de dados obtidos neste estudo confirma a conservação da macroestrutura cariotípica e indicam uma divergência cromossômica a nível intra/interespecíficos dentre os anostomídeos estudados, principalmente quanto as diferenças cariotípicas microestruturais proporcionadas pelo reposicionamento dos rDNAs e pelos acúmulos diferencias dos demais elementos repetitivos analisados. Os resultados mostraram que diferentes classes de DNAs repetitivos (repetições in tandem e TEs) participaram da origem e diferenciação dos cromossomos W em M. obtusidens e M. reinhardti. No entanto, o acúmulo diferencial destes DNAs nas regiões heterocromáticas do cromossomo W sugerem que embora os cromossomos sexuais Z e W de Megaleporinus compartilhem uma origem comum, as etapas posteriores de diferenciação dos cromossomos sexuais seguiram caminhos evolutivos distintos em cada linhagem. Palavras-chave: Cromossomos sexuais. Elementos transponíveis. Evolução cariotípica. Repetições in tandem. Citogenética. Abstract: Anostomidae is a family of Neotropical fishes rich in species numbers and occurs in most of the South American watersheds. Cytogenetically it is proposed that its representatives have preserved 2n of 54 meta and submetacentric chromosomes. Despite their karyotypic stability, anostomids have different levels of relationship between heterochromatin and repetitive DNA sequences. In addition, in species of the genus Megaleporinus, differentiated sex chromosomes of the type ZZ / ZW are found. Studies conducted with a focus on repetitive DNAs are restricted to some species of this family; and are also related to the process of evolution of sex chromosomes in various groups of fish. Thus, the objective of the present study was to analyze the role of repetitive DNAs in the process of karyotypic diversification of the anostomids, besides evaluating the participation of these DNAs in the origin and differentiation of the sex chromosomes of Megaleporinus. In this study populations/species of Leporellus vittatus, Leporinus friderici, Megaleporinus obtusidens and Megaleporinus reinhardti were analyzed by means of classical cytogenetics conventional staining with Giemsa and C Banding) and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) to map chromosomally the multigenic families of ribosomal DNA (rDNA)18S e 5S and small nuclear RNAs (snRNA) U1 e U2, repetition expansions in tandem ((TTAGGG)n, (GATA)n, (GA)15, (CA)15, (A)30) and the transposable elements (Rex1, Rex3 e Gypsy). All populations and species evaluated showed 2n conservatism, with a karyotype of (32m + 22sm) for L. friderici, (28m + 26sm), in L. vittatus and (? 28m + 26sm) (? 28m+25+1st) for Megaleporinus obtusidens and M. reinhardti, in these last two species has been verified the presence of ZW system, where W is subthelocentric that is markedly greater than Z and almost completely heterochromatic, and Z a medium-sized submetacentric. Variations were observed in the number and location of rDNA sites and differential accumulations of the retrotransposon Rex1 in the terminal regions of the chromosomes of the four species studied. Interstitial telomeric sequences (ITS) were not detected in the autosomal chromosomes, only on the W chromosome of Megaleporinus. Intra and interspecific differences with respect to chromosome location and the accumulation of snRNAs U1 e U2, TEs Rex1, Rex3 and Gypsy and in tandem expansions were evidenced for the autosomal and sexual chromosomes Z and W of M. obtusidens and M. reinhardti. The data obtained in this study confirm the conservation of the karyotype macrostructure and indicate an intra / interspecific chromosome divergence among the studied anostomids, mainly due to the karyotypic microstructural differences provided by the repositioning of rDNAs and by the accumulation of differences in the other repetitive elements analyzed. The results showed that different classes of repetitive DNAs (in tandem and TEs) participated in the origin and differentiation of W chromosomes in M. obtusidens and M. reinhardti. However, the differential accumulation of these DNAs in the heterochromatic regions of the W chromosome suggests that although the sex chromosomes Z and W of Megaleporinus share a common origin, the later stages of differentiation of the sex chromosomes followed different evolutionary paths in each lineage. Keywords: Sex chromosomes. Transposable elements. Karyotype evolution. Repetitions in tandem. Cytogenetics.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2017-10-27T12:45:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Geize.pdf: 2675219 bytes, checksum: 90ad2edda2ef72b5d73979929c6cca53 (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-27T12:45:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Geize.pdf: 2675219 bytes, checksum: 90ad2edda2ef72b5d73979929c6cca53 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Loricariidae é uma das maiores famílias de peixes de água doce com 931 espécies válidas distribuídas em 100 gêneros. As espécies pertencentes a essa família são popularmente conhecidas como cascudos que possuem um corpo achatado, coberto por placas ósseas, e boca ventral em forma de ventosa. Pertencente à família Loricariidae e a subfamília Neoplecostominae, o gênero Neoplecostomus compreende espécies de tamanho pequeno que habitam riachos da região sul e sudeste do Brasil. O gênero apresenta interesse em estudos genéticos, visto que é composto por espécies vágeis e que, por raramente migrarem, podem acumular diferenças genéticas entre populações. Das dezesseis espécies válidas descritas até o momento para este gênero, oito foram descritas para a bacia do rio Paraná e há evidências da ocorrência de novas espécies para esta bacia. Sendo assim, este estudo teve como objetivo estudar a diferenciação cariotípica e a diversificação genética no gênero Neoplecostomus das bacias hidrográficas dos rios Iguaçu, Itararé, Cinzas e Tibagi com vistas ao entendimento da evolução cariotípica e descrição da biodiversidade. Para isso, foram realizas coletas em quatro localidades: rio Pinhão (Neoplecostomus sp. 1), rio Samambaias (Neoplecostomus cf. botucatu), rio das Pedras (Neoplecostomus sp. 2) e rio São João (Neoplecostomus yapo). Os dados citogenéticos revelaram um número diploide de 54 cromossomos para as quatro populações, poucas regiões heterocromáticas e sítios cromossomo independentes para os genes ribossomais 5 e 18S. Os resultados citogenéticos evidenciam uma alta estabilidade cariotípica, observado também na subfamília Neoplecostominae. Foram realizadas análises moleculares envolvendo o gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade 1 (COI) e todas as distâncias genéticas foram superiores a 4,7 %. Além disso, contrários à estabilidade cromossômica, os dados de distância genética evidenciaram ausência de fluxo gênico e estruturação populacional, além de sugerir uma provável espécie de Neoplecostomus não descrita para o rio Pinhão, bacia do rio Iguaçu. The Loricariidae family is one of the largest families of freshwater fishes, with 931 species distributed in 100 genera. Loricariidae members are popularly known as armored catfishes and characterized by a depressed body, covered by bony plates and a ventral sucker mouth. Inside the subfamily Neoplecostominae, the genus Neoplecostomus comprises small species that inhabit streams of south and southeast regions of Brazil. This genus is interested in genetic studies because they rarely migrate and can accumulate genetic differences between populations. Of the sixteen valid species described so far for this genus, eight were described for the Paraná river basin and there is evidence of new species occurring in this basin. Therefore, the objective of this study was to analyze the karyotype differentiation and genetic diversification in the genus Neoplecostomus from Iguaçu, Itararé, Cinzas and Tibagi river basins, with the goal of understand the karyotype evolution and biodiversity. The specimens were captured at four localities: Pinhão river (Neoplecostomus sp. 1), Samambaias river (Neoplecostomus cf. botucatu), Pedras river (Neoplecostomus sp. 2) and São João river (Neoplecostomus yapo). Cytogenetic data revealed a diploid number of 54 chromosomes to the four populations, few heterochromatic regions and independent chromosome sites for 5S and 18S ribosomal genes. The cytogenetic results revealed a high karyotypic stability, which is also observed for the subfamily Neoplecostominae. Also, were performed molecular analyzes by mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 gene (COI) amplification, where all genetic distances were higher than 4.7%. In addition, contrary to chromosome stability, genetic distance data also showed absence of gene flow, population structure and suggested a probable Neoplecostomus species not described yet for Pinhão river at Iguaçu basin.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ieda Schleger.pdf: 2652464 bytes, checksum: d6b5e5be7baa4e50ef5c5874a9a4189d (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The family Characidae (Characiformes) is the most diverse in number of species among Neotropical fish. Many genera of this family, for no to present evidence of monophyly, are considered Incertae Sedis, such as Astyanax. This genus of fish groups popularly known as lambari, comprises 155 valid species. Astyanax serratus is considered endemic of the Iguaçu River, where is largely distributed. Astyanax laticeps occurs in coastal basins of the coastal region of Uruguay, south and southeast Brazil. These species are morphologically similar and are included in the complex A. scabripinnis. The purpose of this study was to determine A. serratus and A. laticeps are the same species in synonymy, or form distinct evolutionary units, but cryptic. Therefore, was used morphometric analysis, including measurements of body proportions relative to length of the body and of the head, counting number of teeth, cusps and fins. Cytogenetic analysis consisted in chromosome preparations conventional Giemsa staining, localization of constitutive heterochromatin by C-banding method, detection of nucleolar organizer regions (NORs) by impregnation with silver nitrate (Ag-NORs) and fluorescent in situ hybridization using DNA probes ribosomal (rDNA) 5S and 18S. The sequences used as DNA barcode, were obtained by partial amplification of cytochrome c oxidase I (COI) gene and the genetic distance calculated by the method of Kimura 2-parameters (K2P). The results of morphometric analysis revealed pre-jaw with two series of teeth, presence of hooks on anal and pelvic fins of males, elongated body with a humeral spot with narrow anteroventral extension in both species. Cytogenetic showed the same diploid number of 50 chromosomes, including the first pair of large metacentric chromosomes in relation to the others complements, the same karyotype formula (4m + 24sm + 6st + 16a) and even fundamental number (84). The markings of 5S rDNA coincide in the centromeric region of chromosome 19 pair and were evidenced multiple sites of 18S rDNA, located in the telomeric regions of the chromosomes in both species analyzed. The Ag-NORs showed to be coincident with 18S sites in most cases. The distribution of constitutive heterochromatin blocks occurred preferentially in the centromeric and terminals regions of chromosomes, coincident with the location of ribosomal sites and Ag-NORs in telomeric regions. The analysis of DNA barcode through the COI gene revealed an interspecific genetic divergence to 0.2%, a rate below the threshold considered for the separation of fish species (2%). These different levels of analysis suggest that A. serratus and A. laticeps are synonymous species, increasing the occurrence of A. laticeps for the Iguaçu River basin and enhancing the hypothesis of fauna sharing, caused by tectonic activities of crystalline shield. The interspecifc variations found in the mapping of constitutive heterochromatin, Ag-NORs and 18S rDNA are common in Astyanax and derived of events no robertsonian, while the differences may reflect the vicariant process, with geographic isolation of watersheds and gene flow restriction among the population of the Iguaçu River and coastal populations. A Família Characidae (Characiformes) é a mais diversa em número de espécies entre os peixes neotropicais. Muitos gêneros dessa Família, por não apresentarem evidências de monofiletismo, são considerados como Incertae Sedis, como é o caso de Astyanax. Este gênero agrupa peixes popularmente conhecidos como lambaris, sendo composto por 155 espécies válidas. Astyanax serratus é considerada endêmica do Rio Iguaçu, onde está amplamente distribuída. Astyanax laticeps ocorre nas bacias costeiras da região litorânea do Uruguai, sul e sudeste brasileiro. Estas espécies são morfologicamente semelhantes e estão incluídas no complexo Astyanax scabripinnis. O objetivo do presente estudo foi verificar se A. serratus e A. laticeps constituem uma mesma espécie, em sinonímia, ou formam unidades evolutivas distintas, mas crípticas. Assim, foi empregada análise morfométrica, incluindo medições das proporções corporais em relação ao comprimento do corpo e da cabeça, contagem do número de dentes, cúspides e de raios nas nadadeiras. A análise citogenética consistiu em preparações cromossômicas com coloração convencional por Giemsa, localização de heterocromatina constitutiva pelo método de bandamento C, detecção das regiões organizadoras de nucléolos por impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs) e hibridação in situ fluorescente com sondas de DNA ribossomal (rDNA) 5S e 18S. As sequências utilizadas como DNA barcode foram obtidas através da amplificação parcial do gene citocromo c oxidase I e a distância genética calculada pelo método Kimura 2 Parâmetros (K2P). Os resultados da análise morfométrica revelaram pré-maxilar com duas séries de dentes, presença de ganchos nas nadadeiras anal e pélvicas de machos, corpo alongado, com uma mancha umeral com prolongamento anteroventral estreito em ambas as espécies. A citogenética evidenciou mesmo número diplóide, de 50 cromossomos, incluindo o primeiro par de cromossomos metacêntricos de grande porte em relação aos demais do complemento, mesma fórmula cariotípica (4m + 24sm + 6st + 16a) e mesmo número fundamental (84). As marcações de rDNA 5S coincidiram na região centromérica do par cromossômico 19 e foram evidenciados sítios múltiplos de rDNA 18S, localizados nas regiões teloméricas dos cromossomos em ambas as espécies analisadas. As Ag-RONs mostraram-se coincidentes com os sítios de 18S na maioria dos casos. A distribuição dos blocos de heterocromatina constitutiva ocorreu preferencialmente nas regiões centroméricas e terminais dos cromossomos, coincidentes com a maioria dos sítios ribossomais e das Ag-RONs nas regiões teloméricas. A análise do DNA barcode através do gene COI revelou uma divergência genética interespecífica de 0,2%, índice abaixo do considerado limiar para a separação de espécies de peixes (2%). Estes diferentes níveis de análise sugerem que A. serratus e A. laticeps são espécies sinônimas, ampliando a ocorrência de A. laticeps para a bacia do Rio Iguaçu e reforçando a hipótese de compartilhamento de fauna, provocado pelas atividades tectônicas do escudo cristalino. As variações interespecíficas encontradas no mapeamento de heterocromatina constitutiva, Ag-RONs e rDNA 18S são comuns em Astyanax e derivam de eventos não robertsonianos, mas também podem refletir um processo de vicariância, com o isolamento geográfico das bacias hidrográficas e restrição de fluxo gênico entre a população do rio Iguaçu e populações litorâneas.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thais Dulz.pdf: 2466351 bytes, checksum: 208f40d4e86e959ef9f685c1e5a3cac5 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Characidae is considered the largest family and most complex among the Characiforms. The Astyanax genus is one of the most specious between the characids, comprising 142 valid species distributed in the Neotropical Region. Many of these species are restricted to certain river basins. The fish fauna of the Iguaçu River basin is characterized by having a high endemism, possibly because its isolation of the Paraná River basin, occurred about 22 million years, caused by the emergence of the Iguaçu Falls. Were recently described new species of this genus in the Rio Iguaçu, however its systematic position opposite the other Astyanax is still unknown, reinforcing necessary studies aimed at understanding their diversity and their evolutionary relationships. Therefore, this research aimed was to perform the karyotype characterization of the Astyanax species from the middle Rio Iguaçu: Astyanax altiparanae, A. bifasciatus, A. dissimilis, A. minor, A. ribeirae and A. serratus, using cytogenetics as a tool, in order to contribute to a more consistent scenario about the evolution of this group. The analysis were based on conventional Giemsa staining techniques, detection of nucleolar organizing regions by silver nitrate (Ag-NORs), C-banding and fluorescence in situ hybridization (FISH) to ribosomal genes 18S e 5S probes. All species presented 2n = 50 chromosomes, confirming the conservatism to the genus. The karyotypes comprise all chromosomal types and prevalence of chromosomes with two arms, mainly on the metacentric type except for A. ribeirae with the karyotype formula containing high number of acrocentrics. Despite the diploid number remain constant in these species; there were variations in karyotype formula and consequently the fundamental number, ranging from 66 to 92. The C-banding showed differences in the distribution of heterochromatic blocks between species, occurring polymorphism in A. serratus, which was also observed in other studies involving Astyanax sp. D (A. serratus). The six species showed the presence of NORs located in the telomeric region of the short arm of a chromosome pair of the type subtelocentric, characteristic conserved for the genus. Was identified single NORs in A. altiparanae and A. dissimilis, although the most common being multiple NORs, in almost all cases confirmed by 18S rDNA. All species showed 5S rDNA located in the interstitial segments of the chromosomes. Have been observed simple rDNA 5S in A. altiparanae, A. minor and A. serratus, and multiple in A. bifasciatus, A. dissimilis and A. ribeirae. Highlighted A. ribeirae by presenting a high number of rDNA 18S and 5S sites, which proved to be sintenics and co-located. In addition, this species is considered endemic for Ribeira de Iguape basin; however, was first found in the Iguaçu basin, strengthening fauna sharing hypothesis between rivers of the plateau and coastal regions in southern Brazil. The karyotype diversity evident for all species is mainly due to non-Robertsonian rearrangements. This study presented the first cytogenetic data for the genus Astyanax occurring in the Middle Rio Iguaçu region. A família Characidae é considerada a maior e mais complexa entre os Characiformes. O gênero Astyanax é um dos mais especiosos entre os caracídeos, compreendendo 142 espécies válidas distribuídas na região Neotropical. Muitas destas espécies encontram-se restritas a determinadas bacias hidrográficas. A ictiofauna da bacia do Rio Iguaçu caracteriza-se por apresentar um elevado grau de endemismo, possivelmente devido o seu isolamento da bacia do Rio Paraná, ocorrido há cerca de 22 milhões de anos, causado pelo surgimento das Cataratas do Iguaçu. Recentemente, foram descritas novas espécies deste gênero no Rio Iguaçu, entretanto seu posicionamento sistemático frente aos demais Astyanax ainda é desconhecido, fazendo-se necessários estudos que visem à compreensão de sua diversidade e de suas relações evolutivas. Sendo assim, objetivou-se realizar a caracterização cariotípica de espécies do gênero Astyanax provenientes do médio Rio Iguaçu: Astyanax altiparanae, A. bifasciatus, A. dissimilis, A. minor, A. ribeirae e A. serratus, utilizando como ferramenta a citogenética, a fim de contribuir com um cenário mais consistente acerca da evolução deste grupo. Utilizou-se técnicas baseadas na coloração convencional por Giemsa, detecção de regiões organizadoras de nucléolo por nitrato de prata (Ag-RONs), bandamento C e hibridação in situ fluorescência (FISH) com sondas de genes ribossomais 18S e 5S. Todas as espécies estudadas apresentaram 2n = 50 cromossomos, confirmando o conservadorismo para o gênero. Observaram-se cariótipos compostos por todos os tipos cromossômicos e predominância de cromossomos com dois braços, principalmente do tipo metacêntrico, exceto para A. ribeirae com fórmula cariotípica composta por elevado número de acrocêntricos. Apesar do número diploide se manter constante nestas espécies, houve variações na fórmula cariotípica e, consequentemente no número fundamental, variando de 66 até 92. O bandamento C evidenciou variações na distribuição dos blocos heterocromáticos entre as espécies, com ocorrência de polimorfismo em A. serratus, o que também foi observado em outros estudos envolvendo Astyanax sp. D (A. serratus). As seis espécies estudadas mostraram a presença de RONs localizadas na região telomérica do braço curto de um par cromossômico do tipo subtelocêntrico, característica conservada para o gênero. Ocorreram RONs simples em A. altiparanae e A. dissimilis, as demais espécies possuem RONs múltiplas, em quase todos os casos confirmadas pela FISH com rDNA 18S. Todas as espécies evidenciaram rDNA 5S localizados nos segmentos intersticiais dos cromossomos. Foram observados rDNA 5S em um único par em A. altiparanae, A. minor e A. serratus, e múltiplos em A. bifasciatus, A. dissimilis e A. ribeirae. Destaca-se A. ribeirae por apresentar um elevado número de sítios rDNA 18S e 5S, os quais mostraram-se sintênicos e co-localizados. Além disso, esta espécie é considerada endêmica para bacia do Ribeira de Iguape; no entanto, foi encontrada pela primeira vez na bacia do Iguaçu, reforçando a hipótese de compartilhamento de fauna entre rios do planalto cristalino e regiões costeiras no sul do Brasil. A diversidade cariotípica evidenciada para todas as espécies devem-se principalmente a rearranjos não Robertsoniano. Neste estudo foram apresentados os primeiros dados citogenéticos para o gênero Astyanax ocorrentes na região do médio Rio Iguaçu.