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Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally [1]. Although typically causing mild diseases this virus may be responsible for severe infections, mainly in immunocompromised patients. Currently, there is a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir and related drugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives [2]. According to the World Health Organization plants are the best sources for obtaining a wide variety of drugs [3]. So, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants to the discovery of new natural antiviral compounds. Financial support: CESAM (UID/AMB/50017), Centro de Química e Bioquimica (UID/MULTI/00612/2013) and FCT/MEC through national funds and the co-funding by the FEDER, within the PT2020 Partnership Agreement and Compete 2020. N/A

A área das análises clínicas tem sofrido nos últimos tempos uma importante evolução, quer ao nível da abordagem diagnóstica, quer à introdução e implementação de novas metodologias. O Biólogo profissional do ramo de laboratório deverá ter o dever e a competência necessários ao desempenho das suas tarefas de forma excelente, com base na permanente atualização da formação nas áreas funcionais consideradas fundamentais em análises clínicas e na adequação das suas capacidades à multidisciplinaridade com que os profissionais deste ramo de laboratório se defrontam diariamente, seguros de que o objetivo final do seu trabalho é a obtenção de resultados fiáveis e de qualidade reconhecida pelos pares, tendo em vista o apoio ao diagnóstico clínico e o completo esclarecimento das respetivas patologias. O título de Especialista de análises clínicas ajuda o biólogo profissional de saúde na aquisição e valorização destas competências e encontra-se alinhado com as competências exigidas pela Associação Europeia para a Análises Clínicas. Para o efeito, vão ser dadas as orientações necessárias para o pedido de atribuição do Título de Especialista em análises clínicas – Ramo de Laboratório. N/A

Este estudo tem como objetivo descrever as características demográficas e o quadro clínico e imunitário de doentes com suspeita de infeção viral neurotrópica e analisar a frequência das infeções por CMV nas patologias do SNC, cujo diagnóstico foi confirmado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) entre janeiro de 2010 e abril de 2014.

Oradora por convite O citomegalovírus (CMV) é um vírus ubíquo, sem predomínio sazonal conhecido e com uma prevalência que varia, nos EUA, entre 50% e 85% em adultos (CDC, 2006). A epidemiologia do CMV é diferente nas várias regiões do mundo e nos diferentes grupos etários e socioeconómicos. Geralmente, os grupos socioeconómicos mais elevados apresentam uma seroprevalência mais baixa e adquirem a infeção mais tarde. A caracterização do estado imunitário da população residente em Portugal Continental, no âmbito do 2º Inquérito Serológico Nacional, permitiu conhecer a prevalência do CMV no País e estudar alguns aspetos epidemiológicos, contribuindo para determinar que grupos na população apresentam maior prevalência e que grupos estão mais suscetíveis a casos incidentes (Lopo et al., 2004a). Os resultados indicam que a infeção pelo CMV é muito prevalente na população estudada (77,0%) e ocorre sobretudo nos primeiros anos de vida. No entanto, a partir do grupo etário dos 10 aos 14 anos, verificou-se um aumento da prevalência em indivíduos do sexo feminino, o que poderá corresponder a um maior contacto que os indivíduos do sexo feminino têm com crianças que podem estar a excretar vírus, o que representará um modo de transmissão horizontal do CMV e um risco para as mulheres grávidas e para as trabalhadoras em jardins de infância. O facto de 24,5% e 18,5% de mulheres em idade fértil (dos 20 aos 29 anos e dos 30 aos 44 anos respetivamente) serem suscetíveis para o CMV, leva-nos a admitir um considerável risco para a infeção congénita por este vírus. O CMV é a principal causa de infeção viral congénita, com uma incidência mundial que varia entre 0,4% e 2,2% do total de nascimentos e com um quadro de infeção que pode envolver qualquer órgão e variar entre padrões de doença ligeiros e limitados, até apresentações graves e disseminadas da doença, resultando em mais de 20% de mortalidade perinatal e uma morbilidade com impacto social e económico. A infeção primária materna durante a gestação é responsável por cerca de 40% de transmissão intrauterina, em contraste aos 0,5% estimados em infeções recorrentes durante a gravidez. Segundo estudos efetuados por diferentes grupos de trabalho portugueses, a proporção da infeção congénita pelo CMV numa população da região de Lisboa e numa população da Beira Interior utilizando o método de referência (deteção de vírus na urina pelo método de cultura shell-vials) foi de 0,7% e 0,4%, respetivamente (Lopo et al, 2004b; Almeida et al, 2010); Paixão e col., utilizando a técnica de PCR em amostras de sangue obtidos dos Guthrie Cards, encontraram uma proporção da infeção congénita pelo CMV, de 1,1% em Portugal Continental e Ilhas e de 0,7% na região de Lisboa (Paixão et al, 2009). O rastreio serológico pré-concecional para o CMV, aconselhado desde 2006 na circular normativa nº2/DSMIA, como componente básico dos cuidados pré-concecionais, vem acentuar a importância em conhecer, nas mulheres que pretendem engravidar o seu perfil imunitário para o CMV (Ministério da Saúde, 2006). Para mulheres gestantes, a fonte mais provável de infeção é o contacto com urina ou saliva de crianças. Nos casos em que se deteta a suscetibilidade às infeções causadas por este vírus, o clínico tem a possibilidade de elucidar as mulheres sobre os riscos associados à aquisição de infeção pelo CMV durante a gravidez e sugerir a adoção de medidas preventivas que reduzam a transmissão do vírus, diminuindo a possibilidade de ocorrência de infeção congénita e que passam sobretudo por alterações simples de comportamento. Ainda em fase de ensaios clínicos encontram-se algumas terapêuticas experimentais de imunização passiva e de administração de antivíricos a grávidas infetadas pelo CMV. Com o objetivo de diminuir a mortalidade e as sequelas da infeção pelo CMV, são utilizadas terapêuticas com compostos antivíricos, nomeadamente com o ganciclovir, nas crianças gravemente afetadas. A prevenção mais eficaz da infeção congénita pelo CMV requer a implementação de um esquema de vacinação. No entanto, enquanto se aguarda o desenvolvimento e disponibilização de uma vacina adequada, são necessárias medidas de prevenção e acompanhamento das grávidas. Continua a existir a necessidade em aumentar o conhecimento sobre o impacto em Saúde Pública da infeção congénita pelo CMV e a sua associação com os deficits nestas crianças, uma vez que o seu acompanhamento envolve enormes custos financeiros. Apesar de, tanto quanto é do nosso conhecimento, ainda não ter sido publicado nenhum estudo sobre os custos sociais do CMV em Portugal, a infeção congénita por este vírus já é reconhecida nos EUA e em vários países da Europa, como um condicionante social importante, devido aos elevados custos, quer associados ao tratamento e apoio às crianças com sequelas, quer ao absentismo profissional dos pais e ao acompanhamento das famílias afetadas.

publicado em: ESCV2011-Program Book / European Society of Clinical Virology, p. 73. Disponível em: http://escv.ivdnews.net/public/show_abstract/1126 The incidence of HIV infections in gestational age is an important Public Health issue as are concerns about co-infection with opportunistic viruses, such as CMV/HCV. Several authors refer higher ratios of congenital CMV infection in children born to HIV infected mother than in uninfected. In the case of HCV, perinatal transmission increases in cases of mothers co-infected with HIV. Aims:To study CMV/HCV infection/co-infection in HIV/non-HIV women and their newborns between 2006-2010, according to epidemiological, laboratory and clinical data; to evaluate frequency of CMV/HIV/HCV maternal-fetal transmission and analyse risk factors for infections. Methods:Plasma and/or urine of 137 HIV and 140 non-HIV women, attending a Lisbon Hospital and their 140 newborns were analysed at NIH. HIV-1 and/or HIV-2 proviral DNA nested-PCR was performed on HIV mothers and their newborn’s plasma. Maternal plasma was screened for CMV and HCV antibodies; RNA determination, genotyping and viral load were performed on women with HCV antibodies, their newborn’s plasma was also screened for HCV. Newborn’s urine was inoculated for CMV detection. Data analysis was performed using SPSS 17.0 and Fisher's exact test. Results:HIV1 vertical transmission was diagnosed in 3/140(2.1%) cases. CMV congenital infection was diagnosed in 4(2.9%) newborns from HIV women and no congenital CMV infection was diagnosed in newborns from non-HIV women. 2/137(1.5%) HIV women and 14/140(10.0%) non-HIV women were CMV seronegative. HCV infection was detected in 6(4.4%) HIV women; all had HCV positive viral load; different genotypes were found. One case of HCV perinatal transmission was diagnosed. No HCV antibodies were found in non-HIV women. No children were HIV/HCV or CMV/HCV coinfected but 2 were HIV/CMV coinfected. There is evidence of significant statistical associations with race/ethnicity and time of pregnancy. Conclusion:In this study HIV women had higher CMV/HCV antibody prevalence and frequency of maternal-fetal transmission than non-HIV women. 2/137 HIV seronegative newborns and 2/3 HIV newborns were CMV congenitally infected; this difference should be further studied, as the consequences of CMV/HCV infections may become increasingly serious and complex in the presence of HIV. This specific group is not representative of the Portuguese infected women, nevertheless the significant risk factors found and other risk factors studied without strong associations should be considered in larger studies.

Dissertação de mestrado em Genética molecular e Biomedicina, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa, 2016. Herpes simplex viruses (HSV) are ubiquitous host-adapted pathogens that cause a variety of different disorders. There are two sub-types: HSV-1, which is traditionally associated with oro-facial infections, and HSV-2 that is mostly associated with genital ulcers. This distinction, however, is becoming less evident since HSV-1 frequency in genital infections is increasing due to social, demographic and migratory tendencies, making genital herpes one of the most prevalent sexually transmitted infections worldwide. A better understanding on genital HSV-1 and HSV-2 infections is mandatory to the pathogenesis of human herpes disease. The scope of this thesis was to evaluate the life cycle of various HSV-1 and HSV-2 genital clinical isolates with different viral loads in three distinct host cell lines, giving special focus on both capacity and efficiency of viral infection, in terms of replication rate and progeny. Our results showed that: i) both HSV-1 and HSV-2 isolates exhibited similar infection patterns regardless MOI, with DNA starting to be synthesized nearly at 6-12h post-infection; ii) regardless HSV subtype, initial viral concentrations do not apparently affect adherence to any host cell line nor the generated progeny; iii) Vero E6 cells seemed the most appropriated cell line for HSV-2 infection; iv) HeLa229 cells appeared to be the most suitable for HSV-1 infection for smaller inoculums; and v) Vero cell line had the worst viral growth results for both HSV subtypes. In general, HSV-2 displayed always lower both attachment capacities and growth rates than HSV-1, although higher progenies were seen in Vero E6 cell line. Overall, the findings presented in this MSc thesis will certainly constitute a step forward for the understanding of the pathogenesis of the human herpes genital infections. Herpes simplex viruses (HSV) are ubiquitous host-adapted pathogens that cause a variety of different disorders. There are two sub-types: HSV-1, which is traditionally associated with oro-facial infections, and HSV-2 that is mostly associated with genital ulcers. This distinction, however, is becoming less evident since HSV-1 frequency in genital infections is increasing due to social, demographic and migratory tendencies, making genital herpes one of the most prevalent sexually transmitted infections worldwide. A better understanding on genital HSV-1 and HSV-2 infections is mandatory to the pathogenesis of human herpes disease. The scope of this thesis was to evaluate the life cycle of various HSV-1 and HSV-2 genital clinical isolates with different viral loads in three distinct host cell lines, giving special focus on both capacity and efficiency of viral infection, in terms of replication rate and progeny. Our results showed that: i) both HSV-1 and HSV-2 isolates exhibited similar infection patterns regardless MOI, with DNA starting to be synthesized nearly at 6-12h post-infection; ii) regardless HSV subtype, initial viral concentrations do not apparently affect adherence to any host cell line nor the generated progeny; iii) Vero E6 cells seemed the most appropriated cell line for HSV-2 infection; iv) HeLa229 cells appeared to be the most suitable for HSV-1 infection for smaller inoculums; and v) Vero cell line had the worst viral growth results for both HSV subtypes. In general, HSV-2 displayed always lower both attachment capacities and growth rates than HSV-1, although higher progenies were seen in Vero E6 cell line. Overall, the findings presented in this MSc thesis will certainly constitute a step forward for the understanding of the pathogenesis of the human herpes genital infections. N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2015 This thesis was mostly performed at Centro de Estudos do Ambiente e do Mar da Universidade de Aveiro – Pólo FCUL (CESAM FCUL) under the direct supervision of Professor Maria Filomena Caeiro, and partially performed at Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA) under the supervision of Doctor Sílvia Lopo Esteves. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally. Although causing generally mild infections this virus may cause severe symptoms occasionally, mainly in immunocompromised patients. Presently, there are a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir (ACV) and its prodrugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives. According to the World Health Organization (WHO) plants would be the best sources for obtaining a wide variety of drugs. In fact, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants and the discovery of new natural therapeutic compounds. In this study the anti-herpetic action of an aqueous extract was evaluated. The product was obtained by decoction of stem and leaves from Solidago virgaurea, a perennial herb member of the Asteraceae family. The study of the aqueous extract activity included a preliminary evaluation of its cytotoxicity in Vero cells – by the MTT assay - in the same conditions that are applied for viral production. Extract direct effect on viral particles – virucidal effect – was also assessed, having proved null. Anti-herpetic activity was investigated through two kinds of experiments: treatment of infected cells during virus production that revealed a mean yield reduction of 94 % in treated relatively to non-treated cells and an IC50 of 35.1 μg/mL; and treatment of infected cells during virus titration, which revealed slighter inhibition but significant size differences between virus plaques formed in treated and control conditions (smaller in treatment conditions). To further evaluate the mechanisms that mediate the aqueous extract inhibitory effect, infected cells – treated and non-treated - and virus particles – produced in treated and non-treated cells - were visualized through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing less damage due to infection in treated cells and a reduced amount of viral particles in HSV-2 suspensions produced in treated cells, relatively to controls. A kinetic of the first hours of the infection was performed with and without treatment, to assess possible differences in DNA production. Extracted samples were subjected to qPCR and results showed that the amount of viral DNA raises significantly slower in treated versus non-treated infected cells, throughout the infection. This is consistent with the effective reduction of the extract when added at later infection times - 4-6 h p.i. - when DNA replication is already in an advanced stage. Our results suggest that the aqueous extract inhibits HSV-2 replication, when present at the beginning of the infection, possibly by interfering with the viral DNA synthesis. O vírus Herpes simples tipo 2 (HSV-2) é um vírus de simetria icosaédrica e grandes dimensões, pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae da ordem Herpesvirales. Infecta mais de 500 milhões de pessoas em todo o mundo, surgindo, em cada ano, mais de 20 milhões de casos. A sua prevalência é geralmente mais elevada entre mulheres do que homens e varia substancialmente entre diferentes regiões do globo, alcançando os mínimos na Europa Ocidental - 18 % para mulheres e 13 % para homens – e percentagens máximas na África Subsaariana – 70 % para mulheres e 55 % para homens. O HSV infecta as células da mucosa oral ou genital e tem a capacidade de infetar as dendrites e os gânglios sensoriais que enervam estes tecidos onde estabelece latência. Estas infeções causam normalmente patologias ligeiras – gengivite, herpes labialis ou herpes genitalis – podendo até ser assintomáticas. Porém, infeções com HSV-2 podem causar complicações sérias a nível ocular - sendo a primeira causa de cegueira devida a infeção no mundo Ocidental -, neurológico - causando meningites e encefalites, especialmente comuns em neonatos – e dermatológico. Estas patologias mais severas, associadas à infeção com HSV, ocorrem com maior frequência em pacientes imuno-comprometidas, nomeadamente em indivíduos HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos. Aliás, a infeção com HSV-2 aumenta 3 a 4 vezes a probabilidade de adquirir HIV e a sua disseminação, sendo esta relação recíproca, uma vez que pacientes HIV positivos têm maior probabilidade de adquirir HSV-2 e sofrem mais reativações da infeção. Atualmente, existem vários agentes com atividade antiviral contra HSV, como o Aciclovir (ACV) e as suas pró-drogas, no entanto, tratamentos prolongados com estes compostos podem resultar no desenvolvimento de resistência. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) as plantas são a melhor fonte para a obtenção de novas drogas e, nas últimas décadas, as plantas medicinais têm sido alvo de vários estudos químicos e farmacológicos. Neste estudo foi avaliado o efeito anti-herpético do extrato aquoso de Solidago virgaurea, uma planta perianal, membro da família Asteraceae. O extrato utilizado foi obtido por decocções de caules e folhas de S. virgaurea e a solução stock foi preparada a 100 mg/mL em DMSO. Antes de ser sujeito a testes de actividade anti-herpética foi ensaiado o efeito do extracto aquoso na viabiliade de células hospedeiras não infectadas, através do método do MTT – um ensaio colorimétrico que se baseia na capacidade de reduzir metabolicamente o sal de tetrazolio das células viáveis. Para isso culivaram-se células Vero em placas de 96 poços – em meio de cultura com FBS (Soro Fetal Bovino) a 10 % – até à sub-confluência. O meio de cultura foi depois substituido por meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extracto (25 - 250 μg/mL), ou meio com FBS a 2 % sem adição de extrato no caso dos testemunhos, e as placas foram incubadas 24 ou 48 horas a 37 °C. No final do período de tratamento fez-se o teste do MTT para determinação da viabilidade das culturas tratadas, por comparação com as culturas não tratadas. Os conteúdos de cada poço da P96 foi analisado espectofotometricamente num leitor de placas Elisa. Para caracterizar a actividade citotóxica do extracto foram comparadas as absorvâncias obtidas em poços com células tratadas e relação a células não tratadas e determinaram-se os parametros CMNC (Concentração Máxima Não Citotóxica) - 150 μg/mL - e CC50 (Concentração que inviabiliza 50 % das células) – 177,3 μg/mL. O efeito directo do extracto nas partículas de HSV-2 foi testado através da comparação dos títulos de suspensões virais previamente tratadas com 100 μg/mL de extrato em meio com FBS a 2 % com os títulos de suspensões não tratadas. O extrato não demonstrou efeito virucida sobre partículas virais em suspensão, uma vez que os títulos das suspensões tratadas foram muito semelhantes aos títulos dos testemunhos. Para testar o efeito do extrato na formação de placas virais infetaram-se células, em placas de 24 poços, com diluições seriadas de HSV-2. Depois da entrada do vírus – 30 minutos pós infeção – os inóculos foram removidos e foi adicionado meio de cultura com FBS a 2 % com ou sem 100 μg/mL de extrato, às culturas tratadas e testemunho, respetivamente. No final do período de tratamento – 3 a 4 horas pós infeção (h p.i.) – foi adicionado meio com FBS e Sephadex a 2 %. A redução de título em culturas tratadas foi 71,6 ± 26,8 %, em relação às não tratadas. Foi ainda evidente uma redução no diâmetro das placas produzidas nas culturas tratadas. Foram também levadas a cabo várias experiências envolvendo a produção de vírus em condições de tratamento, em que culturas celulares sub-confluentes foram infetadas com cerca de 3 pfu/célula e tratadas com extrato em diferentes concentrações e durante diferentes períodos da infeção. Os títulos das suspensões produzidas em condições de tratamento foram comparados com os títulos dos testemunhos para o cálculo das percentagens de inibição. A redução média de título – com concentrações de extrato não citotóxicas – foi de 93,65 ± 8 %, relativamente a vírus produzido na ausência do extrato. Para determinar os parâmetros IC50 e IC90 (concentrações que reduzem o rendimento viral em 50 e 90 %, respetivamente) foram produzidas suspensões de HSV-2 em meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extrato (10-175 μg/mL) que foram posteriormente tituladas. Os IC50 e IC90 foram calculados através de regressão linear da curva dose-resposta e foram 35,1 e 128,1 μg/mL, respetivamente. Para investigar a etapa da infeção afetada pelo extrato produziram-se suspensões de HSV-2 sob tratamento - com 100 μg/mL de extrato – iniciado em diferentes horas pós infeção. Foi observável uma redução da percentagem de inibição do extrato para cerca de 50 % em tratamentos começados entre as 3 e as 6 h p.i. e para 0 % a partir das 15 h p.i. Células infetadas tratadas e não tratadas, e partículas virais produzidas em ambas as condições, foram observadas por Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM), revelando a existência de menos danos, devidos à infeção, em células infetadas tratadas do que em não tratadas e uma quantidade significativamente menor de partículas de HSV-2 em suspensões virais produzidas em células tratadas, apesar dos viriões produzidos sob tratamento não apresentarem defeitos morfológicos. Por fim foi executada uma cinética da infeção em condições de tratamento (e uma cinética testemunho, em condições normais de produção viral), para tal, células infetadas – tratadas e não tratadas - foram raspadas para o meio de cultura a diferentes horas pós infeção – 2 a 7. O DNA de cada cultura infetada recolhida foi extraído, quantificado e submetido a PCR para a deteção de DNA viral. O resultado não permitiu visualizar diferenças significativas na quantidade de DNA de HSV-2 em células tratadas e não tratadas, mas mostrou um aumento considerável na quantidade de DNA a partir das 5 horas pós infeção. As mesmas amostras foram depois utilizadas para PCR em tempo real (qPCR) para avaliar possíveis diferenças na quantidade de DNA viral. O resultado mostrou que, embora nas horas iniciais – 3-4 h p.i. – as diferenças na quantidade de DNA sejam mínimas, entre amostras de DNA extraído de células tratadas e não tratadas, é visível um aumento muito mais lento no número de cópias de DNA viral ao longo da infeção em culturas tratadas do que em não tratadas, indicando que a replicação de DNA é afetada durante o tratamento com extrato aquoso de S. virgaurea. CESAM (UID/AMB/50017), Centro de Química e Bioquimica (UID/MULTI/00612/2013), FCT/MEC through national funds and the co-funding by the FEDER, within the PT2020 Partnership Agreement and Compete 2020 N/A