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1.1 Hintergrund und Ziele Chronische Entzündungsprozesse in der Niere werden bei pädiatrischen Patienten häufig durch obstruktive Nephropathien oder anhaltende Glomerulonephritiden ausgelöst. Diese führen in ihrer Endstrecke zu einer zunehmenden Nierenfibrose, die letztlich in einem Funktionsverlust der Niere resultieren kann. Nierenfibrose ist charakterisiert durch anhaltende Zellproliferation und Matrixvermehrung. An diesen Mechanismen können sich Integrine als Zell-Matrix-Rezeptoren ursächlich beteiligen. Die alpha8-Integrinkette (itga8) wird in der Niere von Mesangiumzellen, glatten Gefäßmuskelzellen und aktivierten Fibroblasten exprimiert. Mesangiumzellen können durch vermehrte Produktion von Matrixbestandteilen und Zytokinen wesentlich zur Fibrosierung beitragen. Andererseits können Mesangiumzellen durch Apoptose und Phagozytose apoptotischer Zellen und von Matrixbestandteilen die Ausheilung fördern. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen von itga8 sowohl in einem Modell der chronischen Ureterobstruktion als auch in einem Glomerulosklerose-Modell zu schwereren fibrotischen bzw. sklerotischen Schäden führt. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von itga8 auf die Endoplasmatische (ER) Stressreaktion, Apoptose- und Autophagievorgänge, sowie Aging und Zellproliferation in 2 Mausmodellen: dem interstitiellen Fibrosemodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) und einem Modell der Glomerulosklerose, dem sogenannten Rückkreuzungsmodell (RK). 1.2 Methoden Für das Modell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) wurde sowohl in Wildtyp- als auch in itga8-defizienten Mäusen eine unilaterale Ureterobstruktion durchgeführt. An Tag sieben nach UUO wurde in Narkose Nierengewebe entnommen. Hier wurden sowohl immunhistochemische Untersuchungen als auch Real-Time-PCR Messungen zur Untersuchung von ER-Stress, Autophagie, Apoptose, Aging und Zellproliferation durchgeführt und statistisch ausgewertet. Für das Glomerulosklerosemodell (RK) wurden itga8 heterozygote Mäuse mit gemischtem genetischem Hintergrund auf den 129Sv Mausstamm rückgekreuzt. Die rückgekreuzten Mäuse, die homozygot defizient für itga8 sind (itga8-/-), entwickeln eine Glomerulosklerose. An Tag - 2 - 70 wurde Nierengewebe aus den itga8-/-Mäusen und den itga8+/+Mäusen (Kontrollgruppe) entnommen. Real-Time-PCR-Messungen und immunhistochemische Untersuchungen zur Beurteilung von ER-Stress, Autophagie, Apoptose, Aging und Zellproliferation wurden durchgeführt und statistisch ausgewertet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Induktion einer interstitiellen Fibrose mittels Ureterobstruktion führte zu Veränderungen bei Markern des Zell-Turnovers. Die Proliferations- und Apoptosemarker PCNA, p21, p53, ciap1+2 und Survivin waren unabhängig vom itga8 Genotyp induziert, wohingegen bei den meisten Zellstress-Markern keine Veränderungen nachweisbar waren. In ähnlicher Weise führte im Modell der Glomerulosklerose das Fehlen von itga8 nicht zu einheitlichen Veränderungen in der Expression der untersuchten Marker von Zellstress, Autophagie und Apoptose. Der Agingmarker Sirtuin-1 sowie der antiapoptotische Marker xiap zeigten jedoch eine reduzierte Expression in itga8-/-Mäusen. Die Zellproliferation war bei itga8-defizienten Nieren im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Das ER-Stressprotein Grp78 war in den itga8-/-Mäusen vermehrt immunhistochemisch nachweisbar. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Die Befunde im Modell der Ureterobstruktion zeigen, dass die schwereren fibrotischen Schäden in der Niere bei itga8-defizienten Mäusen, im Vergleich zu Wildtyp Mäusen, nicht auf eine unterschiedliche Regulation der Proliferation oder von ER-Stress, Autophagie, Aging oder Apoptose zurückzuführen sind. Die Befunde werden im Wesentlichen von den Ergebnissen im Modell der Glomerulosklerose gestützt. Den schwereren interstitiellen Schäden der itga8-defizienten Nieren scheinen andere Störungen der Gewebshomöstase zu Grunde zu liegen. Ein möglicher Mechanismus ist, dass itga8-defiziente Mesangiumzellen oder Fibroblasten einen anderen Aktivierungsstatus haben als Wildtyp-Zellen. In der Folge könnten itga8-defiziente Zellen mehr Zytokine oder Chemokine produzieren, die dann zu einer verstärkten Entzündungsreaktion und dadurch zu mehr Fibrose führen können. Die Klärung der zugrundeliegenden Mechanismen wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. 1.1 Background and Objectives In paediatric patients chronic inflammatory processes of the kidney are often the result of obstructive nephropathy or persisting glomerulonephritis. Chronic inflammation leads to fibrosis, which ultimately results in a loss of kidney function. Fibrosis of the kidney is characterised by a persisting proliferation of cells and matrix expansion. Integrins, functioning as cell-matrix-receptors, play a fundamental role in these mechanisms. In the kidney the alpha8-integrin-chain (itga8) is expressed by mesangial cells, vascular smooth muscle cells and by activated fibroblasts. Mesangial cells can contribute significantly to the development of fibrosis by producing increasing amounts of matrix components and cytokines. However, mesangial cells can also help to reverse those pathological changes and promote the regeneration of homeostasis of the tissue by apoptosis and phagocytosis of apoptotic cells and matrix components. A lack of itga8 was associated with a more severe fibrotic damage in a model of chronic ureteral obstruction as well as in a model of glomerulosclerosis in previous analyses. This leads to the assumption of itga8 taking part in regenerative mechanisms. Therefore, the contribution of itga8 to the regulation of endoplasmatic-stress, apoptosis, autophagy, aging and proliferation of cells was investigated in two mouse-models: in a model of interstitial fibrosis after unilateral ureteral obstruction (UUO) and in a model of glomerulosclerosis (the backcrossing model, (RK)). 1.2 Methods For the unilateral ureteral obstruction model (UUO), unilateral ureteral obstruction was performed in both wild-type and itga8-deficient mice. On day seven after UUO, kidney tissue was removed under anesthesia. Immunohistochemical studies as well as real-time PCR measurements were performed to study ER-stress, autophagy, apoptosis, aging and cell proliferation and were statistically analysed. For the model of glomerulosclerosis (RK), itga8 heterozygous mice on a mixed genetic background were backcrossed on the 129Sv mouse strain. Those backcrossed mice, which were homozygously deficient for itga8 (itga8-/-), developed glomerulosclerosis. On day 70, renal tissue was removed from the itga8-/-mice and the itga8+/+mice (control group) under - 4 - anesthesia and real-time PCR measurements and immunohistochemical investigations were performed for ER-stress, autophagy and apoptosis markers and were statistically analysed. 1.3 Observations and Results Induction of interstitial fibrosis by ureteral obstruction led to changes in markers of cell turnover. The proliferation and apoptosis markers PCNA, p21, p53, ciap1+2 and survivin were induced independently of the itga8 genotype, whereas no changes were detected in most cell stress markers. Similarly, in the model of glomerulosclerosis the lack of itga8 did not result in consistent changes in the expression of the examined markers of cell-stress, autophagy and apoptosis. However, aging marker sirtuin-1 and the antiapoptotic-marker xiap showed a reduced expression in itga8-/-mice. Cell proliferation was significantly reduced in itga8-deficient kidneys compared to the wild type. The ER-stress protein grp78 was increased immunohistochemically detectable in itga8-/-mice. 1.4 Conclusions Our findings in the model of ureteral obstruction do not argue for a contribution of differential proliferation, ER-stress, autophagy, aging or apoptosis to the development of the more severe renal fibrotic injury in itga8-deficient compared to wildtype mice. Our findings are essentially confirmed by the results from the glomerulosclerosis model. Other mechanisms regulating tissue homeostasis seem to underlie the more severe renal damage in itga8-deficient mice. Differences in the state of activation of mesangial cells or fibroblasts lacking itga8 compared to wildtype cells might be a possible mechanism. This activated state might lead to an increased production of cytokines and chemokines which might result in a stronger inflammatory reaction and ultimately to a more severe fibrosis. Further investigations of those basic mechanisms will be subject of ongoing research.