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The acute phase of experimental Trypanosoma cruzi infection is associated with a strong inflammatory reaction, physiological changes, amastigote nests in tissues, and hematological alterations. ArtinM, a lectin extracted from Artocarpus heterophyllus seeds, is a homotetramer exhibiting immunomodulatory properties that promotes Th1 immune responses against intracellular pathogens, including the induction of neutrophil migration and increase in IL‐12 production. This study aimed to evaluate the effects of ArtinM on experimental Chagas disease in mice. We evaluated mouse survival curves, parasitemia, hematological parameters including quantification of inflammatory infiltrates, and amastigote nests in cardiac tissue during infection. The results showed a reduced number of parasites in the blood, an increase in animal survival, improvements in hematological parameters, and decrease in inflammatory infiltrates and amastigote nests in the group treated with ArtinM. Collectively, these data suggest that the administration of ArtinM can lower the number of parasites in peak parasitemia caused by the Colombian strain of T. cruzi and can increase survival of infected mice. The observed reduction in cardiac tissue injury may be due to fewer T. cruzi amastigote nests and lower levels of inflammatory infiltrates. This study highlights the need for further investigation into the use of ArtinM as a potential alternative therapeutic for treating Chagas disease.

Colectivo de estudiantes investigadores &nbsp

Water buffalo (Bubalus bubalis) and domestic cattle (Bos taurus) are closely related species. However, embryo transfer interspecies has been attempted without any success. The failure in hybrid embryo-implantation is associated with the glycocode in the maternal-fetal interface. Glycosylation patterns have been studied in different species of ruminants; however, in B. bubalis, only the binucleated cells (BNC) have been analyzed. This glycocode is essential for a successful embryo-implantation and can be defined by Lectin-Histochemistry (LHC). The aim of this study is to compare the glycosylation pattern of placenta and uterus in water buffaloes and cattle by LHC. Tissue samples of placenta and uterus from pregnant Mediterranean female water buffaloes (Buf1) and Angus cows (Bov1) were analyzed. All animals were euthanized at 98 days of gestation. LHC was carried out using twelve lectins (Con A, LCA, PSA, sWGA, PHA-e, SBA, UEA-1, WGA, RCA-1, PNA, DBA, BSA-1). The intensity of lectin binding was semiquantitatively scored using a scale of 0 (negative) to 3 (strongly positive). Difference between species was found in trophoblast layer by PSA, SWGA, PNA and BSA-1, in BNC, and in the mononuclear cells by LCA, PSA, PHA-e, DBA, BSA-1, PNA. In utero, differences in the apical cellular membrane and the secretion of glands were identified by DBA and RCA-1, and in the cytoplasm of those glandular epithelial cells by PHA-e, BSA-1, WGA, and SBA. In both species, BNC presented a strong positive reaction with DBA and SBA, a moderate response by LCA, PHA-e, BSA-1 and PNA lectin, and a low reaction by PSA, UEA-1, SWGA, WGA, Con A and RCA-1. The results found in this study suggest that although both species are closely related, glycosylation patterns in the placenta and uterus are different, thus providing a possible reason for embryo transfer not being possible between these species. Fil: Caspe, Sergio Gastón. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Norte. Estacion Experimental Agropecuaria Pergamino. Agencia de Extension Rural Mercedes.; Argentina Fil: Konrad, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste; Argentina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Cs.veterinarias. Departamento de Producción Animal; Argentina Fil: Moore, Dadin Prando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Agencia de Extensión Rural Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Sala, Juan Manuel. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Norte. Estacion Experimental Agropecuaria Pergamino. Agencia de Extension Rural Mercedes.; Argentina Fil: Lischinsky, Lilian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Agencia de Extensión Rural Balcarce; Argentina Fil: Campero, Carlos Manuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Agencia de Extensión Rural Balcarce; Argentina Fil: Barbeito, Claudio Gustavo. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Cátedra de Histología y Embriología Animal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, Santo André, 2022. Lectinas são proteínas que possuem sítios específicos para reconhecimento de carboidratos e estão presentes em plantas, animais e microrganismos. Dois exemplos de lectinas vegetais são a Concanavalina A (ConA), extraída do "jack bean" ou feijão de porco (Canavalia ensiformis) e a DVL, obtida a partir de sementes de Dioclea violacea. Nesta dissertação de Mestrado, relatou-se a síntese e caracterização de nanopartículas (NPs) de cloreto de prata (AgCl) (denominadas aqui como AgCl-NPs) assistidas pelas lectinas ConA e DVL. As AgCl-NPs foram fotossintetizadas utilizando-se um processo simples, rápido e compatível com a Química verde. A morfologia das AgCl-NPs, observadas nas análises de microscopia eletrônica, foi heterogênea, com predominância de estruturas esféricas com diâmetros médios de 44,38 ± 25,4 nm e 46,75 ± 27,3 nm, para ConA e DVL, respectivamente, resultado compatível com o valor médio estimado pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (ConA~76 nm e DVL~74 nm). Os resultados de potencial zeta indicaram que as AgCl-NPs formaram soluções coloidais estáveis, e análises de difração de raios X mostram elevada cristalinidade e a presença de pequeno conteúdo de prata metálica. Além disso, as AgCl-NPs assistidas pelas lectinas ConA e DVL apresentaram notável atividade antifúngica contra o fungo Cryptococcus neoformans (MIC80 = 1,18 µg.mL-1 para a ConA e MIC80 = 0,69 µg.mL1 para a DVL). Os resultados também mostraram que ambas as lectinas mantêm a atividade hemaglutinante em eritrócitos de coelho quando associadas às nanopartículas. As AgCl-NPs assistidas por lectinas vegetais demonstradas neste estudo apresentam síntese fácil, rápida e com grande potencial para aplicações biotecnológicas. Lectins are proteins that have specific sites for carbohydrate recognition and are present in plants, animals and microorganisms. Two examples of plant lectins are Concanavalin A (ConA) extracted from the jack bean or pig bean (Canavalia ensiformis) and DVL obtained from the seeds of Dioclea violacea. In this Master's dissertation, the synthesis and characterization of silver chloride (AgCl) nanoparticles (NPs) (named here as AgCl-NPs) assisted by ConA and DVL lectins was reported. AgCl-NPs were photosynthesized using a simple, fast and compatible process with the green chemistry. The morphology of AgCl-NPs, observed in the electron microscopy analysis, was heterogeneous, with a predominance of spherical structures, with diameters ranging from 44.38 ± 25.4 nm and 46.75 ± 27.3 nm, for ConA e DVL, respectively, a result compatible with the average value estimated by the dynamic light scattering technique (ConA~76 nm e DVL~74 nm). Zeta potential results indicated that AgCl-NPs formed stable colloidal solutions, and X-ray diffraction analysis showed high crystallinity and the presence of small metallic silver content. Furthermore, AgCl-NPs assisted by ConA and DVL lectins showed excellent antifungal activity against the fungus Cryptococcus neoformans (MIC80 = 1.18 µg.mL1 for ConA and MIC80 = 0.69 µg.mL-1 for DVL). The results also showed that both lectins maintain the hemagglutinating activity when associated with the nanoparticles. The AgCl-NPs assisted by plant lectins demonstrated in this study present an easy and fast synthesis, and great potential for biotechnological applications.

ilustraciones, fotografías, graficas El estudio de las lectinas vegetales ha sido de gran importancia debido a su capacidad de reconocer residuos de carbohidratos, los cuales han sido llamados glicotopes; alguno de ellos se encuentra enmascarados en la superficie celular y están asociados con una gran variedad de carcinomas. Algunas de las lectinas que más se han estudiado son las de origen vegetal de la familia Leguminosae, sin embargo, también se han aislado de otras familias botánicas, tales como Lamiácea. Las lectinas de Lamiáceas se caracterizan porque reconocen los glicotopes T y/o Tn. La información disponible acerca de estas proteínas es muy escasa debido a que los procesos de purificación no permiten obtener la cantidad necesaria para realizar estudios de caracterización estructural y de interacción con el antígeno Tn/T; por otra parte, hasta el momento solo hay dos secuencias de especies relacionadas obtenidas a partir del cDNA, la lectina de Salvia miltorriza (LSM) y de Gleheda y solo se han caracterizado cuatro lectinas de la zona de Eurasia y dos lectinas de especies endémicas de Colombia, la lectina de Salvia bogotensis (LSBo-I) y de Lepechinia bullata (LLb-I) En el presente trabajo, se realizó la purificación de la lectina de Salvia bogotensis I (LSBo-I), empleando cromatografía de intercambio iónico y afinidad. Las fracciones obtenidas presentaron actividad aglutinante por eritrocitos Tn y se observó por SDS PAGE, una banda alrededor de 36 kDa por SDS-PAGE que es similar a lo obtenido en estudios previos. La sepharosa 4B, fue acoplada a una IgG de conejo (antiLSBo-I), y la elución se llevó a cabo mediante un gradiente de pH. En cada etapa de purificación se evaluó la actividad aglutinante con eritrocitos humanos A+, los cuales fueron tratados enzimáticamente con neuraminidasa y B- galactosidasa para exponer el Tn. Se obtuvo el 71% de la secuencia y por predicción se determinó que pertenece a las lectinas tipo Leguminosa (L). También se llevaron a cabo ensayos para la obtención del ADNc y la secuencia de nucleótidos de la LSBo-I. (Texto tomado de la fuente) Plant lectins studies have been of great importance due to their ability to recognize carbohydrate residues on surface cells, epitopes-like glycotopes are called. Some of them are masked on the cell surface and are associated with a wide variety of carcinomas. The most studied lectins belong to the Leguminosae family however, they have also been isolated from other botanical families, such as Lamiaceae. Their lectins are characterized by recognizing T and/or Tn glycotypes. The information available about these proteins is very scarce owing to purification processes do not allow obtaining the amount to carry out structural studies and interaction with Tn/T glycans. Secondly, there are only two sequences related to Lamiacea lectins, Salvia miltorriza (SML) and Gleheda and four lectins have been studied from Eurasia zone and two endemic lectins from Colombia, Salvia bogotensis (SBoL-I) and Lepechinia bullata (LBL-I). In this work, Ion-exchange and affinity chromatography’s led to getting SBoL-I that showed only a band by SDS PAGE, around 36 kDa, according to previous studies. Main purification step was carried out using affinity chromatography, a Sepharose 4B was coupled to IgG (antiSBoL-I) and pH gradient elution. The agglutinating activity was tested using A+ human erythrocytes, which were enzymatically treated with neuraminidase and B−galactosidase, to expose Tn structures. Finally, a sequence with 71% coverage was obtained and three-dimensional model type of Leguminous was predicted by homology. Additionally, cDNA assays were carried out to get nucleotide sequence from SBoL-I. Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Lectinas de Lamiacea

El glicocálix espermático es una estructura altamente compleja desde el punto de vista estructural, composicional y funcional. En este contexto, la presencia y localización de los componentes que conforman el glicocálix espermático ha sido descrita en diferentes especies de mamíferos utilizando mayoritariamente lectinas. De igual forma, se han registrado cambios en los patrones de unión a lectinas durante eventos fisiológicos del espermatozoide como la capacitación o la reacción acrosómica. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los sitios de unión a lectinas en espermatozoides de diferentes especies de mamíferos y describir los cambios que se producen durante ciertos eventos fisiológicos como la capacitación o la reacción acrosómica. En una primera fase, se identificaron los patrones de unión a lectinas en el delfín mular (Tursiops truncatus) antes y después de la capacitación in vitro. Como resultados, se obtuvo que los patrones de unión mayoritarios para las lectinas Peanut agglutinin (PNA) y Wheat germ agglutinin (WGA) cambiaban tras la capacitación in vitro. Por el contrario, los patrones de unión mayoritarios para las lectinas Aleuria aurantia agglutinin (AAA) y Concanavalin A (Con A) no sufrieron cambios tras la capacitación. En una segunda fase, se analizaron los sitios de unión para las lectinas PNA, WGA, AAA, Con A y Pisum sativum agglutinin (PSA) en espermatozoides de cerdo (Sus scrofa) antes y después de la capacitación in vitro y tras la inducción de la reacción acrosómica, después de la incubación durante 1 y 4 h en un medio capacitante. De esta forma, los patrones de unión a lectinas cambiaron mayoritariamente en aquellos espermatozoides sometidos a la inducción de la reacción acrosómica tras 4 h de incubación en un medio capacitante. En la tercera fase, se utilizó una técnica novedosa mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) para evaluar los cambios cuantitativos y cualitativos en los sitios de unión a la lectina Con A tras la capacitación in vitro durante 1 y 4 h en espermatozoides humanos. Como resultado, se registró una disminución progresiva y significativa de los sitios de unión a Con A a lo largo del tiempo de capacitación y una redistribución hacia la zona apical de la región acrosomal. La metodología anteriormente mencionada fue utilizada para valorar los cambios en los sitios de unión de la lectina AAA en el espermatozoide humano durante la cuarta fase. De esta forma, se observó una disminución progresiva de los sitios de unión a AAA durante la capacitación in vitro.

ilustraciones, graficas Las lectinas son glicoproteínas de origen no inmune, que reconocen carbohidratos con diferentes afinidades, por lo tanto, tienen un amplio espectro de estudio y aplicación, en diferentes campos como el médico, por ejemplo, en terapias antirretrovirales y antitumorales. Paralelamente, son de gran importancia en el estudio de formación de complejos lectina–carbohidrato, así como las interacciones proteína carbohidrato, que conducen a diferentes respuestas biológicas. Se encuentran en todos los organismos desde virus hasta humanos, aunque han sido muy bien estudiadas en animales y plantas superiores. Su alta distribución en los diferentes reinos muestra su importancia en los procesos celulares, que se dan por interacciones célula–célula, hospedero–patógeno, y planta–simbionte, entre otras. En el caso de los artrópodos, las funciones fisiológicas de las lectinas aún no están establecidas, sin embargo, hay evidencia de su importancia en la respuesta inmune, metamorfosis, diferenciación, muda, entre otras. Con respecto al estudio de las lectinas en venenos, es muy poco lo que se menciona en las revisiones y en términos generales es muy escaso. Los estudios se han limitado en su mayoría a las lectinas del veneno de serpientes (85.9%) y en menor proporción peces (5,6%), arañas y escorpiones (2,8%). Puesto que, a partir de la glándula de escorpión, se ha registrado solamente una secuencia hipotética para la lectina de Tityus obscurus (TyobL), obtenida mediante estudios de transcriptómica. Además, la única lectina estudiada a partir del veneno es la de Buthus occitanus, especie del sur de Vietnam, que se caracteriza por reconocer residuos de Fuc>> D-Glc > L-Rham= D-xyl, y solo se conoce su análisis de aminoácidos y peso molecular de subunidades. Por consiguiente y teniendo en cuenta que no existen estudios enfocados en lectinas presentes en veneno de escorpión, y que además no se conoce la secuencia ni la estructura terciaria, con el desarrollo de este trabajo se detectaron nuevas lectinas (TymaLs), a partir del veneno de Tityus macrochirus, una especie endémica del departamento de Cundinamarca, las cuales se caracterizaron por ser glicoproteínas de alto peso molecular (>100 kDa), reconocer residuos de lactosa y/o azúcares acetilados, y estar compuestos por monómeros de pesos moleculares ~ 15 kDa. Para complementar el conocimiento acerca de estas lectinas, se llevaron a cabo estudios de predicción estructural con la secuencia (nt) propuesta para la lectina de T.obscurus (TyobL), los resultados obtenidos por SWISS MODEL muestran que es una lectina tipo taquilectina (TL), similar a la isolectina 5a de Tachypleus tridentatus purificada de la hemolinfa del cangrejo (Texto tomado de la fuente). Lectins are proteins of no immune origin belonging to a diverse animal or plant origin group and are characterized by irreversibly binding a given monosaccharide or oligosaccharide. These properties have made them essential molecules in studying carbohydrate structure and function. Studying glycans’ function and how they can regulate biological processes is one of the most rapidly growing fields in biochemistry and molecular biology; this ranges from coagulation to viral and bacterial infection processes acting on different types of cells. Lectins have been clues in the knowledge in this area which will lead to developing new alternatives in treating diseases. Advances in proteomics have also generated growing interest in understanding how glycans participate in the multiple interactions at the cellular level where glycoproteins play a particular role. The most well-known interactions leading to biological responses are protein-protein or protein-carbohydrate ones, while eventual carbohydrate-carbohydrate interactions have not been considered relevant to date; experimental evidence has been presented which has implicated them in biological processes including cellular traffic, host-pathogen interactions, embryogenesis, spermatogenesis, fertilization, nervous system development, and angiogenesis. Many studies related to Arthropods´ lectins are carried out although physiological functions have not been established yet, there is evidence about the role immune system, metamorphosis, and differentiation, among others. However, regarding venom lectins, scarce information is found in the bibliography. Mainly studies have been mostly snakes (85.9%) and, to a lesser extent, fish (5.6%), spiders, and scorpions 82.8%). Only one hypothetical sequence has been registered for Tityus obscurus lectin (TyobL) obtained in transcriptomics studies. Additionally, only one lectin from Buthus occitanus venom was isolated and characterized for recognizing Fuc>> D-Glc > L-Rham= D-xyl residues, aminoacidic and carbohydrate analysis and molecular weight were studied too. Thus, limited structural information is available about its primary and tertiary structure. Likewise, their sequence in nucleotides or amino acid is generally unknown preventing their production in recombinant form. Considering that no studies are focusing on the detection, isolation, and biochemical characterization of lectins from scorpion venom, in this work, an endemic specie from the department of Cundinamarca, Tityus macrochirus (TymaLs) were studied to detect and isolate new lectins (TymacLs), which had specificity towards lactose residues (β-D-Gal (1-4)-β-D-GlcNAc–O-R) and acetylated carbohydrates. These lectins are glycoproteins with molecular weight higher (>100 kDa), and 15 kDa for monomers forms. To deepen the knowledge of these lectins, we chose the sequence from T. obscurus, for carrying out structural prediction studies. These results obtained by SWISS-MODEL showed that it is a tachylectin-like lectin (TL), from Tachypleus tridentatus crab hemolymph. Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Estudios de Lectinas en venenos animales

Lectins are proteins with varied and wide applicability in the field of biotechnology. In general, they are defined as proteins that have the ability to bind specifically and reversibly to carbohydrates, without altering the structure of the ligand. the property of lectins of interactions through due failures, an application that results in relatively simple bioinformation and can generate large interactions with data. In this area of bioinformatics, the use of computer simulations in the study of lectins is promising for application in the health sphere, since it allows a quick and cheap prospection of potential ligands that may include those present in pathogens. Currently, the SARS-CoV-2 virus is one of the biggest threats to global health due to the high infection capacity, responsible for enormous pressure on the health sector due to a high number of infected with consequent hospitalizations. Studies that the infectious activity of coronaviruses is related to the activity of the spike glycoprotein in the envelope and that it has the ability to interact with the host cell 2 converting enzyme of the host. Therefore, the main objective of this study was to analyze the project of recognition of ConA-type lectins to the spike glycoprotein through molecular docking analysis with glycans present on the surface of this target molecule. In order for this objective library to be glycated, a process of building structures of three-dimensional steps, performed and embedded in the interaction, simulations of interaction between lectins and molecular docking assays to determine the most promising lectins in the interaction with a SARS S protein -CoV-2 that may proceed to experimental trials in the future. As lectinas são proteínas com aplicabilidade variada e ampla na área da biotecnologia. De modo geral, elas têm como definição serem proteínas que possuem a habilidade de se ligar especificamente e reversivelmente a carboidratos, não alterando a estrutura do ligante. Devido a propriedade das lectinas de interação com ligantes por meio de interações fracas, a aplicação dessas proteínas em bioinformática é relativamente simples e pode gerar grandes quantidades de dados. Dentro dessa área da bioinformática o uso de simulações computacionais no estudo de lectinas se mostra promissor para aplicação na esfera da saúde, uma vez que permite a prospecção rápida e barata de potenciais ligantes que podem incluir glicoconjugados presentes em patógenos. Atualmente, o vírus SARS-CoV-2 é uma das maiores ameaças à saúde global em virtude da alta capacidade de infecção, responsável por pressionar enormemente o setor de saúde devido a um número elevado de infectados com consequentes internações. Estudos demonstram que a atividade infecciosa dos coronavírus está relacionada com a atividade da glicoproteína spike presente no envelope viral e que tem a capacidade de interagir com a enzima conversora da angiotensina 2 da célula hospedeira. Diante disso, este projeto teve como objetivo principal analisar o reconhecimento de lectinas do tipo ConA à glicoproteína spike por meio da análise de de docking molecular com glicanos presentes na superfície dessa molécula-alvo. Para que esse objetivo seja alcançado, um processo de três etapas foi realizado: construção de uma biblioteca de estruturas tridimensionais dos glicanos de spike, separadamente e inseridas na proteína, simulações de interação entre lectinas e os glicanos por meio de docking molecular e análise das simulações para determinação das lectinas mais promissoras na interação com a proteína S do SARS-CoV-2 que poderão proceder para ensaios experimentais no futuro.

Orientador : Antonio Roberto Martins Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Lectinas são proteínas ligantes de carboidratos de origem não Imune, que aglutinam células e/ou precipitam glicoconjugados. Sua abundância na natureza e a facilidade de serem obtidas fez com que passassem a ser utilizadas como ferramentas valiosas para detecção, isolamento e caracterização de glicoproteínas solúveis ou de membrana. Seu uso tem permitido detectar glicoproteínas envolvidas nas diferentes etapas do desenvolvimento. Na neurogênese cerebelar, por exemplo, lectinas têm sido usadas para detectar e diferenciar componentes moleculares envolvidos nos processos de proliferação, diferenciação, migração celular e formação sináptica. Poderíamos citar, como exemplo típico dessas ferramentas, a lectina KM+, extraída da semente de jaca (Artocarpus integrifolia), recentemente purificada que apresenta especificidade para D(+)mannose e propriedade de induzir a migração de neutrófilo por mecanismos haptotático. Seus ligantes têm sido identificados na superficie e no citoplasma de células endoteliais, na superficie de células epiteliais alveolares, na membrana basal e no tecido conjuntivo intersticial de pulmão de rato. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Lectins are non-immune, non-enzymatic proteins that bind carbohydrates. They can aglutinate cells and precipitate glyconconjugates. Since they are abundant in plants and can be easily purified, they are commonly used as probes to detect, isolate and characterize soluble or membrane-bound glycoproteins. They have been employed to detect glycoproteins involved in different stages of neural development. In the cerebellar neurogenesis, for example, lectins have been used to detect and differentiate molecular components involved in the processes of cellular proliferation, differentiation and migration, as well as in synapse formation. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Farmacologia

Orientador: Jaime Aparecido Cury Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: Lectinas são prot.einas que se ligam a açúcares especifiicos de macromoléculas. Foram descritas inicialmente em plantas, porém de outras fontes já foram isolados como bactérias, animais e até mesmo mamíferos. As lectinas apresentam várias propriedades como hemaglutinação, aglutinação, de bactérias, protozoários, leucocitos, estímulo mitogênico para linfócitos e entre outras a reação e precipitação de glicoproteinas, incluindo imunoglobulinas. As glicoproteinas constituem um grande grupo de substâncias presentes na saliva e soro, dentre elas a imunoglobulina A. Tem sido descrito que lectina de semente de jaca reage com IgA presente no soro e secreções humanas. Neste t.rabalho procuramos verificar se a lectina de semente de jaca, específica para galactose, reagia com imunoglobulina A, salivar, e se era especlfica para esta glicoproteina, comparando as reações com as glicoproteinas do soro. Através de técnicas de dupla difusão em gel de agarose, eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, com saliva e soro deficiente em imunoglobulina A, verificamos que esta lectina reage com outras glicoproteinas da saliva e do soro além da imunoglobulina A. Após o fracionamento do extrato bruto de semente de jaca, por cromatografia de afinidade em agarose-D-galactose, verificamos a existência de outra lectina neste extrato, não específica para galactose, com atividade precipitante para várias proteinas do soro humano. As proteinas da saliva e soro separadas eletroforeticamente em géis de poliacriamida ragem com soluções de lectina. A reação é especifica, pois as proteinas que apresentam afinidad para as lectinas ficam imobilizadas, enquanto que outras se difundem do gel quando em soluções tampões. Est.a t.écnica mostrou-se adequada para o estudo de glicoproteinas da saliva e soro humano normal e patologico Abstract: Interaction of lectins of jack seeds Artocarpus integrifolia, with salivay and human serum glycoproteins. Lectins are proteins which bind to specific saccharides in polysacharides, glycoproteins or glycolipds. Although originally described in plants, they have been isolated from many diverse sources like bacterias and animal including smails, sponges, fish and others. The lectins have many biological activities like erythrocyte bacterial, protozoal, leukocytes aglutination, produce mitogenic effect on lymphocyte culture, and precipitate glycoproteins, as the immunoglobulins. The gycoproteins are important group in t.he salivary and serum components, included immunoglobulin A. Our aim was determine if the lectin of jack seed (galactose specific) reacts specifically with salivary immunoglobin A when compared with serum glycoprotelns. Through double agar diffusion and electrophoretic separation in agarose and polyacrylamide gels of Ig-A deficient saliva and serrum, we observed that other glycoproteins present in saliva and serum react with this lectin. The fractioned crude extracts of jack seeds by affinty chromatography with agarose-D-ga!actose resulted in a lectin specific to galactose. The other proteins that didn't bind to galactose, also react and precipitate various serum proteins. The salivary and serum proteins separated in disc polyacrylamide gels react with lectins solutions. The reaction is specific because only some proteins are retained into gel after repeated wash in buffer. This procedure was shown to be useful for study normal and pathological human salivary and serum glycoproteins Doutorado Biologia e Patologia Buco-Dental Doutor em Odontologia

Orientador: Sergio Marangoni Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As lectinas são proteínas ou glicoproteínas com a capacidade de aglutinar eritrócitos e outras células, precipitar polissacarídeos e outras glicoproteínas por possuírem um (ou mais) centro de ligação, específico e reversível, a carboidratos. As lectinas podem ser encontradas em animais, vegetais e microorganismos. BMooL é uma lectina específica para galactosídeos, e foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni através da cromatografia de afinidade em D-Iactose. O perfil eletroforético (SDS-P AGE) mostrou que BMooL é um homodímero com subunidades de 14 kDa. A proteína apresentou reação positiva quando submetida a coloração para carboidrato, sendo portanto uma glicoproteína. Dentre os eritrócitos testados, BMooL apresentou maior afinidade por eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A, B e O, em concentrações mínimas respectivas de 0,50 ug/ml, 0,96 /. ug/ml e 0,96 ug/ml. Eritrócitos tripsinizados de cavalo e pato não foram aglutinados na presença desta lectina. A atividade hemaglutinante com 2,0 ug/ml de BMooL sobre eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A é inibida com 0,8 mM de lactose, 1,56 mM de galactose e 1,56 mM de rafinose. A atividade hemaglutinante de BMooL demonstrou ser dependente de Ca²+, pois foi inibida na presença de EDT A e EGT A. A associação das subunidades é uma condição fundamental para a atividade hemaglutinante de BMooL, pois quando reduzida com DTT, a lectina não mantém tal atividade. A composição de aminoácidos da lectina permitiu verificar que BMooL é uma proteína que contém em maior proporção resíduos de aminoácidos hidrofílicos como Asx (14%), Glx (13%) e Lys (8,0%) e aminoácidos não polares como Leu (8,1%). Em testes de agregação plaquetária com plasma humano, na presença de colágeno como agonista das agregações, a lectina não demonstrou nenhuma modulação significante nas plaquetas em concentrações de até 40,0 ug/ml. A função das lectinas em venenos ofidicos ainda não está bem esclarecida, a atividade hemaglutinante não reflete diretamente o papel dessas proteínas. O estudo da estrutura e de outras atividades biológicas que as lectinas apresentam, faz-se necessário para um melhor entendimento das interações lectina-carboidrato, que participam da grande maioria das interações biológicas existentes Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins which agglutinate erythrocytes and other cells and polysaccharides, since they have one or more specific carbohydrate-binding sites. Lectins are widely distributed in plants, as well as in animaIs and microorganisms. They have also been found in the venom of snakes. A lactose-specific lectin, BMooL, was purified from the crude venom of Bothrops moojeni by affinity chromatography on an immobilized D-Iactose column. The SDS-P AGE, under reduction conditions, showed that BMooL is a homodimer of 14kDa subunits. The protein appeared to be a glycoprotein once it showed a positive reaction to the Schiff' s reagent. Among the assayed erythrocytes, BMooL had more affinity to trypsined A, B and O types of human erythrocytes with end points of approximately 0.50 ug/ml, 0.96 ug/ml and 0.96 ug/ml, respectively. On the other hand, trypsined erythrocytes from horses and ducks did not agglutinate in the presence of this lectin. The hemagglutination of trypsined A type human erythrocytes induced by 2.0 ug/ml of BMooL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 1.56 mM galactose and 1,56 mM raffinose. BMooL activity is a Ca²+dependence since EDTA and EGTA inactivated the lectin induced hemagglutination. Subunits association is a fundamental condiction for the hem agglutination activity of the lectin, since when reduced by DTT, BMooL have no effect on trypsined human erythrocytes. The detennination of BMooL aminoacid composition showed that it have a high content of acidic residues such as Asx (14%), Glx (13%) and Lys (8%) and non-polar amino acids as Leu (8,1 %). On collagen-induced platelet aggregation assays with human plasma, 40,0 ug/ml lectin showed no significant modulation in the platelet. The role of these lectins in the snake venoms remains unc1ear, the hemagglutination activity does not direct reflect the function of these proteins. Strucutural and other biological activities studies are needed for a more detailed understanding about the carbohydrate-Iectin interactions, which take part in the majority of the biological interactions described up to now Mestrado Bioquímica Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Urara Kawazoe, Adilson Leite Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os efeitos de seis lectinas da subtribo Dioc1einae - DViol, DVir, DGr, ConBr, CF - e da subfamília Mimosoideae - PP - sobre as formas infectantes - esporozoítos de Eimeria acervulina e E. tenella, foram examinadas para determinar o índice de invasão em células primárias de rim e de embrião de galinha O pré-tratamento de esporozoítos com 100 µg/ml das seis lectinas e com 50 µg/ml de DViol, DVir, ConBr e PP inibiram significativamente a invasão por E. acervulina e E. tenella, respectivamente. O pré-tratamento das células primárias de embrião de galinha com seis lectinas (100 µg/ml) não apresentou efeito estatisticamente significante sobre a invasão dos esporozoítos de E. acervulina. Não houve correlação entre a afinidade da lectina DViol por D-manose (açúcar de especificidade das lectinas) e o efeito de inibição da invasão, uma vez que o tratamento de esporozoítos de E. acervulina e E. tenella com essa lectina e D-manose apresentou resultado semelhante ao tratamento somente com lectina. A análise dos esporozoítos de E. acervulina tratados com as seis lectinas (l00 µg/ml), por meio de citometria de fluxo, não demonstrou ruptura na membrana nem perda da viabilidade desses esporozoítos. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que interações específicas entre as lectinas Dioc1einae e esporozoítos de E. acervulina e E. tenella podem alterar o processo de invasão às células cultivadas in vitro sem, no entanto, apresentar atividade parasiticida Abstract: The effect of six plant lectins in the invasion of Eimeria acervulina and E. tenella sporozoites using primary chick kidney and embryo cells cultivated in vitro, was examined. Pretreatment of sporozoites with l00 µg/ml of DViol, DVir, DGr, ConBr, CF, PP and 50 µg/ml of DViol, DVir, ConBr and PP inhibited significantly the invasion of E. acervulina and E. tenella sporozoites, respectively. Pretreatment of cell cultures with l00 µg/ml l of lectins had no significant effect on E. acervulina sporozoites invasion. There was no correlation between sugar affinity of lectins for D-manose and the inhibitory effect of the parasites demonstrated by treatment of E. acervulina and E. tenella sporozoites with DViol and incubated with or without D-manose which showed similar inhibitory effects. Flow citometric analysis of E. acervu/ina sporozoites treated with l00 µg/ml of six lectins showed no membrane disruption and loss of viability. The data observed in the present study suggest that specific interactions between Diocleinae lectins and E. acervu/ina and E. tenella sporozoites can change the process of invasion in cells cultivated in vitro without showing parasiticide activity. The experiments carried out showed higher effect of lectins on E. acervulina sporozoites than for E. tenella sporozoites Mestrado Mestre em Parasitologia

Orientador: Celso Paulino da Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: A interaçao entre lectina de jaca e glicoproteinas que compoem a pelicula adquirida in vitro foi estudada através de ele troforese em acrilamida, dupla difusão em agarose e imunoeletrofo rese em agarose. Saliva humana inicial foi incubada com hidroxiapatita por duas horas à temperatura ambiente e sob agitação constante, sendo, em seguida, elulda primeiramente em tampão fosfato O,2M pH 6,8 e em seguida em tampão fosfato 1,OM pH 6,8. O sobrenadante e os eluatos foram analizados eletroforéticamente e testados em dupla difusao contra lectina de jaca e soro de cabra anti-IgA humana. Paralelamente a estes experimentos foi conduzida a imunoeletroforese das proteinas salivares contra lectina de jaca e soro anti-IgA humana. Os resultados mostraram que a IgA está presente na composição da pellcula adquirida in vitro e que a lectina de jaca reage com as glicoprote1nas sal ivares que possuem afinidade pela hidroxiapatita in vitro Abstract: The interaction between lectin from jackfruit and glycoproteins that compose the acquired pellicle in vitro lllas studied by poliacrilamide gel electrophoresis, double-difusion in . agarose and immunoelectrophoresis. Human sa 1 i va was incubated with hydroxyapatite for 2 hours at room temperature under continous agitation and then eluted in O,2M phosphate buffer pH 6,8 and in the same buffer at 1,OM. The supernatant and the eluted proeins were analysed electrophoretically and tested by double difusion against lectin from jackfruit and anti-IgA goat serum. At the same time immunoeletectrophoresis of human saliva anti-IgA I serum and lectin from jackfruit (IJere performed. The' results Ishowed that IgA is present in the proteins that comp.ose the acquired pellicle in vitro and that the lectin from jackfrui t . reacts with salivary glycoproteins that have affinity for the hydroxiapatite in vitro Mestrado Biologia e Patologia Buco-Dental Mestre em Odontologia

Orientador: Celso Paulino da Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: A reparação é caracterizada por diversos eventos celulares e humorais que ocorrem de forma integrada. As lectinas são glicoproteínas com diversas atividades biológicas, tais como a ativação de células inflamatórias e a secreção de citocinas ''I' que ativam fibroblastos, as quais podem influenciar o reparo. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência das lectinas PHA, WGA e jacalina na reparação tecidual. As respostas inflamatórias in vivo e a influência das lectinas sobre a proliferação de fibroblastos in vitro, também foram avaliadas. Para avaliar a reparação, 300 J.1g1mL de cada lectina foram aplicados sobre as feridas provocadas no dorso de ratos Wistar, com punch de biópsia de 8 milímetros. A retração das feridas foi medida diariamente, após a aplicação. Nos dias 3, 7, 11 e 15 foram realizadas as análises histológicas, em cortes corados com hematoxilina eosina e impregnados pela prata. Os efeitos inflamatórios foram avaliados após injeção intradérmica das lectinas. A proliferação de fibroblastos, na presença das lectinas, foi avaliada por técnica colorimétrica. PHA acelerou a reparação. Aumentou o depósito e a maturação das fibras de colágeno e antecipou a reepitelização. As análises histológicas revelaram reação inflamatória, com predominância de células mononucleares. Quando adicionado ao meio de cultura, PHA inibiu a proliferação dos fibroblastos nas concentrações acima de 20 J.1g1mL. WGA retardou a reparação, o que foi evidenciado pelo atraso no desenvolvimento do tecido de granulação e na formação do epitélio. Induziu fraca reação inflamatória no local de aplicação e, acima de 20 J.1g1mL, inibiu a proliferação dos fibroblastos. A jacalina não influenciou o reparo tecidual ou a proliferação dos fibroblastos. Entretanto, induziu reação inflamatória local com predominância de células mononucleares. Possivelmente, a agregação de células inflamatórias pela ação de PHA foi benéfica. Linfócitos e macrófagos ativados secretam citocinas e fatores de crescimento importantes na reparação. Ao interagir com os receptores para a fibronectina e outras proteínas, WGA impediria a interação das células com a matriz, retardando a reparação. Apesar da jacalina exercer ação mitogênica sobre os linfócitos T, estimular a secreção de INFye produzir reação inflamatória local, esta lectina não influenciou a reparação Abstract: Wound healing is a complex and dynamic process, characterized by the integrated actions of different cells. Lectins are glycoproteins which can present several biological activities. Many of lectin activities may contribute to repair including increased production of cytokines, and activation of inflammatory cells and fibroblasts. The purpose of this work was to evaluate in vivo effects of PHA (Phaseolus vulgaris phytohemaglutinin), WGA (Triticum vulgare lectin) and jacalin (Artocarpus integrifolia lectin) on wound healing in vivo. Male rats were anesthetized and excisions of 8 mm in diameter were performed in their dorsal skin. The lectins (300uglmL) were then placed Qn the wound. Changes in the surface area were recorded everyday as compared to the initial wound size. The rats were then killed at the 3rd, 7th, 11th, or 15th day. The specimens were harvested for histological examination, and stained with hematoxylin-eosin or silver impregnation. The inflammatory reaction was histologically evaluated around the area of lectin injection. The direct fibroblast proliferation induced by theses lectins were analyzed. PHA accelerated tis sue repair and enhanced the rate of wound contraction when applied to wound sites. Furthermore, PHA increased the reepithelization, collagen deposition and also promoted inflammatory reaction. PHA decreased fibroblast proliferation in vitro. WGA delayed wound repair when applied locally on the wound. WGA promoted weak inflammatory reaction and reduced the granulation tissue maturation. Significant decreased fibroblast proliferation were observed. Jacalin did not have a significant effect on repair and fibroblast proliferation. Jacalin promoted inflammatory Feaction when applied locally. PHA may induce wound healing due to the activation of inflammatory cells. Activated leukocytes release growth factors, such as ILs, INFy and F AFs, which have an important role in the repair processo WGA interact with different glycoproteins, such as plasma fibronectin receptor, and modify the cell and extracellular matrix interaction. Although jacalrn induced the proliferation of human lymphocytes and production of lymphokines, itt did not influence the cicatrization processo Doutorado Biologia e Patologia Buco-Dental Doutor em Ciências

Orientador: Jose Camillo Novello Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas Abstract: Snake venom lectins are classified as C-type lectins and their molecular structure consist in at least one carbohydrate recognition domain - CRD per subunit. BJcuL is a lectin from Bothrops jararacussu snake venom, which have been isolated and characterized in our laboratory. The lactose-binding BJcuL is a homodimer, and show toxic activity on cancer cells and endothelial cell lines. The aim of this work was: (1) to determine the complete cDNA sequence that encode the lectin from B. jararacussu snake venom; (2) to develop a methodology for the expression, solubilization, and purification of recombinant BJcuL; (3) to compare recombinant and native BJcuL activity. In addition to the work described we have investigated (4) native BJcuL effect on colon tumor cells concerning the proliferation and reactive oxygen species production (ROS). The cDNA-encoding BJcuL has been isolated of the cDNA phage library, constructed from B. jararacussu venom glands. The mature protein-coding region was amplified by PCR with specific oligonucleotides, and subcloned into the pET-15b vector to express the recombinant BJcuL in Escherichia coli BL21 (DE3). The deduced amino acid sequence exhibits a high degree of sequence identity with c-type lectins (CTLs) and c-type lectin-like domains (CTLDs). An insoluble and inactive 18.5-kDa protein was overexpressed after 1.0 mM IPTG induction. The recombinant BJcuL was recovered and denatured in a buffer with 6 M urea and purified on a nickel-affinity column. Protein refolding was carried out on this column, during procedure purification, followed by dialysis against CTBS and then by gel filtration for separation of the active dimmer. The refolding process of rBJcuL and the analysis of its structure were confirmed by biological assay, circular dichroism and Maldi-Tof. HT-29 D4 and Caco-2 cells, after adhesion, were treated with BJcuL (0 - 10 mM with 5%FBS) in 24, 48 and 72h. Proliferation assays were performed using BrdU-Elisa kit. An interesting decrease in BrdU incorporation was observed for both cells. At 2.5 µM BJcuL inhibited cell proliferation by approximately 50% for Caco-2 and 30% for HT-29 D4 in 24 h. This effect apparently was unrelated to subtle (20%) cellular redox imbalance induced by 2.5 µM BJcuL. In addiction, BJcuL showed a weak cytotoxic effect on these cell lines, since MTT assay did not show any decrease in cell viability. Together with the results presented, we are interested in a more detailed study of the molecular structure of BJcuL and its functions, through cloning and expression of rBJcuL, intending to clarify the structural particularities of these proteins Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Jose Camillo Novello Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As lectinas são proteínas ligantes de carboidratos, de origem não-imune, encontradas numa grande variedade de organismos. Aquelas isoladas de venenos de serpentes são constituídas de cadeias polipeptídicas relativas à região molecular correspondente ao domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) de lectinas. Devido às interações lectina ¿ carboidrato serem reversíveis, e não covalentes, estas moléculas podem ser utilizadas como importantes ferramentas bioquímicas. Este estudo tem como objetivo: (i) a caracterização da estrutura primária da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu (BJcuL); (ii) a investigação do efeito de BJcuL sobre a adesão de células tumorais a proteínas da matriz extracelular, (iii) e sobre a proliferação destas e de células endoteliais. O seqüenciamento N-terminal de BJcuL revelou a presença de uma única seqüência, indicando que esta proteína é composta de cadeias idênticas. A determinação da estrutura primária da lectina realizada por meio de análise dos peptídeos obtidos pela fragmentação da proteína com c1ostripaína e protease SV-8, demonstrou que BJcuL possui os 18 resíduos invariantes que caracterizam o tipo C de lectinas animais. Este fato indica que BJcuL pertence à família das lectinas tipo-C ligantes de I3-galactosídeos e apresenta símilaridades estruturais com a região C-terminal do CRD das lectinas animais de membrana. Nos primeiros testes em cultura de células tumorais, a viabilidade celular foi avaliada após 5 dias de cultivo na presença da lectina. Nestas condições, a BJcuL inibiu 50% do crescimento das células de carcinoma de rins ou pâncreas em concentrações entre 1 e 2 mM. Em testes posteriores, foi observado que as células de carcinoma de mama ou de ovário foram capazes de aderir fracamente a BJcuL. Entretanto, esta adesão não inibiu a fixação destas células à proteínas da matriz extracelular tais como; fibronectina, laminina e colágeno tipo I. Após proliferação de linhagens tumorais por 4 dias na presença de BJcuL, foi observado um efeito inibidor dose-dependente da lectina em células tumorais de glioma e carcinomas de mama ou ovário. No intuito de verificar as propriedades anti angiogênicas da lectina, foi realizado um ensaio de proliferação de células endoteliais na presença de BJcuL. Os resultados mostraram que a BJcuL, numa concentração de 0,09mM, foi capaz de reduzir em 50% a viabilidade destas células. Os resultados aqui mostrados fornecem base para estudos acerca da estrutura molecular da BJcuL e suas funções, da caracterização da ligação lectina-carboidrato, e dos mecanismos envolvidos na ligação da lectina às superficies celulares Abstract: Lectins are carbohydrate-binding proteins of non-immune origin found in a diverse array of organisms. Snake venom lectins are malleable molecules, and their molecular structure comprises the carbohydrate recognition domain (CRD) characterized in other Ca2+-dependent animal lectins. They could be used as interesting tools since lectin-glycan interactions are reversible and non-covalent. The aim of this study was (i) to characterize the molecular structure of lectin from the venom of the snake Bothrops jararacussu (BJcuL); (ii) to investigate the effect of BJcuL on the adhesion properties of tumor cells to the extracellular matrix proteins, (iii) and on the proliferation of cancer and endothelial cells.The determination of the single N-terminal sequence has shown that BJcuL is a homodimer. The analysis of the complete amino acid sequence of the peptides obtained by enzymatic BJcuL digestion (clostripain and SV-8 protease) showed that this lectin displays 18 invariant amino acid residues characteristics of C-type lectins. This fact implies that BJcuL possesses structural similarities to the C-terminal region of the animal membrane lectins CRD, belonging to the C-type j3-galactoside binding lectin family. In the first evaluation in a tumor cell system, cell viability was evaluated after 5 days cultivation. This lectin was a potent inhibitor of growth in human renal or carcinoma cells, with 50% inhibitory concentrations (lC50) of cell growth between 1 and 2 mM of BJcuL. In the second evaluation, cells of human metastatic breast cancer or human ovarian carcinoma cell lines weakly adhere to BJcuL. However, BJcuL was not capable of inhibiting adhesion of these cells to the extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin and type I collagen. 1t was also observed a dose-dependent inhibitory effect of BJcuL in proliferation assays with glioma, breast or ovarian carcinoma cells after 4 days of incubation. Proliferation assays were performed on bovine brain and endothelial cells in order to verify the antiangiogenic properties of the BJcuL These experiments revealed that BJcuL was capable to reduce cell proliferation (lC5o of 0,09mM). Taken together, our findings could be helpful to further studies regarding the lectin structure and function, lectin-glycan binding characterization, as well as, the mechanisms involved in BJcuL binding to cell surface molecules, which influence cell proliferation and angiogenesis Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Sonia Maria Alves Bueno, Ricardo de Lima Zollner Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: A alergia é uma enfermidade do sistema imunológico que afeta aproximadamente de 20 a 30% da população mundial. Dentre as reações alérgicas, a reação de hipersensibilidade imediata é mediada pelas imunoglobulinas E (IgE). Os indivíduos geneticamente predispostos a manifestar reações por hipersensibilidade imediata e polissensibilizados aos alérgenos ambientais são considerados atópicos e, geralmente, possuem teores de IgE total até 10.000 vezes mais elevados do que as pessoas não-atópicas. O conhecimento das interações entre a IgE e ligantes de afinidade pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos da hipersensibilidade imediata, por exemplo a terapia de adsorção seletiva através de circulação extracorpórea, assim como ao desenvolvimento de métodos de obtenção de IgE purificada, para aplicação nas áreas de diagnóstico, pesquisa molecular, dentre outras. Os adsorventes empregados na terapia de adsorção seletiva, bem como na purificação de IgE, geralmente são anticorpos anti-IgE imobilizados em agarose, os quais são de alto custo e difícil obtenção. Este trabalho avaliou o desempenho de adsorventes alternativos ao Sepharose-anti-IgE, visando a remoção de IgE total e específica aos ácaros Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis de amostras plasmáticas e a preparação de soluções enriquecidas em IgE, como uma das etapas do processo de purificação de IgE. Os adsorventes estudados constituíram-se de lectinas (concanavalina A e Lens culinaris), aminas (poli-L-lisina e aminohexil) e o aminoácido D-triptofano, imobilizados em agarose. Dentre eles, o gel agarose-Lens culinaris mostrou-se o mais promissor para aplicação na terapia de adsorção seletiva de IgE e o gel Sepharose-concanavalina A mostrou-se o mais adequado para ser usado na obtenção de soluções enriquecidas em IgE. Experimentos cromatográficos foram realizados visando estabelecer condições experimentais (velocidade superficial, número de passagens de plasma pela coluna, temperatura e razão entre volume de plasma e volume de leito) mais favoráveis à adsorção de IgE em agarose-Lens culinaris. Posteriormente, essas condições foram utilizadas nos experimentos de simulação in vitro de circulação extracorpórea, nos quais o gel agarose-Lens culinaris removeu de 40,7 a 42,8% de IgE¿s total e específicas. A obtenção da solução enriquecida em IgE foi realizada por meio de duas etapas cromatográficas, empregando-se os princípios de afinidade (colunas agarosejacalina e Sepharose-concanavalina A) e de exclusão por tamanho (permeação em gel). A solução final enriquecida em IgE obtida, continha como principais impurezas, IgA e IgG. Como resultado das duas etapas, 36,6% de IgE foi recuperada e o fator de enriquecimento em IgE, em relação a IgA, IgG, IgM e albumina, foi de 75,8. Apesar do gel Sepharose-anti- IgE apresentar desempenho melhor tanto na remoção quanto na purificação de IgE, os adsorventes agarose-Lens culinaris e Sepharose-concanavalina A apresentam custos mais atrativos Abstract: Allergy is a disorder of the imune system, affecting approximately 20%-30% of the general population. Among allergic reactions, immediate hypersensitivity is mediated by immunoglobulin E (IgE). Individuals that have a genetic predisposition for responses to immediate hypersensitivity are named atopic and generally have elevated serum IgE concentration, up to 10,000-fold higher than in the normal population. The knowledge of the interactions between IgE and affinity ligands may lead to the development of new methods of treatment for immediate hypersensitivity, for example, IgE selective adsorption therapy through extracorporeal circulation, as well as to new methods for obtaining purified IgE, which is employed in diagnostic and in molecular research. The adsorbents employed in IgE selective adsorption therapy, as well as in IgE purification, are usually antibodies anti-IgE immobilized on agarose, which have high costs and are difficult to obtain. This work assessed the performance of adsorbents (alternative to Sepharose-anti-IgE) for the removal of total IgE and IgE specific for the airbone allergens Dermatophagoides pteronyssinus and Blomia tropicalis from plasma samples, as well as in the production of IgE enriched solutions, considered as a step of IgE purification. The adsorbents studied were lectins (concanavalina A and Lens culinaris), amines (poli-L-lisina e aminohexil) and the aminoacid D-tryptophan, all of them immobilized on agarose. Among them, Lens culinaris-agarose showed the best performance for IgE selective adsorption therapy, and Sepharose¿concanavalin A was considered the most appropriate for the production of IgE enriched solutions. Chromatographic experiments were accomplished in order to determine operating conditions (superficial velocity, number of times the plasma passed through the column, temperature, and ratio of plasma volume to bed volume) more favorable to IgE adsorption on Lens culinaris-agarose. The selected conditions were utilized in in vitro simulation assays of extracorporeal circulation, in which the Lens culinaris-agarose removed from 40.7% to 42.8% of total and specific IgE. The production of IgE enriched solutions was carried out with two chromatographic steps, employing affinity (columns jacalin-agarose and Sepharose-concanavalin A) and size exclusion (gel permeation) principles. The IgE enriched final solution contained IgA and IgG as the major impurities. As a result of both steps, 36.6% of IgE was recovered and the IgE enrichement number concerning IgA, IgG, IgM, and albumin was 75.8. Despite Sepharose-anti-IgE has better performance in removal and purification of IgE, Lens culinaris-agarose and Sepharose-concanavalin A adsorbents have more attractive costs Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutora em Engenharia Química

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Fernanda Ramos Gadelha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que reconhecem glicoconjugados de superfície celular. Neste trabalho, nós investigamos se a lectina de sementes de Cratylia mollis (Cramoll 1,4) tem efeitos tóxicos em Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 reconheceu glicoconjugados presentes na superfície celular dos parasitas, levando a aglutinação de epimastigotas e tripomastigotas, de uma maneira dose dependente (1-50 µg/ml). Além disso, Cramoll 1,4 diminuiu a proliferação de epimastigotas; 93% de inibição foi obtida com 50 µg/ml. A incubação de células (1.25 x 108 /ml) na presença de Cramoll 1,4 (50 |ig/ml) e Ca2+ (10µM) por 1 h induziu permeabilização de membrana plasmática seguida por influxo de Ca2+ e cúmulo de Ca2+ mitocondrial, resultado que se assemelha ao efeito clássico da digitonina. Cramoll 1,4 estimulou (cinco vezes) a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) mitocondrial, diminuiu de maneira significativa o potencial elétrico de membrana mitocondrial (??m) e prejudicou a fosforilação de ADP. A geração de EROs induzida por Cramoll 1,4 foi diminuída de forma significativa por EGTA. A permeabilização de membrana plasmática por digitonina (20 µM) em meio contendo Ca2+ também estimulou a geração de EROs mitocondrial, mas numa proporção menor que Cramoll 1,4. A velocidade de respiração desacoplada em epimastigotas não foi afetada pelo tratamento com Cramoll 1,4 + Ca2+ mas a respiração de repouso induzida por oligomicina foi 65% maior nas células tratadas do que nos controles. Experimentos usando frações mitocondriais de T. cruzi (MTc) mostraram que, em contraste com a digitonina, a lectina diminuiu de forma significativa o ??m por um mecanismo sensível a EGTA. Em concordância com os resultados da permeabilização de membrana plasmática e prejuízo da fosforilação oxidativa pela lectina, experimentos de microscopia de fluorescência usando iodeto de propídeo revelaram que Cramoll 1,4 induziu morte de epimastigotas por necrose. Experimentos feitos com mitocôndrias isoladas de fígado de rato (MFR) mostraram que Cramoll 1,4 induziu transição de permeabilidade mitocondrial, dependente de Ca2+, com aumento na produção de EROs. Em contraste ao que foi observado em MFR, o efeito de Cramoll 1,4 em MTc é insensível a ciclosporina A, um inibidor clássico do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. Nós mostramos que a toxicidade de Cramoll 1,4 em epimastigotas parece resultar de uma ação conjunta nas membranas plasmática e mitocondrial do parasita, sobrecarga de Ca2+ mitocondrial e produção de EROs Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins that recognize cell surface glycoconjugates. In this work, we investigated whether Cratylia mollis seed lectin (Cramoll 1,4) has toxic effects on Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 recognized glycoconjugates present on the cell surfaces of parasites, leading to agglutination of both epimastigotes and trypomastigotes in a dose-dependent manner (1-50 µg/ml). In additional, Cramoll 1,4 decreased epimastigote proliferation; 93% inhibition was attained at 50 µg/ml. Incubation of cells (1.25 x 108 /ml) in the presence of 50 µg/ml Cramoll 1,4 and 10 Ca2+ for 1 h induced plasma membrane permeabilization followed by Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ accumulation, a result that resembles the classical effect of digitonin. Cramoll 1,4 stimulated (five-fold) mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, significantly decreased the electrical mitochondrial membrane potential (??m) and impaired ADP phosphorylation. ROS generation induced by Cramoll 1,4 was significantly diminished by EGTA. Plasma membrane permeabilization by 20 digitonin in a Ca2+ -containing medium also stimulated mitochondrial ROS generation but at a lower rate than Cramoll 1,4. The rate of uncoupled respiration in epimastigotes was not affected by Cramoll 1,4 plus Ca2+ treatment, but oligomycin-induced resting respiration was 65% higher in treated cells than in controls. Experiments using T. cruzi mitochondrial fractions (MTc) showed that, in contrast to digitonin, the lectin significantly decreased ??m by a mechanism sensitive to EGTA. In agreement with the results showing plasma membrane permeabilization and impairment of oxidative phosphorylation by the lectin, fluorescence microscopy experiments using propidium iodide revealed that Cramoll 1,4 induced epimastigote death by necrosis. Experiments performed with rat liver mitochondria (RLM) showed that Cramoll 1,4 induced Ca2+-dependent mitochondrial permeability transition increasing the ROS production. In contrast to RLM, the Cramoll 1,4 effect in MTc is insensitive to cyclosporin A, a classic inhibitor of mitochondrial permeability transition pore. We showed that Cramoll 1,4 toxicity to T. cruzi epimastigotes seems to result from a concerted action on the parasite's plasma and mitochondrial membranes, mitochondrial Ca2+ overload and ROS production Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Tomomasa Yano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Lectinas constituem uma classe de proteínas ou glicoproteínas que são capazes de ligar-se, reversivelmente e seletivamente, a carboidratos sem causar transformação química. Estudos têm mostrado que a ligação de lectinas a carboidratos de superficie celular de células normais e malignas leva a vários efeitos biológicos tais como proliferação celular e apoptose. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos citotóxicos induzidos por TEL (uma lectina, isolada de sementes de Talisia esculenta, a qual preferencialmente liga-se a resíduos de manose) sobre linhagens de células tumorais e não-tumorais. Células Vero (rim de macaco verde afiicano) e Rela (carcinoma cervical humano) tratadas com TEL exibiram perda da integridade da membrana plasmática, retração celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos. Além disso, células Vero e Rela tratadas com TEL também revelaram uma drástica desorganização do citoesqueleto de actina. A Fragmentação intemuc1eossomal do DNA foi detectada pelo método de TUNEL e eletroforese em gel de agarose. Os efeitos citotóxicos induzidos por TEL foram progressivos e mostraram que as alterações morfológicas e os danos ao DNA ocorreram após a perda da integridade da membrana. Adicionalmente, TEL inibiu significantemente a proliferação das células Rela de maneira dependente da concentração. Nós também mostramos através de microscopia de tluorescência que TEL é intemalizada nas células Vero dentro de pequenas vesículas que depois se acumulam da região perinuclear; nas células Rela, a intemalização não foi observada. Foi estabelecido que a atividade das caspases-3 e -9 aumentaram nas células Vero e Rela de uma maneira dependente do tempo. Em contraste com as células Vero, a atividade da caspase-3 precedeu a ativação da caspase9 nas células Rela. Os efeitos citotóxicos e a intemalização de TEL foram bloqueados pela mano se, sugerindo que a ligação de TEL ao carboidrato específico na superficie celular é um pré-requisito para esses processos. Os resultados mostraram que a morte celular induzida por TEL nas células Vero e Rela seguiu uma série de eventos que culminou em um modo apoptótico de morte celular. Finalmente, uma vez que as células Rela foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina, TEL merece futuras investigações porque suas propriedades podem ser uma ferramenta útil na terapia contra câncer cervical humano Abstract: Lectins constitute a class of proteins or glycoproteins which are capable of binding carbohydrates selectively and reversibly without causing their chemical transformation. Studies have shown that lectin binding to cell surface carbohydrates of normal and malignants cells triggers various biological effects such as cellular proliferation and apoptosis. In this work, we investigate the cytotoxic effects induced by TEL (a lectin, isolated from Talisia esculenta seeds, which binds preferentially to mannose residues), on tumoral and non-tumoral cell lines. TEL- treated Vero (African green monkey kidney) and Hela (human cervical carcinoma) cells exhibited loss of plasma membrane integrity, cellular retraction, chromatin condensation, nuclear fragmentation and formation of apoptotic bodies. Furthermore, TEL-treated Vero and Hela cells also revealed a drastic disorganization of the actin cytoeskeleton. Internucleossomal DNA fragmentation was detected by TUNEL method. and agarose gel electrophoresis. TEL-induced cytotoxic effects were progressive and showed that the morphological alterations and DNA damage occurred after the loss of membrane integrity. Additionally, TEL significantly inhibited the proliferation of Hela cells in a concentration- dependent manner. We also show through of fluorescence microspy that TEL is internalized in Vero cells into small visicles that further coalesce in the perinuclear region; in Hela cells, TEL internalization was not observed. It was established that caspase-3 and -9 activity increased in Vero and Hela cells after TEL treatment in a time- dependent manner. In contrast to Vero cells, caspase- 3 activity preceded the activation of caspase-9 in Hela cells. The cytotoxic effects and the internalization of TEL was blocked by manose, suggesting that the binding of TELto specific carbohydrate on the cell-surface is a prerequisite for these processes. The results showed that TEL- induced cell death in Vero and HeLa cells followed by down stream events leading to apoptotic mode of cell death. Finally, since Hela cells were highly sensitive to lectin-induced cytotoxicity, TEL merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cervical cancer Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Carbohydrates or glycans are ubiquitous components of the cell surface which play crucial biological and structural roles. Sialic acids (Sias) are nine-carbon atoms sugars usually present as terminal residues of glycoproteins and glycolipids on the cell surface or secreted. They have important roles in cellular communication and also in infection and survival of pathogens. More than 20 pathogens can synthesize or capture Sias from their hosts and incorporate them into their own glycoconjugates and derivatives. Sialylation of pathogens’ glycoconjugates may be crucial for survival inside the host for numerous reasons. The role of Sias in protozoa such as Trypanosoma and Leishmania was demonstrated in previous studies. This review highlights the importance of Sias in several pathogenic infections, focusing on Leishmania. We describe in detail the contributions of Sias, Siglecs (sialic acid binding Ig-like lectins) and Neuraminidase 1 (NEU 1) in the course of Leishmania infection. A detailed view on the structural and functional diversity of Leishmania-related Sias and host-cell receptors will be provided, as well as the results of functional studies performed with different Leishmania species.

El género Pomacea es el más derivado y con mayor número de especies dentro de la familia Ampullaridae. Está compuesto por caracoles nativos de América que han sido introducidos en otras partes del mundo donde, algunas de sus especies, se han convertido en una seria plaga para la agricultura. Además, representan un riesgo sanitario al ser hospedadores intermediarios de varios parásitos que pueden afectar a seres humanos. Estos caracoles dulceacuícolas tienen la particularidad de tener oviposición aérea, una adquisición que se ha reconocido clave para el éxito evolutivo del género. En esta inusual estrategia reproductiva, las hembras depositan sus huevos fuera del agua en masas calcáreas coloridas, exponiéndolos a desecación, radiación solar intensa, altas temperaturas y depredación, y sin embargo, las adaptaciones de estos huevos permiten a sus embriones desarrollarse normalmente bajo esas condiciones. Los huevos de Pomacea presentan un sistema de protección, tanto frente a factores ambientales como contra la depredación, probablemente el motivo de sus escasos depredadores reportados. Al igual que la mayoría de los gasterópodos, en Pomacea, el embrión se encuentra rodeado por un fluido perivitelino (FPV) que contiene principalmente hidratos de carbono y proteínas (llamadas perivitelinas) a partir de los cuales se nutre el embrión. Las perivitelinas, además, cumplen el rol de protección frente a factores externos. La más abundante del FPV, llamada PV1, es una carotenoproteína no digerible (antinutritiva) que disminuye el valor nutricional de los huevos, con propiedades antioxidantes y fotoprotectoras. Además, le otorga la coloración característica a las puestas de cada especie, posiblemente una señal de advertencia o aposemática. La carotenoproteína de Pomacea scalaris, llamada PsSC, presenta además actividad lectina (proteínas que unen hidratos de carbono de manera específica de variadas funciones). En los huevos de animales, las lectinas generalmente se han asociado a la protección contra microorganismos y en las plantas a la defensa contra la herbivoría. Esta actividad lectina está ausente en las demás carotenoproteínas estudiadas del género. Más aún, la composición del FPV varía entre especies: Pomacea canaliculata y Pomacea maculata, incluidas en el clado canaliculata, presentan una perivitelina neurotóxica ausente en P. scalaris que pertenece al clado hermano bridgesii. Coincidentemente, las especies del clado canaliculata son las que han alcanzado mayor expansión e invasividad en las áreas introducidas. Las diferencias observadas entre los huevos de los dos clados nos llevaron a cuestionarnos si existían mecanismos de defensa bioquímicos dependientes de la posición filogenética de las especies y en consecuencia a profundizar el conocimiento de las perivitelinas del clado bridgesii, hasta el momento pobremente estudiado. Por otra parte, se sabe que la administración oral de la fracción soluble de huevo (ESF) de P. canaliculata a roedores altera la morfofisiología de su tracto digestivo y disminuye la tasa de crecimiento de estos animales, pero se desconoce el efecto de su administración en otros potenciales depredadores no mamíferos, impulsándonos también a evaluar el efecto de su ingesta sobre el sistema digestivo de anfibios y aves. Para abordar estos objetivos, iniciamos los estudios caracterizando en profundidad la lectina PsSC y su rol en la defensa contra microorganismos y depredadores. Analizamos su estructura primaria y hallamos que las secuencias de las subunidades de esta lectina no tienen homología con ninguna de las lectinas representadas en las bases de datos. Esta proteína solo presenta elevada similitud de secuencia con sus ortólogos del clado canaliculata aunque llamativamente estos no presenten actividad lectina. Evaluamos su especificidad de reconocimiento de hidratos de carbono mediante un microarreglo de glicanos observando que PsSC tiene elevada afinidad por dos motivos de oligosacáridos: gangliósidos y grupo ABO. También evaluamos su capacidad de aglutinar bacterias gram positivas y gram negativas observando que PsSC muestra capacidad para aglutinar estas últimas, pero carece de actividad antimicrobiana contra las cepas evaluadas. Además, evaluamos el efecto de su ingestión sobre el tracto digestivo de roedores donde observamos que afectaba la morfología de las vellosidades del intestino, así como el patrón de glicosilación y extensión de su epitelio absortivo. En conjunto, estos resultados indican que PsSC tendría una doble función ya que estaría implicada en la protección del huevo tanto contra la invasión microbiana como contra depredadores mamíferos. Continuando con el estudio de las perivitelinas del clado bridgesii, se analizaron los huevos de P. diffusa. Se aisló y caracterizó estructural y funcionalmente su perivitelina más abundante: una carotenoproteína a la que denominamos PdPV1. Se determinó su estructura primaria y nuevamente hallamos que está compuesta por polipéptidos que presentan homología únicamente con otras secuencias del género Pomacea. PdPV1 presenta actividad lectina con características estructurales y funcionales similares a las de PsSC y ausencia de homología de secuencia con otras lectinas conocidas, excepto PsSC. PdPV1 es estable estructuralmente en un amplio rango de pH y temperaturas y soporta la digestión por proteasas in vitro e in vivo, siendo capaz de atravesar el tracto digestivo de ratones inalterada, indicando que es una proteína antinutritiva. En conjunto estos avances permitieron realizar las primeras generalizaciones de las PV1s de Pomacea demostrando que las carotenoproteínas del clado bridgesii presentan una novedosa actividad lectina ausente en los ortólogos del clado canaliculata. Además, el FPV de P. diffusa, al igual que el de P. scalaris, no presenta neurotoxinas. En conjunto estos resultados, indican que las defensas de los caracoles del género Pomacea son clado-específicas. Por último, se amplió el conocimiento sobre los posibles blancos de las defensas bioquímicas de los huevos, evaluando el efecto de la administración oral de la ESF sobre el tracto digestivo de un anfibio (la rana toro Lithobathes catesbeianus) y un ave (la codorniz Coturnix coturnix). Analizamos las alteraciones en la morfometría de las vellosidades y los patrones de glicosilación intestinal, su superficie absortiva relativa y la histopatología de los tejidos luego de 24 h y 48 h de la administración. Los resultados muestran que tanto anfibios como aves se ven afectados negativamente 24 h posteriores a la ingestión del extracto de huevo. En los anfibios administrados con ESF de P. canaliculata se observa un ensanchamiento de las vellosidades y engrosamiento de la lámina propia, así como una leve hemorragia y presencia de células inflamatorias, mientras que en las aves administradas con ESF de una especie de cada clado, se vio afectada la morfometría de las vellosidades, la superficie absortiva relativa del intestino y se observó edema e hiperemia de las vellosidades intestinales, independientemente de la ESF del clado empleado. En las ranas, se ensayó además la letalidad de la ESF por administración intraperitoneal, donde observamos que ningún animal resultó afectado tras este ensayo. Este resultado es llamativo ya que investigaciones previas han demostrado que la ESF de P. canaliculata es letal tanto para roedores como para codornices. Los resultados, en conjunto, demuestran que las defensas bioquímicas de los caracoles del género Pomacea no solo son efectivas frente a mamíferos, sino también frente a aves y anfibios. En síntesis, con este trabajo de Tesis Doctoral avanzamos en el conocimiento de las defensas bioquímicas de los huevos de Pomacea en un contexto ecológico-evolutivo. Se demuestra que estas defensas antidepredador son clado-específica y estarían relacionadas con el potencial de invasividad de las especies. Se demuestra también que estas defensas bioquímicas complejas resultan efectivas frente a una diversidad de animales potencialmente depredadores más amplia de lo que se conocía, donde perivitelinas indigeribles que afectan el sistema digestivo juegan un papel central. Desde el punto de vista evolutivo este mecanismo de protección de los huevos, único en animales, es muy similar al que utilizan las plantas como protección contra herbívoros, un caso de convergencia evolutiva, aunque, a diferencia de las plantas, estas defensas estarían aquí advertidas por la llamativa coloración de las puestas. Este inusual conjunto de defensas explicaría la casi ausencia de depredadores reportados para los huevos del género ampliando el conocimiento de las relaciones depredador-presa a nivel molecular., Facultad de Ciencias Naturales y Museo

Galectin-3 (Gal-3) is a protein of the lectin-family, has affinity for β-galactose-containing carbohydrates, and can be localized in nucleus, cytoplasm, membrane associated or secreted. This protein is involved in many immunoregulatory processes, such as DC/T lymphocyte adhesion, inflammatory responses and cell migration toward inflammatory foci and cell proliferation. It was also seen that the T. cruzi infection, that is the etiological agent of Chagas disease, increases the expression of Gal-3. Thus, in this paper we aim to explore the biological activities of galectin-3 in acute and chronic T. cruzi experimental infection. Mice C57/BL6 Wild-Type (WT) and galectin-3 knockout (Gal-3KO) were infected intraperitoneally and was evaluate parasitaemia, recruitment of inflammatory cells in the peritoneal cavity, production of cytokines in spleen and heart and cardiac fibrosis. The data presented here demonstrate that the lack of Galectin-3 enhanced the parasitaemia and reduced the recruitment of leukocytes. In heart samples, we observed an increased secretion of TNF-α and IFN-γ in WT while in galectin-3 knockout mice we detected increased production of IL-1β and IL-4 during the acute phase. This scenario may have accounted to the higher infection rate during acute infection observed in knockout mice. We observed that in the chronic phase of infection the heart tissue of WT mice showed an immune response to Th2 profile, important to control tissue damage, with basal levels of IFN-γ and TNF-α, decrease in the concentration of IL-1β and increased IL-4. The increase in IL-4 is important for reducing heart damage and was not observed in animals Gal-3 KO. In chronic phase we observed an increased recruitment of mastocyte in Gal-3 KO animals and larger fibrosis of the heart. Therefore, the Gal-3 showed chemotactic and immunoregulatory functions that are needed to control the acute phase of infection and decreased chronic heart damage. A galectina-3 (Gal-3) é uma proteína que pertence à família lectina, apresenta afinidade a carboidratos contendo β-galactosídeos, e pode estar localizada no núcleo, citoplasma, associada à membrana ou secretada. Esta proteína está envolvida em muitos processos imunoregulatórios, tais como adesão de linfócitos T/CD, respostas inflamatórias, migração de células para focos inflamatórios e proliferação celular. Foi visto que a infecção por Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, aumenta a expressão de Gal-3. Assim, o objetivo do trabalho foi explorar as atividades biológicas da Gal-3 nas fases aguda e crônica da infecção experimental por T. cruzi. . Camundongos C57 / BL6 Wild-Type (WT) e galectina-3 knockout (Gal-3 KO) foram infectados por via intraperitoneal e foram avaliados quanto a parasitemia, recrutamento de células inflamatórias na cavidade peritoneal, produção de citocinas do baço e coração e fibrose cardíaca. Os dados aqui apresentados demonstraram que a falta de Gal-3 aumentou a parasitemia e reduziu o recrutamento de leucócitos. Em amostras de coração, verificamos um aumento da secreção de TNF-α e IFN-γ em animais WT, enquanto que em animais Gal-3 KO foi detectado o aumento da produção de IL-1β e IL-4 durante a fase aguda. Este cenário pode ter sido responsável pela maior taxa de infecção durante a infecção aguda observada em camundongos deficientes em Gal-3. Observamos que na fase crônica da infecção o tecido cardíaco de camundongos WT apresentou uma resposta imune com perfil Th2, importante para o controle do dano tecidual, com níveis basais de TNF-α e IFN-γ, diminuição na concentração de IL-1β e aumento de IL-4. O aumento de IL-4 é importante para diminuir danos cardíacos e não foi observado em animais Gal-3 KO. Na fase crônica, observou-se um aumento de recrutamento de mastócitos em animais Gal-3 KO e maior fibrose do órgão. Portanto, a Gal-3 apresentou funções quimiotáticas e imunorreguladoras que são necessários para controlar a fase aguda da infecção e diminuir o comprometimento cardíaco na fase crônica. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Since the first reports of erythrocyte agglutination in the late nineteenth century, several studies on lectins have been carried out. Currently, lectins are considered proteins or glycoproteins, not immunoglobulins, which recognize carbohydrates without participating in the metabolism of ligands. The functions of these proteins are broad, acting mainly on the innate immune system in animals. Animal lectins can be classified into several families according to their structural characteristics. In sponges, lectins belonging to three families, C-type lectins, galectins and tachylectins have already been reported, and the vast majority of lectins isolated from sponges lack structural information to classify them in some group. Among the lectins that do not belong to a family are those extracted from the sponges Aplysina fulva and A. lactuca. These lectins demonstrate biotechnological potential due to antibiofilm activity against certain bacterial strains. Thus, the objective of the work is to extract, purify, characterize, and verify the biological activity of a lectin from Aplysina cauliformis. The combination of chromatographic techniques of affinity, ion exchange and molecular exclusion proved to be efficient in the purification of ACL. The new lectin has been shown to have a high specificity for certain glycoproteins, in particular porcine stomach mucin. The hemagglutinating activity was stable up to 80 °C, and between pH 9 and 10, the presence of divalent cations not being necessary to observe it. In the electrophoresis gel, ACL showed a band of approximately 66 kDa under nonreducing conditions and two bands of approximately 35 kDa under reducing conditions. By molecular exclusion chromatography it was possible to detect and separate two lectins, ACL-1 and ACL-2 with native masses of 145 kDa and 120 kDa, respectively. ACL was subjected to protein digestion and the generated peptides were analyzed by mass spectrometry. However, these peptides showed no similarity to any known protein. Furthermore, ACL was able to agglutinate E. coli bacteria. Desde os primeiros relatos de aglutinação de eritrócitos no final do século XIX, diversos estudos sobre lectinas têm sido realizados. Atualmente, lectinas são consideradas proteínas ou glicoproteínas, não imunoglobulinas, que reconhecem carboidratos sem participar do metabolismo dos ligantes. As funções dessas proteínas são amplas, atuando principalmente no sistema imune inato em animais. As lectinas de animais podem ser classificadas em diversas famílias de acordo com suas características estruturais. Em esponjas, já foram relatadas lectinas pertencentes a três famílias, lectinas do tipo-C, galectinas e tachylectinas, sendo que a grande maioria das lectinas isoladas de esponjas carece de informações estruturais para classificá-las em algum grupo. Entre as lectinas que não pertencem a uma família estão aquelas extraídas das esponjas Aplysina fulva e A. lactuca. Essas lectinas demonstram potencial biotecnológico devido a atividade antibiofilme contras certas cepas bacterianas. Com isso, o objetivo do trabalho é extrair, purificar, caracterizar, e verificar a atividade biológica de uma lectina de Aplysina cauliformis. A combinações de técnicas cromatográficas de afinidade, troca-iônica e exclusão molecular se mostrou eficiente na purificação de ACL. A nova lectina mostrou ter uma alta especificidade por certas glicoproteínas, em especial a mucina de estômago de porco. A atividade hemaglutinante foi estável até 80 °C, e entre valores de pH 9 e 10, não sendo necessária a presença de cátions divalentes para observá-la. Em eletroforese em gel de SDS-PAGE, ACL apresentou uma banda de aproximadamente 66 kDa em condições não redutoras e duas bandas de aproximadamente 35 kDa em condições redutoras. Por cromatografia de exclusão molecular foi possível detectar e separar duas lectinas, ACL-1 e ACL-2 com massas nativas de 145 kDa e 120 kDa, respectivamente. ACL foi submetida a digestão proteica e os peptídeos gerados foram analisados por espectrometria de massas. Entretanto, estes peptídeos não apresentaram similaridade com qualquer proteína conhecida. Além disso, ACL foi capaz de aglutinar bactérias E. coli.