Hepatitis B Virus (HBV) is a DNA virus and belongs to the genus Orthohepadnavirus of the Hepadnaviridae family which represents one of two animal viruses with a DNA genome which replicates by reverse transcription of a viral RNA intermediate. Nucleotide variation led to further sub-classification into 8 genotypes (A to H). The reverse transcription step within its life cycle is prone to the introduction of errors and recombination when dually infected. This leads to a viral quasispecies which forms during the course of infection with many minor population variants; such variants can however only be detected by means of ultra-deep sequencing. A recent study in the Department of Medical Virology (UP) by Mayaphi et al. identified a number of the specimens that partitioned away from the typical subgenotype A1 clades with high bootstrap values and longer branch lengths. Thus, the main objective of the current study was to characterize the full genome of all variants for the outliers observed in the aforementioned study, inclusive of potential recombination, dual infection and minor populations. Twenty samples were selected from a previous cohort for purposes of the present study. The viral DNA was extracted and amplified by PCR according to the methods described by Günther et al. with modified primer sets. Nineteen of the samples were successfully amplified and 15 of these were sequenced. Specimens were sequenced by NGS on the Illumina MiSeq™ sequencer and sequence data used to reconstruct the viral quasispecies of each specimen. Further analyses of the reconstructed variants included molecular characterization as well as phylogenetic analysis and screening for recombination and drug resistance mutations. Full genome coverage was obtained for twelve of the fifteen samples and full genome variants reconstructed, generating nearly 40 full genomes. Phylogenetic analysis showed that the majority of the samples are of genotype A, more specifically of subgenotype A1, differing by less than 4% from known sequences. The phylogenetic analysis revealed a similar clade of outliers, where four samples clustered together with significant bootstrap support (75%) and a fifth sample partitioned separate from, yet close to, this clade, away from the typical African A1 clade. This clade was assigned to genogroup III. Three samples were of the Asian A1 clade (genogroup I) with remaining specimens grouping within genotype D and E. The variants showed low diversity within each specimen with some differing at but a few positions across the genome while even the most diverse quasispecies differed by less than a percentage (32 positions). Several unique and atypical positional variations were observed amongst study samples of which some were present in but one of the variants for that sample. Twenty-six lead to shared amino acid changes. Some observed changes, such as A1762T/G1764A and G1896A, could explain the serological patterns such as HBeAg negativity while others, such as C2002T, were previously implicated in disease progression and severity. Sample N199 presented a longer branch length and revealed short regions within the genome that display evidence of recombination between HBV/A1 and HBV/A2. The results illustrate the utility of NGS technology in characterizing viral variants., Le virus de l'hépatite B (VHB) est un virus à ADN et appartient au genre Orthohepadnavirus de la famille des Hepadnaviridae qui représente l'un des deux virus animaux avec un génome à ADN qui se réplique par transcription inverse d'un intermédiaire d'ARN viral. La variation nucléotidique a conduit à une sous-classification supplémentaire en 8 génotypes (A à H). L'étape de transcription inverse au sein de son cycle de vie est sujette à l'introduction d'erreurs et de recombinaisons lorsqu'elle est doublement infectée. Cela conduit à une quasi-espèce virale qui se forme au cours de l'infection avec de nombreuses variantes mineures de la population ; de tels variants ne peuvent cependant être détectés que par séquençage ultra-profond. Une étude récente du Département de virologie médicale (UP) de Mayaphi et al. ont identifié un certain nombre de spécimens qui se sont éloignés des clades typiques du sous-génotype A1 avec des valeurs de bootstrap élevées et des branches plus longues. Ainsi, l'objectif principal de la présente étude était de caractériser le génome complet de toutes les variantes pour les valeurs aberrantes observées dans l'étude susmentionnée, y compris la recombinaison potentielle, la double infection et les populations mineures. Vingt échantillons ont été sélectionnés à partir d'une cohorte précédente aux fins de la présente étude. L'ADN viral a été extrait et amplifié par PCR selon les méthodes décrites par Günther et al. avec des jeux d'amorces modifiés. Dix-neuf des échantillons ont été amplifiés avec succès et 15 d'entre eux ont été séquencés. Les échantillons ont été séquencés par NGS sur le séquenceur Illumina MiSeq™ et les données de séquence utilisées pour reconstruire la quasi-espèce virale de chaque échantillon. D'autres analyses des variantes reconstruites comprenaient la caractérisation moléculaire ainsi que l'analyse phylogénétique et le dépistage des mutations de recombinaison et de résistance aux médicaments. Une couverture complète du génome a été obtenue pour douze des quinze échantillons et des variantes complètes du génome reconstruites, générant près de 40 génomes complets. L'analyse phylogénétique a montré que la majorité des échantillons sont de génotype A, plus précisément de sous-génotype A1, différant de moins de 4 % des séquences connues. L'analyse phylogénétique a révélé un clade similaire de valeurs aberrantes, où quatre échantillons se sont regroupés avec un support bootstrap significatif (75 %) et un cinquième échantillon séparé, mais proche de ce clade, loin du clade A1 africain typique. Ce clade a été assigné au génogroupe III. Trois échantillons appartenaient au clade asiatique A1 (génogroupe I) avec des spécimens restants regroupés au sein des génotypes D et E. Les variantes présentaient une faible diversité au sein de chaque spécimen, certaines différant à quelques positions du génome, tandis que même les quasi-espèces les plus diverses différaient de moins qu'un pourcentage (32 positions). Plusieurs variations positionnelles uniques et atypiques ont été observées parmi les échantillons de l'étude, dont certaines n'étaient présentes que dans l'une des variantes de cet échantillon. Vingt-six conduisent à des changements d'acides aminés partagés. Certains changements observés, tels que A1762T/G1764A et G1896A, pourraient expliquer les schémas sérologiques tels que la négativité HBeAg tandis que d'autres, tels que C2002T, étaient auparavant impliqués dans la progression et la gravité de la maladie. L'échantillon N199 a présenté une longueur de branche plus longue et a révélé des régions courtes dans le génome qui présentent des preuves de recombinaison entre HBV/A1 et HBV/A2. Les résultats illustrent l'utilité de la technologie NGS dans la caractérisation des variantes virales.