Search

O déficit hídrico, que tem como componente principal o estresse osmótico, é o principal fator que limita a produção vegetal. O acúmulo de prolina é uma das respostas mais características a esse estresse, mas sua função, bem como a regulação da sua acumulação, não está bem estabelecida. No presente estudo, testou-se a hipótese que hormônios exercem um controle diferencial sobre a expressão dos genes e nas atividades das diferentes enzimas envolvidas na síntese e degradação da prolina sob déficit hídrico e estresse osmótico. Visando entender este controle, mutantes e transgênicos hormonais da cultivar Micro-Tom (MT) de tomateiro foram examinados quanto a possíveis alterações no acúmulo de prolina. Todos os experimentos foram realizados em condições ambientais controladas ( 350 µE m-2 s-1, 28±2/24±2°C e fotoperíodo de 16 h). Genótipos de MT com aproximadamente 20 dias após a germinação (DAG) foram submetidos ao déficit hídrico através da suspensão de rega por até oito dias. Alguns genótipos responderam diferencialmente quanto ao acúmulo de prolina, mas também houve diferenças no decréscimo de w do substrato com a secagem. Portanto, os genótipos que apresentaram acúmulo diferenciado de prolina no experimento com seca foram submetidos a PEG-6000 em solução nutritiva, sob dois potenciais hídricos (-0,8 e -1,2 MPa), por 12, 24 e 36 h. O uso de PEG foi importante, pois permitiu expor os materiais simultaneamente a um mesmo potencial hídrico. Alguns mutantes apresentaram resposta diferenciada e, dentre eles, verificou-se que o transgênico 35S::PS, com níveis elevados de prosistemina (PS), foi mais resistente ao estresse osmótico. Sabe-se que a PS leva a um acúmulo elevado de ácido jasmônico (JA), assim como evidências sugerem a participação do JA no acúmulo de prolina, mas pouco se sabe sobre o papel de ambos neste acúmulo. Para examinar se há diferenças no papel da PS e do JA no acúmulo de prolina, foi realizado um experimento a -1,2 MPa com o transgênico 35S::PS e MT com aplicação exógena de metil jasmonato (MeJa). Em ambos os casos, houve indução da P5CS (via de síntese) e da enzima P5CDH (via de degradação) em condições controle, porém não houve acúmulo de prolina. Já sob estresse osmótico, foi observado um aumento adicional da atividade das enzimas de síntese e uma acentuada repressão da P5CDH. Assim, o MeJa parece promover um elevado turnover de prolina em condições controle, sem promover seu acúmulo, mas com a imposição de estresse osmótico a via de degradação parece ser acentuadamente reprimida causando o acúmulo deste aminoácido. Para examinar a dependência de MeJa por ABA no acúmulo de prolina, o mutante sitiens, deficiente em ABA, foi submetido ao estresse osmótico juntamente com a aplicação exógena de MeJa, ABA e MeJa + ABA. No mutante sitiens, a manutenção de um w mais elevado e próximo do controle (MT) foi dependente de ABA, mas não de MeJa. O teor de prolina aumentou moderadamente na presença de MeJa ou ABA, sob estresse osmótico, mas foi acentuado na presença dos dois hormônios, sugerindo algum grau de interdependência na ação destes hormônios no acúmulo de prolina Drought, which has as its main component osmotic stress, is the major factor limiting crop production. The accumulation of proline is one of the most characteristic responses to this stress, but its function as well as the regulation of its accumulation is not well established. In this study, we tested the hypothesis that hormones exert control over the differential expression of genes and the activity of enzymes involved in the synthesis and degradation of proline under drought and osmotic stress. To understand this control, hormonal mutants and transgenic lines of the Micro-Tom (MT) cultivar of tomato were examined for possible changes in the accumulation of proline. All experiments were conducted under controlled environmental conditions ( 350 E m-2 s-1, 28±2/24±2 °C and a photoperiod of 16 h). Plants of MT genotypes, approximately 20 days after germination (DAG), were subjected to drought via suspension of irrigation for up to eight days. Some genotypes responded differentially with respect to proline accumulation, but there were differences in the decrease of w of the substrate with drying. Therefore, the genotypes that showed different levels of proline in the experiment with drought were treated with PEG-6000 in nutrient solution at two different water potentials (-0.8 and -1.2 MPa) for 12, 24 and 36 h. The use of PEG was important because it allowed simultaneous exposure to the same water potential. Some mutants displayed a differential response, and, among them, the transgenic line 35S::PS, with high levels of prosystemin (PS), was more resistant to osmotic stress. It is known that PS leads to increased accumulation of jasmonic acid (JA), and evidence suggests the involvement of JA in proline accumulation, but little is known about the role of either in this accumulation. To examine whether there are differences in the role of PS and JA in the accumulation of proline, an experiment at -1.2 MPa with 35S::PS and MT with exogenous application of methyl jasmonate (MeJa) was performed. In both cases there was induction of the enzyme P5CS (synthesis) and P5CDH (degradation) under control conditions, but without accumulation of proline. However, under osmotic stress, a further increase in the activity of synthesis enzymes and a marked suppression of P5CDH were observed. Thus, MeJa seems to promote a high \"turnover\" rate of proline under control conditions, without promoting its accumulation, but upon the application of osmotic stress, its degradation appears to be markedly suppressed, resulting in the accumulation of this amino acid. To examine the dependence of MeJa on ABA for the accumulation of proline, the sitiens mutant (deficient in ABA) was subjected to osmotic stress along with exogenous application of MeJa, ABA and ABA + MeJa. In sitiens, maintainance of a higher w, closer to MT, was dependent on ABA, but not MeJa. The proline content increased moderately in the presence of MeJa or ABA under osmotic stress, but was pronounced in the presence of both hormones, suggesting some degree of interdependence in the role of these hormones in the accumulation of proline

The domestication of plants and animals from wild parents occurred independently in various parts of the world thousands of years ago. During this process, humans selected the characteristics of most interested to them. Therefore, many species have domesticated traits in common. This sort of traits, which can be used to differentiate a wild species from domesticate ones, is termed domestication syndrome. The closest ancestor of tomato (Solanum lycopersicum) is believed to be S. pimpinellifolium, a species with pea-sized fruits. To create the current varieties available for consumption, it was necessary to select traits that would modify both the size and the shape of the fruits. Many genes are involved in these traits and their domesticated alleles are now known. Among the most important genes for weight gain are FRUIT WEIGHT 11.3, a cell size regulator, and FRUIT WEIGHT 2.2, which codes for a cell number regulator. As for genes controlling fruit shape, the SUN, is positive growth regulator, and OVATE, a negative growth regulator. Elongated fruits can be produced by either a gain-of-function allele of SUN or a loss-of-function allele of OVATE. Much is known about the impact of these genes on fruits, but their influence on the whole plant development is not always clear. It is also known that plant hormones are important for the physiological control of plant development. Therefore, in this work we sough to understand the impact of fruit weight genes on shoot and root traits, as well as the influence of fruit shape genes on the expression of hormonal pathways during ovary/fruit development. A domesticação de plantas e animais a partir de progenitores selvagens iniciou-se independentemente em vários locais do mundo a milhares de anos. Durante esse processo, os humanos selecionaram características importantes para eles. Portanto, muitas espécies possuem características domesticadas em comum. Esse tipo de característica, que pode ser usada para diferenciar uma espécie selvagem de uma espécie domesticada, é denominado síndrome de domesticação. Acredita-se que o ancestral mais próximo do tomateiro (Solanum lycopersicum) seja S. pimpinellifolium, uma espécie com frutos do tamanho de uma ervilha. Para criar as variedades atuais disponíveis para consumo, foi necessário selecionar características que modificassem tanto o tamanho quanto a forma dos frutos. Muitos genes estão envolvidos nessas características e seus alelos domesticados são agora conhecidos. Entre os genes mais importantes para aumento de peso dos frutos encontram-se FRUIT WEIGHT 11.3, um regulador do tamanho da célula, e FRUIT WEIGHT 2.2, que codifica para um regulador do número de células. Para o formato de frutos, temos SUN, um regulador positivo do crescimento, e OVATE, um regulador negativo do crescimento. Frutos alongados podem ser produzidos por um alelo de ganho de função de SUN ou por um alelo de perda de função de OVATE. Muito se sabe sobre o impacto desses genes nos frutos, mas sua influência no desenvolvimento da planta como um todo nem sempre é clara. Sabe-se também que os hormônios vegetais são importantes para o controle fisiológico do desenvolvimento das plantas. Portanto, neste trabalho buscamos entender o impacto dos genes de tamanho do fruto nas características do caule e da raiz, bem como a influência dos genes do formato do fruto na expressão de vias hormonais durante o desenvolvimento do ovário/fruto.

The formation of branches is one of the key determinants of shoot architecture, determining how plants grow and having direct impacts in their productivity. Lateral branches originate from axillary meristems, formed in the axils of each leaf primordia. Once established, axillary meristems give rise to a few lead primordia, giving rise to an axillary bud. Depending on the plants developmental program and on environmental conditions, axillary buds may remain dormant or outgrow, forming a new lateral branch. Several transcription factors, phytohormones, metabolites and environmental signals have been associated with the formation of axillary meristems or with the regulation of axillary bud activity. Members of the SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPLs/SBPs) family of transcription factors regulated by the microRNA156 (miR156) have emerged as potential regulators of shoot architecture, regulating both the formation of axillary meristems and the activity of axillary buds. In this work, we: (1) review recent literature on the effects of the main endogenous and environmental signals controlling the formation of axillary meristems and activity of axillary buds and; (2) investigated the role of miR156-targeted SlSBPs in the control of shoot branching in tomato, demonstrating an interaction between the miR156/SBP module and auxin and cytokinin signalling, besides a possible interaction with other transcription factors controlling the activity of axillary buds. A formação de ramos laterais é um dos principais aspectos da arquitetura vegetativa, determinando a forma de crescimento da planta e tendo efeitos diretos sobre a produtividade. Ramos laterais são originados a partir de meristemas axilares, formados nas axilas de cada primórdio foliar. Uma vez formados, meristemas axilares dão origem a gemas axilares, compostas por pequenas folhas não expandidas. Dependendo do programa de desenvolvimento da planta e de condições ambientais as gemas podem permanecer dormentes ou brotarem, dando origem a um novo ramo. Diversos fatores de transcrição, fitohormônios, metabólitos e sinais ambientais já foram descritos como sendo importantes para a formação de meristemas axilares ou de regulação da atividade das gemas axilares. Dentre estes, os fatores de transcrição da família SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPLs/SBPs) regulados pelo microRNA156 (miR156) emergiram como potenciais reguladores da arquitetura vegetativa, regulando desde a formação do meristema axilar quanto à atividade das gemas. Dessa forma, neste trabalho, nós: (1) revisamos a literatura disponível sobre os principais sinais endógenos e ambientais controlando a formação de meristemas axilares e atividades das gemas axilares e; (2) estudamos o papel das SlSBPs reguladas pelo miR156 no controle da ramificação lateral em tomateiro, demonstrando uma interação entre o modulo miR156/SBP e a sinalização dos fitohormônios auxina e citocinina, além de uma possível interação com outros fatores de transcrição envolvidos na regulação da atividade de gemas axilares.

Glandular trichomes are epidermal appendages capable of producing, storing, and releasing metabolites of economic and ecological importance that, among other functions, have a fundamental role in plant defense. The developmental path of these trichomes remains unclear since most of the studies involve the model plant Arabidopsis thaliana, in which multicellular trichomes are absent. The genus Solanum has a great diversity of trichomes, especially glandular types (I, IV, VI, and VII). Wild species such as S. galapagense and S. pennellii are sources of genetic resources for tomato (S. lycopersicum) because they have natural genetic variations that provide them with greater resistance to herbivore attacks. Among these variations, there is the presence of type-IV glandular trichomes, a source of acylsugar (AS), a multifunctional substance in the herbivores control. In this work, we sought to elucidate the genetic bases that control the development of type-IV glandular trichomes, in addition to understand the relationship of this structure with herbivory resistance. For this, two introgression lines were created in which the ability of both S. galapagense and S. pennellii to develop type-IV trichomes was introgressed into the cv. Micro-Tom. In the first chapter, we explored the Galapagos enhanced trichomes (MT-Get) line, which was produced from a crossing with S. galapagense. Although the lineage had a high density of type-IV trichomes, the plants remained susceptible to whitefly (Bemisia tabaci). Analysis of GC-MS, LC-MS, and gene expression showed that the presence of type-IV trichomes was not enough for AS high production. Furthermore, MT-Get mapping-by-sequencing revealed that five chromosomal regions containing S. galapagense alleles are associated with this phenotype. Thus, these results provide the basis for understanding the development of glandular trichomes, showing their polygenic nature in S. galapagense. Besides, they also subsidize the creation of insect-resistant tomatoes from varieties with a high density of type-IV trichomes, to be later complemented by pyramidization with the metabolic pathways associated with AS production. In the second chapter, the line Pennelli enhanced trichomes (MT-Pet) was obtained. In it, a single chromosomal region of S. pennellii is related to the presence of type-IV trichomes. The plants did not show any pleiotropic traits linked to the presence of type-IV trichomes, but GC-MS analyses and Rhodamine-B assay revealed a lack of AS. Although the type-IV trichome density in MT-Pet is much lower than in MT-Get, the monogenic trait of MT-Pet may facilitate the isolation of a critical ontogenic gene, thus helping to unravel the genetic basis for the formation of glandular trichomes, a development path that is still virtually unknown. Os tricomas glandulares são apêndices epidérmicos capazes de produzir, estocar e liberar metabólitos de importância econômica e ecológica que, dentre outras funções, têm papel fundamental na defesa das plantas. A via de desenvolvimento desses tricomas ainda permanece obscura, uma vez que a maior parte dos estudos desenvolvidos envolve a planta modelo Arabidopsis thaliana, na qual os tricomas multicelulares são ausentes. O gênero Solanum possui uma grande diversidade de tipos de tricomas, em especial os glandulares (tipos I, IV, VI e VII). Espécies selvagens como S. galapagense e S. pennellii são fontes de recursos genéticos para o tomateiro (S. lycopersicum) por possuírem variações genéticas naturais que lhes conferem maior resistência ao ataque de herbívoros. Dentre essas variações, está a presença de tricomas glandulares do tipo IV, sendo eles fontes do aleloquímico acilaçúcar (AS), uma substância multifuncional no controle de herbívoros. No presente trabalho, avançou-se na elucidação das bases genéticas que controlam o desenvolvimento dos tricomas tipo IV, além de entender a relação dessa estrutura com a resistência a herbívoros. Para isso, criou-se duas linhas de introgressão nas quais a capacidade de desenvolver tricomas IV tanto de S. galapagense quanto de S. pennelli foi introgredida na cv. Micro-Tom. No primeiro capítulo, encontram-se os resultados da linhagem Galapagos enhanced trichomes (MT-Get), produzida a partir do cruzamento com S. galapagense. Embora, a linhagem tenha apresentado alta densidade de tricomas do tipo IV, as plantas continuaram suscetíveis à mosca branca (Bemisia tabaci). As análises de GC-MS, LC-MS e expressão gênica demonstraram que a presença de tricomas IV não é suficiente para alta produção de AS. Além disso, o mapeamento por sequenciamento de MT-Get revelou que cinco regiões cromossômicas contendo alelos de S. galapagense estão associadas ao fenótipo apresentado. Assim, esses resultados fornecem a base para a compreensão do desenvolvimento de tricomas glandulares, mostrando seu caráter poligênico em S. galapagense. Além disso, os resultados subsidiam a obtenção de tomateiros resistentes a insetos a partir de variedades com alta densidade de tricomas IV, a serem posteriormente complementada pela piramidação das vias metabólicas associadas à produção de AS. No segundo capítulo, a linhagem Pennelli enhanced trichomes (MT-Pet) foi obtida e analisada. Nela, uma única região cromossômica de S. pennellii está relacionada com a presença de tricomas IV. As plantas não apresentaram caracteres pleiotrópicos ligados à presença do tricoma IV e as análises de GC-MS e ensaio de Rodamina-B apontam uma ausência de AS. Embora a quantidade de tricomas IV seja bem menor que em Get, o caráter monogênico de Pet poderá facilitar o isolamento de um dos principais genes envolvidos no desenvolvimento dessa estrutura, assim contribuindo para desvendar a base genética da formação de tricomas glandulares, um via de desenvolvimento ainda praticamente desconhecida.

To deal with insect pests the tomato wild relatives produce a variety of defensive compounds in their glandular trichomes type-VI. By contrast, although cultivated tomatoes (Solanum lycopersicum L.), also display type-VI trichomes, the gland in cultivated tomato is much smaller containing mainly monoterpenes and low levels of cytosolic-derived sesquiterpenes, which have no apparent effect against insect pests. In the present work, we carried out crosses between the wild species S. habrochaites and the tomato cultivar Micro-Tom (MT) in order to create introgression lines (ILs). We successfully transferred the plastid-derived sesquiterpene pathway from S. habrochaites to type-VI trichomes of the cultivated tomato (cv. Micro-Tom). The trichomes of the introgressed line named MT-Sesquiterpene synthase 2 (MT-Sst2) showed even higher concentration of α-santalene, β-bergamotene, and α-bergamotene compared to the wild species type-VI glandular trichomes. Surprisingly, the presence of high amounts of plastid-derived sesquiterpenes was not sufficient to confer resistance to specific tomato pests in MT-Sst2. The sesquiterpene profile of MT-Sst2 and LA1777 unveils sesquiterpene-derived compounds only found in the wild species, which point for additional steps necessary to obtain insect-resistant tomatoes. This work paves the way for both the understanding of the morphology and functionality of type-VI trichomes and for breeding insect resistant tomatoes. Para lidar com insetos pragas, as espécies selvagens do tomateiro produzem uma variedade de compostos de defesas em seus tricomas glandulares do tipo-VI. Por outro lado, embora as espécies cultivadas (Solanum lycopersicum L.) também apresentem tricomas do tipo-VI, a glândula do tomate cultivado é muito menor, contendo principalmente monoterpenos e baixos níveis de sesquiterpenos derivados do citosol, que não têm efeito aparente contra os insetos pragas. No presente trabalho, realizamos cruzamentos entre a espécie selvagem S. habrochaites e a cultivar de tomate Micro-Tom (MT), afim de se criar linhas de introgressão (ILs). Transferimos com sucesso a via do sesquiterpeno derivado do plastídeo de S. habrochaites para tricomas do tipo-VI do tomate cultivado (cv. Micro-Tom). Os tricomas da linhagem introgredida denominada MT-Sesquiterpeno-sintase 2 (MT-Sst2) apresentaram concentrações ainda maiore de α-santaleno, β-bergamoteno e α-bergamoteno em comparação com os tricomas glandulares do tipo-VI da espécie selvagem. Surpreendentemente, a presença de grandes quantidades de sesquiterpenos derivados do plastídio ainda assim não foi suficiente para conferir resistência as pragas específicas de tomate no MT-Sst2. O perfil de sesquiterpeno de MT-Sst2 e LA1777 revela compostos derivados de sesquiterpeno encontrados apenas na espécie selvagen, o que aponta para a necessidade de etapas adicionais para obteção de tomate resistente a insetos. Este trabalho abre caminho para o entendimento da morfologia e funcionalidade dos tricomas do tipo-VI e para a criação de tomates resistentes a insetos.

Many characteristics of a fully developed fruit are controlled by processes that take place early in fruit development, even at floral meristem level. In fact, events that range from the transition of a vegetative into an inflorescence meristem to the last stages of fruit ripening determine characteristics of a mature fruit. Transcription factors post-transcriptionally regulated by microRNAs (miRNAs) play crucial roles in most of these stages. In such pathways, miRNAs may regulate its targets spatially, temporally, or dampen amount of targets transcript to provide optimal expression patterns for adequate organ development. Many miRNAs have been described to be essential in the regulation of flowering time, gynoecium patterning, post-pollination gynoecium growth and fruit ripening, among other stages of fruit development. Some aspects of early stages of gynoecium development, such as floral meristem maintenance, carpel fusion and gynoecium pattern, have been well studied in Arabidopsis. However, these stages are poorly understood in the development of fleshy fruit species, such as tomato. Many miRNA-related pathways were described to interact with phytohormone pathways. A good example is the interaction between miR156 and Gibberellins (GA) in the regulation of flowering time. Interestingly, this interaction is substantially different in Arabidopsis and tomato. MiR156 have been also shown to have distinct roles in controlling tomato and Arabidopsis gynoecium development. Considering this, here we: (1) review the available literature concerning control of fruit development, from gynoecium patterning to fruit ripening, by non-coding RNAs and (2) study the relationship between miR156 and GA pathways in the regulation of early stages of fruit development. We show that these pathways control floral meristem size and boundary establishment during gynoecium development and miR156 pathway modulates responses to GA. Muitas características finais deu um fruto são controladas por processos que se dão muito cedo no desenvolvimento dos frutos, até mesmo a nível de meristema. De fato, processos que vão desde a transição de um meristema vegetativo para um meristema de inflorescência até os estágios finais do amadurecimento definem muitas características do fruto maduro. Fatores de transcrição regulados pós transcricionalmente por microRNAs (miRNAs) têm papel crucial na maior parte desses estágios. Nessas vias os miRNAs geralmente regulam a expressão de seus alvos espacialmente, temporalmente, ou diminuem o acúmulo de transcritos do alvo, proporcionando níveis adequados de expressão para o desenvolvimento do órgão. Muitos estudos mostram que determinados miRNAs são essenciais no controle do tempo de florescimento, desenvolvimento do gineceu, crescimento do fruto após a polinização e amadurecimento, dentre outros estágios do desenvolvimento do fruto. Muitos aspectos do controle do desenvolvimento inicial do gineceu foram relativamente bem estudados em Arabidopsis. Porém, essas etapas iniciais do desenvolvimento de carpelos/gineceu ainda não são bem estudadas em plantas que produzem fruto carnoso, como é o caso do tomateiro. Já foi demonstrado que muitas vias reguladas por miRNAs interagem com fitormônios na regulação de vários processos de desenvolvimento. Como exemplo podemos citar a relação entre a via do miR156 e a via das giberelinas (GA) no controle do tempo de florescimento. Essa relação é substancialmente em Arabidopsis e tomateiro. Além disso, foi demonstrado que o miR156 possui papéis distintos na regulação do desenvolvimento do gineceu nessas duas espécies. Dessa forma, nesse trabalho nós: (1) fazemos uma revisão de literatura sobre a regulação do desenvolvimento de frutos, do desenvolvimento inicial do gineceu ao amadurecimento, por vias reguladas por RNAs não codantes e; (2) estudamos a relação entre as vias do miR156 e GA na regulação de etapas iniciais do desenvolvimento de frutos. Nós demonstramos que essas vivas controlam o tamanho de meristemas florais, bem como o estabelecimento de zonas de divisão no desenvolvimento do gineceu. Além disso, mostramos que a via do miR156 modula a resposta a GA.

O florescimento é um processo essencial no desenvolvimento vegetal. A mudança de fase vegetativa para reprodutiva em plantas reprograma várias vias genéticas e metabólicas fundamentais para a complementação de seu ciclo de vida. Em Arabidopsis thaliana, modelo mais estudado para o desenvolvimento floral, cinco rotas genéticas são descritas para o controle do florescimento, apresentando redundância de regulação entre essas vias. Dentre essas, a via AGE, regulada pela idade da planta, tem como seu principal efetor o microRNA156 (miR156) e os seus alvos diretos, os fatores de transcrição do tipo SBP/SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-like). Em tomateiro (Solanum lycopersicum L.), planta considerada insensível ou pouco responsiva a duas das cinco vias do florescimento (fotoperíodo e vernalização), a via AGE também controla a transição de fase vegetativa para reprodutiva. Plantas de tomateiro superexpressando o miR156 atrasam a transição de fase vegetativa para reprodutiva. Ao contrário, plantas superexpressando o florígeno SINGLE FLOWER TRUSS (SFT) aceleram a mudança de fase vegetativa para reprodutiva. Após curta exposição a baixa temperatura (16°C) o tomateiro também altera o tempo de florescimento, atrasando a transição de fase e prolongando o número de dias até a antese, tanto no cultivar determinado Micro-Tom (MT), quanto no cultivar indeterminado Ailsa Craig. Interessantemente, houve redução de número de folhas nesses cultivares quando expostos a curto período de baixa temperatura (16°C). Entretanto, a diminuição do número de folhas, que está relacionada ao plastochron, pode ter assumido funções específicas em tomateiro que não estão diretamente correlacionadas com o controle do tempo de florescimento em resposta a baixas temperaturas. A baixa oferta do florígeno SFT, em resposta a baixa temperatura, foi necessária para o atraso no tempo de florescimento das plantas, associando sua expressão a via AGE, com regulação da expressão do miR156 e do seu alvo SlSBP15, alterando o acúmulo de seus transcritos no ápice e cotilédones. Em arabidopsis, a redução da expressão de genes SPLs em plantas superexpressando o miR156 resulta em extremo atraso no florescimento e concomitante aumento da produção de folhas em resposta a baixas temperaturas, Em tomateiro, a repressão dos genes SBPs/SPLs em plantas miR156OE também promove atraso no florescimento, mas não afeta a produção de folhas em resposta a baixa temperatura, o que também é observado com o aumento de SFT e plantas p35S::SFT. Além disso, a regulação transcricional, pós-transcricional e possivelmente epigenética de alguns genes da via miR156/SPL/SBP, sugere uma complexa inter-relação entre essa via e a temperatura ambiental em tomateiro. Flowering is an essential process in plant development. The change from vegetative to reproductive phase in plants reprograms several genetic and metabolic pathways fundamental to the complementation of their life cycle. In Arabidopsis thaliana, the most studied model for floral development, there are five genetic routes described for the control of flowering, which present regulatory redundancy between them. Among these, the AGE pathway, regulated by plant age, has microRNA156 (miR156) as its main effector and the transcription factors SBP/SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-like) as its direct targets. In tomato (Solanum lycopersicum L.), plant considered insensitive or not responsive to two of the five flowering pathways (photoperiod and vernalization), the AGE pathway also controls vegetative to reproductive phase transition. Tomato plants overexpressing the miR156 delay the transition from vegetative to reproductive phase. In contrast, plants overexpressing the flowering SINGLE FLOWER TRUSS (SFT) accelerate the vegetative to reproductive phase shift. After short exposure to low temperature (16°C) the tomato also altered the flowering time, delaying the phase transition and extending the number of days until the anthesis, both in the determined Micro-Tom (MT) cultivar and in the indeterminate cultivar Ailsa Craig. Interestingly, there was a reduction in the number of leaves in these cultivars when exposed to a short period of low temperature (16°C). However, the decrease in number of leaves, related to plastochron, may have assumed specific functions in tomatoes that are not directly correlated with the control of flowering time in response to low temperatures. The low supply of the SFT florigen, in response to low temperature, was necessary for the delay in the flowering time of the plants, associating its expression to the AGE path, with regulation of the expression of miR156 and its target SlSBP15, changing the accumulation of its transcripts at the apex and cotyledons. In arabidopsis, the reduction of SPL gene expression in plants overexpressing miR156 results in extreme flowering delay and concomitant increase of leaf production in response to low temperatures. In tomato, repression of SBPs / SPL genes in miR156EE plants also promotes delay in flowering, but does not affect leaf production in response to low temperature, which is also observed with increasing SFT and p35S::SFT plants. In addition, the transcriptional, post-transcriptional and possibly epigenetic regulation of some genes in the miR156 / SPL / SBP pathway suggests a complex interrelationship between this pathway and the environmental temperature in tomato.

Os patógenos de plantas são frequentemente classificados em biotróficos, necrotróficos ou hemibiotróficos de acordo com seu mecanismo de infecção e estilo de vida e, consequentemente, respostas distintas do hospedeiro são ativadas. As respostas da planta a patógenos são reconhecidamente reguladas por hormônios vegetais. Classicamente, considera-se que a sinalização por ácido salicílico (SA) é requerida para resistência a patógenos biotróficos, enquanto que a combinação de ácido jasmônico (JA) e etileno (ET) são requeridos para a resistência a necrotróficos. Com o objetivo de identificar mutantes e/ou transgênicos hormonais que apresentassem resposta diferencial contrastante à infecção pelos patógenos necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum e biotrófico Oidium neolycopersici foi realizado um experimento com nove mutantes e transgênicos hormonais de tomateiro juntamente com o controle \'MT\'. Nesse screening foi concluído que o mutante sitiens, com reduzidos níveis de ácido abscísico (ABA), responde diferencialmente, apresentando maior suscetibilidade ao necrotrófico do que \'MT\' e resistência parcial ao fungo biotrófico. Evidências adicionais da participação do ABA nessas interações foram encontradas por meio da detecção no aumento no conteúdo de ABA em folhas de plantas inoculadas com ambos os patógenos, pelo aumento da expressão de GUS no transgênico RD29B::GUS, cujo promotor é responsivo ao ABA , e pela modulação da resistência com a aplicação exógena de 100 μM de ABA ou 2 μM de fluridone em \'MT\', em sitiens e no mutante sp12, com elevados níveis de ABA. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da via biossintética de ABA na modulação do ciclo ascorbato-glutationa de antioxidação e remoção de H2O2, e do papel do ABA na alteração do perfil transcricional e protéico em folhas de tomateiro em resposta a infecção por S. sclerotiorum ou O. neolycopersici. sitiens apresenta elevados níveis de H2O2 no apoplasto, que parece resultar em morte celular programada (PCD). A presença dessa mutação interrompe a via de biossíntese do ABA, com provável acúmulo de intermediários, ocorrendo o consumo do ascorbato pela enzima violaxantina de-epoxidase (VDE) no cloroplasto. Com isso, esse ascorbato não é transportado para o apoplasto para a remoção de H2O2, o que auxilia no acúmulo de H2O2 e a consequente indução de PCD. A análise da expressão gênica diferencial por RNA-seq permitiu observar o enriquecimento de termos associados a grupos de genes induzidos relacionados a mecanismos de autofagia em \'MT\' inoculado com S. sclerotiorum. A autofagia é um tipo distinto de PCD e pode ser vista como uma estratégia de sobrevivência para evitar a extensiva morte celular, resultando no aumento da resistência a patógenos necrotróficos, como observado em \'MT\'. A análise proteômica permitiu verificar em \'MT\' uma maior abundância relativa de proteínas relacionadas a patogênese quando inoculadas com S. sclerotiorum. As proteínas encontradas em maior abundância relativa estão relacionadas a vias de sinalização do JA e ET, degradação da parede celular de fungos e de metabólitos secundários, conferindo uma maior resistência ao \'MT\'. Na interação com O. neolycopersici, foi verificada uma maior indução dos genes de resistência em sitiens e não foi detectado o enriquecimento de termos ligados a grupos de genes de autofagia em \'MT\'. Por outro lado, a análise de proteínas revelou a participação de uma endoquitinase em sitiens com papel presumível na resistência parcial a este patógeno biotrófico. Em conclusão, a via de biossíntese de ABA pode modificar a capacidade de remoção de H2O2 e ABA pode induzir a formas distintas de morte celular e regular a expressão de genes de resistência. Plant pathogens are often classified as biotrophic, necrotrophic or hemibiotrophic according to their mechanism of infection and lifestyle and, consequently, distinct host responses are activated in each case. Plant responses to pathogens are known to be regulated by plant hormones. Classically, salicylic acid (SA) signaling is required for resistance to biotrophic pathogens, whereas the combination of jasmonic acid (JA) and ethylene (ET) are required for necrotrophic resistance. In order to identify mutant and/or hormonal transgenic plants that showed differential response to infection by the necrotrophic pathogens Sclerotinia sclerotiorum and biotrophic Oidium neolycopersici, an experiment was carried out with nine mutants and hormonal transgenic tomato plants together with the \'MT\' control. In this screen, the sitiens mutant, with reduced levels of abscisic acid (ABA), presented greater susceptibility to the necrotrophic fungus and partial resistance to the biotrophic fungus in comparison to \'MT\'. Further evidence of the participation of ABA in these interactions was given by the fact that ABA contents increased in leaves of plants inoculated with both pathogens, GUS expression increased in the transgenic RD29B :: GUS whose promoter is responsive to ABA, and resistance was modulated by the exogenous application of 100 μM ABA or 2 μM fluridone in \'MT\', sitiens and the sp12 mutant (high levels of ABA). The objective of this work was to investigate the role of the ABA biosynthetic pathway in the modulation of the ascorbate-glutathione cycle of antioxidation and H2O2 removal, and the role of ABA in altering the transcriptional and protein profile in tomato leaves in response to infection by S. sclerotiorum or O. neolycopersici. sitiens presents high levels of H2O2 in the apoplast, which appears to result in programmed cell death (PCD). The presence of this mutation interrupts the ABA biosynthesis pathway, with a probable accumulation of intermediates, with the use of ascorbate by the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE) in the chloroplast. Thus, this ascorbate is not transported to the apoplast to remove H2O2, promoting the accumulation of H2O2 and the consequent induction of PCD. In \'MT\' inoculated with S. sclerotiorum, the analysis of differential gene expression by RNA-seq revealed the enrichment of terms associated with groups of induced genes related to mechanisms of autophagy. Autophagy is a distinct type of PCD and is a survival strategy to prevent extensive cell death, resulting in increased resistance to necrotrophic pathogens, as observed in \'MT\'. Proteomic analysis showed that \'MT\' presented a greater relative abundance of proteins related to pathogenesis when inoculated with S. sclerotiorum. These proteins are related to JA and ET signaling pathways, secondary metabolites and cell wall degradation of fungi, conferring greater resistance to \'MT\'. In the interaction with O. neolycopersici, increased induction of resistance genes was observed in sitiens and no enrichment of terms linked to groups of autophagy genes in \'MT\' was detected. On the other hand, protein analysis revealed the participation of an endochitinase in sitiens with a presumed role in the partial resistance to this biotrophic pathogen. In conclusion, the ABA biosynthetic pathway can modify the H2O2 removal capacity and ABA can induce distinct forms of cell death and regulate the expression of resistance genes.

Evidence suggests that root cell walls are a target of low pH stress. Severe low pH stress causes cell death in the root tip. The walls of these cells are highly dynamic. Our hypothesis is that in these cells low pH causes stress in the cell wall due to excessive loosening. Thus, a certain level of turgor pressure should be required to cause cell death. Here, we aimed to investigate the role of the cell wall in low pH stress leading to cell death. We looked for the possible involvement of players such as class III peroxidases and ethylene signaling, which could promote changes in the cell wall and cause differential sensitivity to low pH. Arabidopsis thaliana and mutants in the genetic background of Col-0 were grown in a medium containing agar (0.8%) and half the concentration of Hoagland\'s nutrient medium. Five-day-old seedlings were exposed to low pH in a solution composed of 0.5 mM CaCl2 and 0.6 mM Homopipes buffer. Treatment of roots at pH 4.6 caused death of cells in the transition zone (TZ) and meristematic zone (MZ). However, cell death was negligible when plants were treated at pH 4.6 in an hyperosmotic solution (Ψs = -0.37 MPa), thereby decreasing cell wall tension. Also, an hypoosmotic treatment (HO) caused cell death at pH 5.8 in TZ. Cell death was accelerated when HO was performed in a low pH solution. The mutant of a cell wall integrity sensor protein, wak-1, displayed reduced cell death when exposed to low pH. Also, cell death seems to occur through a programmed cell death mechanism. Thus, low-pH induced cell death appears to be triggered by perception of cell wall stress. We examined published data to search for class III peroxidases possibly involved in cell death due to low pH. The gene for AtPrx62 is induced 8.37-fold in low pH exposed roots. The atprx62 KO mutant was less sensitive to low pH than Col-0 roots. The mRNA of AtPRX62 accumulated in the same zone that cell death occurred due to low pH. This strongly suggests that AtPRX62 is positive regulator of low-pH induced cell death. Also, ethylene pretreatment induced subsequent tolerance of roots to low pH and this was dependent of its receptor ETR1. Together we show that a cell wall stress caused by low pH causes cell death. This death was in part due AtPRX62 activity and was also suppressed by ethylene. Evidencias recentes sugerem que a parede celular é um alvo direto do estresse por baixo pH em raízes. Estresse severo por baixo pH rapidamente causa a morte de células do ápice radicular, onde a parede é altamente dinâmica. Nossa hipótese é de que nessas células, o baixo pH cause mudanças na parede celular, como afrouxamento excessivo. Assim, a pressão de turgor sobre a parede deve ser necessária para causar danos que levam à morte das células. Neste trabalho, nós investigamos o papel da parede celular no estresse por baixo pH e na consequente morte de células radiculares. Além disso, tambem foi investigado o papel de peroxidases de classe III e sinalização por etileno, que promovem mudanças na parede celular as quais podem gerar sensibilidade diferenciada a baixo pH. Plântulas de Arabidopsis thaliana e mutantes no background de Col-0 foram crescidas em meio contendo ágar (0.8%) e metade da concentração dos nutirentes do meio de Hoagland. Plântulas com 5 dias de idade foram expostas a baixo pH em uma solução composta por 0.5 mM de CaCl2 e 0.6 mM de tampão Homopipes. O tratamento de raízes a pH 4.6 causou morte em células da zona de transição (TZ) e zona meristemática (MZ). Entretanto, a morte celular foi negligível quando as plantas foram tratadas a pH 4.6 simultaneamente com a diminuição da tensão na parede celular, através de solução com potencial de - 0.37 MPa. Além disso, um choque repentino na pressão de tugor por intermédio de tratamento hiposmótico (HO) causou morte celular a pH 5.8 na TZ. A morte celular foi acelerada quando HO foi realizado em uma solução a baixo pH. A morte celular foi reduzida no mutante wak-1 exposto a baixo pH. WAK-1 é um receptor de parede que atua no sistema de monitoramento de integridade da parede celular. A morte das células provavelmente ocorreu por meio de morte celular programada. Juntos, esses dados trazem evidências que a parede celular é crucial para percepção do estresse causado por baixo pH e essa percepção possivelmente está envolvida em repostas que causam a morte celular. Nós examinamos dados publicados procurando por peroxidases classe III possivelmente envolvidas com a morte celular devido baixo pH. O gene codante para AtPRX62 foi induzido 8.37 vezes em raízes expostas a baixo pH. O mutante KO atprx62 foi menos sensível a baixo pH que raízes de Col-0. O mRNA de AtPRX62 acumulou-se na mesma zona de morte celular devido baixo pH em raízes de Col-0. Isso sugere que a atividade de AtPRX62 está relacionada com a morte celular devido baixo pH. Além disso, o pré-tratamento com etileno induziu tolerância de raízes à exposição subsequente a baixo pH. Esta indução foi dependente de sinalização via ETR1. No conjunto, nós mostramos que um estresse causado na parede celular pelo baixo pH causa a morte celular. Essa morte é em parte devido a atividade de AtPRX62 mas pode ser aliviada por etileno.

Our knowledge of the factors mediating ethylene-dependent and -independent ripening of climacteric fruit remains limited. Besides the known importance of ethylene roles, auxin has also been emerged as crucial to regulating ripening. Furthermore, the crosstalk between ethylene and auxin in tomato fruit ripening still awaits clarification. ERFs (Ethylene Responsive Factors) are transcription factors belonging to a large family acting downstream on ethylene signaling that direclty regulate ripening-related metabolisms, but their specific roles are still lacking. We present here a comprehensive expression profiling of tomato ERFs in wild-type and tomato ripening-impaired tomato mutants (Nr, rin and nor) indicating that out of the 77 ERFs present in the tomato genome, 27 show enhanced expression at the onset of ripening, while 28 display a ripening-associated decrease in expression, suggesting that different ERFs may have contrasting roles in fruit ripening. Members of subclass E, ERF.E1, ERF.E2 and ERF.E4, show dramatic down-regulation in the ripening mutants suggesting their expression might be instrumental to fruit ripening. The study illustrates the high complexity of the regulatory network interconnecting RIN and ERFs and identifies subclass E members as the most active ERFs in ethylene- and RIN/NOR-dependent ripening. Additionally, with the aim to shed more light into ethylene and auxin interplay, hormonal treatments were applied to tomato fruits and several ripening aspects were then evaluated such as the volatile profile. Overall, results elicited that auxin delay the onset of ripening further showing epistatic effects over the influence of ethylene. Several ripening-related genes, including components of the ethylene signaling, were affected by auxin suggesting potential crosstalk points between the two hormones. Moreover, ethylene appears as potentially part of the auxin regulation through inducing its conjugation. The modulation of hormone levels in tomato fruit throughout ripening can be useful to help designing approaches that both improve fruit quality and extend shelf life. O conhecimento acerca dos fatores dependentes e independentes de etileno que regulam o amadurecimento de frutos climatéricos é ainda limitado. Além da importância conhecida do etileno, a auxina também tem sido apontada como crucial para o controle do amadurecimento. Mais ainda, há poucos estudos envolvendo o crosstalk entre etileno e auxina em frutos de tomateiro. ERFs (Ethylene Responsive Factors) são fatores de transcrição que atuam nos últimos níveis da via de sinalização de etileno, regulando diretamente metabolismos associados ao amadurecimento. Contudo, seus papéis específicos ainda são desconhecidos. O presente estudo revela o perfil detalhado de expressão de ERFs em tomate selvagem e nos mutantes cujo amadurecimento é comprometido (Nr, rin e nor) indicando que dos 77 ERFs presentes no genoma, 27 apresentam aumento de expressão no início do amadurecimento, enquanto 28 apresentam redução, sugerindo que diferentes ERFs possivelmente têm papéis distintos na regulação do amadurecimento. Membros da subclasse E, ERF.E1, ERF.E2 e ERF.E4, apresentam drástica redução de expressão nos mutantes Nr, rin e nor apontando que tais fatores devem atuar fortemente no amadurecimento. O estudo ilustra também a complexidade das vias de regulação envolvendo RIN e ERFs e ainda aponta os membros da subslasse E como os mais ativos ERFs atuando nas vias etileno-dependentes e RIN/NOR-dependentes. Indo além, com o objetivo de se aprofundar no crosstalk entre etileno e auxina, tratamentos hormonais foram aplicados em frutos de tomateiro e diversos parâmetros do amadurecimento foram avaliados. De uma maneira geral, a auxina retarda o amadurecimento e ainda parece sobrepor os efeitos indutórios do etileno. Genes relacionados ao amadurecimento, incluindo genes relacionados à via de sinalização de etileno, foram afetados pela auxina sugerindo potenciais pontos de crosstalk entre os dois hormônios. O etileno ainda parece regular o metabolismo de auxina no fruto via indução de conjugação pela ativação de GH3s. Compreender o papel dos hormônios no controle da maturação é essencial para o desenvolvimento de tecnologias que visam melhorar a qualidade pós-colheita de frutos.

As plantas se defendem do ataque de patógenos através de um sistema imune composto por duas fases. A primeira delas é mediada por receptores localizados na membrana celular ou intracelularmente, os quais são conhecidos como receptores de reconhecimento padrão (do inglês, pattern recognition receptors - PRR). Esses receptores reconhecem moléculas derivadas de microrganismos, as quais são conservadas evolutivamente e são chamadas de padrões moleculares associados a patógenos (do inglês, pathogen-associated molecular patterns - PAMPs). Esse reconhecimento dispara uma resposta de defesa conhecida como PTI (do inglês, PAMP-triggerd immunity - PTI). Alguns patógenos foram aptos a sintetizar moléculas capazes de suprimir a PTI e essas moléculas são denominadas de efetores. A resposta que ocorre devido à ação dos efetores é chamada de susceptibilidade disparada por efetores (do inglês, effector-triggered susceptibility - ETS). Entretanto, plantas resistentes podem reconhecer os efetores através de proteínas de resistência localizadas intracelularmente, ativando a imunidade disparada por efetores (do inglês, effector-triggeredimmunity - ETI). De modo geral, as respostas advindas da PTI e da ETI são similares, mas a segunda é ativada mais rapidamente e é mediada por um único gene de resistência R. Por essa razão, a ETI é conhecida como uma resposta à doença qualitativa e as plantas não desenvolvem sintomas, caracterizando a interação incompatível. Por outro lado, a PTI é mediada por diversos genes e as respostas de defesa são tardias, possibilitando a disseminação do patógeno pelas células da planta e a ocorrência da doença, o que caracteriza a interação compatível. Nas respostas de defesa, moléculas como o óxido nítrico, as poliaminas e o ácido salicílico participam do processo de sinalização. O sistema antioxidante da planta é ativado de modo a mitigar os efeitos das espécies reativas de oxigênio e o metabolismo da planta é alterado. Dessa maneira, o estudo das respostas de defesa contra patógenos, pode ser uma ferramenta útil para estabelecer controles efetivos para as doenças de plantas Plants defend themselves from pathogen attack through an active immunity system composed by two phases. The first is mediated by cell surface and intracellular pattern recognition receptors (PRR), which recognizes conserved molecules derived from microbes known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). This recognition triggers a defense response called PAMP-triggered immunity (PTI). Throughout evolution, pathogens were able to synthesize molecules capable of suppressing PTI. These molecules are named effectors and they are responsible for effector-triggered susceptibility (ETS). However, resistant plants can recognize effectors by intracellular resistance (R) proteins, initiating effector-triggered immunity (ETI). In general, responses derived from PTI and ETI are the same, but the latter is activated faster and is mediated by a single R gene. For this reason, ETI-response is also known as qualitative disease response (QDR) and plants do not develop disease symptoms, characterizing the incompatible interaction. On the other hand, PTI is mediated by several genes and the defense response is delayed, enabling the pathogen to spread out and to cause disease. This interaction is known as compatible. In defense responses, molecules like nitric oxide, polyamines and salicylic acid can participate in signaling process. The antioxidant system can be activated to quench the ROS effects and the plant metabolism is altered. In this sense, studying defense responses against pathogens can help to develop tools to establish effective control methods for plant disease

Plant regeneration through de novo organogenesis is a critical step in most of the plant micropropagation and genetic transformation procedures. In the last years, significant progress has been made in the understanding of the mechanisms underlying de novo organogenesis in the worldwide crop tomato (Solanum lycopersicum). However, the hormonal and molecular factors involving the acquisition of competence for tomato shoot formation, an essential step for the regeneration process, are still not known. The failure in acquire competence can be the reason for the widely described absence of shoot regeneration from tomato root explants. In the first chapter, we conducted a temporal and hormonal characterization of the tomato acquisition of competence and the shoot induction phases using the model system cv. Micro-Tom. Regeneration was improved by pre-incubation on root-inducing medium (RIM) during the early two days in culture, a period corresponding to acquisition of competence step in cotyledon explants. Conversely, the pre-incubation on another auxin-rich condition, the callus-inducing medium (CIM), under the same period, abolished the regeneration achievement. The 2d RIM pre-treatment induced an extensive and intense endogenous auxin response in the explant, probably improving the cells competence to produce shoots under further cytokinin induction on shoot-inducing medium (SIM). This knowledge was applied to improve the Agrobacterium-mediated tomato genetic transformation procedure, leading to an efficient, simple, inexpensive and genotype-independent protocol. In the second chapter, we developed an unprecedented method for tomato shoot regeneration from root explants. The shoot organogenesis was obtained by adjusting the CIM pre-treatment to the acquisition of competence period, corresponding to the initial four days in culture for root explants. The number and quality of shoots formed were also augmented by the optimization of explants properties, medium components, and culture conditions. Taken the two chapters together, the knowledge obtained about organogenic competence advanced and created new regeneration and genetic transformation systems, which are very useful tools for biotechnology and functional studies of specific genes in tomato. A regeneração de plantas através da organogênese de novo é uma fase crítica para a maioria dos procedimentos de micropropagação e transformação genética. Recentemente, progressos significativos tem sido alcançados no entendimento dos mecanismos fundamentais à organogênese de novo de tomateiro (Solanum lycopersicum). Entretanto, fatores hormonais e moleculares envolvidos na aquisição de competência para formação de gemas caulinares na espécie, etapa essencial ao processo de regeneração, permancece desconhecido. O fracasso em adquirir competência pode ser associado a amplamente descrita incapacidade de tomateiro em regenerar brotos caulinares a partir de raízes. No primeiro capítulo, realizou-se uma caracterização temporal e hormonal das fases de aquisição de competência e indução de gemas caulinares usando a cultivar modelo Micro-Tom. A eficiência de regeneração foi melhorada através de pré-incubação em meio indutor de raízes (RIM) durante os dois primeiros dias de cultivo, período correspondente à fase de aquisição de competência em explantes cotiledonares. Diferentemente, a pré-incubação em outro meio rico em auxina, o meio indutor de calo (CIM), sob mesmo intervalo, aboliu completamente a regeneração. A pré-incubação de dois dias em RIM induziu uma intensa e extensa resposta a auxina endógena no explante, o que provavelmente aumentou a competência das células a induzir brotos caulinares em resposta a citocinina presente no meio indutor de gemas caulinares (SIM). A aplicação desse conhecimento na melhoria do procedimento de transformação genética via Agrobacteria levou a um eficiente, simples, barato e genótipo-independente protocolo. No segundo capítulo, nós desenvolvemos um método inédito de regeneração de tomateiro via explante radicular. A formação de brotos caulinares foi obtida por ajuste do pré-tratamento em CIM ao período de aquisição de competência, correspondente a quatro dias de cultivo em explantes radiculares. O número e qualidade dos brotos também foram elevados pela otimização do explante, composição do meio de cultivo, e condições de cultivo. Somando-se os dois capítulos, o conhecimento obtido a cerca da competência organogênica resultou em novos sistemas de regeneração e transformação genética, ferramentas importantes para processos biotecnológicos e estudos funcionais de genes específicos em tomateiro.

RALF é um peptídeo hormonal de aproximadamente 5kDa presente em diferentes espécies do reino vegetal regulando negativamente a expansão celular. AtRALF1 é uma isoforma específica de raiz das 37 presentes em Arabidopsis thaliana que regula negativamente o crescimento de raízes seguido de uma mobilização de Ca+2 intracelular e inibição na secreção de prótons (H+). Neste trabalho foi caraterizado a localização e tráfego intracelular do peptídeo AtRALF1. RALF is a 5kDa peptide hormone ubiquitous in different species of the plant kingdom that regulates cell expansion. AtRALF1 is a root-specific isoform of 37 present in Arabidopsis thaliana that negatively regulates root growth by intracellular calcium mobilization and inhibition of proton secretion (H+). In this work was studied the localization and intracellular trafficking of the AtRALF1 peptide.

Fortes chuvas e outros eventos climáticos podem afetar o fitness de plantas e insetos. Estudos recentes têm demonstrado que esses organismos são capazes de detectar súbitas variações da pressão barométrica que antecedem a condição climática adversa. Para os insetos, esta percepção é acompanhada de alterações comportamentais aparentemente adaptativas, como a redução do voo e chamamento para cópula. As plantas, por sua vez, respondem com a abertura dos estômatos, de maneira muito semelhante ao estresse hídrico, devido à ativação de rotas bioquímicas associadas ao ácido abscísico. O longo histórico co-evolutivo entre plantas e insetos herbívoros indica que alterações em um organismo reflete na resposta adaptativa do outro. Assim, mesmo que a variação na pressão barométrica afete apenas um dos organismos, a interação inseto-planta deve ser alterada, porém, esta abordagem nunca foi estudada. Utilizando como modelo o milho, Zea mays L. (Poales: Poaceae) e a lagarta-cartucho-do-milho, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), nós investigamos o desempenho alimentar do inseto e defesas induzidas de plantas intactas e com indução pela herbivoria frente a diferentes pressões barométricas. Para isso foram desenvolvidos dispositivos automatizados e os ensaios foram conduzidos dentro de uma câmara barométrica. As lagartas consumiram maiores áreas foliares em pressão baixa do que alta, porém o ganho de peso foi similar nas pressões testadas. Plantas intactas, danificadas pela lagarta e com aplicação do regurgito de S. frugiperda não produziram defesas induzidas pela pressão barométrica, apesar dos tratamentos com indução pelo herbívoro emitirem misturas mais complexa de voláteis comparado às plantas intactas. Além disso, plantas com indução mecânica apresentaram maiores níveis do fitohormônio ácido jasmônico. Nesse contexto, nós hipotetizamos que condições de estresse, como pressão baixa, aumentam o consumo foliar e taxa metabólica das lagartas, resultando em incremento de peso similar a condições não estressantes. Em contrapartida, plantas de milho aparentemente não utilizam a pressão como fator abiótico preditor de alterações climáticas e aumento de herbivoria. Para o melhor do nosso conhecimento, este foi o primeiro estudo a investigar os efeitos da pressão barométrica na interação planta-inseto herbívoro e os resultados obtidos podem repercutir na inclusão da pressão como fator que transmuta ensaios biológicos. Severe raining and other climatic events can affect plant and insect\'s fitness. Recent studies have shown that these organisms are able to detect sudden barometric pressure variations that generally precede an adverse climatic condition. For insects, this perception is followed by behavioral modifications that are apparently adaptive, as, for instance, the reduction in flights and the calling for mating. Plants, in turn, respond with stomata opening, similar to hydric stress, once biochemical routes associated to the abscisic acid are activated. The historical co-evolutive process between plants and herbivore insects indicate that changes in one organism reflects in the adaptive responses of the other. In that sense, even if the fluctuation of the barometric pressure has direct effects in a single organism, the insect-plant interaction may be altered. However, this approach has never been examined. Taking as models maize plants, Zea mays L. (Poales: Poaceae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) we have investigated the feeding performance and induced defences of intact and herbivore-induced plants under different barometric pressures. For that, we developed automated devices and the assays were conducted inside of a barometric chamber. The fall armyworms larvae consumed greater leaf areas under low than high pressures, but the weight gain was similar among the pressures tested. Wound-induced maize did not displayed defenses by the barometric pressure changes, although the treatments with herbivore induction have emitted more complex volatiles blends when compared to intact maize. Besides that, plants with mechanical damage presented higher levels of the phytohormone jasmonic acid. In this context, we have hypothesized that stress conditions by low pressures increase the leaf area consumption by S. frugiperda, possibly associated to higher metabolic rates of armyworms, resulting in a weight gain similar to the non-stress conditions. On the other hand, corn plants apparently do not use the barometric pressure as an abiotic predictor of climatic changes and increase of herbivory. To the best of our knowlegde this is the first study investigating the barometrtic pressure effects on plant-herbivore insect interaction. Our results may potencially impact in the inclusion of pressure as factor that reshape biological assays.

The hormonal control of tomato (Solanum lycopersicum) fruit development have been extensively studied, mainly during ripening. Notwithstanding, considerable gaps still exist in our understanding of the function and spatial-temporal distribution of hormones during fruit development. Here, we performed histochemical analysis of tomato cv. Micro-Tom transgenic lines harboring the gene reporter GUS fused to five different promoter responsive to the hormones, auxin, cytokinins (CKs), gibberellins (GAs), abscisic acid (ABA) and ethylene, in order to redefine their spatial-temporal distribution during tomato fruit development, from early pre-anthesis stages to red ripe (RR) stage. CKs levels were high during pre-anthesis, initially in placental tissues and subsequently in ovule, indicating a major function of this hormone during pre-fertilized ovary growth. At early post-fertilization stages, CKs contents were high in seeds, and afterward in the outer and inner epidermical and subepidermical layer of pericarp. High auxin content was observed, during all pre-anthesis and fruit development stages, in pedicel, suggesting a basipetal transport to the mother plant. Ethylene contents increased during pre-anthesis ovary growth. Interestingly, ethylene contents did not decrease, immediately, post-fertilization. The content of GAs and ABA was low at pre-anthesis and early post-fertilization stages, specific in placental tissues and pericarp. Conversely, these hormones accumulated mainly during cell expansion phase of fruit growth. Pollen grains that reached the stigma, post anther dehiscence, showed high content of auxin and ABA. In addition, we reported an antagonism between ethylene and GAs contents during tomato fruit development, where the level of ethylene started to decrease during the cell expansion phase of the fruit growth, moment when the level of GAs started to increase in placental tissues and pericarp. O controle hormonal do desenvolvimento do fruto do tomateiro (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) já foi extensamente estudado, principalmente no amadurecimento. No entanto, ainda existem consideráveis lacunas em nosso conhecimento da função e distribuição espaço-temporal dos hormônios durante o desenvolvimento do fruto. Foram realizados ensaios histoquímicos com cinco linhas transgênicas de tomate cv. Micro-Tom que carregavam o gene repórter GUS fusionado a cinco diferentes promotores responsivos aos hormônios, auxina, citocinina (CKs), giberelina (GAs), ácido abscísico (ABA) e etileno, com o fim de redefinir a distribuição espaço-temporal deles ao longo do desenvolvimento do fruto, desde estágios iniciais pre-anteses até o estágio red ripe (RR). Os níveis de CKs foram altos na fase pre-anteses, inicialmente na placenta e posteriormente nos óvulos, indicando um papel importante deste hormônio no crescimento do ovário, pre- fertilização. Nos estágios inicias, post-fertilização, o conteúdo de CKs foi alto nas sementes e depois nas camadas epidérmicas e subepidérmicas internas e externas do pericarpo. Alto conteúdo de auxina foi observado, durante todos o desenvolvimento do fruto, no pedicelo, sugerindo o transporte basípeto de auxina para a planta mãe. Os níveis de etileno aumentaram durante o crescimento do ovário antes da anteses. Interessantemente, o nível de etileno não diminuiu imediatamente post-fertilização. Os conteúdos de GA e ABA foram baixos prévios a anteses e nos estágios inicias pre-fertilização, especificamente na placenta e pericarpo. Inversamente, o conteúdo desses hormônios aumentou na fase de expansão celular do crescimento do fruto. Os grãos de pólen que chegaram ao stigma, post deiscência das anteras, apresentaram altos níveis de ABA e auxina. Além disso, reportamos um antagonismo entre conteúdo de etileno e giberelina durante o desenvolvimento do fruto, onde o nível de etileno começou a decrescer durante a fase de expansão celular do crescimento do fruto, momento em que o nível de giberelina começou a aumentar na placenta e pericarpo.

O aumento para demanda na produção de alimentos associado a possíveis alterações climáticas globais tem promovido um interesse renovado em pesquisas envolvendo o metabolismo fotossintético. Acredita-se que com o melhoramento fotossintético a produtividade das culturas aumente. Para se alcançar este objetivo, além do uso de práticas biotecnológicas, ainda são necessários estudos abordando as limitações intrisecas do processo fotossintético que possam contribuir com a identificação de alvos para a engenharia genética. Neste contexto, esta tese aborda perguntas especificas sobre a regulação da fotossíntese C4 pela nutrição nitrogenada, o deficit hídrico e a interação destes dois fatores. No primeiro capítulo experimental foi desenvolvido um estudo envolvendo os efeitos da nutrição nitrogenada na difusão interna de CO2. Foi observado que o conteúdo de nitrogênio (N) foliar é determinante para a condutância interna de CO2 (? 18O-gm). Um menor conteúdo de N induz reduções iniciais em ? 18O-gm devido menor atividade das enzimas carboxilativas. Conforme o conteúdo de N reduz em folhas mais velhas alterações na antomia passaram a contribuir com a regulação de ? 18O-gm. No segundo capítulo, foi explorada a variação genotipica de cana-de-açúcar quanto a parâmetros relacionados a fotossíntese e o nitrogênio foliar, envolvendo a eficiência de uso de nitrogênio fotossintética (PNUE) e índices de herdabilidade. A variabilidade dos materiais genéticos foi explicada principalmente pelos parâmetros de trocas gasosas que contribuíram com o agrupamento dos materiais em três grupos. A partir deste agrupamento é possível verificar as diferenças entre os materiais em reposta a nutrição nitrogenada. Além disto, parâmetros de trocas gasosas como a taxa de assimilação de CO2 e condutância estomática junto com PNUE apresentaram altos índices de herdabilidade no sentido restrito. Por fim, o terceiro capítulo investigou a regulação do metabolismo de assimilação de CO2 em resposta ao deficit hídrico em folhas de cana-de-açúcar e como o metabolismo de nitrogênio está envolvido neste processo. Diferentes fatores envolvidos na regulação negativa da fotossíntese foram identicados. Interesantemente, alterações nos componentes nitrogenados só contribuíram com a inibição metabólica na fase de estresse severo. Adicionalmente foi observado que a superação da inibição metabólica durante a reidratação é mais rápida quando a cultivar apresenta decréscimos mais lentos no metabolismo de N no período de seca, associado a menores danos na capacidade fotossintética. Increased demand for food production and the possibility of global climate change has promoted renewed interest in photosynthesis research. It is expected that with the photosynthetic improving the crop productivity increase. For this, besides of the use of biotechnological practices, further studies are needed about intrinsic limitations of the photosynthetic process that can contribute to the identification of targets for genetic engineering. In this context, this thesis discusses specific questions about photosynthesis regulation C4 by nitrogen nutrition, water deficit and the interaction of these two factors. In the chapter I, it was developed a study of the effects of nitrogen nutrition in the internal diffusion of CO2. It was observed that the leaf nitrogen (N) is essential for the internal CO2 conductance (Δ 18O-gm). A lower leaf N induces initial reductions in Δ18O-gm by lower activity of the carboxylation enzymes. With N leaf reduction in older leaves anatomy changes began to contribute to the regulation of Δ18 O-gm. In the chapter II, the genotypic variation of sugarcane to photosynthetic parameters and leaf nitrogen was explored, involving the photosynthetic nitrogen use efficiency (PNUE) and heritability analysis. The variability of the genetic material is explained mainly by gas exchange parameters that contributed to the grouping of materials into three groups. From this, it is possible examine the differences between the materials in response to nitrogen nutrition. Furthermore, gas exchange parameters such as CO2 assimilation rate and stomatal conductance along with PNUE showed high heritability in the narrow sense. Finally, the chapter III investigated the regulation of CO2 assimilation metabolism in response to water deficit sugarcane leaves and how nitrogen metabolism is involved in this process. Different factors involved in the negative regulation of photosynthesis were identified. Interestingly, changes in nitrogen components only contributed to metabolic inhibition in severe stress. Additionally it noted that overcoming metabolic inhibition during rehydration is faster when the cultivar presents slower decreases in N metabolism during water deficit, associated with less damage to the photosynthetic capacity.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) desempenha um papel de grande importância no cenário socioeconômico brasileiro, e representa 42% da matriz energética renovável do país. A expansão da área de cultivo da cana-de-açúcar para solos marginais e a necessidade de manutenção da alta produtividade dessa cultura tem levado à maior aplicação de fertilizantes a base de nitrogênio (N). Tal fato aliado à baixa responsividade da cana-de-açúcar a fertilizantes nitrogenados acarreta altos custos econômicos e ambientais. O amônio é a fonte preferencial de N para essa gramínea, sendo que pouco se conhece sobre a funcionalidade dos transportadores de NH4+ pertencentes à família gênica AMT (AMMONIUM TRANSPORTER). Neste contexto, é relevante esclarecer os mecanismos que influenciam na eficiência do uso de N (NUE), visando reduzir o impacto econômico e ambiental da aplicação dos fertilizantes nitrogenados nos sistemas agrícolas. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional de membros da subfamília AMT2 de cana-de-açúcar através de expressão heteróloga em mutantes de Saccharomyces cerevisiae (cepa 31019b) e Arabidopsis thaliana (qko), defectivos no transporte de amônio. As sequências gênicas e promotoras de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A foram identificadas em biblioteca de BAC (bacterial artificial chromosome) de cana-de-açúcar (cultivar \'R570\'). Análises de expressão gênica de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A em cana-de-açúcar demonstraram uma expressão preferencial em raízes e em folhas maduras, respectivamente, e que estes genes são regulados de maneira distinta entre si e entre os órgãos, de acordo com o desenvolvimento e com o status de N da planta. A complementação de levedura com os AMT2 de cana-de-açúcar demonstrou que estes genes restauram o crescimento do mutante, sendo que ScAMT2;1 permite maior absorção de amônio; porém o experimento não indicou sensibilidade dessas proteínas ao metilamônio (análogo tóxico ao amônio). Experimentos de localização da expressão órgão/tecido específico em arabidopsis selvagem \'Col-0\', utilizando os promotores de ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A fusionados a GUS ou GFP, demonstraram que esses AMTs são preferencialmente expressos na região da endoderme/periciclo e vascular das células das raízes e região vascular da parte aérea, sendo regulados pela disponibilidade e fonte de N. Plantas de arabidopsis qko superexpressando ScAMT2;1, ScAMT3;3A ou transformadas com ScAMT2;1 dirigido por seu promotor endógeno, crescidas in vitro com amônio como fonte exclusiva de N, apresentaram um aumento significativo na produção de biomassa em relação a qko não transformada, principalmente para ScAMT2;1, indicando que essas proteínas são capazes de transportar amônio e complementar o mutante. Dados de influxo e acúmulo de 15N-amônio in vivo em raízes e parte aérea de plantas qko superexpressando ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A demonstraram que ScAMT2;1 atua na absorção de amônio pelas raízes e provavelmente do carregamento do xilema, enquanto ScAMT3;3A está possivelmente envolvida na remobilização de amônio na parte aérea, podendo atuar aditivamente na absorção de NH4+ em raízes sob alto amônio. Esses resultados indicam que os transportadores ScAMT2;1 e ScAMT3;3A de cana-de-açúcar são funcionais, atuando com propriedades e funções distintas no transporte de amônio nessa gramínea e de acordo com a disponibilidade de N. Sugarcane (Saccharum spp.) plays a major role in the Brazilian socio-economic scenario, and represents 42% of renewable energy sources in the country. The expansion of sugarcane cultivation to marginal lands and the requirement to maintain high yields have led to increased application of nitrogen (N) fertilizer. This fact, coupled with the low response of sugarcane to N fertilization, entails high economic and environmental costs. Ammonium is the preferred source of N by this grass; however, little is known about the functionality of NH4+ transporters belonging to the AMT gene family (AMMONIUM TRANSPORTER). In this context, it is important to clarify the mechanisms that affect the nitrogen use efficiency (NUE) in order to reduce the economic and environmental impact of the application of N fertilizers in agricultural systems. Therefore, this study aimed to conduct the molecular and functional characterization of members of the AMT2 subfamily from sugarcane by heterologous expression in mutants of Saccharomyces cerevisiae (strain 31019b) and Arabidopsis thaliana (qko), both defective in ammonium transport. Gene and regulatory region sequences of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A were identified in a bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugarcane (cultivar \'R570\'). Expression analysis of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A in sugarcane showed a preferential expression in roots and mature leaves, respectively, and indicated a distinct expression pattern between genes and organs according to the ontogeny and the N status of the plant. The yeast complementation with AMT2 of sugarcane demonstrated that these genes restore the mutant growth, with ScAMT2;1 enabling higher ammonium absorption; however, the experiment did not indicate sensitivity to methylammonium (toxic ammonium analog). Arabidopsis wild type \'Col-0\' transformed with the promoter region of ScAMT2;1 or ScAMT3;3A directing the expression of GUS or GFP, demonstrated preferential expression in the endodermis/pericycle regions of roots and vascular region in shoots, being regulated by the availability and source of N. Arabidopsis qko overexpressing ScAMT2;1, ScAMT3;3A or transformed with ScAMT2;1 driven by its endogenous promoter, grown in vitro with ammonium as the sole source of nitrogen, showed a significant increase in biomass production compared to untransformed qko, especially for ScAMT2;1, indicating that these proteins are capable of transporting ammonium and complementing the mutant. Data of 15N-ammonium influx and accumulation in vivo in roots and shoots of qko plants overexpressing ScAMT2;1 or ScAMT3;3A showed that ScAMT2;1 acts in ammonium uptake by roots and probably in the xylem loading, while ScAMT3;3A is possibly involved in ammonium remobilization in shoots, and may act additively in the absorption of NH4+ in roots under high ammonium. These results indicate that ScAMT2;1 and ScAMT3;3A from sugarcane are functional, working with distinct properties and functions in ammonium transport according to the availability of N

The study of natural genetic variations affecting organogenic capacity in tomato (Solanum lycopersicum) is attractive due to the existence of several tomato wild relatives with enhanced organogenic capacity. The characterization of such variations is relevant not only in order to manipulate plant development, but also to understand its ecological and evolutionary significance. The objective of this work was to characterize three tomato loci whose alleles from the wild relative S. pennellii enhance in vitro shoot and root regeneration, and analyze their involvement in the acquisition of competence phase. In the first manuscript, we report the genetic and physiological characterization of the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F. The S. pennellii alleles were introgressed into the tomato genetic model cv. Micro-Tom (MT), creating the near isogenic lines (NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H and MT-Rg8F. In the second manuscript we present a comparative analysis between the Near-Isogenic Lines (NILs) MT-Rg3C and MT-Rg1. Since Rg1 was proposed to be a key gene in the acquisition of competence, and was mapped in the chromosome three, it is believed that Rg3C is probably equivalent to the Rg1 allele from S. peruvianum. After the introgression of the loci into the MT background, the NILs presented enhanced regeneration of both roots and shoots, confirming that the loci were successfully introgressed. The analysis of the time for acquisition of competence and induction, together with the molecular characterization of the NILs, indicate that the genes present in the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F affect in vitro regeneration by distinct pathways. While Rg3C decreased the time required for both acquisition of competence and induction, the other loci seem to influence only the time of acquisition of competence, in the case of Rg8F, or the time of induction, in the case of Rg7H. Additionally, although MT-Rg3C has an enhanced shoot branching phenotype, MT-Rg7H and MT-Rg8F did not differ from MT in this trait. This indicates that enhanced in vitro shoot formation in tomato is not necessarily related to a deleterious high branching phenotype. Comparative analyses of MT-Rg1 and MT-Rg3C strongly indicate that Rg1 and Rg3C are alleles of a same gene controlling regeneration capacity. Integrating Rg1 and Rg3C mapping information, we were able to narrow the number of candidate genes for Rg1/Rg3C to only 27, which were also analyzed and discussed. O estudo de variações genéticas naturais afetando a capacidade de organogênese in vitro em tomateiro (Solanum lycopersicum) é promissor devido a existência de uma série de espécies selvagens relacionadas ao tomateiro, que apresentam alta capacidade organogênica in vitro. A caracterização de tais variações é relevante não apenas com o objetivo de manipulação do desenvolvimento vegetal, mas também com o intuito de entender o significado ecológico e evolutivo de tal característica. O objetivo desse trabalho foi caracterizar três loci de tomateiro, cujos alelos vindos de seu parente selvagem S. pennellii aumentam a capacidade de regeneração de gemas caulinares e radiculares in vitro, e analisar o envolvimento de tais loci na fase de aquisição de competência para regeneração. Nós apresentamos no primeiro capítulo a caracterização genética e fisiológica dos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F. Os alelos de S. pennellii foram introgredidos na cultivar modelo Micro-Tom (MT), criando as linhagens quase isogênicas (Near Isogenic Lines - NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H e MT-Rg8F. No segundo capítulo nós analisamos comparativamente as NILs MT-Rg3C e MT-Rg1. Uma vez que Rg1 foi proposto como gene chave na aquisição de competência, e assim como Rg3C está localizado no cromossomo 3, acredita-se que Rg3C seja provavelmente ortólogo ao gene Rg1 de S. peruvianum. Após a introgressão dos loci na cultivar MT, as NILs, assim como esperado, apresentaram alta taxa de regeneração tanto de gemas caulinares, quanto de radiculares in vitro, confirmando que os loci foram devidamente introgredidos. A análise do tempo de aquisição de competência e indução, juntamente com a caracterização molecular das NILs, indicam que os genes localizados nos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F afetam a regeneração in vitro através de rotas distintas. Enquanto Rg3C diminui o tempo necessário tanto para a aquisição de competência quanto para indução de gemas caulinares, os outros dois loci parecem influenciar apenas a aquisição de competência, no caso de Rg8F, ou a indução de gemas caulinares, no caso de Rg7H. Além disso, apesar de MT-Rg3C apresentar alta ramificação, MT-Rg7H e MT-Rg8F não diferiram de MT nesse aspecto, o que evidencia que a formação de gemas caulinares in vitro não está necessariamente relacionada ao aumento da ramificação. As análises comparativas entre MT-Rg3C e MT-Rg1 indicam fortemente que Rg1 e Rg3C sejam dois alelos de um mesmo gene controlando a alta capacidade de regeneração. Através do cruzamento dos dados de mapeamento disponíveis para esses dois alelos foi possível diminuir o número de genes candidatos à Rg1/Rg3C para apenas 27 genes, que são apresentados nesse trabalho.

Salinity is a challenge for crop productivity. Hence, plants exposed to saline environments reduce their vegetative and reproductive growth due to adverse effects of specific ions on metabolism and water relations. In order to cope with salinity, plants display physiological mechanisms based on three main aspects: i) source-sink relationships, ii) resource allocation and iii) alterations in endogenous hormone levels. The roles of developmental and hormonal mechanisms in salt response were investigated here. We employed mutants and transgenic tomato plants affecting different aspects of plant development and hormone response in the same genetic background (cultivar Micro-Tom). The following genotypes were used: Galapagos dwarf (Gdw), Lanata (Ln), lutescent (l), single flower truss (sft), sft heterozygous (sft/+), diageotropica (dgt), entire (e), Never ripe (Nr), epinastic (epi), procera (pro), notabilis (not), anti sense Chloroplastic carotenoid cleavage dioxygenase 7 (35S::asCCD7) and Salicylate hydroxylase (35S::nahG). Among the developmental genotypes studied, sft and l, involved in flower induction and senescence, respectively, were less affected when exposed to salt stress. Although l is considered deleterious due to its precocious senescence, it presented greater shoot biomass and leaf area during salinity. The heterozygous sft/+, whose high productivity was recently linked to an improved vegetative-to-reproductive balance, changed this balance and lowered its yield more than the control MT upon salt treatment. In the analysis of genotypes affecting hormonal status/signaling four kinds of salt responses among the genotypes were observed: i) High shoot growth in spite of high Na:K ratio presented by the strigolactone deficient and high branching CCD7 transgene; ii) High shoot growth and reduced accumulation of Na in tissues (probably due to dilution) presented by the auxin constitutive response e mutant; iii) The opposite response observed in \"ii\" presented by the low auxin sensitivity dgt mutant and iv) growth inhibition combined with reduced levels of Na and higher accumulation of K presented by the not mutant, which produces less ABA. Taken together, the results presented here points to novel developmental mechanisms, such as the promotion of moderate senescence and vegetative growth, and hormonal imbalances to be explored in the pursuing of crops resistant to salt stress. A salinidade é um desafio para a produtividade agrícola, uma vez que plantas expostas à salinidade tem o crescimento vegetativo e reprodutivo reduzido devido aos efeitos adversos de íons específicos no metabolismo e nas relações hídricas. A fim de lidar com a salinidade, as plantas desempenham mecanismos fisiológicos baseados em três principais características: i) relações fonte-dreno; ii) alocação de reservas e iii) alterações nos níveis endógenos de hormônios. Nesse trabalho, investigamos a relação entre os processos de desenvolvimento e de regulação hormonal com a resposta à salinidade. Para tanto foram usados genótipos de tomateiro com alteração em diferentes vias de desenvolvimento e de produção ou sinalização de hormônios vegetais. Os seguintes genótipos foram usados: Galapagos dwarf (Gdw), Lanata (Ln), lutescent (l), single flower truss (sft), sft heterozygous (sft/+), diageotropica (dgt), entire (e), Never ripe (Nr), epinastic (epi), procera (pro), notabilis (not), anti sense Dioxigenase cloroplastídica de carotenoide 7 (35S::asCCD7) e Salicilato hidroxilase (35S::nahG). Entre os genótipos de desenvolvimento estudados, sft e l, relacionados à menor indução floral e senescência respectivamente, foram os menos afetados quando expostos à salinidade. O genótipo l acumulou maior biomassa e área foliar, apesar de ser considerado deletério devido à senescência precoce. As plantas heterozigotas, sft/+, cuja maior produtividade foi recentemente relacionada a um melhor balanço vegetativo/reprodutivo, alteraram esse balanço sob salinidade e reduziram sua produtividade mais que o controle MT sob estresse salino. Na análise dos genótipos com alteração hormonais foram observados quatro tipos de respostas à salinidade: i) elevado crescimento da parte aérea, apesar da razão Na:K ser alta no genótipo CCD7 cujo transgene induz deficiência de estrigolactona e excessiva ramificação; ii) elevado crescimento e acúmulo reduzido de Na nos tecidos (devido provavelmente a diluição) apresentada pelo mutante de resposta constitutiva a auxina e; iii) o oposto da resposta anterior foi apresentado pelo mutante pouco sensível à auxina , dgt; iv) inibição do crescimento combinado com nível reduzido de Na e alto acúmulo de K apresentada pelo mutante not que produz menos ácido abscísico. Considerados em conjunto, os resultados apresentaram temas para novos mecanismos de desenvolvimento, como a promoção moderada de senescência e do crescimento vegetativo além dos desbalanços hormonais, para serem explorados na busca de culturas resistentes ao estresse salino.

O E. grandis x E. camaldulensis possui características favoráveis de adaptação à seca, conferidas pelo E. camaldulensis e qualidade da madeira para papel e celulose, conferida pelo E. grandis. Esta adaptação à seca está relacionada a fatores fisiológicos e também moleculares, expressos em sua proteoma e metaboloma, que se alteram na presença do estresse. Objetiva-se neste trabalho estudar as respostas fisiológicas, proteômicas e metabolômicas (metabólitos primários) diferencialmente expressos em folhas de Eucalyptus submetidas ao déficit hídrico. Dois genótipos de E. grandis x E. camaldulensis, sendo um tolerante (T) e um susceptível (S) ao déficit hídrico foram submetidos à 100% e 30% da capacidade de campo (CC), para as plantas bem irrigadas e as em déficit hídrico, respectivamente. Os tratamentos foram chamados de T100, T30, S100 e S30 para os diferentes genótipos, T e S, submetidos a diferentes CC, 100% e 30%. Estas plantas foram avaliadas fisiologicamente com auxílio do equipamento Infrared Gas Analyzer (IRGA). Foram empregadas técnicas de proteômica quantitativa, label-free e shotgun, através do uso de UPLC-MSE. O estudo de metabolômica ocorreu através da utilização do GC x GC-TOF/MS. Os dados de proteômica foram processados no programa Protein Lynx Global Server (PLGS) e ExpressionE, através das análises comparativas S100 vs S30 e T100 vs T30, e dos metabólitos primários nos programas ChromaTOF e MetaboAnalyst. Foi possível observar que o T100 apresentou menor taxa fotossintética e condutância estomática do que o S100. Ambos os genótipos apresentaram taxas fotossintéticas e condutância estomática muito menores a 30% da CC do que a 100% da CC. A análise proteômica identificou um total de 397, 305, 366, 309 proteínas nos tratamentos S100, S30, T100 e T30 respectivamente. As análises comparativas por PLGS constataram que houve um aumento no número de proteínas diferencialmente expressas na presença do déficit hídrico. Cinco processos biológicos que apresentaram um aumento no número de proteínas diferencialmente expressas na presença do déficit hídrico foram: homeostase celular, fotossíntese, resposta ao estímulo abiótico, resposta ao estresse e morte celular. Três vias biológicas que apresentaram a participação de muitas enzimas identificadas, relacionadas a processos fotossintéticos, foram: fixação de carbono em organismos fotossintéticos, ciclo TCA e glicólise/gluconeogênese. O déficit hídrico diminuiu o número de proteínas diferencialmente expressas relacionadas ao processo metabólico de compostos contendo bases nucleares, regulação biológica e processo biossintético, que estão relacionados ao crescimento, desenvolvimento e manutenção dos processos vitais das plantas. Em relação à análise metabolômica foram identificados um total de 93, 94, 90 e 91 metabólitos primários nos tratamentos S100, S30, T100 e T30, respectivamente. Utilizando o programa Metaboanalyst, foi possível identificar os 15 metabólitos que mais contribuíram para a separação dos tratamentos, com maiores \"VIP scores\", sendo alguns responsivos ao déficit hídrico. A via da purina e arginina foi identificada como a mais frequente dentre os metabólitos identificados com VIP score ≥ 1,5. The E. grandis x E. camaldulensis has favourable characteristics of adaptation to drought, conferred by E. camaldulensis and quality of wood for pulp and paper, conferred by E. grandis. This adaptation to drought is related to physiological factors and also expressed in their molecular proteome and metabolome, which change in the presence of stress. The aim of this work was to study the physiological responses, proteomics and metabolomics (primary metabolites) differentially expressed in leaves of Eucalyptus under drought. Two genotypes of E. grandis x E. camaldulensis, a tolerant (T) and a susceptible (S) to drought stress, were subjected to 100% and 30% of field capacity (FC), for the well-watered plants and drought stressed plants, respectively. The treatments were called T100, T30, S100 and S30 for different genotypes, T and S, submitted to different FC, 100% and 30%. These plants were evaluated physiologically using the Infrared Gas Analyzer (IRGA). Label-free and shotgun quantitative proteomics were realized using UPLC-MSE. The metabolomics study was carried out using GC x GC-TOF/MS mass spectrometer. The proteomics data were processed using the Protein Lynx Global Server program (PLGS) and ExpressionE program, through comparative analyses S100 vs S30 and T100 vs S30, and primary metabolites in ChromaTOF and MetaboAnalyst programs. It was observed that T100 had lower photosynthetic rate and stomatal conductance than S100. Both genotypes showed stomatal conductance and photosynthetic rates lower at 30% of FC than at 100% of FC. The proteomic analysis identified a total of 397, 305, 366, 309 proteins in the treatments S100, S30, T100 and T30 respectively. Comparative PLGS analyses showed an increase in the number of differentially expressed proteins under drought stress. The five biological processes that showed an increase in the number of differentially expressed proteins under drought stress were: cellular homeostasis, photosynthesis, response to abiotic stimulus, response to stress and cell death. The three biological pathways that had the participation of many identified enzymes, which are related to photosynthetic processes, were: carbon fixation in photosynthetic organisms, TCA cycle and glycolysis / gluconeogenesis. The drought reduced the number of differentially expressed proteins related to the metabolism of compounds containing nuclear bases, biological regulation and biosynthetic process, which were related to growth, development and maintenance of the vital processes of plants. The metabolomic analysis identified a total of 93, 94, 90 and 91 primary metabolites in the treatments S100, S30, T100 and T30, respectively. Using Metaboanalyst program, it was possible to identify 15 metabolites that contributed to the separation of treatments with higher \"VIP scores\", some of these are responsive to drought. The purine and arginine pathway was identified as the most frequent among the metabolites identified with VIP score ≥ 1.5.

A incidência de doenças crônicas atinge índices epidêmicos, sendo responsável por mais de 60% da mortalidade mundial. Medidas preventivas são adotadas e, entre elas, uma alimentação balanceada. Nesta inclui-se o consumo de frutos e vegetais, especialmente os de coloração vermelha e laranja, ricos em carotenoides, fitonutrientes que muitas vezes assumem papel de antioxidantes, prevenindo a incidência destas doenças. No presente trabalho foram obtidas linhagens quase isogênicas (NILs) de tomateiro contendo os alelos at, B, Del, gf, og, r, t e y, os quais afetam a composição de carotenoides. Tais linhagens constituem uma importante ferramenta para estudos de nutracêutica, como os testes de biodisponibilidade de diferentes tipos de carotenoides no plasma sanguíneo, após ingestão, o que foi testado no presente trabalho através do emprego de HPLC e ratos da linhagem Wistar. Além disso, frente às diferentes ofertas de cores e composições metabólicas de tomates disponíveis no mercado, as NILs permitiram o ajuste de parâmetros de colorimetria como um método rápido para identificar os principais mutantes da via de biossíntese de carotenoides presentes em linhagens comerciais. Ressalta-se que, muitas vezes as cores podem enganar e não trazer vantagens nutricionais, como é o caso do consumo de linhagens comerciais contendo a mutação yellow flesh (r). Por fim, as NILs foram utilizadas para verificar se as mutações alterando a composição de carotenoides possuíam alguma penalidade em termos de produtividade ou outros parâmetros de qualidade de fruto (Teor de Sólidos Solúveis, acidez). Os resultados mostraram-se de aplicabilidade e geraram um banco de dados passível de expansão, para novos mutantes que alterem a cor do tomate e fazendo uso de outros backgrounds. Tais dados podem ser usados tanto para programas de melhoramento visando a qualidade nutricional, quanto para o comércio atacado, beneficiando o consumidor final. The incidence of chronic disease reaches epidemic levels, accounting for over 60% of global mortality. Preventive measures are adopted, and among them, a balanced diet. This includes the fruits and vegetables consumption, especially the red and orange ones, rich in carotenoids, phytonutrients which often assumes the role of antioxidants preventing these diseases incidence. In this study, tomato near isogenic lines (NILS) containing the alleles B, Del, gf, og, r, t and y, were obtained, affecting the carotenoid fruit content. Such lines are an important tool for nutraceutical studies, like different carotenoids bioavailability tests in blood plasma after ingestion, which was tested in this work by HPLC employment and Wistar rats. Moreover, in the face of different colors and metabolic contents offerings of tomatoes available at the market, NILs allowed the adjustment of colorimetric parameters as a fast way to identify carotenoids biosynthetic pathway key mutants present in commercial strains. It is highlighted that many times colors can mislead and not bring nutritional benefits, like the consumption of commercial strains containing the mutation yellow flesh (r). At the end, NILs were used to verify if the carotenoid content mutations had some penalty in terms of productivity or other fruit quality parameters (Soluble Solids Content, acidity). The results showed relevant and generated a database capable of expansion to new fruit color tomato mutants even in other genetic backgrounds. Such data can be used both for nutritional quality breeding programs, both for the wholesale trade, benefiting the end user.

Atualmente, o HLB é considerado a principal doença que acomete as plantas cítricas. Diante desse fator, pesquisas por cultivares resistentes a esta doença são necessárias. A transformação genética via Agrobacterium, juntamente com o uso de plantas modelos, tem sido uma alternativa para verificação do funcionamento dos genes em resposta a patógenos, isto porque as plantas modelos possuem como característica ciclo de vida curto e alto poder de regeneração. Assim sendo, objetivou-se com o presente trabalho, a transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, de tomate Micro-Tom (Solanum lycopersicum L.) e de laranja doce, com os genes que codificam as proteínas PR-8 e CDR-1, isolados a partir de Citrus simensis. Os cotilédones provenientes de sementes germinadas in vitro de tomate Micro-Tom foram utilizados como fonte de explante para os experimentos de transformação genética com os genes PR-8 e CDR-1. Esses explantes foram subcultivados até o aparecimento de brotos regenerantes e posteriormente plantas transgênicas, as quais foram aclimatizadas e levadas a casa-de-vegetação. A transgenia foi confirmada por PCR e o número de inserções do gene por Southern blot. As plantas foram cultivadas até a obtenção da geração T1. Simultaneamente, foram realizados experimentos de transformação genética em segmentos de epicótilo, provenientes de sementes de laranja ‘Hamlin’ germinadas in vitro, com o gene CDR-1, a fim de se obter plantas transgênicas e sua caracterização. Paralelamente, foi realizada a construção da curva padrão pela análise de qPCR para identificação de Pseudomonas syringae pv. tomato. Foram obtidas treze plantas transgênicas de tomate Micro-Tom com o gene PR-8 e três com o gene CDR-1. As eficiências de transformação foram em torno de 0,38 a 1,98%. Três plantas de tomate Micro-Tom transgênicas com o gene PR-8 foram caracterizadas por Southern blot e o número de inserções variou de 1 a 3. Dezenove plantas transgênicas de laranja ‘Hamlin’ com o gene CDR-1 foram obtidas através dos experimentos de transformação genética. A eficiência de transformação foi de 2,06 a 5,96%. Dessas, apenas uma foi caracterizada por Southern blot apresentando 1 número de cópia do DNA no genoma da planta. HLB is currently considered the main disease affecting citrus plants. Given this factor, research for cultivars resistant to this disease is needed. Genetic transformation via Agrobacterium with the use of model plants has been an alternative for checking the gene function in response to pathogens, because these model plants have as characteristic a short life cycle and high power of regeneration. Therefore, the aim of this work was to produce transgenic plants, via Agrobacterium tumefaciens, of Micro-Tom tomato (Solanum lycopersicum L.), and sweet orange, with the genes encoding the PR-8 and CDR-1 proteins isolated from Citrus sinensis. The cotyledons from in vitro germinated Micro-Tom tomato seeds were used as explants source for genetic transformation experiments with PR-8 and CDR-1 genes. These explants were subcultured until the appearance of regenerating shoots and after transgenic plants, which were acclimatized and taken to a greenhouse. The transgenic plants were confirmed by PCR and the number of gene insertions by Southern blot. The plants were grown until T1 generation was obtained. Simultaneously genetic transformation experiments were performed with epicotyl segments from \'Hamlin\' sweet orange seeds germinated in vitro with CDR-1 gene in order to obtain transgenic plants and their characterization. Simultaneously, the standard curve construction was performed by qPCR analysis for identification of Pseudomonas syringae pv. tomato. Thirteen transgenic plants of Micro-Tom tomato with PR-8 gene and three with CDR-1 gene were obtained. The transformation efficiencies were around 0,38 to 1,98%. Three transgenic plants of Micro-Tom tomato with PR-8 gene were characterized by southern blot, and the number of inserts ranged from 1 to 3. Nineteen transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants with CDR-1 gene were obtained through genetic transformation experiments, and the transformation efficiency was 2,06 to 5,96%. One plant was characterized, by Southern blot and has one DNA copy number in the plant genome.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

Considerando (1) a importância da bananicultura no Vale do Ribeira, (2) o destaque da Mata Atlântica no contexto da conservação da fauna e flora mundial, (3) a necessidade da adoção de práticas agrícolas alternativas mais eficientes do ponto de vista ambiental e econômico, (4) o papel dos hormônios etileno, acido indol-3-acético (AIA) e ácido abscísico (ABA) no contexto das respostas dos vegetais a diferentes condições ambientais e nos atributos de qualidade da banana, (5) a falta de metodologias otimizadas para a extração de compostos fenólicos solúveis totais (CFST) em bananeiras e (6) a importância do estudo da relação entre os CFST e fatores de estresse, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da proximidade do fragmento florestal de Mata Atlântica com a área de cultivo da banana (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) sobre o amadurecimento da fruta e os CFST em folhas de bananeiras, além de otimizar uma técnica para a extração destes últimos. Foi observado que bananas colhidas próxima ao fragmento florestal apresentam vida-verde (período compreendido entre a colheita do fruto e o início do seu amadurecimento) maior quando comparados a frutos com a mesma idade fisiológica, porém colhidos em áreas sem a influência da floresta nativa. Este fato pode ser explicado, pelo menos em parte, pela diferença nos perfis de etileno, ABA e AIA ao longo do amadurecimento das bananas provenientes das diferentes áreas, que também influenciam no metabolismo amido-sacarose. Quanto aos CFST nas folhas, foi observado que a utilização de acetona 80% em água (v/v) e posterior emprego de hexano para a remoção do excesso de clorofilas é capaz de obter um bom rendimento de extração de CFST, sem extrair compostos que interferem significativamente no método de Folin-Ciocalteu. Além disso, a utilização da metodologia otimizada mostrou que bananeiras podem apresentar diferenças na sua composição de fenólicos quando influenciadas ou não pela presença de biodiversidade. Assim, a avaliação dos CFST em folhas pode fornecer informações importantes sobre as condições ambientais da planta. Considering (1) the importance of banana production in Ribeira Valley, (2) the Atlantic Rainforest in the context of fauna and flora conservation, (3) the need for the adoption of more sustainable agricultural practices, (4) the ethylene, indole 3-acetic acid and abscisic acid responses in acclimation mechanisms of plants and in the quality attributes of the banana, (5) the lack of methodologies optimized for the extraction of total soluble phenolics compounds (TSPC) in banana leaves and (6) the importance of the relationship between the TSPC content and stress factors, the present work aimed to evaluate the influence of the Atlantic Forest fragments proximity in the banana (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) crop area on fruit ripening and leaves TSPC levels, using a optimized methodology. It was observed that bananas harvested near to the forest fragment presented a longest greenlife (period between the harvest and the climacteric) when compared with the fruits with the same phisiologycal age, but without the influence of the native forest. This fact can be explained, at least partly, by the difference on ethylene, ABA and IAA profiles in the ripening of bananas from the different areas, which also influence the starch-sucrose metabolism. Moreover, it was observed that the extraction with acetone (80% v/v in water) and posterior hexane cycle to remove chlorophylls excess was able to obtain a good TSPC extraction yield in leaves, without extracting compounds that interfere significantly with Folin-Ciocalteu method. In additional, the use of optimized methodology showed that bananas leaves can present different TSPC amount when influenced by the presence of native forest. Thus, the evaluation of leaves TSPC profile can provide important information about the environmental conditions of the plant.

Tnt1 is a transcriptionally active LTR-retrotransposon, present in over 600 copies in the Nicotiana tabacum genome. Under normal growth conditions, Tnt1 expression is limited to basal levels, but its expression is further induced under biotic and abiotic stresses. Transgenic tobacco plants (HP plants) expressing a Tnt1 reverse transcriptase hairpin were generated. These showed pleiotropic phenotypes such as cell death spots on the leaves and callose deposition and other severe abnormal development in aerial and underground portions. RNA sequencing of leaves with cell death spots revealed a rewiring of transcriptional regulatory networks related to stress responses exclusive to HPs. Among the positively modulated genes were ethylene synthesis and response cascade genes. The objective of the present work was to unravel the relation observed between Tnt1 and ethylene, generating a model. The results obtained suggest that HP seedlings and plants have increased ethylene synthesis when compared to the wildtype. Folding prediction of Tnt1 messenger RNA allowed the identification of ethylene-responsive sequences in putative stem loop locations. Thus it is possible that Tnt1 expression can produce small RNAs targeted to sequences present in the Tnt1 retrotransposon itself as well as at the promoter region of other ethylene responsive genes. Quantification of the expression of Tnt1 and ethylene related genes revealed \"phase opposition\" expression kinetics in the HPs, which led us to hypothesize that there might be an antagonistic relationship between the expression of Tnt1 and the expression of ethylene responsive genes involved in plant defense responses. Our findings suggest that Tnt1 could generate sRNAs that exerts transcriptional control over itself as well as other genes. Our model establishes a completely new biological role for a retrotransposon: Tnt1 would provide feedback control to ethylene-mediated gene regulation in tobacco defense responses, bringing the system back to a homeostatic condition and turning the defense responses down. Tnt1 é um retrotransposon com LTR transcricionalmente ativo, e está presente em mais de 600 cópias no genoma de Nicotiana tabacum. Em condições normais de crescimento Tnt1 é expresso em níveis basais. No entanto, sua expressão é induzida pelo estímulo de estresses bióticos e abióticos. Plantas de tabaco transgênicas (chamadas de HP) expressando um grampo da transcriptase reversa de Tnt1 foram geradas. Estas apresentaram fenótipos como: pontos de morte celular e deposição de calose nas folhas e severas anomalias de desenvolvimento severas nas porções aérea e radicular das plantas. Sequenciamento de RNA de folhas com os pontos de morte celular revelou uma reorganização de redes de regulação transcricional relacionadas a resposta a estresses. Essas novas redes surgiram exclusivamente nas plantas HP. Entre os genes modulados positivamente estavam genes de síntese e de resposta ao etileno. O presente trabalho teve como objetivo elucidar a relação observada entre Tnt1 e o fitormônio etileno gerando um modelo de atuação. Os resultados obtidos permitiram demonstrar que plântulas e plantas HP adultas tem um aumento na síntese de etileno quando comparadas à selvagem. A predição do dobramento do RNA mensageiro de Tnt1 permitiu a identificação de sequências responsivas ao etileno localizadas em posição potencial para formar grampos. Desta forma, é possível que a expressão de Tnt1 leve à produção de pequenos RNAs que tem como alvo sequências responsivas a etileno presentes tanto no próprio elemento quanto em regiões promotoras de outros genes. A quantificação da expressão de Tnt1 versus genes relacionados ao etileno revelou um padrão em \"oposição de fase\" nas HPs, o que nos levou a hipotetizar que talvez ocorra uma relação antagonista entre a expressão de Tnt1 e a expressão de genes responsivos ao etileno envolvidos em respostas de defesa vegetais. Nossos resultados sugerem que Tnt1 pode gerar pequenos RNAs que exercem controle transcricional sobre Tnt1 e outros genes endógenos. Nosso modelo estabelece um novo papel biológico para um retrotransposon: Tnt1 agiria como um modulador da indução de genes mediada por etileno nas respostas de defesa de tabaco, trazendo o sistema de volta à condição homeostática e encerrando as respostas de defesa.

Estudos sobre agroquímico geralmente reportam sobre sua eficiência no controle de pragas. Como no caso do tiametoxam, um inseticida sistêmico do grupo dos neonicotinóides que atua inibindo a ação do receptor nicotínico acetilcolina (nAChR) dos insetos levando-os à morte. Porém, essa molécula apresenta ações fisiológicas nas plantas capazes de influenciar o desenvolvimento das culturas, e quando um agroquímico apresenta essa atividade é comumente chamado de bioativador, devido ao aumento do vigor e da produtividade das plantas tratadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos bioquímicos, fisiológicos e produtivos de doses crescentes do tiametoxam, aplicado via tratamento de sementes, nos cultivos de trigo, braquiária, arroz e milho. Experimentos com trigo, braquiária e arroz foram conduzidos em vasos, sob casade- vegetação, no Horto Experimental do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ/USP, Piracicaba, SP. Enquanto a condução da cultura do milho ocorreu em casa-de-vegetação, do Departamento de Agronomia no CEDETEG/UNICENTRO, e em área de plantio comercial, ambos no município de Guarapuava, PR. Durante a realização dos experimentos foram mensuradas características biométricas de: índice de emergência; altura de plantas; índice de clorofilas (SPAD); massa seca da parte aérea; comprimento, área e volume radicular. Parâmetros bioquímicos como: atividade de nitrato redutase; fenilalanina amônia-liase; conteúdo de proteína total; pigmentos fotossintéticos e conteúdo de nutrientes foliares. Parâmetros sobre a qualidade nutricional da braquiária também foram analisadas. E ao final do ciclo reprodutivo dos cereais foram determinados alguns parâmetros relacionados à produção. Foi constatado que o tiametoxam interferiu sobre diversos parâmetros bioquímicos, em todas as culturas testadas, com destaque para a potencial ação dessa molécula sobre atividades de nitrato redutase e fenilalanina amônia-liase, bem como sobre o conteúdo de proteína total em trigo e braquiária, além de alterar o teor de pigmentos fotossintéticos foliares em arroz e milho. Para as culturas do trigo e da braquiária foram notadas modificações severas sobre a fisiologia e produção. Concluiu-se que a aplicação de tiametoxam, via tratamento de sementes, foi responsável por moderar o metabolismo e o desenvolvimento vegetal, até o final do ciclo da planta, de maneira que as plantas submetidas a essa molécula expressaram maior vigor e, consequentemente, apresentaram maior aptidão para incrementar sua produção. Studies on agrochemicals generally report on their effectiveness in pests control. As with thiamethoxam, a systemic insecticide of the neonicotinoid group that acts by inhibiting the action of acetylcholine nicotinic receptor (nAChR) of insects, leading to death. But this molecule which has physiological effect in plants, can influence crop development; and when an agrochemical presents this activity, it is commonly called bioactivator due to increased vigor and productivity of the treated plants. The aim of this study was to evaluate: biochemical, physiological and productive effects of increasing doses of thiamethoxam applied as seed treatment in wheat, Brachiaria, rice and corn crops. Experiments with wheat, rice and Brachiaria were conducted in pots under greenhouse, in the Horto Experimental of Biological Sciences Department of ESALQ/USP, Piracicaba, SP. While one corn crop was conducted in a greenhouse of the Department of Agronomy at CEDETEG / UNICENTRO, the other one was conducted in the field, both in Guarapuava, PR. We measure the biometric characteristics: emergence index, plant height, chlorophyll index (SPAD), shoot dry weight, length, root area and volume. Biochemical parameters such as: nitrate reductase activity, phenylalanine ammonia-lyase, total protein content, photosynthetic pigments and leaf nutrient content. Parameters on the nutritional quality of Brachiaria were also analyzed. And at the end of the reproductive cycle of cereals some parameters related to production were determined. It was found that thiamethoxam interfered in various biochemical parameters in all tested crops, highlighting the potential action of this molecule on activities of nitrate reductase and phenylalanine ammonia-lyase, as well as the total protein content in wheat and pasture, besides changing the content of photosynthetic pigments in rice and corn leaves. For wheat and Brachiaria crops severe changes were noted on the plant physiology and production. It is concluded that the application of thiamethoxam, via seed treatment, was responsible for moderating metabolism and plant development, until the end of the life cycle of the plant, so that the plants under this molecule expressed greater vigor and thus had higher ability to increase production.

Os solos ácidos (pH < 5,0) representam cerca de 40 % das áreas agricultáveis no mundo. Nestes solos ocorre a solubilização de formas tóxicas de alumínio que inibe o crescimento radicular. Independente da presença do Al, o baixo pH pode ser tóxico à raiz, afetando a viabilidade celular no ápice e o crescimento radicular. Há evidências de que o estresse por H+ e/ou Al³+ afetam a parede celular. Por outro lado, modificações na parede podem determinar o grau de tolerância da planta quando submetidos a estes estresses. Assim, utilizou-se de duas abordagens para investigar se possíveis modificações na parede celular melhorariam o crescimento e viabilidade celular na exposição a H+ e Al³+. Na primeira, raízes de plantas do cultivar Micro-Tom (MT) de tomateiro (Solanum lycopersicum L.), com 2 e 13 dias de desenvolvimento, foram expostas de forma direta ou gradual ao baixo pH. Na segunda abordagem, as raízes foram submetidos a um tratamento hipo-osmótico antes de serem expostas a pH 4,0 ou 4,5 + Al. Em plantas com 2 e 13 dias, a exposição gradual foi realizada alterando o pH ao longo de 12 e 24 h, respectivamente. No tratamento hipo-osmótico (priming), as plantas foram transferidas de uma solução de alta osmolaridade (150 mM) para uma com baixa osmolaridade (0,5 mM), a pH 5,8, por 0; 0,5; 1 e 2 h antes de serem expostas a pH 4,0 ou 4,5 + Al por 12h. Como controles, raízes não receberam tratamento osmótico ou foram mantidas continuamente em alta osmolaridade. O crescimento de raízes expostas diretamente a pH 4,5 foi cerca de metade do controle a pH 5,8 e a pH 4,0 foi nulo. Ao contrário do esperado, na exposição gradual a pH 4,5, as raízes cresceram menos do que aquelas expostas diretamente a este pH e a pH 4,0 o crescimento continuou insignificante. No entanto, raízes expostas gradualmente ao pH 4,0 mantiveram a viabilidade das células do ápice, ao contrário daquelas expostas diretamente. Assim, a redução do crescimento radicular pela exposição a baixo pH pode ser uma resposta gerada pela própria planta, não sendo necessariamente decorrente da ação direta do pH. O priming hipo-osmótico antes da exposição a pH 4,0 permitiu a manutenção da viabilidade celular e um crescimento radicular de até 38% das raízes controle a pH 5,8, enquanto que nos controles a pH 4,0 as células morreram e o crescimento foi praticamente nulo. Em pH 4,5 + 5 ?M de Al o priming não reverteu a inibição do crescimento radicular, indicando que as respostas para H+ e Al³+ são diferentes. Ficou evidente que a atividade de GPX está envolvida nas respostas encontradas tanto na exposição gradual a baixo pH como no tratamento hipo-osmótico anterior ao baixo pH, mas não foi possível determinar se é consequência ou uma das possíveis causas destas respostas. No seu conjunto, os dados indicam que possíveis mudanças na parede celular podem estar envolvidas na melhoria do crescimento radicular e viabilidade celular do ápice durante o estresse. Acidic soils (pH

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é um interessante modelo para estudar a base genética da capacidade de formação de órgãos adventícios, uma vez que existem variações genéticas naturais consideráveis em seus parentes selvagens. Assim, sabese que o alelo dominante Rg1, presente no braço curto do cromossomo 3 de S. peruvianum, confere alta capacidade de regeneração de gemas caulinares. Usando uma coleção de 50 linhas de introgressão (ILs), cada uma contendo um pequeno segmento cromossômico de S. pennellii LA716 introgredido e mapeado na cultivar M82, foram realizados testes com explantes cotiledonares com 12 dias de idade cultivados em meio MS contendo 5,0 M BAP, e encontramos uma alta capacidade de regeneração de gemas caulinares nas IL3-2, IL6-1, IL7-1, IL 8-3, IL-9-1 e IL10-2. Isto significa que S. pennellii provavelmente possua alelos com capacidade superior para a regeneração in vitro nessas regiões cromossômicas, incluindo um possível novo alelo para Rg1 na IL3-2. Plântulas em F1 do cruzamento entre Micro-Tom x ILs e ILs x ILs provaram que a capacidade de regeneração de gemas caulinares foi dominante nas ILs 3-2, 6-1, 7-1 e 8-3, e que a capacidade de regeneração das IL8-3 aumentou a das outras ILs, comportando-se de uma maneira aditiva. Uma vez que as ILs 3-2, 7-1, 8-3 e 10-2 também aumentaram a formação de raízes em meio MS contendo 0,4 M ANA, elas podem apresentar novos alelos que controlam a fase de competência, estando aptas a assumir diferentes destinos celulares, ao invés da indução de um órgão específico. Também realizamos a introgressão dos alelos selecionados para o modelo genético Micro-Tom, o qual proporcionará a caracterização e isolamento de genes importantes para estudos de desenvolvimento de plantas e aplicações biotecnológicas. Tomato (Solanum lycopersicum L.) is an attractive model to study the genetic basis of adventitious organ formation capacity, since there is considerable natural genetic variation in its wild relatives. Accordingly, it is known that the dominant Rg1 allele, present in the short arm of S. peruvianum chromosome 3, confers high shoot regeneration capacity. Using a set of 50 introgression lines (ILs), each containing small a chromosomal segment of S. pennellii LA716 introgressed and mapped into the tomato cultivar M82, we found a high shoot regeneration capacity for IL3-2, IL6-1, IL7-1, IL 8-3, IL-9-1 and IL10-2, when 12-days-old cotyledon explants were cultivated in MS medium containing 5.0 M BAP, suggesting that. S. pennellii might present superior alleles for in vitro regeneration in such chromosomal regions, including a possible novel allele for Rg1 in IL3-2. F1 seedlings from the crosses Micro-Tom x ILs and ILs x ILs demonstrated that the shoot regeneration capacity of the ILs 3-2, 6-1, 7-1 and 8-3 was dominant and that the regeneration ability of IL8-3 enhanced that of the other ILs in an additive manner. Since ILs 3-2, 7-1, 8-3, and 10-2 also exhibited enhanced root formation on MS medium containing 0.4 M NAA, these segments might contain novel alleles controlling the competence to assume distinct cell fates, rather than the induction of a specific organ. We also performed the introgression of such alleles into the genetic model system Micro-Tom, which will enable the characterization and isolation of important genes for plant development studies and biotechnological applications.

Dentre os fatores relacionados à capacidade superior de regeneração in vitro de Solanum peruvianum, está a presença do alelo dominante Rg1. O gene RG1, envolvido na formação de gemas caulinares a partir de raízes e outros explantes, foi mapeado no cromossomo 3 entre os genes BETA-CAROTENE HYDROXYLASE (CrtR-b) e PHYTOENE SYNTHASE (PSY1). Variações alélicas também são conhecidas para genes CrtR-b e PSY1. white flower (wf) é o alelo de CrtR-b que produz pétalas brancas e yellow flesh (r) é o alelo de PSY1 que produz frutos amarelos. Os alelos wf e Rg1 com r foram introgredidos na cultivar Micro-Tom (Solanum lycopersicum L). Através da transferência sequencial de explantes de SIM para MB e de RIM para SIM, verificou-se que MT-Rg1 reduz o tempo necessário para a indução de gemas em um dia (6 dias em SIM para MT), devido a redução no tempo necessário para a aquisição de competência em um dia (2 dias para MT). Foram obtidos 30 possiveis recombinantes advindos do cruzamento Rg1/rg1 Wf/wf x rg1/rg1 wf/wf, baseados nas características de pétala branca (efeito do alelo wf) e maior ramificação (efeito do alelo Rg1). Todos os possíveis recombinantes foram testados in vitro quanto à capacidade de formar gemas caulinares em SIM e raízes em RIM. Com isso, 7 linhagens recombinantes foram confirmadas e utilizadas para o mapeamento fino da região na qual o gene RG1 está localizado no cromossomo 3. Para o mapeamento foram testados marcadores do tipo CAPS e SCAR, sendo utilizado o DNA genômico extraído de S. pennellii, S. peruvianum, Micro- MsK, MT, MT-Rg1, MT-wf e das 7 linhagens recombinantes, constatando-se que alguns marcadores moleculares desenhados para S. pennellii podem ser utilizados para S. peruvianum. Estas análises também evidenciaram que o segmento de introgressão de MT-Rg1 está entre o marcador P5 e o gene CrtR-b, totalizando 136 genes, entre os quais GRAS 10 destacou-se como principal candidato para a função gênica de Rg1. Complementarmente, foi realizada a análise de RNA-Seq (plataforma SOLiD) para a identificação de genes diferencialmente expressos entre MT e MT-Rg1. Com isso, observou-se que existem mais genes regulados negativamente do que positivamente durante a aquisição de competência. Devido ao grande número de genes diferencialmente expressos, alguns parâmetros foram utilizados para classificar os genes que poderiam ser quantificados por qRT-PCR em um experimento de regeneração in vitro. Entre os 361 genes classificados, 5 foram selecionados para a quantificação de sua expressão. Destes 5 genes, GRAS 10 e Serine/threonine protein phosphatase 7 foram os que apresentaram-se mais positivamente expressos e aparentemente são os que estão mais intimamente ligados a fase de aquisição de competência. Como existem muitos genes GRAS, foi feita uma árvore filogenética para posicioná-lo e identificar genes homólogos a ele. Com base na análise filogenética foi possível identificar o gene GRAS 10 como homológo ao gene SCL8 já identificado em Arabidopsis. Porém, pouco se sabe a respeito de SCL8. Desse modo, ainda é necessário confirmar a identidade do gene RG1, o que possibilitará a compreensão do processo de aquisição de competência. The dominat allele Rg1 is related to the greater in vitro regeneration capacity of Solanum peruvianum L. The Rg1 gene is required for shoot formation from roots and others explants and was mapped on chromosome 3 between BETA-CAROTENE HYDROXYLASE (CrtR-b) and PHYTOENE SYNTHASE (PSY1) genes. Allelic variants are also known for the genes CrtR-b and PSY1. white flower (wf) is the allele of CrtR-b that produces white petals and yellow flesh (r) is the allele of PSY1 that produces yellow fruits. The alleles wf and Rg1 with r were introgressed into the Micro-Tom cultivar (Solanum lycopersicum L). Through the sequential transfer of explants from SIM to BM and RIM to SIM, we found that MT-Rg1 reduces the time required for the induction of shoots in one day (6 days on SIM for MT), due the reduction of the time required for competence acquisition in one day (2 days to MT). It was obtained 30 putative recombinants from crossing Rg1/rg1 Wf/wf x rg1/rg1 wf/wf. The recombinant lines were scored based on the presence of white petals (wf allele\'s effect) and increased shoot branching (Rg1 allele\'s effect). All putative recombinant lines were tested in vitro for their capability to form shoots in SIM and roots in RIM. Thus, 7 recombinant lines were selected and used to fine mapping the region where RG1 gene is located. CAPS and SCAR markers designed to S. pennellii were tested to fine-mapping, using as template genomic DNA samples from S. pennellii, S. peruvianum, Micro-MsK, MT, MT-Rg1, MT-wf and the 7 recombinant lines. These results confirmed that the molecular markers designed for S. pennellii can be successfully used for S. peruvianum. These analyzes also suggest that the introgressed segment of MT-Rg1 is located between the P5 marker and the CrtR-b gene. Within this region, there are 136 genes, including the GRAS 10 gene whichis the main candidate to RG1 gene function. In addition, we performed RNA-Seq analysis (SOLiD platform) to identify genes differentially expressed in MT and MT-Rg1. It was observed more down-regulated than up-regulated genes in the competence acquisition stage. Due to the large number of differentially expressed genes, some parameters were used for selection of genes that would have their expression validated by qRT-PCR in an in vitro regeneration test. Five genes among 361 genes differentialy expressed were selected to test their expression. Of these 5 genes, GRAS 10 and Serine / threonine protein phosphatase 7 were the most up-regulate genes and showed to be closely related to the stage of competence acquisition. Since there are many GRAS genes, we performed a phylogenetic analysis to identify homologous genes. Based on the phylogenetic analysis, GRAS 10 was identified as homologous to SCL8, a gene already identified in Arabidopsis. However, little is known about SCL8. Thus, it is still necessary to confirm the RG1 gene identity. This approach will provide a better understanding of competence acquisition process.

A combinação do aumento da população mundial e a melhoria nos padrões de vida estão levando a uma maior demanda por alimentos com alto valor nutricional. As variedades de laranjas de polpa vermelha são as únicas laranjas que acumulam licopeno na polpa e no suco. O licopeno é um carotenóide considerado como um composto antioxidante, com ação potencial na prevenção de alguns tipos de câncer. Apesar do valor nutricional agregado as laranjas de polpa vermelha, a caracterização fisiológica e molecular dos carotenóides nessas laranjas permanece pouco estudada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil de transcrição de genes envolvidos na via de biossíntese dos carotenóides e quantificar a concentração dos carotenóides na polpa dos frutos de duas laranjas de polpa vermelha e da laranja Pêra (controle). Para comparação entre variedades, os frutos das laranjas Sanguínea-de-Mombuca (\'SM\') e Bahia Cara-Cara (\'CC\'), que possuem polpa vermelha, e da laranja Pêra (\'P\') foram colhidos aos 270, 300 e 330 dias após o florescimento (DAF), em Cordeirópolis (CCSM). Para identificar a influência climática no acúmulo de carotenóides, frutos da laranja de polpa vermelha \'SM\' foram também colhidos frutos aos 270, 300 e 330 DAF em diversos locais: CCSM, Mogi-Mirim (MM) e São Bento do Sapucaí (SBS). A quantidade dos transcritos dos genes fitoeno sintase (PSY), fitoeno dessaturase (PDS), \'dzeta\'-caroteno dessaturase (ZDS), carotenóide isomerase (CRTISO), licopeno \'épsilon\'-ciclase (LCY\'\'épsilon\'), licopeno \'beta\'-ciclase (LCY\'beta\'), hidroxilase \'beta\'-caroteno (HY\'beta\') e zeaxantina epoxidase (ZEP), que codificam para as enzimas da via de biossíntese dos carotenóides, foram analisados por PCR em tempo real. A quantificação dos principais carotenóides presentes no suco dos frutos foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. A análise quantitativa de transcritos obtidos a 330 DAF indicaram a existência de maiores níveis de expressão dos genes precursores dos carotenos (PSY, PDS, CRTISO, ZDS, LCY\'beta\') nas variedades de polpa vermelha, principalmente na \'SM\'. A quantidade dos carotenos fitoflueno, licopeno e \'beta\'-caroteno foram maiores nas laranjas vermelhas, em relação ao observado nos frutos de laranja Pêra, correlacionando com os níveis de expressão gênica. Nos frutos da laranja pigmentada \'SM\' coletadas aos 330 DAF pôde-se observar uma possível associação entre o clima do local de cultivo e o conteúdo de transcritos dos genes da via de carotenóides. O cultivo em clima mais quente (MM) resultou em frutos com maiores níveis de transcritos dos genes precursores de carotenos (PSY, PDS, ZDS, CRTISO e LCY\'beta\'), enquanto que o cultivo em região de clima mais frio (SBS) resultou no aumento do nível de transcritos dos genes precursores das xantofilas (HY\'beta\' e ZEP). Como consequência, houve um acúmulo maior dos carotenos fitoflueno, licopeno e \'beta\'-caroteno, nos frutos cultivados em locais quentes, porém, em regiões mais frias, houve maior acúmulo das xantofilas zeaxantina e violaxantina, nos frutos. Com o sequenciamento das regiões de diferentes genes da via de biossíntese de carotenóides, foram identificadas algumas mutações pontuais na sequência de nucleotídeos dos genes PSY, CRTISO e ZDS da variedade pigmentada \'SM\', em comparação com os mesmos genes da laranja Pêra. Algumas dessas mutações resultaram na alteração de aminoácidos na sequência das proteínas e deste modo, supõe-se que estes genes sejam os principais candidatos a serem os responsáveis pela alteração do fenótipo das variedades que produzem frutos com polpa avermelhada, ricos em licopeno The increasing world population and improvement in living standards are leading to greater demand for foods with high nutritional value. The sweet orange varieties with red-flesh are the only ones that accumulate lycopene in the pulp and juice. Lycopene is a carotenoid compound with antioxidative property which may have a potential action in preventing some cancers. Despite of the high nutritional value in the red-fleshed oranges, the physiological and molecular characterization of carotenoids remains to be elucidated. The present work aimed to characterize the transcriptional profile of genes involved in carotenoids biosynthesis pathway and quantify the carotenoids in red-fleshed oranges and Pêra orange (as a control). For a direct comparison among the varieties, fruits of Sanguínea-de-Mombuca (\'SM\') and Bahia Cara-Cara (\'CC\') red-fleshed sweet oranges, and Pêra orange were harvested at 270, 300 and 330 days after flowering (DAF) in Cordeirópolis station (CCSM). To investigate the impact of climate variation on carotenoids accumulation, red-fleshed fruits \'SM\' orange were harvested on 270, 300 and 330 DAF in different climate locations: Cordeirópolis station (CCSM), Mogi-Mirim (MM) and São Bento do Sapucaí (SBS). Quantitative transcriptional analysis of the genes phytoene syntase (PSY), phytoene desaturase (PDS), \'dzeta\'-carotene desaturase (ZDS), carotenoid isomerase (CRTISO), lycopene \'épsilon\'-ciclase (LCY\'épsilon\'), lycopene \'beta\'-cyclase (LCY\'beta\'), hydroxylase \'beta\'-carotene (HY\'beta\') and zeaxanthin epoxidase (ZEP) related to the carotenoids biosynthesis pathway were performed by quantitative Real Time PCR. Further, carotenoids quantification in red-fleshed fruits was measured by high performance liquid chromatography. The transcriptional profile at 330 DAF revealed high expression levels for the carotene gene precursors (PSY, PDS, CRTISO, ZDS, LCY\'beta\') in red-fleshed oranges, in particular to \'SM\' orange when compared to Pêra orange. Carotenoids profiling displayed higher phytofluene, lycopene and \'beta\'-carotene concentrations in red-fleshed orange than Pêra orange fruits. Transcript levels of genes related to the carotenoids pathway were responsive to the climate variation in red-fleshed orange harvested at 330 DAF. In warmer climate conditions, increased expression levels were found for the genes related carotene precursors (PSY, PDS, ZDS, CRTISO and LCY\'beta\'), whereas under colder climate conditions, the red-fleshed fruits orange showed higher expression levels for the xanthophylls precursors genes (HY\'beta\' e ZEP). As a consequence, the carotenes phytofluene, lycopene and \'beta\'-carotene accumulated in warmer climate developed fruits, instead of colder climate conditions, where the fruits accumulate increased concentrations of xanthophylls such as zeaxanthin and violaxanthin. Moreover, the sequencing of fragments from different genes related to the carotenoids pathway enabled the identification of point mutations for the genes PSY, CRTISO and ZDS in the red-fleshed variety. These mutations caused amino acid changes in the protein which indicates that these genes might be responsible for the phenotypes red-fleshed fruits and increased lycopene levels shown in the variety \'SM\'

A exemplo do que ocorre em animais, peptídeos hormonais em plantas desempenham papéis importantes no crescimento, desenvolvimento e defesa. RALF é um peptídeo hormonal ubíquo em plantas que foi primeiramente isolado de folhas de tabaco. Embora não se saiba exatamente sua função, as informações até agora existentes apontam para um envolvimento com aspectos básicos da biologia celular, provavelmente alongamento celular. Peptídeos RALF em Arabidopsis são encontrados em uma família multigênica de 37 membros. Plantas transgênicas superexpressando o AtRALF1 sob o controle do forte promotor constitutivo 35S, mostram um fenótipo semi-anão e inibição do crescimento das raízes. Um fenótipo semelhante também foi observado quando o AtRALF23 foi superexpresso. O AtRALF23, ao contrário do AtRALF1, tem sua expressão inibida por brassinosteróides. Esses fatos sugerem que diferentes peptídeos hormonais RALF, apesar de convergirem para a mesma função, apresentam uma relação individualizada com outros hormônios. O objetivo desse trabalho foi contribuir para a determinação da função dos peptídeos RALF em plantas e para o esclarecimento da inter-relação existente entre eles e os demais hormônios vegetais. Para tal, selecionou-se as isoformas AtRALF1 e AtRALF34 com base em semelhança/dessemelhança estrutural e padrão de expressão. Plantas silenciadas e com altos níveis de expressão para ambos os genes foram obtidas e avaliadas. A construção gênica AtRALF1-GFP foi inserida em Arabidopsis sob o controle do promotor 35S e foi observada fluorescência no retículo endoplasmático, complexo de Golgi e apoplasto. Genes anteriormente reportados como induzidos em plantas 35S:AtRALF1 foram validados e utilizados em experimentos com o AtRALF1 e o brassinolide. O conjunto dos resultados sugere um efeito antagônico do peptídeo AtRALF1 com relação ao efeito do brassinolide no alongamento de hipocótilos e raízes. Plantas com altos níveis de AtRALF1 são resistentes a aplicação exógena de brassinolide, não exibindo as respostas características do hormônio esteróide. O antagonismo entre os dois hormônios também foi sugerido pela análise da expressão de genes que são induzidos por AtRALF1 e brassinolide. Like in animals, plant peptide hormones play important roles in growth, development and defense. RALF is a peptide hormone ubiquitous in plants that was first isolated from tobacco leaves. Although its function has not been established, the information gathered so far suggest its involvement with basic aspects of cellular biology, probably cellular elongation. RALF peptides in Arabidopsis are found in a multigene family of 37 members. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 under the control of the strong constitutive promoter 35S, show a semi-dwarf phenotype and root growth inhibition. A similar phenotype was also observed when AtRALF23 was overexpressed. AtRALF23, as opposed to AtRALF1, is inhibited by brassinosteroids. These facts suggest that different RALF peptide hormones, despite the convergence to the same function, show a unique relationship with other hormones. The goal of this work was to contribute to the determination of the function of RALF peptides in plants and to clarify the inter-relationship between RALF and the other plant hormones. With that in mind, the isoforms AtRALF1 and AtRALF34 were selected based on primary structure similarity/dissimilarity and pattern of gene expression. Plants with high levels of expression or silenced for both genes were obtained and evaluated. The gene construct AtRALF1-GFP was introduced in Arabidopsis under the control of the 35S promoter and fluorescence was observed in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and apoplast. Genes previously reported as induced in 35S:AtRALF1 plants were validated and used in AtRALF1 peptide and brassinolide experiments. Taken together our results suggest an antagonistic effect of the peptide AtRALF1 regarding the elongation effect of brassinolide in hypocotyls and roots. Plants with high levels of AtRALF1 are resistant to exogenously applied brassinolide, and do not show typical responses to the steroid hormone. The antagonism between the two hormones was also suggested by the gene expression analysis of the AtRALF1 and brassinolide inducible genes.

Atualmente a cultura da cana de açúcar tem ganhado destaque no cenário mundial devido a seu potencial uso na produção de bioenergia o qual poderia ser beneficiado desenvolvendo-se cultivares com aumento da produtividade de biomassa por unidade de área, o que é por sua vez, determinada pela arquitetura da planta. A brotação lateral é um dos principais fatores que regulam a arquitetura dos vegetais. Recentemente, esta fase do desenvolvimento tem sido estudada intensivamente em plantas consideradas modelo, elucidando em parte as vias genéticas, ambientais e hormonais que regulam este processo. Dentro desta vias, microRNAs, uma classe de pequenos RNAs não codantes que modula pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, parecem ser importantes reguladores. Em cana de açúcar, a brotação lateral é importante para a arquitetura dos ramos laterais, germinação de gemas e perfilhamento. Entretanto, devido a sua complexidade genética e ausência de mutantes defectivos na brotação lateral, estudos nesta área ao nível molecular são limitados. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos estudar em cana de açúcar a via microRNA156/fatores de transcrição do tipo SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPL), a qual é associada à regulação do perfilhamento, bem como caracterizar molecularmente o processo de emergência de gemas axilares. Ferramentas computacionais usando o banco publico de ESTs TIGR gene índex permitiram identificar e classificar no genoma de cana de açúcar, diferentes genes associados ao processo de brotação lateral e resposta hormonal. Entres estes, seis genes SPL regulados pelo miR156 foram identificados, sendo um deles (SsSPL1) homólogo a SPLs envolvidas diretamente na regulação do perfilhamento. A expressão da SsSPL1 foi monitorada em diferentes tecidos e órgãos, juntamente com o miR156. Os dados sugerem que a SsPL1, é regulada negativamente pelo miR156, sendo esta via também conservada em cana de açúcar. Foram geradas plantas transgênicas da cultivar RB85486 com o gene endógeno SsmiR156a/b o qual codifica um precursor conservado do miR156 e parece estar associado com a evolução da arquitetura em monocotiledôneas. O acúmulo do miR156 foi avaliado em plantas transformadas via RT-qPCR encontrando variabilidade na sua expressão. Bibliotecas de pequenos RNAs foram geradas em gemas dormentes e em desenvolvimento, permitindo identificar membros de 26 famílias de miRNAs. A expressão de quatro deles, de seus genes-alvo e de outros genes selecionados foi monitorada em gemas dormentes e com 2 e 5 dias após o plantio. Interessantemente, o miR159 foi o mais expresso em gemas axilares de cana e parece ser um fator chave na emergência da gema, já que, segundo os resultados obtidos, esse miRNA parece modular a expressão do seu gene alvo SsGAMyB, o qual é um fator de transcrição implicado na ativação de genes de resposta a giberelina. Durante esta fase inicial do desenvolvimento também foi observado alterações na expressão de genes associados com processos de transdução de sinal associados aos fitohormônios auxina e etileno. Os resultados obtidos indicam que a emergência de gemas laterais é um processo dinâmico em que fitohormônios, fatores de transcrição e microRNAs participam conjuntamente para promover o crescimento e 12 desenvolvimento da nova plântula de cana de açúcar. Sugarcane is an economically important biofuel crop that recently has become a target for improvement of sustainable biomaterial production due to its high biomass productivity and built-in containment features. Therefore, studies aiming to improve the production of biomass per area are among the most important issues in sugarcane production. Plant biomass is defined, at least in part, by its shoot architecture. Although shoot architecture (branching/tillering) is to some extend influenced by environmental factors, it is determined mainly by the plants genetic program. This includes developmental programs that are regulated by a complex network of genetic pathways that integrate endogenous and environmental cues. Several transcription factors as well as microRNAs are likely part of this network. In this study, we started to investigate the roles of the genetic pathway regulated by the microRNA156 and its targets, the transcription factors SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPLs) in sugarcane branching/tillering. We identified six members of the SPL family that were further classified into four subfamilies. In both dicots and monocots, these SPLs are key regulators of the plant shoot architecture. We monitored the expression patterns of SsmiR156 e SsSPL1 in distinct sugarcane tissues/organs. Our observations suggest that miR156 regulates posttranscriptionally SsSPL1 mainly in leaf tissues. We generated transgenic sugarcane plants overexpressing the monocot-specific sugarcane miR156 precursor SsMIR156b/c via biolistic method. This precursor is thought to be important for the evolution of grass shoot architecture. Although we observed higher accumulation of mature SsmiR156b/c in leaf tissues of some transgenic plants as compared with tissues from non-transgenic plants, we could not detect any significant changes in their vegetative architecture. Using deep sequencing approaches, we have generated two small RNA libraries from dormant and outgrown sugarcane lateral buds. Preliminary analyses indicate that a select group of small RNAs are expressed in lateral buds, including over 200 repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) and 25 conserved microRNAs (miRNAs). Amongst the miRNAs, miR159 was the most sequenced in the two libraries. We evaluated miR159 accumulation pattern in addition to other selected miRNAs via qRT-PCR in dormant and developing buds. The majority of the evaluated miRNAs accumulate differentially during bud development, though with distinct expression patterns. Interestingly, miR159 accumulates at high levels in dormant buds, but scarcely in developing buds. Conversely, the experimentally confirmed miR159 target, a sugarcane GAMyB-like gene (SsGAMyB), is lowly expressed in dormant buds while its transcripts accumulate at higher levels in developing buds. GAMyB-like genes encode R2R3 MYB domain transcription factors that have been implicated in gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) signaling in germinating seeds. Our data suggest miR159 regulates GAMyB-like genes during sugarcane bud outgrowth. Similarly, SsSPL1 is regulated posttranscriptionally by the miR529, though this gene has sites for both miR529 and miR156. Auxin and ethylene-associated regulatory pathways are affected during sugarcane bud development. Taken together,our data indicate that sugarcane bud outgrowth from rhizomes is a complex developmental process involving hormones, transcription factors as well as microRNAs and other regulatory RNAs.

Os hormônios vegetais etileno e ABA são possíveis reguladores chave do desenvolvimento das micorrizas arbusculares (MAs). O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento da MA em mutantes superprodutores e insensíveis ao etileno (epinastic e Never ripe, respectivamente) e verificar se enzimas relacionadas ao sistema de defesa vegetal são reguladas diferencialmente pelo etileno durante o desenvolvimento da simbiose A colonização de raízes de epinastic (epi) por G. clarum foi significativamente reduzida quando comparada com Micro-Tom (MT), além disso, a funcionalidade da simbiose, demonstrada pelo acúmulo de transcritos de LePT4, foi fortemente reduzida quando comparada com MT. Por outro lado, o padrão de colonização e funcionalidade da simbiose no mutante Nr não diferiu de MT. Indução no acúmulo de transcritos de genes que codificam quitinases e enzimas relacionadas ao estresse oxidativo foi observada no mutante epi, enquanto o acúmulo de transcritos de uma -1,3-glucanase foi fortemente induzido no mutante Nr. O segundo objetivo foi verificar se a colonização reduzida observada em mutantes deficientes em ABA é dependente da produção do etileno. Para tanto, mutantes que diferem na deficiência de ABA e produzem diferentes quantidades de etileno (notabilis e sitiens) e o mutante epi foram inoculados com G. clarum e tratados com aminoethoxivinilglicina (AVG), um inibidor de etileno. A colonização intrarradicular de G. clarum nos mutantes epi e notabilis (not) foi significativamente reduzida quando comparada com MT, sendo que o mutante sitiens (sit) foi o menos susceptível à colonização em relação aos demais genótipos. A aplicação de AVG a 10 µM restaurou completamente a colonização em epi, mas não nos mutantes deficientes em ABA. O acúmulo de transcritos de LePT4 confirmou os resultados de colonização. Os genes que codificam enzimas chave na biossíntese do etileno, LeACS2 e LeACO4, foram regulados positivamente pela inoculação com G. clarum, e a restauração do desenvolvimento da MA observada em epi que recebeu AVG, provavelmente envolveu ACC oxidase (LeACO4). O acúmulo de transcritos dos genes que codificam ACC oxidase (LeACO1 e LeACO4) foi induzido significativamente em sit, mostrando que a superprodução de etileno observada neste mutante pode envolver a regulação da ACC oxidase. Por fim, indução no acúmulo de transcritos do gene LeNCED foi observada em todos os genótipos micorrizados e em raízes de epi que receberam AVG, demonstrando que LeNCED é regulado positivamente pela inoculação com G. clarum e que o etileno regula a expressão deste gene. Os resultados demonstram que etileno e ABA estão envolvidos na regulação do desenvolvimento de MA e que etileno modula a expressão de genes relacionados ao sistema de defesa vegetal permitindo o estabelecimento de uma simbiose funcional. The plant hormones ethylene and ABA are probably key developmental regulators of arbuscular mycorrhizae (AM). The first objective of this work was to evaluate the development of MA in overproducing and insensitive mutants to ethylene (epinastic and Never ripe, respectively) and verify if enzymes related to plant defense system are differentially regulated by ethylene during the symbiosis development. The colonization of epinastic (epi) roots by G. clarum was significantly reduced when compared with Micro-Tom (MT), moreover, the functionality of the symbiosis as demonstrated by transcripts accumulation of LePT4, was strongly reduced when compared with MT. Still, the pattern of colonization and functionality of the symbiosis in the Nr mutant did not differ from MT. Induction in the transcripts accumulation of genes encoding chitinase and enzymes related to oxidative stress was observed in epi mutant, whereas transcripts accumulation of -1, 3-glucanase was strongly induced in the Nr mutant. The second objective was to determine whether the reduced colonization observed in mutants deficient in ABA is dependent on ethylene production. For this purpose, mutants that differ in ABA deficiency and produce different amounts of ethylene (notabilis and sitiens) and the epi mutant were inoculated with G. clarum and treated with an ethylene inhibitor called aminoethoxivinilglicin (AVG). The intraradical colonization of G. clarum in epi and notabilis (not) mutants was significantly reduced when compared with MT and sitiens mutant was less susceptible to colonization in comparison with other genotypes. The application of AVG to 10 µM completely restored the colonization in the epi but not in mutants deficient in ABA. The transcripts accumulation of LePT4 confirmed the results of colonization. The genes that encode key enzymes in the biosynthesis of ethylene, LeACS2 and LeACO4, were positively regulated by inoculation with G. clarum and the restoration in the development of MA observed in epi which received AVG probably involved ACC oxidase (LeACO4). Transcripts accumulation of genes that encode ACC oxidase (LeACO1 and LeACO4) were induced significantly in sit showing that overproduction of ethylene in this mutant can involve ACC oxidase. Finally, the induction in the accumulation of gene transcripts LeNCED was observed in all genotypes and mycorrhizal roots of epi which received AVG demonstrating that LeNCED is regulated positively by the inoculation with G. clarum and that ethylene regulates the expression of this gene. Results show that ethylene and ABA are involved in regulating of MA development and ethylene modulates the expression of genes related to the plant defense system allowing the establishment and functionality of the symbiosis.

A filosfera foi considerada um ambiente extremo durante muitos anos para os microrganismos. Estudos recentes envolvendo comunidades bacterianas na superfície das plantas têm demonstrado que esta é composta por uma enorme e variável diversidade, principalmente em plantas de ambientes naturais como as da Mata Atlântica. Comparar as comunidades de bactérias de plantas de ambientes naturais com as de sistemas agrícola é de extrema importância, visto que as matas abrigam uma enorme diversidade vegetal e esta vem sendo diariamente substituída pela agricultura. Fatores ambientais como radiação UV, compostos orgânicos liberados pelas plantas em resposta à proteção, estresse osmótico e disponibilidade de nutrientes também podem induzir ou reprimir a colonização dessas bactérias na filosfera das plantas. Portanto, este trabalho traçou dois objetivos, o primeiro foi avaliar a variabilidade na comunidade bacteriana da filosfera de plantas cultivadas (soja, cana-de-açúcar, e eucalipto), localizadas em regiões geograficamente distintas, utilizando sequenciamento de bibliotecas de clones de DNA do gene rRNA 16S e comparar com as comunidades da filosfera de plantas nativas (Trichilia clausenii, Trichilia catigua e Campomanesia xanthocarpa), e o segundo, foi verificar a influência dos compostos orgânicos voláteis (COVs) emitidos pela planta, os diferentes níveis de radiação solar e a sazonalidade na seleção das comunidades bacterianas na filosfera de Trichilia clausenii, usando sequenciamento de bibliotecas de clones de cDNA do gene rRNA 16S e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGEM). A análise comparativa das bibliotecas de clones do gene rRNA 16S de plantas de ambientes naturais com cultivadas, confirmou que cada espécie de planta possui sua própria comunidade de bactérias, sendo a diversidade de UTOs na filosfera de C. xanthocarpa e T. clusenii maior que a de plantas cultivadas. O filo Proteobacteria. foi predominante em ambas as filosferas de plantas cultivadas e nativas, sendo as Alphaproteobacteria dominantes na soja e na cana-de-açúcar e as Gamaproteobacteria nas filosferas das três árvores da Mata Atlântica. Este resultado sugere que a filosfera de plantas cultivadas pode selecionar grupos específicos de bactérias que não são encontradas na filosfera de espécies arbóreas da Mata Atlântica, e vice-versa, e que a substituição de florestas por culturas agrícolas pode levar a uma redução da beta-diversidade de bactérias. Já os resultados da afiliação filogenética das amostras da filosfera de Tichilia clausenii submetida a diferentes intensidades de radiações UV, também mostraram uma predominância de clones associados à Proteobacteria em todas as bibliotecas avaliadas. O fator luminosidade e o da planta, quando avaliados na mesma época, não mostraram efeito sob a comunidade bacteriana, entretanto, o efeito da sazonalidade foi bastante evidente, apresentando uma maior diversidade e riqueza de espécies durante a estação chuvosa. Os dados sugerem que as bactérias epifíticas possuem um elevado grau de adaptação a diferentes condições ambientais que são expostas. The phyllosphere has been considered an extreme environment to microorganisms for many years. Recent studies involving bacterial communities on plant surfaces has shown that they comprise an abundant and dynamic variety, mainly in natural environments, such as the Atlantic Forest. The comparison of bacterial communities from plants in natural environments with those of agricultural systems is extremely important, since forests contain an enormous plant diversity which is being replaced daily by agricultural cultivation. Environmental factors such as UV radiation, organic compounds released by plants in response to protection, osmotic pressure, and nutrient availability can either induce or suppress the colonization of bacteria in the phyllosphere of plants. Therefore, this study aimed to evaluate the variability in phyllospheric bacterial communities of native plants (Trichilia clausenii, Trichilia catigua and Campomanesia xanthocarpa) and crops (soybean, sugar cane and eucalyptus) located in geographically distinct regions, using 16S rRNA gene sequences from clone libraries, the influence of volatile organic compounds (VOCs) emitted by each plant, the different levels of solar radiation, and seasonality in the selection of bacterial communities in the phyllosphere of Trichilia clausenii using 16S rRNA gene sequences from cDNA clone libraries and gas chromatography-mass spectrometry (GCMS). The comparative analysis of the 16S rRNA gene sequences from clone libraries of plants from natural environments confirmed that each plant species has its own community of bacteria, where the diversity of OTUs in the phyllosphere of C. xanthocarpa and T. clusenii was greater than that of cultivated plants. The phylum Proteobacteria was predominant in the phyllosphere of both cultivated and native plants, where Alphaproteobacteria was dominant in phyllospheres of soybean and sugar cane and Gamaproteobacteria was harbored on the three trees of the Atlantic Forest. These results suggest that the phyllosphere of cultivated plants can select for specific groups of bacteria that are not found in the phyllosphere of tree species in the Atlantic Forest, and vice versa, where the conversion of forests to agriculture may lead to a reduction of bacterial beta diversity. The results of the phylogenetic affiliation between the phyllospheres of Tichilia clausenii, subjected to different intensities of UV radiation, also showed a predominance of clones associated with Proteobacteria in the evaluated clone libraries. The light factor, which was evaluated during the same period, showed no effect on the bacterial community, however, seasonal effects were quite evident, showing a higher diversity and species richness during the rainy season. This data suggests that epiphytic bacteria are equipped with a high degree of adaptation to different environmental conditions that they are exposed to.

Micorrizas arbusculares (MAs) são simbioses mutualistas formadas entre fungos do solo e a maioria das plantas terrestres, principalmente angiospermas. Esta simbiose pode trazer uma série de benefícios para o hospedeiro vegetal, como uma maior absorção de fosfato, um aumento na tolerância ao estresse abiótico e biótico, e resistência a agentes patogênicos, resultando numa melhor adaptação ao meio. É possível que hormônios vegetais estejam envolvidos em eventos de sinalização entre fungos micorrízicos arbusculares e plantas hospedeiras, durante os processos de colonização das raízes e de desenvolvimento dos arbúsculos. Recentes estudos têm demonstrado que durante o estabelecimento da simbiose, ocorre uma reprogramação da expressão de um grande número de genes, e que essas alterações na expressão gênica podem estar associadas a alterações dos níveis de hormônios nas plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento de MAs em mutantes de tomateiro cv Micro-Tom (MT) insensível ao ácido jasmônico (jai1-1), superprodutor de etileno (epi) e duplo mutante epijai1 inoculados com Glomus clarum em condições de baixa concentração de fósforo no substrato, e a expressão de genes relacionadas à biossíntese do ácido jasmônico (AJ) (OPR3 e AOC) e do etileno (ET) (ACO4 e ACS2). O mutante jai1-1 não apresentou colonização intrarradicular e o acúmulo de transcritos tanto para a via de biossíntese do AJ como do ET foi relativamente menor do que o controle MT o que sugere a importância do AJ para o desenvolvimento da simbiose.O mutante epi e o duplo mutante apresentaram colonização intraradicular reduzida em relação ao controle MT. O acúmulo de transcritos dos genes da via do ET (ACO4 e ACS2) e do AJ (OPR3 e AOC) foi maior no mutante epi. A insensibilidade ao AJ presente no duplo mutante não impediu o acúmulo de transcritos para as vias de biossíntese do AJ e do ET, o que sugere uma relação sinérgica entre os hormônios vegetais no estabelecimento da simbiose. Arbuscular mycorrhizal (AM) symbioses are formed between mutualistic soil fungi and most land plants, particularly angiosperms. This symbiosis can bring many benefits to the host plant, such as increased absorption of phosphate, an increase in tolerance to abiotic and biotic stress, and resistance to pathogens, resulting in better adaptation to the environment. Its possible that plant hormones are involved in signaling events between mycorrhizal fungi and host plants during the processes of colonization of roots and development of arbuscules. Recent studies have shown that during the establishment of symbiosis, there is a reprogramming of the expression of a large number of genes, and that these changes in gene expression may be associated with altered levels of hormones in plants. The aim of this study was to evaluate the development of MA in mutants of tomato cv Micro-Tom (MT) insensitive to jasmonic acid (jai1-1), ethylene overproducer (epi) and double mutant epijai1 inoculated with Glomus clarum under low phosphorus concentration in substrate, and the expression of genes related to biosynthesis of jasmonic acid (JA) (and OPR3 AOC) and ethylene (ET) (ACO4 and ACS2). Jai1-1 mutant showed no intraradical colonization and the accumulation of transcripts for both the biosynthesis of JA and ET was less than the control MT suggesting the importance of JA for the development of epi and double mutant symbiosis. The mutant epi and the double mutant showed reduced intraradical colonization when compared to the control MT. The transcript accumulation of the ET (ACO4 and ACS2) and JA (OPR3 and AOC) genes was higher in the mutant epi. The insensitivity to the JA in this double mutant did not prevent the accumulation of transcripts for the biosynthetic pathways of JA and ET, suggesting a synergistic relationship between plant hormones for the establishment of symbiosis.

O déficit hídrico é o principal fator limitante na produtividade das culturas agrícolas. A exposição das plantas a este estresse pode resultar em dano oxidativo devido ao aumento na produção de espécies ativas de oxigênio (EAOs). O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do déficit hídrico, em 20 variedades de cana-deaçúcar, através da resposta do sistema antioxidante. O déficit hídrico foi imposto pela supressão da irrigação durante 3, 10 e 20 dias. A peroxidação lipídica, mensurada através do conteúdo de MDA, e a concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) foram utilizados como indicativos da ocorrência de estresse oxidativo. A resposta do sistema antioxidante variou em função das variedades estudadas e da intensidade do estresse aplicado. Todavia, após 3 dias de supressão da irrigação não ocorreu variação no perfil protéico em SDS-PAGE, no conteúdo de MDA, H2O2, prolina e na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPOX) e glutationa redutase (GR), para a maioria das variedades estudadas. Entretanto, aos 10 dias de supressão da irrigação, com exceção da GR, a maioria das variedades demonstrou incremento nestes parâmetros. Após 20 dias todos os genótipos demonstraram incremento no conteúdo de MDA, em relação ao controle, refletindo os danos causados pelo estresse oxidativo. As variedades que demonstraram redução na atividade das enzimas SOD e APX, 20 dias após a suspensão da irrigação, apresentaram maior incremento na peroxidação lipídica e conteúdo de H2O2. Estes resultados sugerem que sob déficit hídrico moderado, a maioria das variedades foi capaz de induzir a atividade das enzimas antioxidantes. Entretanto, à medida que o déficit hídrico torna-se mais severo pode ocorrer o colapso do sistema de defesa antioxidante, sendo a SOD e APX as enzimas mais afetadas. Water deficit is the major yield-limiting factor of crop plants. Plant exposure to this abiotic stress can result in oxidative damage due to the over production of reactive oxygen species (ROS). The aim of this work was to study the effects of water deficit in 20 sugarcane genotypes in response of the antioxidant system. Water deficit was imposed by withholding irrigation during 3, 10 and 20 days. Lipid peroxidation, measured as MDA content, and hydrogen peroxide (H2O2) was used as oxidative stress markers. Antioxidant system response ranged according to genotypes and stress intensity. After 3 days of withholding irrigation, no variation in protein profile (SDSPAGE), MDA content, H2O2, proline and activity of antioxidant enzymes superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), guaiacol peroxidase (GPOX) and glutathione reductase (GR) was observed, in the majority of genotypes. However, 10 days after withholding irrigation, the majority of genotypes showed increase in these parameters. After 20 days, all genotypes showed increase in MDA content, compared with control plants, reflecting the damage caused by oxidative stress. Genotypes that showed decrease in the activity of SOD and APX, 20 days after withholding irrigation, presented high increase in lipid peroxidation and H2O2 content. These results suggest that under moderate water deficit, the majority of genotypes were able to induce the activity of antioxidant enzymes. However, as the water deficit became more severe the collapse of antioxidant system can occur, being SOD and APX the more affected enzymes.

As espécies selvagens relacionadas ao tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill. Syn. Solanum lycopersicum L) em latitudes do Sul do Equador ao norte do Chile. Estas condições ambientais contrastantes possibilitaram o aparecimento de grande diversidade genética dentre estas espécies. Lycopersicon cheesmanii f .minor (Hook.f.) C. H. Hill. Syn. Solanum galapagense S. Darwin & Peralta é endêmica das Ilhas Galápagos e possui características peculiares, como porte reduzido, dormência de sementes e folhas bastante recortadas. Estas características também estão presentes em mutantes de tomateiro com deficiência no hormônio giberelina (GA). Mutações em GA como gib1, gib2, gib3 (deficientes) e procera (resposta constitutiva) são amplamente conhecidas em tomateiro. Já os alelos Sp (Self Pruning) e Pts (Petroselinum), presentes em S. galapagense, alteram altura e recorte foliar, respectivamente. Visando entender a natureza destas variações genéticas naturais, foram feitos cruzamentos e retrocruzamentos sucessivos de S. galapagense com a cultivar miniatura de tomateiro Micro-Tom (MT), onde tentou se isolar plantas segregando para características presentes no parental selvagem (dormência, nanismo e maior recorte foliar). Na geração BC1F2 foram selecionados indivíduos com porte menor que MT e folhas com bordos muito recortados. Sementes BC1F3 apresentaram taxa de germinação de 47,6 %, contrastando com o valor 94,5 % apresentado por MT. Entretanto, após aplicação de 100 µM de GA3 a taxa de germinação de BC1F3 foi elevada para 72 %. Em análise de curvas de dose-resposta a GA, as plantas BC1F3 apresentaram menor porte que MT, sendo que este nanismo não foi completamente revertido aplicando-se GA. Em gerações avançadas de retrocruzamentos, constatou-se que a dormência de sementes foi perdida durante as introgressões. Tal constatação leva a crer que o principal componente da dormência de S. galapagense não está ligado ou é efeito pleiotrópico dos genes que respondem pelo seu nanismo ou recorte foliar. A análise de segregação de 278 plantas BC4F2 mostrou que o principal componente do nanismo de S. galapagense segrega na proporção 3:1, sendo a mutação recessiva presente em S. galapagense denominada galapagos dwarf (gdw). Plantas quase isogênicas a MT (geração BC6Fn) foram obtidas carregando os alelos Pts, Sp e gdw. Experimentos comparando-as com MT confirmaram que o alelo Pts aumenta pronunciadamente o recorte foliar de tomateiro e diminui ligeiramente a germinação e o porte das plantas. Tal observação está de acordo com a descoberta recente de que PTS codifica para um gene da classe KNOX, que podem estar envolvidos com GA. Em cominação com Pts, esse alelo parece ter efeito discreto no recorte foliar, mas somente em combinação com Pts. Surpreendentemente, sementes Sp tiveram germinação precoce, comparadas com MT (sp). Já o alelo gdw não mostrou ter efeito na germinação, mas confirmou afetar a altura e o recorte foliar. Esses resultados evidenciam que porte reduzido e folhas bastante recortadas de S. galapagense podem ser atribuídos principalmente a gdw e Pts. A dormência parece ser controlada por outro(s) gene(s) ainda desconhecido(s). Como o novo gene descoberto, GDW, não afeta a germinação, é pouco provável que esteja ligado a GA, podendo ser uma nova classe de genes controlando nanismo. The tomato (Lycopersicon esculentum Mill. Syn. Solanum lycopersicum L) related wild species evolved into a wide range of latitudes, from the southern of Ecuador to the northern of Chile. These contrasting environment conditions allowed the emergence of great genetic diversity among these species. Lycopersicon cheesmanii f. minor (Hook.f.) C. H. Hill. Syn. Solanum galapagense S. Darwin & Peralta is endemic in the Galapagos Islands and has characteristics such as small plant size, dormant seeds and profusely divided leaves, being these characteristics also common in tomato gibberellin (GA) mutants. GA mutants such as gib1, gib2, gib3 (deficient), and procera (constitutive) are widely known in tomato. In addition to the afore mentioned mutations, the alleles Sp (Self Pruning) and Pts (Petroselinum), present S. galapagense, lead to changes in plant height and leaf architecture, respectively. Aiming at the understanding of such natural genetic variations, successive crosses and backcrosses of S.galapagense with the miniature tomato cultivar Micro-Tom (MT) were made, attempting to isolate plants segregating characteristics of the parental wild species (dormancy, dwarfism, and increased leaf indentation). In the BC1F2 generation were selected individuals shorter than MT, and with more serrated leaf margins or with more leaflets when compared to MT. BC1F3 seeds showed germination rates of only 46.7 %, contrasting with the 94.5% of MTs germination. However, after the application of 100 µM GA, the rate of germination of BC1F3 was increased to 72 %. Analysis GA dose-responses showed that the BC1F3 plants displayed smaller sizes than the MT plants, and this dwarfism was not completely reversed by GA applications. In advanced backcross generations, it was found that the dormancy of seeds was lost during the process of introgression, since the selection was not for this trait, but only for plant with small size and/or more divided leaves. This finding suggests that the main component of dormancy of S.galapagense is not connected to or is not a pleiotropic effect of the genes for dwarfism and leaf shape. The analyzes of the segregation of 278 BC4F2 plants, already harboring the alleles sp and pts from MT, showed that the main component of the dwarfism of S. galapagense segregates in the proportion 3:1, and then, the recessive mutation present in this specie was named galapagos dwarf (gdw). Plants nearly isogenic to MT (BC6Fn generation) were obtained carrying the alleles Pts, Sp and gdw. Experiments comparing these plants with MT confirmed that the allele Pts produces more divided leaf and leaflets, and showed that this allele has a slight effect in reducing seed germination and plant size. This observation is consistent with the recent discovery that Pts codes for a gene from the KNOX class, which may be involved with the GA hormone. The Sp allele had no direct effect on plant height, but only indirectly due to its indeterminate growth. This allele seems to have a slight effect on leaf shape, but only in combination with Pts. Surprisingly, Sp seeds had an early germination when compared to MT (sp). On the other hand, the allele gdw did not show any effect on germination, but confirmed to affect plant height and leaf architecture. Taken together, these results showed that the reduced plant size and the profusely divided leaves of S. galapagense can be attributed mainly to the effect of Pts and gdw alleles. Regarding seed dormancy, this trait appears to be controlled by other(s) gene(s), yet unknown, although Pts also contributes to this characteristic. Since the new gene that we discovered, GDW, does not affect the germination, it is unlikely that it can be linked the GA hormone, but it may represent a new class of genes controlling an important agronomic trait, the dwarfism.