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In this work we analyze genomic neighborhood of a gene as a source of functional information. Using concept of Similarity-Neighborhood graph we show presence of non-trivial relations between genomic neighbors in the context of several genomes. We also show that while for prokaryotes the existence of such relations can be deduced from the operonic organization of prokaryotic genomes, these relations can also be detected in the eukaryotic genomes where such organization is not common (with notable exception of Caenorhabditis elegans and possibly othermembers of Nematodae). We demonstrate applicability of the our method for uncovering gene's function and studying properties of genomes. We also demonstrate the techniques and tools developed for the analysis of genomic data. PEDANT genome system has been developed by our group and served as a main foundation for development of Similarity-Neighborhood approach, with the latter coming into life as a separate gene-function prediction tool - SNAPper web server. We discuss the techniques hiding behind our all-against-all protein alignment database, which has been developed as part of PEDANT genome analysis system. Such database is the requirement for nearly any cross-genome comparison approach, as it provides the basis for delineating of orthologous and paralogous groups of genes. One of such approaches - phylogenetic profiling, has been implemented by us in collaboration with Philip Wong and Walid Houry of University of Toronto, as highly flexible Web-based tool called PWP. The Jaba visualisation tool which we developed for manual analysis of the genomes and multiple gene predictions and which has been extensively used in several genome projects, including large eukaryotic genome projects such as Arabidopsis thaliana and Neurospora crassa is also presented. Wir untersuchen genomische Nachbarschaft as eine Quelle funktioneller Informationen über Gene. Basierend auf dem Konzept von Simlarity-Neighborhood Graphen wird gezeigt, wie nicht-triviale Verhältnisse zwischen benachbarten Genen aufgedeckt werden können. Während in Prokaryoten das Vorhandensein solcher Korrelationen auf die Operonstrukturen zurückverfolgt werden kann, wurde dieses Phänomen auch in einigen eukaryontischen Genomen entdeckt, wo Operone in der Regel nicht vorkommen. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieser Methode zur Genfunktionsvorhersage und Untersuchung von Genomeigenschaften. Darüber hinaus werden folgende Techniken zur Genomanalyse vorgestellt: a) Eine Web-Ressource zur Untersuchung von Similarity-Neighborhood Graphen, b) Die Datenbank von Alignments zur Berechnung von paralogen und orthologen Gengruppen, c) Ein phylogenetic profiling Werkzeug, d) Ein Programm zur Visualisierung genomischer Informationen und multiplen Genvorhersagen.

Die Bindungseigenschaften des humanen Apolipoprotein D (ApoD), eines Vertreters der Lipocalin-Proteinfamilie, wurden so verändert, daß anstelle der natürlichen niedermolekularen Liganden ein vorgegebenes Protein-Antigen erkannt wird. Dazu wurde die gentechnische Produktion des ApoD in E. coli etabliert und dessen Bindungseigenschaften charakterisiert, wobei Progesteron und Arachidonsäure als physiologische Liganden bestätigt wurden, nicht jedoch andere Verbindungen, die zuvor als Liganden diskutiert worden waren. Durch kombinatorisches Protein-Design wurde eine Varianten-Bibliothek des ApoD hergestellt, aus der ein sogenanntes Anticalin mit Bindungsaktivität für den exemplarischen Liganden Hämoglobin mit einer Komplex-Dissoziationskonstante von 2,16 µM isoliert wurde. The binding properties of human apolipoprotein D (ApoD), a member of the lipocalin protein family, were modified in a way that the protein recognized a prescribed antigen instead of its natural low molecular weight ligands. Therefore, the production of ApoD in E. coli was established and its binding properties were analyzed. Progesterone and arachidonic acid formed complexes with ApoD, but not other compounds which were dicussed as ligands. By means of combinatorial design, a library of variants of ApoD was generated, from which a so called anticalin with binding activity for an exemplary ligand, hemoglobin, with a complex dissociation constant of 2.16 µM was isolated.

Holins are small hydrophobic proteins causing non-specific membrane lesions at the end of bacteriophage multiplication, to promote access of the murein hydrolase to their substrate. We have established a lambda-delta-Sthf genetic system, which enables functional expression of holins from various phages in an isogenic phage lambda background, and allows qualitative evaluation of their ability to support lysis of Escherichia coli cells. Synthesis of holins is under control of native lambda transcription and translation initiation signals, and the temperature-sensitive CIts857 repressor. A number of different holins were tested in this study. The opposing action of phage lambda S105 and S107 holin variants in lysis timing could be confirmed, whereas we found evidence for a functionally non-homologous dual translational start motif in the Listeria phage Hol500 holin. The largest holin known, HolTW from a Staphylococcus aureus phage, revealed an early lysis phenotype in the lDSthf background, which conferred a plaque forming defect due to premature lysis. Mutant analysis revealed that an altered C-terminus and/or a V52L substitution were sufficient to delay lysis and enable plaque formation. These results suggest that the extensively charged HolTW C-teminus may be important in regulation of lysis timing. Gene 17.5 product of E. coli phage T7, and Gp T from T4 was found to support sudden, saltatory cell lysis in the lDSthf background, which clearly confirms their holin character. In conclusion, lDSthf offers a useful genetic tool for studying the structure-function relationship of the extremely heterogeneous group of holin protein orthologs. MscL, the mechanosensitive channel forming protein, which shares main structural features with holins of was unable to complement the lysis defect of lDSthf, confirming specitivity of holin function. The functional properties of Hol118 holin from Listeria monocytogenes bacteriophage A118 were analysed in detail. The gene was cloned into lDSthf, whose CIts857 repressor allows precise estimation of the cell lysis event mediated by a cloned holin, through the possibility to heat-induce the lytic cycle in lysogenized E. coli. Native hol118 caused relatively late cell lysis, beginning at 90 min after induction. Lysis could not be prematurely triggered with energy poisons, indicating that the energized membrane does not inhibit permeabilization by this holin. Immunological analyses demonstrated that Hol118 appears in the inner membrane fraction of infected cells 20 min after phage multiplication starts in induced E. coli. Hol118 could also be detected in A118-infected Listeria monocytogenes cells. Since hol118 features a dual start, different N-terminally modified Hol118 variants were tested for differences in lytic properties. Changing the ATGs encoding M1 or M4 into CTG had no significant influence on lysis timing, indicating that these alleles do not assume the effector/inhibitor roles described for S. Toeprinting assays of hol118 mRNA revealed use of an additional ATG start codon at position 40, encoding M14. Using in vitro approaches, we were able to demonstrate that a Hol118(83) variant is actually translated from the hol118 transcripts. This N-terminally truncated holin lacks the first predicted transmembrane domain. Although it appears in the cytoplasma membrane, it is functionally deficient and unable to complement R in lDSthf. Changing the M14-encoding ATG into codons not used as translational starts (M14I, M14L) resulted in an accelerated, premature lysis phenomenon, pointing to an inhibitor function of Hol118(83). This hypothesis was further supported by the observation that hol118(83) expressed in trans also inhibited holin function. This suggests that the first transmembrane domain is indispensable for the permeablization process leading to pore formation. Based on our findings, we propose a new model of holin functional regulation, where the intragenic Hol118(83) acts as an functional inhibitor, and therefore constitutes a key part of the lysis clock of A118. The strict regulation and inhibition of poreforming aids to explain the long latend period of Listeria phage A118, where the onset of lysis under optimal conditions takes approximately 70 min, more than twice the time needed by phage l. The functional properties of Hol500 holin from Listeria monocytogenes bacteriophage A500 was also analysed, and compared to Hol118 and to Hol2438 from Listeria innocua. Native hol500 caused cell lysis, beginning at 60 min after induction of lDSthf::hol500. Here, lysis could be prematurely triggered with energy poisons, indicating that the energized membrane inhibits permeabilization by this holin. N-terminally modified Hol500 variants were tested for differences in lytic properties. Changing M14-encoding ATG into ATT resulted in accelerated cell lysis. Toeprinting assays on hol500 mRNA revealed use of M14 as a translational start pointing to the synthesis of a truncated protein from this position. We have shown that Hol118(83), the intragenic inhibitor of Hol118, can also inhibit Hol500 lysis, which further supports our model for regulation of lysis timing in these very similar Listeria holins. Hol2438 differs from Hol500 in the reduced net charge of the C-terminal domain, due to the lack of one lysine residue at the C-terminal end. This difference had a significant influence on lysis timing, confirming the crucial role for the distal part of the C-terminus of Listeria holins tested in this work. In dieser Arbeit wurde die Struktur-Funktionsbeziehung von Holinen, phagencodierten Membranproteinen in einem einheitlichem genetischen Hintergrund untersucht. Für den zeitlichen Verlauf und die effektive intrazelluläre Lyse von phageninfizierten Bakterien ist außer den Endolysinen als Mureinhydrolasen meist noch ein zusätzliches Protein nötig, welches über Porenbildung in der Cytoplasma-Membran den Durchtritt der Endolysine an das Zellwand-Substrat ermöglicht. Diese kleinen hydrophoben Proteine werden aufgrund ihrer Funktion als Holine bezeichnet. Die Primär-Sequenzen der Holinen sind sehr heterogen; es gibt fast keine signifikanten Homologien, außer bei einzelnen Phagen von taxonomisch sehr nah verwandten Bakterien. Hier wurde ein Derivat von dem Phagen Lambda-gt11 konstruiert, Lambda-delta-Sthf, in dem das S Holin Gen vollständig deletiert wurde und eine eingeführte EcoRI - Schittstelle die Einklonierung einen heterologen Holin Gens erlaubte. Die Lysisgen-Kassette mit dem klonierten Holin Gen konnte mittels Prophagen-Induktion von lDSthf durch Inaktivierung des temperatur-sensitiven Cits857 Repressors exprimiert werden. Beobachtung und Verlauf des zeitlichen Verlaufes der Lyse ermöglichte einen Vergleich der Funktion verschiedener Holine. Als erstes wurden die in der Funktion unterschiedliche Varianten von Lambda S getestet. Die Expression des S105 Effektors führte zu sehr schneller, vorzeitiger Lyse, während der Inhibitor S107 deutlich schlechter lysierte. Das größte bis jetzt bekannte Holin des Staphylococcus aureus Phagen Twort verursachte eine vorzeitige Lyse die zu einem "Plaque Defekt" führte. Die Holine der virulenten E. coli Phagen T4 (gp T) und T7 (gp 17,5) führten zu einer schnellen, abrupten Lyse, die für diese in ihrer Struktur sehr unterschiedlichen Holinen fast identisch war. Außerdem wurde gezeigt das ein porenbildendes Membranprotein, MscL, welches den Holinen gemeinsame Sekundär-Strukturmerkmalen aufweist, in lDSthf keine Lyse verursachte. Das bedeutet, das die Funktion auch bei der extermen Heterogenität der primären Holinstrukturen spezifisch ist. Die membranpermeabilisierende Aktivität des Hol118 Holin des Listeria monocytogenes Bakteriophagen A118 wurde in lDSthf getestet. lDSthf::hol118 lysierte E. coli Zellen relativ spät, 90 min nach Induktion. Die Lyse konnte auch nicht durch eine Zerstörung des Membranpotentials vorzeitig induziert werden. Zwanzig Minuten nach der lDSthf::hol118 Prophagen-Induktion war Hol118 in der inneren Membranfraktion von E. coli immunologisch nachweisbar. Außerdem wurde das Hol118 Protein in der Membran der Listeria Zellen nach A118 Infektion nachgewiesen. Um den potentiellen doppelten Start zu untersuchen, wurden Mutationen im N-Terminus eingeführt und der Effekt dieser Mutationen getestet. Veränderungen des ersten und vierten ATGs hatten keinen bedeutenden Einfluß auf den zeitlichen Verlauf der Lyse. "Toeprinting" auf der hol118 mRNS zeigte ein zusätzliches ATG Start Kodon an Nukleotid-Position 40 in hol118. In vitro Versuche zeigten daß diese Hol118(83) Variante von hol118 tatsächlich translatiert wird. Das gekürzte Protein kann nur zwei Transmembrandomänen in der Membran bilden, ist nicht mehr funktionsfähig und kann R in lDSthf nicht mehr komplementieren. Diese funktionellen Eigenschaften von Hol118(83) zeigten eindeutig das die erste Transmembrandomäne für die porenbildende Funktion des Holin essentiell ist. Ersatz des M14 ATG Kodons in die für die Initiation der Translation in der Regel nicht verwendeten CTG or ATT (M14L, M14I) führte zu zunehmend schnelleren Lyse. Diese Ergebnisse deuten auf eine Inhibitor-Funktion für Hol118(83) hin. Hol118(83) inhibierte auch in trans Hol118 induzierte Lyse. Auf Grund dieser Ergebnisse wird ein neues Modell postuliert: Hol118(83), das an Nukleotid-Position 40 des hol118 Gens startet funktioniert als der Inhibitor der Lyse, und hat somit einen Einfluß auf die Regulation der Dauer der Latenzphase des A118 Bakteriophagen. Die Aminosäuresequenzen der Holine Hol118 und Hol500 unterscheiden sich nur in sieben Aminosäuren, haben aber unterschiedliche membranpermeabilisierende Aktivitäten in lDSthf. lDSthf::hol500 lysierte die E. coli Zellen schneller und effizienter als Hol118. Das Membranpotential der Zelle hatte hier einen inhibitorischen Effekt auf die Lyse; die Inaktivierung des Membranpotentials führte zu einer vorzeitigen Lyse. Wie bei Hol118 wurden Mutationen in den N-Terminus eingeführt und getestet. Die Änderungen des vierten Methionins in Leucin oder Isoleucin verstärkten die lytische Aktivität, während die Inaktivierung des ersten ATGs zu einer verzögerten Lyse führte. "Toeprinting" auf der hol500 mRNS zeigte ebenfalls ein zusätzliches intragenes ATG Start Kodon an Position 40. Die Änderung ATG zu ATT hatte einen identischen funktionellen Effekt wie in hol118: Beschleunigung der Lyse. Exprimiert in trans inhibierte Hol118(83) die Hol500-induzierte Lyse. Da die Unterschiede in der Aminosäuresequenzen zwischen Hol118 und Hol500 minimal sind kann das postulierte Modell der Lyseinhibition für A118 auf den Phagen A500 erweitert werden. Hol2438 unterscheidet sich von Hol500 nur in einer Aminosäure des C-terminalen Bereichs. Das fehlende Lysin reduzierte die positive Ladung des C-Terminus was im Vergleich zu Hol500 zu einer Beschleunigung der Lyse führte.

In den letzten Jahren wurden zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen vermehrt bispezifische F(ab)2-Fragmente entwickelt. Insbesondere wird die Strategie verfolgt, cytotoxische Effektorzellen durch spezifische Vermittlung eines Kontakts zwischen den Tumorzellen und dem tumorassoziierten Antigen lokal zu aktivieren. Beispielsweise wird die Therapie des Hodgkin-Lymphoms angestrebt, indem das Fab-Fragment HRS3 einerseits das Antigen CD30 auf den lymphatischen Tumorzellen erkennt und andererseits das Antikörperfragment A9 den Fc-gamma-Rezeptor III (CD16) auf natürlichen Killerzellen bindet und aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die proteinchemischen Grundlagen für die Konstruktion eines humanisierten bispezifischen F(ab)2-Fragments zum Zweck der Tumortherapie refraktärer Hodgkin-Lymphome zu schaffen. Um die Antigene CD16 und CD30 in ausreichender Quantität und Qualität zu produzieren, wurden Vektoren für die Expression der extrazellulären Domänen als Fusionsproteine mit dem Strep-tag-Affinitätsanhängsel im Periplasma von E. coli konstruiert. Beim CD16-Antigen ließ sich auf diese Weise der die Aminosäuren 3-176 umfassende Bereich (CD16B) mit der kompletten extrazellulären Domäne mit Ausbeuten von 50 µg/L Kulturmedium (OD550 = 1) in löslicher Form gewinnen. Im Fall des CD30-Antigens mit seiner in zwei Subdomänen untergliederten extrazellulären Region wurde ein Fragment mit der C-terminalen Subdomäne (Aminosäuren 185-335; CD30A) für die gentechnische Herstellung ausgewählt, das sich mit Ausbeuten von 100 µg/L Kulturmedium (OD550 = 1) produzieren ließ. Mit Hilfe des Quadromantikörpers A9/HRS3 konnte sowohl im ELISA als auch mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie gezeigt werden, daß die rekombinanten Antigenfragmente CD16B und CD30A jeweils dasjenige Epitop trugen, welches vom entsprechenden Fab-Teil des bispezifischen Antikörpers erkannt wird. Ebenso wurde die spezifische Interaktion der in E. coli funktionell hergestellten chimären Fab-Fragmente muA9 und muHRS3c mit den entsprechenden rekombinanten Antigenfragmenten nachgewiesen und durch Gleichgewichtsanalyse folgende Dissoziationskonstanten ermittelt: muA9: 49.1 ± 2.8 nM; muHRS3c: 25.9 ± 2.8 nM. In guter Übereinstimmung dazu sind die aus der kinetischen Analyse ermittelten Dissoziationskonstanten. Die Auswertung der Kinetik ergab für die Komplexbildung aus dem muA9 Fab-Fragment und CD16B eine Geschwindigkeitskonstante kon von 2.4*105 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 1.5*10-2s-1, woraus sich eine Dissoziationskonstante von 63 nM errechnet. Für die Bildung des Komplexes aus dem muHRS3c Fab-Fragment und CD30A wurde eine kon von 8.6*104 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 2.0*10-3s-1 bestimmt, was eine Dissoziationskonstante von 24 nM ergab. Für die kovalente Kopplung zweier Fab-Fragmente zum F(ab)2-Fragment wurden zwei Sequenzmotive mit zwei bzw. einem freien Cysteinrest am C-Terminus der leichten Immunglobulinkette entwickelt. Mit Hilfe des Sequenzmotivs mit zwei freien Cysteinresten konnten die beiden Fab-Fragmente muA9 und muHRS3c über Disuldfidbrücken mit einer Kopplungsausbeute von 70 % zum F(ab)2-Fragment verknüpft werden. Im ersten Schritt dieses zweistufigen Kopplungsverfahrens wurden die freien Cysteinreste des muHRS3c Fab-Fragments in einer Thiol/Disulfidaustauschreaktion mit dem Ellman´s Reagenz DTNB derivatisiert. Nach Isolierung des entstandenen gemischten Disulfids wurde dieses mit dem muA9 Fab-Fragment in einer weiteren Thiol/Disulfidaustauschreaktion umgesetzt. Im Falle des Sequenzmotivs mit nur einem freien Cysteinrest gelang die Kopplung nach diesem Verfahren mit Ausbeuten von 55 %. Außerdem konnten zwei muHRS3c Fab-Fragmente mit zwei freien Cysteinresten über Thioetherbindungen mittels dem Linkerreagens o-Phenylendimaleimid regioselektiv mit Ausbeuten von 30-40 % zum bivalenten F(ab)2-Fragment gekoppelt werden. Um die Immunogenität der murinen variablen Domänen des Fab-Fragments zu reduzieren, wurde in dieser Arbeit der HRS-Antikörper mittels CDR-Transplantation humanisiert. Das resultierende humanisierte huHRS3 Fab-Fragment wurde in E. coli produziert und durch Metallchelat-Affinitätschromatographie gereinigt. Die mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie bestimmte Dissoziationskonstante war mit 278 ± 61 nM um Faktor 10 geringer war als die des zugrundeliegenden chimären muHRS3c Fab-Fragments. Die Untersuchung zur Ursache des Verlustes an Antigenaffinität anhand hybrid gepaarter variabler Domänen ergab, daß dieser Effekt hauptsächlich auf die humanisierte VH-Domäne zurückzuführen war. Diese wurde daher einer in vitro-Affinitätsmaturierung unterzogen. Mittels Error Prone PCR wurde eine huVH-Genbibiliothek mit Zufallsmutationen präpariert und diese in Form des rekombinanten Fab-Fragments im Kolonie-Filterstapel-Test auf verbesserte Bindung des markierten CD30A-Antigens durchmustert. Nach dreimaligem Durchlaufen des Affinitätsmaturierungszyklus wurde die Variante EP3/1 isoliert, welche insgesamt vier Aminosäuresubstitutionen – zwei in FR-H3 und zwei in CDR-H3 – aufwies. Im ELISA bzw. FACS zeigte diese Mutante ein nahezu identisches Bindungsverhalten an rekombinantes CD30A-Antigen bzw. CD30-positive L540 CY-Zellen wie das ursprüngliche chimäre muHRS3c Fab-Fragment. Die mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie für die Variante EP3/1 ermittelte Dissoziationskonstante nach der Gleichgewichtsanalyse betrug 58 ± 10 nM und war somit im Vergleich zum ursprünglich humanisierten HRS3 Fab-Fragment um den Faktor 5 verbessert. Die Auswertung der Kinetik ergab für die Komplexbildung eine Geschwindigkeitskonstante kon von 5.1*104 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 2.0*10-3 s-1, woraus sich eine Dissoziationskonstante von 40 nM errechnet. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen, um in Kombination mit einem humanisierten anti-CD16 Fab-Fragment ein vollständig humanisiertes bispezifisches anti-CD16/anti-CD30 F(ab)2-Fragment in ausreichenden Mengen zu ökonomischen Bedingungen für Tierversuche und spätere therapeutische Anwendungen bereitzustellen. In the last few years the immunotherapy of tumour diseases with bispecific F(ab)2 fragments became more and more interesting. Especially the strategy of activating cytotoxic effector cells by crosslinking them with tumour cells via the tumour associated antigen is promising. For example, this method can be used to therapy the Hodgkin lymphoma disease. Then, one arm of the bispecific construct, the Fab fragment HRS3, binds to the CD30 on lymphatic tumour cells, and the other, the A9 Fab fragment, binds to the Fc-gamma receptor III on natural killer cells and activates them. The aim of this thesis was the development of the proteinchemical basis for the construction of a humanized bispecific F(ab)2 fragment for immunotherapy of the Hodgkin lymphoma disease. To produce the antigens CD16 and CD30 in sufficient quantity and quality in E. coli vectors for the periplasmic expression of the extracellular domains as fusion proteins with the Strep-tag were constructed. Regarding the CD16 antigen the region with the amino acids 3-176 (CD16B) with nearly the complete extracellular domain could be isolated in soluble form with yields of 50 µg/L culture (OD550=1). In the case of the CD30 antigen with its extracellular domain divided in two subdomains a fragment with the C-terminal subdomain (amino acids 185-335; CD30A) was chosen for production. The yield was 100 µg/L culture (OD550=1). The binding of the original bispecific anti-CD16/anti-CD30 (A9/HRS3) monoclonal mouse antibody to the recombinant antigens CD16B and CD30A revealed that they carried the epitope recognized by the corresponding Fab-part of the bispecific A9/HRS3 monoclonal mouse antibody. Also, the specific interaction of the chimaeric Fab fragments muA9 and muHRS3c that were produced in E. coli could be detected. Following dissociation constants were determined by equilibrium analysis using surface plasmon resonance spectroscopy: muA9: 49.1 ± 2.8 nM, muHRS3c: 25.9 ± 2.8 nM. In good agreement to these are the dissociation constants from the kinetic analysis. For the formation of the complex between the chimaeric muA9 Fab fragment and CD16B the kinetic association constant kon was 2.4*105 M-1s-1, whereas the kinetic dissociation constant koff was 1.5*10-2s-1, yielding a dissociation constant of 63 nM. For the formation of the complex between the chimaeric muHRS3c Fab fragment and CD30A kon was 8.6*104 M-1s-1 and for the dissociation koff was 2.0*10-3s-1, resulting in a dissociation constant of 24 nM. For covalently coupling two Fab fragments to a F(ab)2 fragment two sequence motifs with one or two free cysteine residues at the C-terminus of the light chain were developed. Using the sequence motif with two free cysteine residues the two chimaeric Fab fragments muA9 and muHRS3c could be linked via disulfid bonds. The coupling efficiency was about 70 %. In the first step of this two-step coupling procedure the free cysteine residues of the chimaeric muHRS3c Fab fragment were reacted with Ellman´s Reagent DTNB in a thiol/disulfid exchange reaction. After isolation of the produced mixed disulfid it was reacted with the muA9 Fab fragment in a second thiol/disulfid exchange reaction. In the case of the sequence motif with only one free cysteine residue the coupling efficiency was about 55 %. Moreover, two chimaeric muHRS3c Fab fragments with two free cysteine residues could be linked to a bivalent F(ab)2 fragment via thioether bonds using the chemical linker o-phenylendimaleimide. The coupling efficiency was about 30-40 %. To reduce the immunogenicity of the murine variable domains the chimaeric muHRS3 Fab fragment was humanized by CDR grafting. The resulting humanized huHRS3 Fab fragment was produced in E. coli and purified by metal-chelat affinity chromatography. The dissociation constant determined by using surface plasmon resonance spectroscopy was 278 ± 61 nM and therefore a factor ten lower than for the original chimaeric muHRS3c Fab fragment. The analysis of the decrease in affinity revealed that this effect was mainly due to the humanized VH domain. Therefore, this domain was affinity maturated. Using error prone PCR a huVH gene library with random mutations was prepared. The corresponding Fab fragments were screened for improved binding towards CD30A antigen using a filter sandwich colony screening assay. After three rounds of this affinity maturation cycle the variant EP3/1 could be isolated. It contained four amino acid substitutions, of which two were in FR-H3 and two in CDR-H3. In ELISA and FACS this mutant revealed nearly identical binding towards recombinant CD30A antigen and CD30+ L540 CY-cells as the original chimaeric muHRS3c Fab fragment, respectively. The dissociation constant for the variant EP3/1 determined by equilibrium analysis was 58 ± 10 nM. Compared to the original humanized HRS3 Fab fragment the affinity could be improved by a factor of five. The kinetic analysis revealed for the complex formation a kinetic association constant kon = 5.1*104 M-1s-1 and for the complex dissociation a kinetic dissociation constant koff = 2.0*10-3 s-1, revealing a dissociation constant of 40 nM. Now, in combination with a humanized anti-CD16 Fab fragment a completely humanized bispecific anti-CD16/anti-CD30 F(ab)2 fragment can be produced in a sufficient amount for further studies.

Axone werden im ZNS von Wirbeltieren durch das Neuronale Inhibitorprotein Nogo-A aktiv am Aussprossen gehindert. Dies beschränkt die Plastizität des adulten ZNS, verhindert allerdings im Fall einer Läsion auch maßgeblich die neuronale Regeneration. Der mono-klonale Antikörper IN-1 (IgM/k) neutralisiert die inhibitorische Wirkung von Nogo-A und ermöglicht so die axonale Regeneration im ZNS. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zur Herstellung und Optimierung rekombinanter Fragmente des Antikörpers IN-1 sowie des neuronalen Inhibitors Nogo-A mittels Protein-Engineering einschließlich der Analyse ihrer Wechselwirkung entwickelt. Auf diese Weise wurden schließlich in vitro – im Gegensatz zu konventionellen Immunisierungsversuchen – Antikörper mit verbesserter Affinität und neutralisierender Aktivität erhalten. Für den IN-1 Antikörper wurde zunächst die bakterielle Produktion eines chimären Fab-Fragmentes im Fermenter-Maßstab soweit verbessert, daß es in ausreichender Menge für Zellkultur- und Tierexperimente zur Verfügung stand. Hierzu wurde eine vektorvermittelte Komplementierung der chromosomalen proBA-Deletion des prolin-auxotrophen E. coli K12-Stamms JM83 realisiert. Diese ermöglichte die Nutzung des überlegenen Sekretionsverhaltens von JM83 bei der Fermentation in einem Minimalmedium und führte zur Stabilisierung des Expressionsvektors durch den zusätzlichen metabolischen Selektionsdruck. Das chimäre IN-1 Fab-Fragment, dessen Ausbeute mit diesem Verfahren im Vergleich zu vorherigen Experimenten vervierfacht wurde, wurde mittels IMAC gereinigt und für Regenerations-Experimente verwendet. Im Zusammenhang mit der Behandlung von Rückenmarksläsionen bei Ratten konnte mit dem IN-1 Fab-Fragment eine signifikante Regeneration von verletzten zentralnervösen Neuronen erreicht werden. Auf der Grundlage des rekombinanten Wildtyp IN-1 Fab-Fragments wurde zudem die Reini-gung mittels der Thiophilen Adsorptionschromatographie etabliert. Dabei wurde das Fab-Fragment unabhängig von einem Affinitätsanhängsel (His6- oder Strep-Tag) in einem Schritt als löslicher Heterodimer aus der periplasmatischen Proteinfraktion von E. coli isoliert. Insbesonders für eine eventuelle therapeutische Anwendung von optimierten Varianten des IN-1 Fab-Fragments ist der Verzicht auf Affinitätsanhängsel vorteilhaft. Die vermutlich extrazelluläre und inhibitorisch aktive Domäne von Nogo-A wurde als lösliches Protein in E. coli hergestellt und durch Streptavidin-Affinitätschromatographie gereinigt. Das erhaltene Fragment NiFr2 war inhibitorisch aktiv und bildete die Grundlage für die In vitro-Affinitätsmaturierung des Antikörpers IN-1. Durch Herstellung eines rekombinanten Nogo-A Fragments (NiFr4) mit einem Strep-Tag sowie einem His6-Tag an den beiden Termini, welches durch IMAC und Streptavidin-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, konnten Reinheit und Homogenität der Präparationen im Vergleich zu NiFr2 maßgeblich verbessert werden. Dies war die Grundlage für den erstmaligen Nachweis der Antigen/Antikörper-Komplexbildung aus Nogo-A und dem IN-1 Fab-Fragment mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie. Bis zu Beginn der vorliegenden Arbeit war es aufgrund der geringen Affinität von IN-1 gegenüber dem vermuteten Antigen nicht gelungen, die direkte Bindung des Antikörpers an natives oder rekombinantes Nogo-A mit immunchemischen Methoden nachzuweisen und damit auf molekularer Ebene zu begründen. Ausgehend von dem IN-1 Fab-Fragment wurde daher ein Verfahren zur Affinitätsmaturierung bezüglich Nogo-A etabliert. Durch wiederholte Zyklen von ortsgerichteter Zufallsmutagenese und Durchmusterung der resultierenden Molekülbibliothek mit Hilfe eines Filterstapel-Tests auf verbesserte Bindung von NiFr2 wurde die Mutante II.1.8 des IN-1 Fab-Fragments erhalten. Das II.1.8 Fab-Fragment weist im Vergleich zu IN-1 insgesamt fünf Aminosäure-Substitutionen innerhalb von CDR-L3 auf und zeigt nachweisbare Bindung an natives Nogo-A bzw. an seine bakteriell produzierten Fragmente im ELISA. Die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem II.1.8 Fab-Fragment und NiFr4 wurde durch Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie mit 1 µM bestimmt. Das Wildtyp IN-1 Fab-Fragment zeigte unter denselben Bedingungen eine achtfach schlechtere Affinität. Damit wurde erstmals mit immunchemischen Methoden demonstriert, daß es sich bei dem Produkt des Nogo-A-Gens um das Antigen des Antikörpers IN-1 handelt. Im Gegensatz zum Wildtyp IN-1 wurden durch Verwendung des II.1.8 Fab-Fragments bei immunhistochemischen Experimenten myelinreiche Regionen im Hirn und Rückenmark der Ratte spezifisch angefärbt. Darüber hinaus zeigte das II.1.8 Fab-Fragment in Zellkultur-Experimenten eine konzentrationsabhängige neutralisierende Aktivität gegenüber der inhibitorischen Wirkung von Nogo-A, die deutlich über der des IN-1 Fab-Fragments lag. Damit wurde der Zusammenhang zwischen einer verbesserten proteinchemischen Bindung von Nogo-A durch das optimierte IN-1 Fab-Fragment und einer erhöhten neutralisierenden Aktivität gezeigt. Für eine mögliche therapeutische Anwendung von Nogo-A-bindenden rekombinanten Fab-Fragmenten wurden die variablen Domänen des II.1.8 Fab-Fragments humanisiert. Dazu wurden dessen CDRs auf die Gerüststruktur der variablen Domänen des humanen Anti-Thyroidperoxidase-Antikörpers TR1.9 übertragen. Das resultierende humII.1.8 Fab-Fragment wurde in E. coli produziert und mittels IMAC gereinigt. In ELISA-Experimenten wurde der Erhalt der Bindungsaktivität des humanisierten Fab-Fragments gegenüber dem rekombinanten Nogo-A Fragment NiFr2 nachgewiesen. Schließlich wurde die bakterielle Produktion von neuartigen Fusionsproteinen aus einem Fab-Fragment und dem Enzym TEM1 b-Lactamase etabliert. Deren bifunktionelle Eigenschaften im Hinblick auf die Antigenbindung und die Reporteraktivität wurden durch ELISA sowie enzymkinetische Experimente nachgewiesen. Damit wurde eine Grundlage für die Ver-wendung ähnlicher Fusionsproteine für diagnostische oder auch therapeutische Anwendungen geschaffen. The outgrowth of axons in the CNS of higher vertebrates is strongly restricted by the neuronal inhibitor protein Nogo-A leading to limited plasticity and the lack of neuronal regeneration after lesions. The inhibitory activity of Nogo-A can be neutralized by application of the monoclonal antibody IN-1 (IgM/k) which enables neuronal outgrowth and regeneration in the CNS. In this work the production and optimization of recombinant fragments of IN-1 and Nogo-A is described including the detection and analysis of their interaction in vitro. In contrast to conventional immunization experiments by the approach realized in this work it was possible to obtain antibodies with improved affinity and neutralizing activity. In a first step the high-scale production of a partially humanized (chimeric) IN-1 Fab-fragment was optimised allowing cell culture and in vivo experiments. Therefore the proline-auxotrophic Escherichia coli K12 strain JM83 harboring a newly constructed expression vector providing the proBA gene in trans was utilized for the production of the IN-1 Fab-fragment in a fermentor. The plasmid mediated complementation of the chromosomal proBA deletion abolished plasmid-loss observed in earlier experiments and enabled the utilization of JM83 as an expression strain with approved periplasmic protein secretion characteristics in the presence of minimal media. Using this strategy the yield of the chimeric IN-1 Fab-fragment could be improved by the factor of four. The obtained Fab-fragment was used for experiments in vivo and led to a significant regeneration of injured neurons in the spinal cord of adult rats. Furthermore, based on the chimeric IN-1 Fab-fragment an alternative purification procedure utilizing thiophilic adsorption chromatography (TAC) was established. By this way the Fab-fragment was isolated in one step from the periplasmic protein fraction of E. coli without the need for an affinity tag (e. g. His6- or Strep-Tag). This method should prove valuable in case of a therapeutic application of the IN-1 Fab-fragment when the presence of affinity tags might not be feasible. The putative extracellular domain of Nogo-A which is thought to carry its inhibitory activity was produced as a soluble protein in E. coli and purified by Streptavidin (SA) affinity chromatography. The obtained fragment NiFr2 revealed inhibitory activity and was used for in vitro affinity maturation of the antibody IN-1. In order to improve purity and homogeneity of the target protein a recombinant Nogo-A fragment (NiFr4) which carried a His6 tag in addition to the Strep-Tag was produced and purified by consecutive IMAC and SA affinity chromatography. Using NiFr4 in surface plasmon resonance spectroscopy it was possible to detect and analyze the formation of the antigen/antibody complex of Nogo-A and IN-1 for the first time. Due to the low antigen affinity of the IN-1 antibody it had not been possible to detect its binding to native or recombinant Nogo-A by conventional immunoassays until the begin of this work. Therefore a method for an in vitro affinity maturation concerning Nogo-A was established starting from the chimeric IN-1 Fab-fragment. After repeated cycles of site-directed random mutagenesis and screening the mutant II.1.8 of the IN-1 Fab-fragment was obtained carrying five side chain substitutions within CDR-L3 and showing detectable binding to native and recombinant Nogo-A in ELISA experiments. The dissociation constant for the complex with NiFr4 was determined in surface plasmon resonance measurements as approximately 1 µM. The affinity of the non-mutated IN-1 Fab-fragment was 8-fold lower. This proved for the first time that Nogo-A represents the antigen of the antibody IN-1. In contrast to the IN-1 Fab-fragment the engineered Fab-fragment appeared to be well suited for the specific detection of Nogo-A in immunochemical assays and for the histochemical staining of myelin-rich tissue sections. Most importantly, its concentration-dependent neutralizing effect on the Nogo-A inhibitory activity was significantly enhanced in cell culture. These experiments revealed the coherence between improved binding affinity to Nogo-A and the enhanced biological activity in the context of inhibitor neutralization in the CNS. As a further step to the therapeutic application of Nogo-A binding recombinant Fab-fragments in near future the variable domains of the II.1.8 Fab-fragment were humanized by CDR-grafting. The resulting humII.1.8 Fab-fragment was produced in E. coli, purified by IMAC and showed a detectable binding to recombinant Nogo-A fragments in ELISA. Finally, the bacterial production of fusion proteins constituted of an Fab-fragment and the enzyme TEM1 b-lactamase was established. The (bi-)functionality of this construct concerning antigen-binding and reporter activity was proven by ELISA and enzyme kinetic experiments. This new type of fusion proteins might serve as diagnostic or therapeutic tools in the future.

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