Search

Sepsis fra bakterier er en alvorlig tilstand som årlig krever mange liv. Selv om immunsystemet og det hemostatiske system samarbeider for å bekjempe bakterieinfeksjoner, kan dette i noen tilfelle skyte over mål. Derfor har vi i denne studien undersøkt om bakterieindusert aktivering av koagulasjon og inflammasjon reduseres av en dobbelthemming av komplementsystemet og toll-like reseptorer (TLR). Det ble benyttet en human fullblodsmodell for inflammasjon der blod fra friske givere tilsettes spesifikke hemmere av komplement og TLR etter stimulering med bla. Gram-negative og Gram-positive bakterier. Etter at rørene ble inkubert i ønsket tid kunne ulike analytter måles ved hjelp av flowcytometri, immunoassay (ELISA), tromboelastometri og polymerase kjedereaksjonen (qPCR). Den kombinerte behandlingen reduserte den Escherichia coli (E.coli)-induserte koagulasjonsaktiveringen målt som protrombin fragment 1+2 og vevsfaktor målt på mRNA nivå, uttrykt på monocyttenes overflate og uttrykt på mikropartikler i plasma. C1-INH, en multifunksjonell serin protease inhibitor, reduserte også denne bakterie-induserte koagulasjonsaktiveringen målt med tromboelastometri. Hemming av komplementfaktor C5 hadde også betydning for E.coli-indusert koagulasjon, men påvirket ikke koagulasjonen under normale forhold. Anti-CD14, som hemmer flere TLR enn den spesifikke TLR4/MD2 hemmeren eritoran, gav mest effektiv hemming av den bakterieinduserte vevsfaktoren og den inflammatoriske responsen. Komplementsystemet og TLR er begge nødvendig for å gjenkjenne bakteriene og starte den inflammatoriske responsen ved sepsis. En kombinert hemming ser ut til å kunne hindre overaktiveringen av denne responsen. Imidlertid gjenstår mye arbeid før kombinasjonshemmingen kan bli en del av sepsisbehandlingen sammen med antibiotika, og viktig støttende terapi som vasopressor og intravenøs væske. Sepsis is a serious and complex disease leading to 5 million deaths worldwide every year. Although the immune system is working hard to overcome the bacteria, the inflammatory response can escalate and attack the host. Antibiotic is given to kill the bacteria. By studying the complement system, and important part of primary immune system, and its reaction with another part of this system, the Toll-like receptors (TLRs), we aimed to improve the treatment of sepsis. We used a human blood model of inflammation developed at our Research Laboratory. Bacteria was added to blood from healthy donors and specific inhibitors of complement and TLRs were investigated as possible candidate drugs to treat sepsis. We observed that each of the two inhibitors reduced the detrimental effects induced by the bacteria, while the combination of the two virtually abolished bacteria-induced clotting and inflammatory responses. The thesis has given knowledge that may contribute to new treatment of sepsis.

Sepsis er fortsatt en alvorlig tilstand med høy mortalitet, til tross for mange år med intens forskning. Ved sepsis er det en systemisk inflammasjonsreaksjon som involverer komplement, koagulasjons- og kallikrein-kininsystemet. Den økte prokoagulante tilstanden som blant annet skyldes økt uttrykk av vevsfaktor (TF) vil bidra til disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC) og organsvikt. Det ble i denne studien undersøkt hvilken effekt C1-inhibitor (C1-INH) har på koagulasjonsaktiveringen ved Gram-negativ sepsis i en human fullblodsmodell. C3 hemmeren compstatin ble brukt for å sammenligne effekten av C1 INH med en ren komplementhemmer. Dette gjorde det mulig å studere om koagulasjonsaktiveringen i modellen er komplementmediert. Det ble benyttet en godt etablert human fullblodsmodell med E. coli og renset lipopolysakkarid (LPS) fra Escherichia coli (E. coli) som stimuli. Antikoagulanten lepirudin ble benyttet. Denne har ingen innvirkning pår komplementaktiveringen og hemmer koagulasjonsaktiveringen ved å hemme trombin direkte. Prøvene ble inkubert med stimuli og hemmere i 60 eller 120 minutter. Koagulasjonsaktiveringen ble målt som protrombin faktor 1 og 2 (protrombin F1+2) med ELISA. Relativ ekspressjon av TF mRNA ble bestemt ved hjelp av RT-qPCR. Det ekstracellulære TF uttrykket på bla. monocytter ble målt ved hjelp av flowcytometri. Aktiviteten av TF i plasma mikropartikler ble bestemt med en enzymatisk metode. Det terminale komplement komplekset (TCC) og lang pentraxin 3 (PTX3), en inflammatorisk mediator, ble målt med ELISA. En rekke (27) cytokiner i plasma ble analysert med multiplex teknologi. Både C1-INH og compstatin hemmet effektivt koagulasjonsaktiveringen målt som protrombin F1+2 etter tilsetting av E. coli og LPS i humant fullblod. Både E. coli og LPS stimuli ga økt nivå av membranbundet TF på overflaten av monocytter, TF mRNA og TF aktivitet i plasmamikropartikler. Denne økningen av TF ble effektivt redusert av C1-INH. Compstatin hemmet til sammenligning TF mRNA oppregulering og TF uttrykket på monocytt-overflaten, men ga en ikke-signifikant hemming av TF funksjon i plasmamikropartikler. E. coli indusert komplementaktivering målt som TCC ble også effektivt redusert både av C1-INH og compstatin. C1-INH reduserte syntesen av PTX3 og cytokiner, mens compstatin til sammenligning kun reduserte IL 8 nivået. Inaktivert C1-INH reduserte også E. coli og LPS-indusert koagulasjonsaktivering. Resultatene viser at C1-INH i høye konsentrasjoner kan redusere E. coli og LPS-indusert oppregulering av TF og koagulasjonsaktivering. Compstatin reduserte også E. coli og LPS-indusert oppregulering av TF uttrykk og koagulasjonsaktivering. Dette kan indikere at komplementaktivering spiller en viktig rolle for koagulasjonsaktiveringen under en Gram -negativ sepsis.