Search

The Brazilian National Regulatory Agency for Private Health Insurance and Plans has recently published a technical note defining the criteria for the coverage of genetic testing to diagnose hereditary cancer. In this study we show the case of a patient with a breast lesion and an extensive history of cancer referred to a private service of genetic counseling. The patient met both criteria for hereditary breast and colorectal cancer syndrome screening. Her private insurance denied coverage for genetic testing because she lacks current or previous cancer diagnosis. After she appealed by lawsuit, the court was favorable and the test was performed using next-generation sequencing. A deletion of MLH1 exon 8 was found. We highlight the importance to offer genetic testing using multigene analysis for noncancer patients. Recentemente a Agência Nacional de Saúde publicou nota técnica que define os critérios para a cobertura de teste genético para diagnóstico de câncer hereditário. Aqui mostramos o caso de uma paciente com nódulo benigno na mama e com extenso histórico de câncer, e que foi encaminhada a um serviço privado de aconselhamento genético. A paciente se enquadra em ambos critérios para rastreamento de síndrome de câncer de mama e colorretal hereditário. O seguro de saúde da paciente negou o pedido de realização do teste genético por ausência de diagnóstico atual ou prévio de câncer. A paciente recorreu judicialmente, o tribunal foi favorável e o teste foi realizado utilizando sequenciamento de próxima geração. A deleção do exon 8 do gene MLH1 foi encontrada. Destacamos a importância de se oferecer testes genéticos pela análise multigene para pacientes sem câncer.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-06-05T17:25:04Z No. of bitstreams: 1 13_v.9_3.pdf: 306312 bytes, checksum: 8b06672fa61e117cfcd49c7a0bd4b99a (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-05T17:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 13_v.9_3.pdf: 306312 bytes, checksum: 8b06672fa61e117cfcd49c7a0bd4b99a (MD5) Previous issue date: 2010-09 A enzima poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) representa um novo alvo importante na terapia-alvo do câncer. PARP-1 é essencial para o reparo de quebras no DNA via o reparo por excisão de base. Inibidores da PARP-1 têm mostrado um aumento nos efeitos citotóxicos das radiações ionizantes e das terapias quimioterápicas com os agentes de metilação e topoisomerase I. Neste momento, existem pelo menos cinco inibidores de PARP sendo testados em ensaios clínicos. Este artigo apresenta uma visão global dessa ferramenta na área de oncologia molecular e debate a real importância dessa descoberta no tratamento do câncer. Salvador

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Os genes de câncer/testículo (CT) são excelentes candidatos para o desenvolvimento de ferramentas imunoterapêuticos associadas ao câncer, devido à sua expressão restrita em tecidos normais e à capacidade de provocar uma resposta imune quando expressa em células tumorais. Neste sentido, no presente estudo realizamos uma análise em escala genômica para os genes de CT, identificando 745 putativos genes de CT. Ao compararmos com outros conjuntos de genes foram identificados novos genes de CT. Realizamos a integração de várias bases de dados de expressão gênica de tecidos normais e de tumores, para identificação desses genes. A integração de dados clínicos e de infiltração de células CD8+ no tumor, nos proporcionou a identificação de dezenas de genes de CT associados com prognóstico bom ou ruim. Para aqueles genes de CT relacionados ao bom prognóstico, mostramos em pacientes com câncer uma relação direta entre a expressão gênica do CT e um sinal de infiltração de células CD8+ para alguns tipos de tumores, especialmente melanoma. Adicionalmente, nesta tese contextualizamos a bioinformática em um cenário de big data. Cancer/testis (CT) genes are excellent candidates for cancer immunotherapies because of their restrict expression in normal tissues and the capacity to elicit an immune response when expressed in tumor cells. In this study, we provide a genome-wide screen for CT genes with the identification of 745 putative CT genes. Comparison with a set of known CT genes shows that 201 new CT genes were identified. Integration of gene expression and clinical data led us to identify dozens of CT genes associated with either good or poor prognosis. For the CT genes related to good prognosis, we show that there is a direct relationship between CT gene expression and a signal for CD8+ cells infiltration for some tumor types, especially melanoma. In addition, we contextualized bioinformatics in a big data scenario.

A incidência de carcinomas diferenciados da tireoide no Rio Grande do Norte, Brasil, é relativamente elevada. Casualmente, observamos uma destacada ocorrência de casos de carcinomas papilíferos em membros de mesmas famílias identificados em nossa casuística, a partir de observações clínicas de rotina. Em algumas famílias detectamos três ou mais casos de carcinomas papilíferos diagnosticados entre pacientes de primeiro e segundo grau de parentesco. Assim, decidimos aprofundar o estudo no que se refere à etiopatogenia desses tumores com o objetivo de estabelecer se há alguma expressão coincidente entre essas pessoas, que possa justificar tal prevalência e traçar um perfil clínico e genético a partir da análise do sequenciamento do exoma por meio do estudo do DNA extraído de coletas de amostras sanguíneas desses pacientes e de seus familiares. Constatamos que o sequenciamento do exoma realizado na família IV, portadora de Câncer Familiar de Tireoide Não Medular, em quatro pacientes afetados com carcinoma papilífero da tireoide em três gerações consecutivas, identificou uma mutação no gene X, quando ocorreu a substituição de adenina por citosina (A>C) no exon X. E esta alteração de nucleotídeos causou o deslocamento de isoleucina para metionina na posição X (p.xM). Esta variante foi classificada como deletéria e provavelmente prejudicial. Este gene X é um componente importante da membrana basal e evidências científicas mostraram que ele tem função relacionada à migração, invasão e progressão tumoral. Com a informação fornecida pelo sequenciamento genético de nova geração, apontando genes associados ao carcinoma diferenciado da tireoide, será possível o aperfeiçoamento do diagnóstico, condução do tratamento e rastreamento de membros familiares afetados por doença nodular tireoideana, impactando nos diversos índices de aferição de resultados de promoção da saúde. Este projeto é original uma vez que aborda um tema de investigação ainda não esclarecido na literatura e inédito no nosso país. The incidence of thyroid differentiated carcinomas in Rio Grande do Norte, Brazil, is relatively high. Incidentally, we observed a prominent occurrence of cases of papillary carcinomas in members of the same families identified in our series, based on routine clinical observations. In some families we have detected three or more cases of papillary carcinoma diagnosed among first and second degree, kinship patients. Thus, we decided to deepen the study regarding the etiopathogenesis of these tumors in order to establish if there is any coincident expression among these people, which may justify such prevalence and draw a clinical and genetic profile from the analysis of exome sequencing through from the study of DNA extracted from blood samples collected from these patients and their families. We found that exome sequencing performed in family IV, with non-medullary thyroid cancer, in four patients with papillary thyroid carcinoma in three consecutive generations, identified a mutation in the gene X, when adenine was replaced by cytosine (A> C) in exon X. And this nucleotide change caused the shift from isoleucine to methionine at position X (p.xM). This variant was classified as deleterious and probably harmful. This gene X is an important component of the basement membrane and scientific evidence has shown that it has a function related to migration, invasion and tumor progression. With the information provided by the new generation genetic sequencing, pointing out genes associated with differentiated thyroid carcinoma, it will be possible to improve the diagnosis, treatment management and screening of family members affected by thyroid nodular disease, impacting the various indexes of measurement of the results health promotion. This project is original as it addresses a research topic not yet clarified in the literature and unpublished in our country.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Os microrganismos representam a maior biomassa do planeta, mas devido às limitações das técnicas de cultivo, a maior parte desse patrimônio genético encontra-se inacessível. Com o advento das metodologias metagenômicas, essas limitações foram superadas, permitindo a exploração do pool genético de microrganismos não cultiváveis. Essas metodologias nos permitem obter novos genes e desenvolver produtos biotecnológicos. Neste trabalho, uma abordagem metagenômica foi utilizada para selecionar genes envolvidos na degradação e emulsificação de hidrocarbonetos. O DNA ambiental foi extraído do solo coletado próximo a um rio salino do Rio Grande do Norte e uma biblioteca metagenômica foi construída. Um clone identificado como 3C6 foi positivo na triagem funcional para proteína biossurfactante e revelou uma ORF de 897 pb com alta similaridade para sequências codificadoras de uma proteína hipotética de espécies da família Halobacteriaceae. Esta ORF foi subclonada em vetor de expressão e sua expressão heteróloga foi realizada em Escherichia coli, sendo posteriormente purificada exibindo atividade biossurfactante com alta estabilidade. Esta nova proteína com atividade biossurfactante foi obtida a partir de uma abordagem metagenômica, e denominada proteína biossurfactante metagenômica 1, a MBSP1. Aqui, descrevemos a clonagem de um gene ambiental que codifica uma proteína com interessantes propriedades tensoativas que pode ser produzida em uma célula hospedeira como E. coli sem dependência de substrato. A MBSP1 é a primeira proteína com estas características descritas nos domínios Archaea ou Bacteria. Microorganisms represent the largest biomass on the planet, but due to the limitations of cultivation techniques, most of this genetic patrimony has been inaccessible. With the advent of metagenomic methodologies, these limitations have been overcome, allowing the exploitation of the genetic pool of noncultivable microorganisms. These methodologies allow us to obtain new genes and develop biotechnological products. In this work, a metagenomic approach was used to select genes involved in hydrocarbon degradation and emulsification. Environmental DNA was extracted from soil collected in a saline river of Rio Grande do Norte and a metagenomic library was constructed. A clone identified as 3C6 was positive in functional screening for biosurfactant protein and revealed an open reading frame (ORF) of 897 bp with high identity to sequences encoding a hypothetical protein from species of Halobacteriaceae family. This ORF was subcloned into expression vector and its heterologous expression was performed on Escherichia coli, being further purified exhibiting biosurfactant activity with high stability. This new protein with biosurfactant activity was obtained from a metagenomic approach, and called metagenomic biosurfactant protein 1, MBSP1. Here we describe the cloning of an environmental gene encoding a protein with interesting tensoactive properties that can be produced in a host cell such as E. coli without substrate dependence. MBSP1 is the first protein with these characteristics described in the Archaea or Bacteria domains. 2020-04-24

Diabetes Melitos (DM) é uma doença complexa, endócrina e difusa caracterizada pela elevação da glicemia. Uma das complicações recentemente apontada é a infertilidade, sendo esta caracteriza pela redução dos níveis de testosterona e alterações no epitélio germinativo dos túbulos seminíferos. O extrato de Allium cepa L. (cebola) já vem sendo apontado como hipoglicemiante e antilipêmico. O aminoácido extraído deste extrato, denominado S-metilcisteína, apresenta resultados ainda mais positivos em estudos diversos. A aquisição de novas terapias que possam auxiliar no tratamento da diabetes é de extrema importância, pois representa um impacto direto no bem-estar da sociedade. Assim, este trabalho visou investigar os aspectos bioquímicos, morfofuncionais e morfométricos do tecido testicular de ratos diabéticos, induzidos por estreptozotocina, tratados com extrato de A. cepa L. e com o aminoácido S-metilcisteína. Foram utilizados ratos Wistar, machos (45 dias), pesando de 200-250g, divididos em quatro grupos: controle normoglicêmico, diabético sem tratamento, diabético tratados com o extrato de A. cepa L. (400 mg/kg) e diabético tratado com o aminoácido S-metilcisteína (200 mg/kg). O DM foi induzido por estreptozotocina (40 mg/kg via intraperitoneal) e o tratamento foi realizado por gavagem diariamente por um período de 4 semanas. Após a eutanásia, os testículos foram coletados para análise histológica da integridade do tecido (Hematoxilina e Eosina), morfometria (azul de toluidina) e imunohistoquímica para receptores de testosterona. Ambos os tratamentos foram capazes de reduzir a glicemia dos animais, porém não foram capazes de interferir em parâmetros biométricos. Morfometricamente, ambos os tratamentos foram capazes de melhorar o tecido testicular, elevando a altura do epitélio e diâmetro dos túbulos seminíferos. Porém, os tratamentos não foram capazes de interferir nos componentes intertubulares. As analises morfológicas do tecido demonstraram uma melhora visível para ambos os tratamentos e, a imunohistoquímica apresentou uma melhora na apresentação de receptores para testosterona para ambos os tratamentos, principalmente para o extrato. O extrato da cebola apresentou resultados positivos como forma de terapia, principalmente na disponibilidade de receptores para testosterona. O aminoácido isolado foi capaz de apresentar resultados ainda melhores de forma generalizada na melhora da integridade do tecido testicular. Diabetes Melitos (DM) is a complex, endocrine and diffuse disease characterized by elevated glycemia. One of the recently reported complications is infertility, which is characterized by reduced testosterone levels and changes in the germinal epithelium of the seminiferous tubules. The extract of Allium cepa L. (onion) has already been reported as hypoglycemic and antilipemic. The amino acid extracted from this extract, called Smethylcysteine, presents even more positive results in several studies. The acquisition of new therapies that may aid in the treatment of diabetes is extremely important, since it has a direct impact on the well-being of society. This work aimed to investigate the biochemical, morphofunctional and morphometric aspects of the testicular tissue of diabetic rats, induced by streptozotocin, treated with extract of A. cepa L. and with the amino acid S-methylcysteine. Male Wistar rats (45 days) weighing 200-250 g were divided into four groups: normoglycemic control, diabetic without treatment, diabetic treated with the extract of A. cepa L. (400 mg / kg) and diabetic treated with the amino acid S-methylcysteine (200 mg / kg). DM was induced by streptozotocin (40 mg / kg intraperitoneally) and the treatment was performed by gavage daily for a period of 4 weeks. After euthanasia, the testes were collected for histological analysis of tissue integrity (Hematoxylin and Eosin), morphometry (toluidine blue) and immunohistochemistry for testosterone receptors. Both treatments were able to reduce the glycemia of the animals, but were not able to interfere in biometric parameters. Morphometrically, both treatments were able to improve the testicular tissue, raising the height of the epithelium and diameter of the seminiferous tubules. However, the treatments were not able to interfere with the intertubular components. The morphological analyzes of the tissue showed a visible improvement for both treatments, and the immunohistochemistry presented an improvement in the presentation of receptors for testosterone for both treatments, mainly for the extract. The onion extract presented positive results as a form of therapy, mainly on the availability of receptors for testosterone. The isolated amino acid was able to present even better results in a generalized way in the improvement of the integrity of the testicular tissue.

Os problemas relacionados com defeitos ósseos continuam a motivar a busca de terapias mais eficazes. Assim, a combinação de biomateriais, células-tronco e moléculas bioativas fazem parte das ferramentas usadas pela medicina regenerativa para alcançar esse objetivo. Diversos estudos já mostraram o potencial osteogênico dos polissacarídeos sulfatados (PSs) extraídos de macroalgas marinhas. Entre eles, o fucoidan, isolado da alga marrom Fucus vesiculosus, é o mais estudado, sendo já comercializado por algumas empresas. As algas verdes também são fonte de PSs, mas estas são ainda pouco exploradas para aplicações na regeneração óssea. Em geral, as aplicações clínicas dos PSs extraídos de algas ainda são limitadas devido à escassez de estudos sobre os seus efeitos, como por exemplo, o potencial genotóxico é desconhecido na maioria dos casos. Assim, neste trabalho avaliamos a atividade osteogênica 1) do Fucoidan de F. vesiculosus (um extrato comercializado pela Sigma), 2) das amostras ricas em PSs obtidas do subfracionamento do fucoidan comercial, e 3) do extrato rico em PSs extraídos da alga verde Caulerpa sertularioides usando como modelo células-tronco humanas isoladas da geleia de Wharton de cordões umbilicais (CTMH-GW). Estudou-se também o potencial genotóxico dos extratos totais de F. vesiculosus e C. sertularioides e posteriormente, da subfração do fucoidan que apresentou maior potencial osteogênico, utilizando do ensaio de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) na linhagem CHO-K1. Os ensaios de redução do MTT evidenciaram que as amostras ricas em PSs não apresentaram citotoxicidade significativa ao longo de 72 h, até 10 μg.mL-1. Os ensaios de atividade da fosfatase alcalina (ALP) e de mineralização sugerem que as amostras ricas em PSs possuem atividades osteogênicas diferentes: a subfração do fucoidan FUC 0.5 (5 μg.mL-1) foi a que apresentou melhor resultado, aumentando 124% a atividade da ALP em relação ao controle positivo (células mantidas em meio osteogênico). Já o extrato total de C. sertularioides (5 μg.mL-1) aumentou 192% a atividade da ALP. Adicionalmente, todas as amostras testadas induziram o acúmulo de cálcio na matriz extracelular. Quanto à genotoxicidade, os resultados do ensaio CBMN sugerem que, nas condições testadas, estas amostras não são genotóxicas, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regeneração óssea. Problems related with bone defects continue to motivate the search for more effective therapies. Thus, the combination of biomaterials, stem cells and bioactive molecules is part of the tools used by regenerative medicine to achieve this goal. Several studies have already shown the osteogenic potential of sulfated polysaccharides (SPs) extracted from marine macroalgae. Among them, fucoidan, isolated from brown algae Fucus vesiculosus, is the most studied, and is already commercialized by some companies. Green algae are also a source of SPs, but these are even more unexploited in the scope of bone regeneration. In general, the clinical applications of SPs from algae are very limited, because studies on their effects are scarce, for example, their genotoxic effects are unknown in most cases. Thus, in this work, we evaluated the osteogenic activity of Fucoidan from F. vesiculosus (an extract commercialized by Sigma), 2) SPs-rich samples obtained from subfractionation of commercial fucoidan, and 3) SPs-enriched extract from green algae Caulerpa Sertularioides, using human mesenchymal stem cells isolated from the Wharton jelly of umbilical cords (CTMH-GW) as cell model. It was also studied the genotoxic potential of the total extracts of F. vesiculosus and C. sertularioides, using the cytokinesis block micronucleus assay (CBMN) in the line CHO-K1. The genotoxicity of fucoidan’s subfraction that presented greater osteogenic potential was also evaluated. The MTT reduction assays showed that SPs-enriched samples did not show significant cytotoxicity over 72 h, up to 10 μg.mL-1. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization assays suggest that SPs-enriched samples have different osteogenic activities: fucoidan subfraction FUC 0.5 (5 μg.mL-1) showed the best result, increasing 124% the ALP activity in relation to the positive control (cells maintained in osteogenic medium). The total extract of C. sertularioides (5 μg.mL-1) increased the ALP activity by 192%. In addition, all samples tested induced calcium accumulation in the extracellular matrix. Concerning to genotoxicity, CBMN assay results suggest that, under the tested conditions, these samples are not genotoxic, indicating their potential as alternative bone regeneration therapy.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As proteínas da família triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM) são associados com o risco e progressão da aterosclerose. Em resultados prévios observamos que a alta expressão do TREML4está relacionada com fase inicial da Síndrome Coronariana Aguda (SCA).Neste estudo, investigamos a relação dos polimorfismos e a expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes estratificados de acordo com a extensão das lesões das atrérias coronárias. Foram incluídos pacientes com doença arterial coronariana (DAC) (n=151), com idades entre 30 e 74 anos, submetidos à angiografia coronária eletiva. A extensão da lesão coronariana foi avaliada através do índice de Friesinger. Os polimorfismosrs2803495 (A> G), rs2803496 (T> C) e aexpressão do RNAm do TREML4 em leucócitos foram analisadas por qRT-PCR. A expressão de TREML4 foi maior em pacientes com lesões coronarianas graves em relação aos sem lesão, baixas e intermediárias, (p G) and rs2803496 (T>C) variants andleukocyte mRNA expression were analyzed by qRT-PCR. TREML4 expression was higher in patients with major coronary artery lesions compared to subjects without or with low and intermediate lesions, (p < 0.05). Subjects carrying rs2803495 G allele (AG/GG genotypes) and rs2803496 C allele (TC/CC genotypes) were more prone to have positive TREML4 mRNA expression (Allele G: OR = 2.4, 95% CI 1.0-5.7, p < 0.05; allele C: OR = 7.8, and 95% CI = 2.9-20.9, p < 0.01, respectively).However, TREML4 polymorphisms were not associated with the extent of coronary lesion.In conclusion, increased TREML4 mRNA expression in blood leukocytes is influenced by gene polymorphisms and it is associated with more severe coronary artery lesions, suggesting its role as potential biomarker to investigate the extent of coronary lesion in CAD patients.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) As fendas orais constituem um problema de saúde publica atingindo cerca de 15% de todas as malformações, caracterizando-se pela formação incompleta das estruturas que separam a cavidade nasal e a cavidade oral com fatores genéticos e ambientais que contribuem para sua etiologia. Atualmente, estudos de microarray, utilizando pacientes fissurados identificaram diversas regiões de susceptibilidade para o desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas, dentre essas alguns estudos demonstraram a região do gene Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6) associado ao aumento de risco para o desenvolvimento das fendas. O objetivo do presente trabalho é pesquisar polimorfismos do gene IRF6 e as possíveis associações com o desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas. Para isso, um total de 368 individuos (186 pacientes FL/P e 182 controles) foram selecionados no Serviço de Atendimento ao Paciente Fissurado - HUOL/UFRN. Amostras de sangue foram coletadas para extração do DNA e análise dos polimorfismos do gene IRF6 (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, e rs1044516) por PCR em tempo real. Os pacientes foram classificados nos grupos Fenda Lábio-palatina (CLP), Fenda labial (CL) e Fenda Palatina (CP) e foi observada uma associação significativa de rs2235371 (OR: 11,24, 95% CI: 1.97-64.22, p = 0,016) no grupo com a fendas palatinas isoladas (CP). Além disso, a análise da combinação alélica mostrou um aumento do risco de fendas associado aos polimorfismos rs1044516 e rs2236907, uma vez que estavam presentes em todas as combinações significativas. Assim, a associação do rs2235371 com pacientes do grupo CP mostra-se como um fator de risco para CP em nossa população. A análise das combinações alélicas mostram a influência de polimorfismos do IRF6 combinadas, principalmente (rs1044516 e rs2236907) sugerem que cada polimorfismo pode contribuir minimamente para aumentar o risco de desenvolver fendas orais não-sindrômicas em uma população brasileira de Rio Grande do Norte. Orofacial clefts are a public health problem accounting for approximately 15% of all malformations, characterized by the incomplete formation of structures that separate the nasal cavity and oral cavity with genetic and environmental factors that contribute to its etiology. Currently, microarray studies using fissured patients have identified several regions of susceptibility to the development of non-syndromic orofacial clefts among which some studies have demonstrated the region of the Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6) gene associated with increased risk for non-syndromic orofacial clefts development. The aim of the present study is to investigate polymorphisms of the IRF6 gene and the possible correlations with the development of non-syndromic orofacial clefts. For this, a total of 368 individuals (186 FL / P patients and 182 controls) were selected in the Service of the Fissured Patient - HUOL / UFRN. Blood samples were collected for DNA extraction and analysis of the polymorphisms of the IRF6 gene (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and rs1044516) by real-time PCR. Patients were classified into the CLP, CL and CP groups and a significant association of rs2235371 (OR: 11.24, 95% CI: 1.97-64.22, p = 0.016) was observed in the group with isolated palate clefts (CP). In addition, the analysis of the allelic combination showed an increased risk orofacial clefts associated with the polymorphisms rs1044516 and rs2236907, since they were present in all significant combinations. Thus, the association of rs2235371 with patients in the CP group is shown as a risk factor for CP in our population. The analysis of allelic combinations show the influence of combined IRF6 polymorphisms mainly (rs1044516 and rs2236907) suggest that each polymorphism may contribute minimally to increase the risk of developing non-syndromic orofacial clefts in a Brazilian population of Rio Grande do Norte.

A Síndrome de câncer de mama e ovário hereditário corresponde a 10-15% de todos os casos diagnosticados de câncer de mama no mundo. A maioria das mutações germinativas são identificadas nos genes BRCA1 e BRCA2, contudo, a aplicação de painéis multigênicos tem aumentado o número de variantes patogênicas detectadas em outros genes supressores de tumor. De acordo com a versão atual do protocolo americano NCCN (National Comprehensive Cancer Network), as mutações em BRCA1 e BRCA2, TP53 e PTEN conferem alto risco de desenvolver câncer de mama, e mutações em CDH1, CHEK2, PALB2, ATM e BRIP podem aumentar em 20% o risco para o desenvolvimento desta doença. Neste estudo foram analisados 157 indivíduos com histórico pessoal e/ou familiar de câncer de mama. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico por meio de extração à base de solução salina e as amostras foram analisadas usando o sequenciamento de nova geração (NGS). Foram identificadas 15 variantes patogênicas e 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) em 27 indivíduos (27/157; 17%), dos quais três são assintomáticos. Foram identificadas sete novas variantes em 4 genes: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT e ATR_c.3043C>T. Sessenta e oito por cento (13/19; 68%) de variantes foi detectada nos genes BRCA1 e BRCA2, enquanto 32% (6/19) foram identificados nos genes de risco moderado ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) e MSH6 (1/19). Os indivíduos foram separados em dois grupos para a análise comparativa: portadores de mutação nos genes de alto risco e nos genes de risco moderado. Entre os três indivíduos assintomáticos, duas variantes estão presentes nos genes de risco moderado ATM e MLH1. Entre os indivíduos com câncer de mama, dezoito pacientes (18/24; 75%) apresentaram mutações em genes de alto risco, enquanto seis (6/24; 25%) são portadores de mutações em genes de risco moderado. Ambos os grupos apresentaram alta incidência de câncer de mama precocemente (83% dos indivíduos). O grupo de portadores de mutação nos genes de alto risco apresentaram maior ocorrência de tumores de alto grau (83% vs 67%, P = 0,0090). No grupo de indivíduos com mutações em genes de risco moderado, os tumores apresentaram um fenótipo mais agressivo com câncer bilateral (33% versus 11%, P = 0,0002), ocorrência de metástases (33% vs 5,6%, P G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT and ATR_c.3043C>T. Sixty-eight percent (13/19; 68%) of variants was detected in BRCA1 and BRCA2 genes, while 32% (6/19) were identified in moderate risk genes ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) and MSH6 (1/19). The individuals were separated in two groups for comparative analysis: high-risk genes and moderate risk genes. Among three asymptomatic individuals, two present variants in moderate risk genes ATM and MLH1. Among breast cancer individuals, eighteen patients (18/24; 75%) presented mutations in high-risk genes, while six (6/24; 25%) harbored mutations in moderate risk genes. Both groups had a high incidence of early-onset breast cancer, 83%. The group of individuals harboring variants in high-risk genes presented a greater occurrence of high-grade tumors (83% vs. 67%, P= 0.0090). In the group of individuals harboring mutation in moderate risk genes, tumors presented a more aggressive phenotype with bilateral cancer (33% vs. 11%, P= 0.0002), occurrence of metastasis (33% vs. 5.6%, P

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A poluição atmosférica é um fator de risco ambiental, e consequentemente, um problema a saúde. Diversas substâncias são lançadas diariamente por meio de atividades antropogênicas ou naturais, tornando o ar impróprio e nocivo ao bem-estar de seres humanos e prejudicial à fauna e à flora. Na região amazônica, os desmatamentos e as queimadas têm causado prejuízos para a população exposta. Estudos demonstram que essas partículas presentes no ar causam sérios problemas respiratórios e cardiovasculares, incluindo danos ao DNA. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar o estresse oxidativo, a integridade mitocondrial e morte celular desencadeados por compostos orgânicos do material particulado menor que 10 μm (MP10) oriundos da queima de biomassa da floresta Amazônica, assim como os efeitos do reteno, marcador de queima de biomassa, em células epiteliais do pulmão humano (A549). Para tal, foi avaliado a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) com os corantes DCF e MitoSOX e o processo de autofagia por expressão e distribuição das isoformas da proteína LC3, marcadora de autofagossomo maduro, em células A549 expostas a 200 μg/mL e 400 μg/mL de MP10 nos tempos de 24 h e 72 h. Da mesma forma, foi analisado os efeitos do reteno sobre estresse oxidativo nas concentrações de 3,3 ng/mL, 10 ng/mL e 30 ng/mL. Também foi observado a função mitocondrial com TMRM e Mitotracker e o processo de morte celular via marcação por anexina e iodeto de propídeo. Com relação à fração orgânica do material particulado, esta induziu um aumento da produção de ERO intracelulares e de superóxido mitoncondrial. Além disso, a exposição ao MP10 desencadeou a formação de autofagossomos, sugerindo o aumento da autofagia. Nas análises biológicas com o reteno, os dados mostraram que este composto levou ao aumento de ERO e de superóxido mitocondrial, a hiperpolarização da membrana mitocondrial, assim como o aumento do conteúdo mitocondrial em todos os tempos testodos. Porém, o reteno só foi capaz de induzir a morte celular na maior concentração utilizada e no período de 72 h. Com esses resultados, é importante enfatizar a necessidade de redução da emissão de poluentes por queima de biomassa, buscando políticas de controle. Além disso, a toxicidade apresentada pelo reteno levanta um alerta em relação a inclusão desse composto, marcador de queima de biomassa, na avaliação de risco dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA). In recent discussions on environmental issues, air pollution has been considered an important environmental risk factor, and, consequently, a burden to human health. Several poluents are released daily by natural or human activities, causing the air to be improper and harmful to the welfare of humans and ecosystems. In the Amazon region, deforestation and forest fires have been causing damage to the exposed population. Studies already demonstrated that airborne particles can lead to serious cardiorespiratory effects, including DNA damage. Therefore, the aim of this study was to evaluate oxidative stress, mitochondrial integrity and cell death caused by organic chemical compounds from particulate matter smaller than 10 μm (PM10) originated from biomass burning of the Amazon forest, as well as the effects of retene, a biomass burning marker, in human lung epithelial cells (A549). It was evaluated reactive oxygen species (ROS) generation (DCF and MitoSOX) and autophagy process by expression and distribution of LC3 protein, autophagosome marker, in A549 cells exposed to 200 μg/mL and 400 μg/mL for 24 h and 72 h. Likewise, it was examined the effects of retene on oxidative stress on the concentrations of 3,3 ng/mL, 10 ng/mL and 30 ng/mL. Also, mitochondrial function and cell death was observed with TMRM and Mitotracker dyes and annexin and propidium iodide markers, respectifully. Regarding the extracted organic particulate matter, this led to the increased production of reactive oxygen species and intracellular mitochondrial superoxide. Additionally, PM10 exposure triggered the formation of autophagosomes, suggesting increased autophagy. In the biological analysis with retene, the data showed that this compound led to an increase in reactive oxygen species and mitochondrial superoxide, hyperpolarization of the mitochondrial membrane, as well as increased mitochondrial content at all tested times. However, the retene was only able to induce cell death in the greatest concentration used and over a 72-hour period. From these results, it is important to emphasize the reduction of emissions by biomass burning, searching for new control policies. In addition, the toxicity of the retene, a biomass burning marker, raises an alert about the inclusion of this compound in the risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs).

O surgimento da Telefonia Celular, a partir dos anos 1990, e a construção frenética de torres nas cidades assustou a população, levou a comunidade científica mundial e os órgãos de controle ambiental a dar maior atenção às ondas eletromagnéticas não ionizantes. Um estado pobre como o Rio Grande do Norte evoluiu a quantidade de celulares em operação de 340 mil no ano 2002 para 4,6 milhões em 2014. No RN a quantidade de linhas celulares supera a própria população, com uma densidade de 128,98 acessos para cada 100 habitantes. Natal, a capital do RN, com 850 mil habitantes, já possui 882 Estações Rádio Base dos Sistemas celulares em 167,26 km2 de área urbana. O objetivo do presente trabalho é fazer um diagnóstico sobre a exposição à radiação eletromagnética não ionizante em toda área urbana da Cidade. A metodologia usada levou em conta medições de intensidade das radiações feitas em 160 diferentes pontos da cidade. As medições foram feitas na faixa de 88MHz a 2.400 MHz. Os serviços de telecomunicações avaliados na pesquisa foram: TV (Broadcasting), Rádio FM (Broadcasting), Sistemas Celulares e WLAN (IEEE 802.11bg).Foram considerados para comparação os limites de exposição do ICNIRP (InternationalCommission on Non IonizationProtection), parâmetros: “Intensidade de Campo Elétrico” e “Razão de Exposição” (ER). Resultados: de acordo com as medições realizadas, 48.48 % da exposição eletromagnética outdoor na cidade do Natal decorre da radiação emitida pelos transmissores de TV. Da mesma forma, constatou-se que, em 77,2 % dos pontos pesquisados, a intensidade do campo elétrico gerada pelas TVs supera todos os demais serviços de telecomunicações, inclusive a Telefonia Celular. A Taxa de Exposição (ER) média de Radiação Não Ionizante verificada para a faixa de frequência pesquisada foi de 4,43. 10 -3, enquanto o valor máximo foi de 7,67. 10-2. Foi desenvolvido modelo para estimativa do Campo Elétrico gerado pelos transmissores das TVs em qualquer ponto da cidade. Utilizouse a Técnica Estatística de Regressão Multivariada, a partir das 160 amostras. As equações finais obtidas permitem as estimativas com grau de precisão R2 superior a 0,9, p 0,9 and p

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-κB and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Despite advances in antibiotic therapy, bacterial meningitis (BM) remains with high mortality and morbidity rates in worldwide. One important mechanism associated to sequels during disease is the intense inflammatory response which promotes an oxidative burst and release of reactive oxygen species, consequently leading to cell death. Activation of DNA repair enzymes during oxidative stress has been demonstrated in several neurological disorders. APE1/Ref-1 is a multifunctional protein involved in DNA repair and plays a redox function on transcription factors such as NFkB and AP-1.The aim of this study was assess the role of APE1/Ref-1 on inflammatory response and the possibility of its modulation to reduce the sequels of the disease. Firstly it was performed an assay to measure cytokine in cerebrospinal fluid of patients with BM due to Streptococcus pneumoniae and Neisseriae meningitides. Further, a cellular model of inflammation was used to observe the effect of the inhibition of the endonuclease and redox activity of APE1/Ref-1 on cytokine levels. Additionally, APE1/Ref-1 expression in cortex and hippocampus of rat with MB after vitamin B6 treatment was evaluated. Altogether, results showed a similar profile of cytokines in the cerebrospinal fluid of patients from both pathogens, although IFNy showed higher expression in patients with BM caused by S. pneumoniae. On the other hand, inhibitors of APE1/Ref-1 reduced cytokine levels, mainly TNF-α. Reduction of oxidative stress markers was also observed after introduction of inhibitors in the LPS-stimulated cell. In the animal model, BM increased the expression of the protein APE1/Ref-1, while vitamin B6 promoted reduction. Thereby, this data rise important factors to be considered in pathogenesis of BM, e.g., IFNy can be used as prognostic factor during corticosteroid therapy, APE1/Ref-1 can be an important target to modulate the level of inflammation and VIII oxidative stress, and vitamin B6 seems modulates several proteins related to cell death. So, this study highlights a new understanding on the role of APE1/Ref-1 on the inflammation and the oxidative stress during inflammation condition A meningite bacteriana (MB) é uma doença infecciosa que permanece com altas taxas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos, apesar dos avanços na antibioticoterapia. Um dos principais mecanismos associados às sequelas durante a MB é a elevada resposta inflamatória, que promove uma exacerbada quantidade de espécies reativas de oxigênio (ERO) levando às células a apoptose ou necrose. A ativação de enzimas de reparo de DNA durante o estresse oxidativo tem sido demonstrada nas mais diversas desordens. Uma importante enzima envolvida neste processo é a endonuclease apurínica/apirimidinica1/fator redox-1 (APE1/Ref-1). Ela é uma proteína multifuncional envolvida no reparo de DNA e na redução de fatores envolvidos com a resposta inflamatória, tais como o fator nuclear kappa B (NFkB) e proteína ativadora 1 (AP-1). Este estudo teve como objetivo identificar o envolvimento de APE1/Ref-1 na resposta inflamatória visando a possibilidade de sua utilização como alvo terapêutico na redução de sequelas durante a MB. Para isto, inicialmente foi realizado uma análise no perfil de expressão de citocinas em líquor de pacientes com meningite causada por Streptococcus pneumoniae e Neisseriae meningitidis visando selecionar moduladores inflamatórios de interesse para ensaios em cultura de célula subsequentes. Em seguida, utilizando um modelo celular de indução com LPS foi avaliado o efeito da inibição da atividade de reparo e redox de APE1 sobre a expressão de citocinas inflamatórias. Por fim, foi observada a expressão de APE1 no córtex (CX) e hipocampo (HC) de ratos com MB frente a uma terapia adjuvante com vitamina B6. Nossos resultados mostraram um perfil de moduladores inflamatórios muito semelhante no líquor dos pacientes com MB causada pelos patógenos estudados, embora interferon gama (IFNy) tenha sido VI significativamente mais expresso em pacientes com S. pneumoniae do que N. meningitidis. Quanto ao uso dos inibidores das funções, redox e de reparo, de APE1/Ref-1 no modelo in vitro, houve redução significativa na expressão de algumas citocinas, principalmente o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α). Além disso, os inibidores demonstraram uma redução nos níveis de ERO nas células estimuladas com LPS. No modelo animal, a expressão protéica de APE1/Ref-1, no CX e HC dos ratos, foi modulada após introdução da vitamina B6. Portanto, esses dados fornecem um novo olhar para a fisiopatologia da MB, em que citocinas como IFNy podem ser usadas em um diagnóstico diferencial entre meningites causadas por S. pneumoniae e N. meningitidis. A proteína de reparo de DNA, APE1/Ref-1, parece ser um alvo potencial na modulação da resposta inflamatória e do estresse oxidativo, bem como a terapia adjuvante com vitamina B6 mostra ter um papel sobre a expressão de APE1/Ref-1. Consequentemente, o conhecimento obtido neste estudo pode ser importante na melhoria do prognóstico da MB, além de contribuir para entender a associação entre o reparo de DNA e inflamação 2020-01-01

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Gene therapy is based on the transfer of exogenous genetic material into cells or tissues in order to correct, supplement or silencing a particular gene. To achieve this goal, efficient vehicles, viral or non-viral, should be developed. The aim of this work was to produce and evaluate a nanoemulsion system as a possible carrier for no-viral gene therapy able to load a plasmid model (pIRES2-EGFP). The nanoemulsion was produced by the sonication method, after been choose in a pseudo-ternary phase diagram build with 5 % of Captex 355®, 1.2 % of Tween 80®, 0.8 % of Span 80®, 0.16% of stearylamine and water (to 100 %). Measurements of droplet size, polydispersity index (PI), zeta potential, pH and conductivity, were performed to characterize the system. Results showed droplets smaller than 200 nm (PI < 0.2) and zeta potential > 30 mV. The formulation pH was near to 7.0 and conductivity was that expected to oil in water systems (70 to 90 μS/s) A scale up study, the stability of the system and the best sterilization method were also evaluated. We found that the system may be scaled up considering the time of sonication according to the volume produced, filtration was the best sterilization process and nanoemulsions were stable by 180 days at 4 ºC. Once developed, the complexation efficiency of the plasmid (pDNA) by the system was tested by agarose gel electrophoresis retardation assay.. The complexation efficiency increases when stearylamine was incorporated into aqueous phase (from 46 to 115 ng/μL); regarding a contact period (nanoemulsion / pDNA) of at least 2 hours in an ice bath, for complete lipoplex formation. The nanoemulsion showed low toxicity in MRC-5 cells at the usual transfection concentration, 81.49 % of survival was found. So, it can be concluded that a nanoemulsion in which a plasmid model was loaded was achieved. However, further studies concerning transfectation efficiency should be performed to confirm the system as non-viral gene carrier A terapia gênica consiste na transferência de material genético exógeno para células ou tecidos no intuito de corrigir, suplementar ou silenciar um determinado gene. Para que este objetivo seja alcançado, eficientes veículos carreadores devem ser desenvolvidos: virais ou não-virais. O objetivo deste trabalho foi produzir e avaliar um sistema nanoemulsionado como possível veículo não-viral para terapia gênica, capaz de veicular um modelo plasmidial (pIRES2-EGFP). A nanoemulsão foi produzida pelo método de sonicação, após ser escolhida em um digrama de fases pseudo-ternário. A formulação é constituída de 5 % de Captex 355®, 1,2 % de Tween 80®, 0,8 % de Span 80®, 0,16 % de estearilamina e água (qsp 100 %). O sistema foi caracterizado quanto ao tamanho de gotícula, índice de polidispersão (PI), potencial zeta, pH e condutividade. Os resultados mostraram gotículas menores que 200 nm (PI < 0,2) e potencial zeta > 30 mV em uma formulação de pH próximo a 7,0 e condutividade compatível a formulações de óleo em água (70 90 μS/s). A possibilidade de escalonamento, a estabilidade do sistema e a melhor forma de esterilização também foram avaliadas onde observou-se que o sistema pode ser escalonado adequando o volume produzido ao tempo de sonicação e a forma mais eficiente de esterilização foi a filtração em membrana. O sistema apresentou estabilidade maior que 180 dias quando armazenado a 4 ºC. Uma vez desenvolvido, o sistema foi testado quanto à capacidade de compactar o modelo plasmidial (pDNA). Eletroforese em gel de agarose foi a metodologia empregada para este fim, onde verificou-se que o poder de compactação aumenta (de 46 para 115 ng/μL) quando a estearilamina é incorporada na fase aquosa, respeitando um período de contato (nanoemulsão/pDNA) de pelo menos 2 horas, em banho de gelo. A nanoemulsão mostrou-se pouco tóxica nas concentrações usuais para ensaios de transfecção em células do tipo MRC-5, apresentando 81,49 % de viabilidade celular. Portanto, o processo de produção de um sistema que complexa eficientemente o modelo plasmidial foi obtido. Contudo, estudos de eficiência de transfecção devem ser conduzidos para confirmar o sistema como um carreador não-viral de material genético

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress. O seqüenciamento do genoma da espécie Chromobacterium violaceum identificou um cromossomo simples circular de 4.8 Mb, no qual aproximadamente 40% das ORFs encontradas são classificadas como hipotéticas conservadas ou hipotéticas. Algumas regiões gênicas de interesse biotecnológico e biológico vêm sendo caracterizadas, como por exemplo, genes de detoxificação ambiental e genes de reparo de DNA, respectivamente. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi identificar genes de C. violaceum envolvidos com a resposta ao estresse, como por exemplo, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade genômica. Para tanto, foi construída uma biblioteca genômica de C. violaceum na cepa DH10B de Escherichia coli (RecA-), a qual foi testada para clones resistentes a UVC, resultando na seleção de cinco clones candidatos. Foram identificadas quatro ORFs (CV_3721 a 3724) no clone PLH6A. Das quais, as ORFs CV_3722 e CV_3724, foram subclonadas e uma atividade sinérgica de complementação foi observada. A ocorrência de um operon foi confirmada usando cDNA de C. violaceum em ensaio de RT-PCR. Adicionalmente, foi observada a indução do operon após tratamento com UVC, dessa forma, esse operon foi relacionado à resposta ao estresse em C. violaceum. Ensaios de mutagênese com rifampicina após tratamento com luz UVC mostraram alta freqüência de mutagenicidade para a ORF CV_3722, subunidade δ da Polimerase III. Assim, propomos que esta subunidade de C. violaceum pode agir em DH10B na síntese translesão utilizando Pol IV em uma via RecA independente. Em ensaios de viabilidade outros quatro clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H) foram capazes de complementar a função na dose de 5 J/m2. E em ensaios de mutagenicidade PLE7B, PLE10B e PLE12H apresentaram freqüências de mutação com diferenças significativas em relação ao controle (DH10B), demonstrando que de alguma forma eles estão envolvidos na resposta ao estresse em C. violaceum. Estes clones parecem estar inter-relacionados, provavelmente, regulados por molécula mensageira (como o nucleotídeo c-di-GMP) e/ou molécula regulatória global (como a subunidade σS da RNA Polimerase). Os resultados obtidos contribuem para um melhor conhecimento da genética desta espécie e de seus mecanismos de resposta ao estresse ambiental. 2020-01-01

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment. A riboflavina é uma vitamina de fundamental importância em organismos aeróbios, sendo precursora de importantes coenzimas que participam da cadeia transportadora de elétrons. Contudo, após a sensibilização da riboflavina com luz UV ou luz visível, observou-se a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais podem oxidar o DNA. O reparo de lesões oxidativas no DNA ocorre principalmente através da via de reparo por excisão de bases (BER), na qual a endonuclease APE1 exerce um papel central. Por sua vez, a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua reparando lesões no DNA que causam distorções na dupla hélice. Recentemente tem sido descrito a participação da via NER na remoção de danos oxidativos e na estimulação da função de reparo de APE1. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi analisar os efeitos citotóxicos da riboflavina fotossensibilizada (RF*) em células proficientes e deficientes na via NER, correlacionando à expressão de APE1. Para tanto, as linhagens proficientes e deficientes no NER foram submetidas ao tratamento com RF* e em seguida foram realizados os ensaios de viabilidade celular, extração de proteínas totais, fracionamento celular, immunoblotting, imunofluorescência indireta e a análise de polimorfismos em genes da via BER. Os resultados evidenciaram perfis de sensibilidade distintos ao estresse oxidativo induzido pela RF*, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis, enquanto a linhagem XPC mostrou resistência similar à linhagem MRC5-SV, a qual é proficiente na via NER. Esses resultados indicam que as proteínas XPA e CSB possuem um importante papel no reparo das lesões oxidativas induzidas pela RF*. Além disso, foi demonstrado que polimorfismos em um único nucleotídeo (SNPs) em enzimas do BER podem influenciar na sensibilidade dessas linhagens. Em relação às análises dos níveis de expressão de APE1, os resultados mostraram que houve alteração na expressão dessa proteína após o tratamento com RF* somente na linhagem deficiente em XPC. Porém, observou-se que APE1 é recrutada e se torna ligada à cromatina após o tratamento nas linhagens MRC5-SV e XPA. Os resultados também comprovaram a indução de danos após o tratamento com RF* através do estudo da proteína-H2AX, pois o tratamento provocou um aumento nos níveis endógenos desta proteína fosforilada, a qual atua na sinalização de quebras de fita dupla no DNA. Porém, na linhagem XPC, além de ter sido observado uma curva de sobrevivência semelhante à linhagem MRC5-SV, os níveis endógenos de APE1 são significativamente reduzidos quando comparados com as outras linhagens e APE1 não se encontra ligada à cromatina após tratamento com RF*. Conclui-se que a RF* foi capaz de induzir a morte celular em linhagens deficientes no sistema de reparo por excisão de nucleotídeos, onde as linhagens XPA e CSB foram mais sensíveis quando comparadas à linhagem normal MRC5-SV e à linhagem XPC. Este último resultado é potencialmente interessante, considerando que a linhagem XPC apresenta baixos níveis protéicos de APE1. Adicionalmente, os resultados comprovaram que a proteína APE1 pode estar envolvida no reparo de danos oxidativos causados pela RF*, já que APE1 é recrutada na cromatina e se liga fortemente a esta após o tratamento.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos do metabolismo celular capazes de reagir com biomoléculas, como proteínas, lipídeos e ácido nucléico. Essas reações podem causar modificações deletérias para a célula. Fotossensibilizadores como o azul de metileno (MB), são capazes de produzir EROs, como o oxigênio singlete (1O2), uma das formas mais reativas do oxigênio molecular. O 1O2 é capaz de oxidar guaninas, gerando lesões no DNA, como 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), o mais frequente produto da oxidação, que durante a replicação pode emparelhar com adenina levando à mutações. Foi de interesse desse estudo, caracterizar a citotoxicidade, o potencial mutagênico e o padrão de expressão protéica, durante o estresse oxidativo induzido pelo MB, usando como modelo cepas de Escherichia coli proficiente em reparo e deficientes em MutY-Glicosilase, uma enzima de reparo envolvida na correção de pares 8-oxoG:Adenina. Essas cepas foram tratadas com MB em presença ou ausência de luz. O crescimento, sobrevivência, a taxa de mutagênese e padrão de síntese protéica, foram analisados. O tratamento afetou o crescimento bacteriano, induzindo morte celular, mutagênese, e mudanças no padrão de síntese protéica em ambas as cepas. Entretanto a cepa deficiente em MutY mostrou uma maior sensibilidade em relação a cepa proficiente. Adicionalmente, a cepa deficiente em MutY apresentou um padrão de expressão protéica diferenciado quando comparado com a cepa proficiente. Esses resultados sugerem o envolvimento da MutY na correção de lesões de DNA não caracterizadas e que a ausência de MutY induz alterações no padrão de expressão protéica