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Trabajo presentado a la XVI Reunión de Biología Molecular de Plantas-Meeting of Plant Molecular Biology (RBMP) celebrada en Sevilla entre el 14 y el 16 de diciembre de 2022., Plants possess a battery of dedicated intracellular immune receptors known as nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins (NLRs) involved in recognition of pathogen derived efectors and activation of efector-triggered immunity (ETI). In a recent work, we report a two-tiered regulatory network in Arabidopsis mediated by a microRNA (miR825-5p) and a wave of secondary NLRderived phased small RNAs (phasi-NLRs) involved in silencing dozens of NLR genes encoding Toll/interleukin-1 NLRs (TNLs). In our model, targeting of MIST1 (microRNA-silenced TNL1) transcripts by miR825-5p, triggers the generation of phasi-NLRs that subsequently silence a wide network of TNL encoding genes and reinforce the silencing of MIST1 (López-Márquez et al., 2021). Although miRNA and phasi-NLR mediated regulation of NLRs has been characterized to some extent, the current knowledge regarding how these miRNA-target-phasiRNA networks are modulated and their contribution to the immune response during diferent developmental stages is still scarce (Deng et al., 2018; Cui et al., 2019). Thus, through generation of GUS-based A. thaliana reporter lines we have characterized the expression pattern of both genes (MIR825 and MIST1) as well as the domain activity of miR825-5p. Moreover, a comprehensive analysis of RNA and small RNA-seq datasets, as well as the use of diferent orthogonal approaches, unravelled a hitherto unknow connection between miR825-5p/phasi-NLR mediated regulation of NLRs and plant development. Further analysis also supports the notion that the action of this regulatory mechanism is restricted to control NLR expression in an organ specifc way, mainly operating in leaves of the model plant. At present, we are working to understand how the changes on miRNA/phasi-NLR levels during developmental stages modulate the strength of the immune response and the biological impact of this developmental-dependent regulation on plant health. In summary, our results point to a developmentally regulated sRNA-based control of NLR expression in Arabidopsis and shed light on how levels of these regulatory molecules (miRNAs and phasi-NLRs) are modulated during development or in an organ specifc manner to fne-tune NLR expression., This work was supported by Project Grant RTI2018-095069-B-I00 fnanced by MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ and FEDER, and by Project Grant PY18-2398 fnanced by Junta de Andalucía. ADE was funded by a FPU Grant (Predoctoral Fellowship from the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades; FPU17/03520).

The Pseudomonas syringae type III secretion system translocates effector proteins into the host cell cytosol to suppress plant basal immunity. Effector HopZ1a suppresses local and sys- temic immunity triggered by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and effectors, through target acetylation. HopZ1a has been shown to target several plant proteins, but none fully substantiates HopZ1a-associated immune suppression. Here, we investigate Arabidopsis thaliana mitogen-activated protein kinase kinases (MKKs) as potential targets, focusing on AtMKK7, a positive regulator of local and systemic immunity. We analyse HopZ1a interference with AtMKK7 by translocation of HopZ1a from bacteria inoculated into Arabidopsis expressing MKK7 from an inducible promoter. Reciprocal pheno- types are analysed on plants expressing a construct quenching MKK7 native expression. We analyse HopZ1a–MKK7 interaction by three independent methods, and the relevance of acetylation by in vitro kinase and in planta functional assays. We demonstrate the AtMKK7 contribution to immune signalling showing MKK7- dependent flg22-induced reactive oxygen species (ROS) burst, MAP kinas (MAPK) activation and callose deposition, plus AvrRpt2-triggered MKK7-dependent signalling. Furthermore, we demonstrate HopZ1a suppression of all MKK7-dependent responses, HopZ1a–MKK7 interac- tion in planta and HopZ1a acetylation of MKK7 with a lysine required for full kinase activity. We demonstrate that HopZ1a targets AtMKK7 to suppress local and systemic plant immunity. RTI2018- 095069-B-I00, BIO2015-64391-R, UMA18-FEDERJA-070, FPU14/04233, XDB27040204, Universidad de Málaga-CBUA

Finalmente se ha generado una nueva metodología para la producción sencilla y económica de Target Mimics (MIMs), una herramienta ampliamente utilizada para la caracterización funcional de los pequeños RNAs en planta. Esta nueva metodología permite su aplicación directa en estudios de escala masiva. Las plantas codifican para una batería de receptores intracelulares conocidos como genes de Resistencia o NLRs (nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors), que reconocen a proteínas efectoras y disparan una respuesta de defensa de tipo ETI (Effector-Triggered Immunity). En plantas, estos genes se clasifican en dos sub-familias: CNLs (Coiled-Coil) o TNLs (Toll-interleukin-1). Esta tesis doctoral, ha demostrado que el miR825-5p de Arabidopsis thaliana regula la expresión del gen TNL, AT5G38850 (MIST1). El reconocimiento ocurre mediante una secuencia presente en MIST1 que codifica para el motivo TIR-2, ligado al correcto funcionamiento de estos receptores. Además, este miRNA dispara la producción de siRNAs secundarios (phasiRNAs) a partir de MIST1, estableciendo una compleja red de regulación de genes de resistencia con una implicación en la respuesta inmune frente a Pseudomonas syringae. Durante la respuesta de defensa, tanto el miR825-5p como los phasiRNAs reducen su acumulación, permitiendo la expresión de los genes TNLs. Gracias a el uso de fusiones transcripcionales al gen chivato GUS se han caracterizado los patrones de expresión de ambos genes (Pri-miR825 y MIST1) así como el dominio de actividad del miR825-5p. Esta caracterización sugiere una mayor actividad del miRNA y una mayor producción de phasiRNAs en las hojas adultas de Arabidopsis thaliana. Además, se observo una reducción de los niveles del miRNA maduro y phasiRNAs y el incremento de los niveles de su diana MIST1, durante el desarrollo. Estos resultados están en concordancia con observaciones previas que describen un aumento de la resistencia frente a P. syringae durante el envejecimiento de las hojas de A. thaliana.

Additional file 1. Supplementary methods, figures and table.

La defensa PTI (Pattern triggered immunity) en plantas evita la infección por parte de un gran número de patógenos. P. syringae suprime la PTI mediante proteínas (efectores) introducidas en el interior de la célula vegetal por un sistema de secreción tipo III. La ETI (Effector triggered immunity), detecta la actividad de los efectores, mediante receptores intracelulares denominados proteínas “R”. En plantas, los pequeños RNAs participan en regulación de la expresión mediante silenciamiento génico. Existen dos tipos de pequeños RNAs en silenciamiento génico: pequeños RNAs interferentes (siRNAs) y microRNAs (miRNAs). Los miRNAs son RNAs no codificantes de cadena sencilla que reducir la expresión de transcritos mediante la unión al complejo RISC (RNA-induced silencing complex) por un mecanismo dependiente de secuencia. Este mecanismo regula las respuestas de defensa frente a muchos patógenos. Nosotros trabajamos con miR825* de A. thaliana que presenta como dianas genes “R” aún por caracterizar. MiR825* regula la expresión de estos genes R y desencadena la generación de pequeños RNAs en fase (phasiRNAs) a partir de una de estas dianas. La activación de PTI determina una bajada en los niveles de miRNA825* , activándo así la expresión de estos genes R. Plantas con niveles alterados de miRNA825* muestran una PTI alterada. Hemos seleccionado una de las dianas reguladas por este miRNA, el gen AT5G38850, y hemos mostrado mediante fusiones a GFP y. microscopia confocal, que se localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma. También hemos caracterizado el patrón de expresión del gen y del miRNA, demostrando que este último regula los niveles del primero en diferentes tejidos. La expresión inducible de la proteína en los fondos Col-0 (silvestre) y DCL234 (mutante afectado en la biogénesis de siRNAs) lleva a su acumulación solo en el fondo mutante , sugierendo un mecanismo de autorregulación mediado por phasiRNAs. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Durante la interacción planta-patógeno, el éxito en la colonización y desarrollo de la enfermedad del patógeno viene determinado por su capacidad de evadir y/o suprimir las respuestas de defensas disparadas por la planta. La planta detecta patrones moleculares, como por ejemplo flagelina o EF-Tu, desencadenando una defensa llamada PTI , que algunas bacteriaspatógenas pueden suprimir mediante la proteínas de virulencia (efectores) . En plantas resistentes, la célula detecta dichos efectores mediante receptores intracelulares, proteínas R, desencadenando una segunda línea de defensa, llamada ETI , que conduce a una muerte celular programada conocida como HR. La activación de estas respuestas de defensa a nivel local inducen la Respuesta Sistémica Adquirida (SAR) en hojas distales. Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena, capaz de infectar una gran variedad de plantas, incluyendo Arabidopsis. Su virulencia depende de su capacidad de translocar efectores Tipo III (T3Es), directamente al citosol de la célula hospedadora mediante un Sistema de Secreción Tipo III (T3SS). HopZ1a es un efector capaz de suprimir en Arabidopsis defensas locales (PTI y ETI) y sistémicas (SAR) por medio de su actividad acetiltransferasa. En bacterias patógenas de animales, los homólogos de HopZ1a inactivan por acetilación a quinasas del hospedador implicadas en señalización positiva de defensa. En plantas resistentes, HopZ1a acetila la pseudoquinasa ZED1, propuesta como señuelo que imita al objetivo HopZ1a en la planta, para desencadenar la ETI dependiente de HopZ1a. Estos datos sugieren una quinasa reguladora positiva de defensa, tanto a nivel local como sistémico, como probable diana de HopZ1a. En este trabajo identificamos a ZIP1, una que funciona como un regulador positivo de PTI, ETI y SAR, que interactúa con HopZ1a y es acetilada por este efector en una lisina esencial para su actividad quinasa. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

In plants, two main types of noncoding small RNA molecules have been found: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs), differing these in their biogenesis and mode of action, but sharing similar sizes (20-24 nt). In plants, their mature forms are products of the activity of DCL proteins and can act as negative regulators of gene expression. In recent years, the role of miRNAs in regulation of gene expression in plant responses against bacterial pathogens is becoming clearer. Comparisons carried out in our lab between expression profiles of different Arabidopsis thaliana mutants affected in gene silencing, and plants challenged with Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000, led us to identify a set of uncharacterized R genes, belonging to the TIR-NBS-LRR gene family, as differentially expressed in these conditions. By bioinformatics tools, we found a miRNA* of 22 nt putatively responsible for down-regulating expression of these R genes. We have also found that the corresponding pri-miRNA is down-regulated after PAMP-perception. We demonstrate that plants with altered levels of this miRNA* (knockdown lines or overexpression lines) exhibit altered PTI-associated phenotypes, suggesting a role for this miRNA* in this defence response against bacteria. We have characterized the expression pattern of both primiRNA and its best target R genes. Finally, we identify phasiRNAs that arise from the transcript of this R gen in a miRNA*-RDR6-DCL4-dependent manner Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La heterogeneidad o variación fenotípica en bacterias es un fenómeno descrito en poblaciones clonales desde hace décadas. Puede estar determinada por mecanismos epigenéticos, y dar lugar a linajes bacterianos con perfiles de expresión génica diferentes. Bajo el control de ciertos circuitos regulatorios, la heterogeneidad en la expresión génica puede dar lugar a un perfil de expresión bimodal en ambientes homogéneos, proceso conocido como biestabilidad. La relevancia de este proceso se ha demostrado en Salmonella entérica y en otros patógenos humanos durante el establecimiento de la resistencia a antibióticos, y se ha observado la implicación de este proceso en la expresión de genes de virulencia. Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena cuya virulencia depende del Sistema de Secreción Tipo III (T3SS). Nuestro equipo ha descrito que genes de diferentes elementos del T3SS en P. syringae pv. phaseolicola muestran biestabilidad en condiciones de inducción en el laboratorio. Además, las subpoblaciones bacterianas separadas según niveles de expresión muestran diferencias en virulencia, y dicha expresión es marcadamente heterogénea durante la colonización de los tejidos de la planta. Por otro lado, el flagelo es otro elemento importante tanto en el estilo de vida de P. syringae como en su interacción con el huésped, donde dispara inmunidad basal. Hemos observado que fliC el gen que codifica para la flagelina presenta expresión heterogénea, en este caso tanto en cultivos de laboratorio, como durante la proliferación en los espacios intercelulares de la hoja huésped. Dado que resultados previos de nuestro y otros laboratorios indican la existencia de un cierto grado de contra-regulación entre el flagelo y el T3SS, se pretende profundizar en la relación entre la motilidad flagelar y la regulación de la expresión génica del T3SS, así como en el impacto potencial que la expresión biestable del T3SS puede tener sobre la motilidad.

La heterogeneidad o variación fenotípica ha sido descrita en poblaciones clonales microbianas desde hace décadas. Bajo el control de ciertos circuitos regulatorios, la heterogeneidad en la expresión génica puede dar lugar a un perfil de expresión bimodal en ambientes homogéneos, proceso conocido como biestabilidad. La relevancia de este proceso se ha demostrado en Salmonella entérica y en otros patógenos humanos durante el establecimiento de la resistencia a antibióticos, y se ha observado la implicación de este proceso en la expresión de genes de virulencia. Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena de gran importancia económica que requiere del Sistema de Secreción Tipo III (T3SS) para suprimir las respuestas de defensa de la planta. Nuestro equipo ha descrito que genes de diferentes elementos del T3SS muestran biestabilidad en su expresión en condiciones de inducción en el laboratorio, asociada a diferencias fenotípicas en virulencia, y que dicha expresión es marcadamente heterogénea durante la colonización de la planta. Por otro lado, el flagelo es otro elemento importante tanto en el estilo de vida de P. syringae como en su interacción con el huésped, donde dispara inmunidad basal, que asimismo presenta expresión heterogénea, tanto en cultivos, como durante la proliferación en los espacios intercelulares de la hoja huésped. Dado que resultados previos de nuestro y otros laboratorios indican la existencia de un cierto grado de contra-regulación entre el flagelo y el T3SS, este trabajo pretende profundizar en la relación entre la motilidad flagelar y la regulación de la expresión génica del T3SS, así como en el impacto potencial que la expresión biestable del T3SS puede tener sobre la motilidad a nivel de una sola célula. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Gene silencing is a mechanism of regulation of gene expression where the small RNAs (sRNAs) are key components for giving specificity to the system. In plants, two main types of noncoding small RNA molecules have been found: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs). DCL proteins acting on large RNA precursors produce the mature forms of sRNAs (20-24nt) that can act as negative regulators of gene expression. In recent years, the role of miRNAs in regulation of gene expression in plant responses against bacterial pathogens is becoming clearer. Comparisons carried out in our lab between expression profiles of different Arabidopsis thaliana mutants affected in gene silencing, and plants challenged with Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000, led us to identify a set of uncharacterized R genes, belonging to the TIR-NBS-LRR gene family, as differentially expressed in these conditions. Through the use of bioinformatics tools, we found a miRNA* of 22 nt putatively responsible for down-regulating expression of these R genes. We have validated this regulation, and have also established that the corresponding pri-miRNA is down-regulated upon PAMPs or bacteria perception. Using GUS reporters, we have characterized the expression pattern of both pri-miRNA and its best target R genes. We demonstrate that plants with altered levels of miRNA* (knockdown or overexpression lines) exhibit altered PTI-associated phenotypes, supporting a role for this miRNA* in the defence response against this bacterial pathogen. Finally, we identify phasiRNAs that arise from the transcript of one of the R target genes in a miRNA*-RDR6-DCL4-dependent manner. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Pseudomonas syringae es un patógeno bacteriano modelo capaz de infectar y desarrollar la enfermedad en una gran variedad de plantas. Para ello, P. syringae utiliza un sistema de secreción de tipo III para translocar proteínas efectoras dentro del citosol de la célula vegetal, muchas de las cuales suprimen la defensa basal PTI (PAMP-Triggered Immunity), disparada por el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Algunos de esos efectores suprimen la ETI (Effector-Triggered Immunity), respuesta de defensa más específica e intensa desencadenada por el reconocimiento de efectores y cuyo resultado final es la muerte celular programada llamada HR (Hypersensitive Response). Además de las respuestas locales, PTI y ETI, la planta puede activar una respuesta sistémica de defensa SAR (Systemic Acquire Resistance) que la protege contra ataques posteriores del patógeno. El efector HopZ1a es una acetiltransferasa perteneciente a la superfamilia de efectores YopJ, capaz de suprimir las respuestas de defensa PTI, ETI y SAR en Arabidopsis. De entre todas las diana descritas para este efector, ZED1 es una pseudokinasa cuya única función conocida es ser acetilada por HopZ1a, activando así a una proteína R llamada ZAR1, y desencadenando ETI. Esta función de decoy de ZED1, junto a la existencia de interacciones entre otros efectores de la familia YopJ con kinasas de animales, nos lleva a pensar que una kinasa pueda ser diana de HopZ1a. Nuestro trabajo identifica a la kinasa ZIP1, regulador positivo de defensa, como diana de HopZ1a. Nosotros caracterizamos su interacción y demostramos que HopZ1a acetila a ZIP1 en una lisina esencial para su función kinasa para suprimir las defensas de la planta. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Durante un estrés biótico, las plantas modulan la expresión de una batería de genes involucrados en la respuesta de defensa, proceso donde recientemente se ha determinado el papel esencial que desempeña el silenciamiento génico. El silenciamiento génico es un mecanismo de regulación de la expresión génica, donde destacan como principales moléculas efectoras los pequeños RNAs (sRNAs). En plantas, estos sRNAs, son clasificados en pequeños RNAs interferentes (siRNAs) o microRNAs (miRNAs), presentando tamaños similares (20-24 nt) pero difiriendo en su biogénesis y modo de acción. Los miRNAs son pequeños RNAs de cadena sencilla que actúan regulando negativamente la expresión de genes, mediante su unión al complejo RISC (Rna Induced Silencing Complex) y en una forma dependiente de secuencia. En nuestro laboratorio, mediante el análisis de datos transcriptómicos, y el uso de herramientas bioinformáticas, identificamos un miRNA* de 22 nt como potencial regulador de la expresión de genes de resistencia (“R”) del tipo TIR-NBS-LRR. Posteriormente hemos validado dicha regulación y caracterizado los patrones de expresión tanto del Pri-miRNA como de un gen “R” regulado por este, en diferentes tejidos y estadios del desarrollo, así como durante la interacción con P. syringae. Por otro lado, hemos generado plantas transgénicas que presentan niveles alterados del miRNA* (incremento y reducción) y hemos observado que muestran fenotipos alterados de PTI y una mayor/menor colonización de P. syringae. Finalmente hemos identificado la producción de sRNAs (phasiRNAs) a partir del gen de resistencia, en una forma dependiente de miRNA*-RDR6-DCL4, pudiendo estos sRNAs secundarios regular otros transcritos de la misma familia de genes de resistencia. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

During the plant-pathogen interaction, disease or resistance are determined in the plant by a series of molecular events. The plant detects Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), such as flagellin, triggering a defence response called PTI (PAMP-Triggered Immunity). Bacterial pathogens can in turn suppress such defence response through the translocation into the plant cell cytosol of virulence proteins, called effectors, via a Type Three Secretion System (T3SS). In resistant plants, intracellular receptors known as R proteins recognize these effectors, triggering a second line of defence, more specific and intense, called ETI (Effector-Triggered Immunity), which usually leads to programmed cell death known as HR (Hypersensitive Response). Pseudomonas syringae is a phytopathogenic bacterium whose virulence depends on a T3SS and its effector repertoire. Some strains include HopZ1a, an unusual effector which is able to suppress in Arabidopsis both local (PTI and ETI), and systemic (SAR, for Systemic Acquired Resistance) defences, by means of its acetyltransferase activity. In resistant Arabidopsis plants, HopZ1a acetylates the ZED1 pseudokinase, which is proposed to function as a decoy mimicking HopZ1a target in the plant: ZED1 modification activates an R-protein (ZAR1) to trigger HopZ1a-dependent ETI. None of the Arabidopsis proteins proposed to date as HopZ1a targets is a kinase, nor fully explains the effector´s defence suppression abilities. In this work we identify an Arabidopsis kinase that functions as a positive regulator of PTI, ETI and SAR, which interacts with HopZ1a and is acetylated by this effector in lysine residues essential for its kinase activity. Further, HopZ1a can specifically suppress the defence phenotypes resulting from ZIP1 expression in Arabidopsis. We propose that ZIP1 acetylation by HopZ1a interferes with its kinase activity, and consequently with positive defence signalling. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Las plantas cuentan con diferentes mecanismos para hacer frente a la diversidad de estreses tanto bióticos como abióticos presentes en la naturaleza. Estos organismos han desarrollado un complejo sistema inmune que les protege de una gran variedad de patógenos. Ciertas moléculas de dichos patógenos conocidas como fatrones Moleculares Asociados a fatógenos (P AMPs) son reconocidas por receptores presentes en la planta (PRRs) desencadenando una primera defensa basal conocida como PTI (Pattem triggered immunity). Por otro lado los patógenos cuentan con una batería de proteínas efectoras capaces de suprimir dicha respuesta al ser translocados al interior de la célula vegetal a través del Sistema de secreción tipo 111 (T3ss). Como consecuencia las plantas han evolucionado un segundo nivel de defensa, conocida como ETI (Effector triggered immunity) que depende del reconocimiento específico de estos efectores (o de sus funciones) en el interior celular por proteínas de resistencia de la planta (proteínas R). Generalmente este reconocimiento desencadena una muerte celular programada del tejido vegetal conocida como HR (Hypersensitive Response), capaz de frenar el avance del patógeno. El silenciamiento génico es un mecanismo de regulación de la expresión génica mediado por pequeños RNAs. En plantas, estos pequeños RNAs, son producidos por la acción de RNAsas del tipo 111 conocidas como "Dicer-Like proteins" (DCLs). Existen básicamente dos tipos principales de pequeños RNAs involucrados en silenciamiento génico: Los pequeños RNAs interferentes (siRNAs) y los microRNAs (miRNAs), difiriendo estos en su biogénesis y modo de acción pero compartiendo tamaños similares (20-24 nt). Los microRNAs son pequeños RNAs no codificantes, de cadena sencilla capaces de regular negativamente la expresión de transcritos diana mediante la unión al complejo RISC (RNA-induced silencing complex) y por un mecanismo dependiente de secuencia. Esta regulación mediada por miRNAs es englobada dentro del silenciamiento génico post­transcripcional (PTGS). Durante un proceso de infección, las plantas reconocen la presencia del patógeno y modulan la expresión de una variedad de genes implicados en la respuesta de defensa. Es en este proceso donde recientemente se ha demostrado que los miRNAs desempeñan un papel fundamental en la reprogramación hacia una respuesta de defensa exitosa y es por ello que ciertas proteínas efectoras presentan como diana algunos componentes de la maquinaria involucrada en la producción y el correcto funcionamiento de los miRNAs. Diferentes análisis de los perfiles de expresión de plantas mutantes afectadas en la syringae pathovar tomato DC3000, nos ha permitido identificar una serie de genes "R" no caracterizados (TIR-NBS-LRR) expresados diferencialmente en ambas condiciones. Con el uso de diferentes herramientas bioinformáticas, identificamos un miRNA * de 22 nt como potencial regulador de la expresión de dichos genes "R" a través de la generación de pequeños RNAs en fase (Phased-siRNAs) a partir de su gen diana. Hemos demostrado que la expresión del precursor de dicho miRNA * (pri-miRNA) es reprimida durante la infección tras la detección de Patrones Moleculares Asociados a Patógenos. Además hemos observado que plantas con niveles alterados de dicho miRNA * muestran fenotipos alterados de PTI, lo cual sugiere un papel del miRNA * en este mecanismo de defensa frente a la bacteria. Finalmente hemos llevado a cabo una caracterización de los patrones de expresión de ambos genes en plantas de Arabidopsis thaliana. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Durante la interacción planta-patógeno se producen una serie de eventos moleculares que determinan el resultado final de dicha interacción: multiplicación del patógeno y desarrollo de síntomas de enfermedad en plantas sensibles, o bloqueo del proceso de infección corno resultado de una eficaz respuesta de defensa en plantas resistentes. Cuando una bacteria patógena entra en contacto con la célula vegetal, se produce el reconocimiento, por parte de receptores específicos de membrana, de patrones moleculares asociados a patógenos (P AMPs ), corno por ejemplo flagelina o EF-Tu. Este reconocimiento inicia una respuesta de defensa denominada PTI (P AMP-Triggered Irnrnunity), que de no ser suprimida es suficiente para evitar el progreso de la infección. Sin embargo, algunas bacterias patógenas pueden suprimir la respuesta PTI mediante la translocación al interior de la célula vegetal de proteínas de virulencia, llamadas efectores, mediante un Sistema de Secrección Tipo 111 (T3SS). En plantas resistentes, la célula vegetal es capaz de detectar dichos efectores mediante receptores intracelulares conocidos corno proteínas R. Este reconocimiento da lugar a una segunda línea de defensa, más específica e intensa que la PTI, llamada ETI (Effector-Triggered Irnrnunity), que desencadena una muerte celular programada conocida corno HR (Hypersensitive Response). Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena Grarn-negativa que, corno especie, posee un amplio rango de hospedador, que sin embargo es reducido para cada estirpe individual. La virulencia de esta bacteria es dependiente del T3 SS y su repertorio de efectores, que varía entre diferentes estirpes. Uno de estos efectores, HopZla, utiliza su actividad acetiltransferasa para suprimir las respuestas de defensa de la planta, tanto PTI corno ETI, e incluso la respuesta sistémica (SAR), lo que constituye un rango de supresión de inusual amplitud 1'2 . Aunque se han propuesto diversas dianas en la planta para HopZla, ninguna de ellas es consistente con el amplio rango de supresión del que es capaz este efector. La diana de HopZla debe ser compatible con un regulador positivo de defensa necesario para la señalización de PTI, ETI y SAR. Los homólogos de HopZla en bacterias patógenas de animales actúan inactivando por acetilación a quinasas del hospedador implicadas en señalización positiva de defensa. En plantas resistentes, HopZ 1 a acetila la pseudoquinasa ZED 1, un decoy del sistema de defensa, que a su vez activa una proteína R específica (ZARl) para disparar ETI. En conjunto, estos datos sugieren a una quinasa reguladora positiva de defensa corno probable diana para HopZ 1 a. En este trabajo proponernos a ZIPl, una quinasa que actúa corno regulador positivo de las respuestas de defensa PTI, ETI, y SAR, corno diana en la planta de HopZ1a. Siguiendo diversas aprox1mac1ones experimentales demostramos que (i) HopZla interfiere con todas las respuestas de defensa señalizadas específicamente a través de ZIPl, contribuyendo en el proceso a la caracterización molecular de dichas respuestas (ii) HopZla interacciona con ZIPl in vitro e in planta (iii) HopZla acetila a ZIPl en una lisina esencial para su actividad quinasa in vitro e in planta. Este trabajo contribuye a caracterizar el mecanismo molecular por el cual HopZla suprime las defensas de la planta, identificando y caracterizando una diana consistente con el amplio rango de supresión del que es capaz este efector. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Poblaciones bacterianas genéticamente idénticas pueden mostrar variedad fenotípica en ocasiones. Esta variación puede darse en respuesta a estímulos ambientales, o ser estocástica y producirse en condiciones homogéneas. La heterogeneidad fenotípica puede llegar a dar lugar a la formación de subpoblaciones fenotípicamente diferentes cuando los genes implicados están bajo el control de un cierto tipo de circuitos regulatorios. Este proceso es conocido como biestabilidad. En los últimos años se ha descrito un número creciente de genes importantes para la virulencia, la persistencia crónica, o la resistencia que presentan expresión heterogénea y/o biestable en patógenos humanos. Recientemente, describimos el primer ejemplo de biestabilidad en genes de virulencia en un patógeno de plantas, Pseudomonas syringae, la bacteria fitopatógena de mayor relevancia académica e importante impacto económico. Mediante fusiones transcripcionales cromosómicas a genes codificantes de proteínas fluorescentes, microscopía confocal y la citometría de flujo mostramos que la expresión de genes que codifican diferentes elementos del sistema de secreción tipo 111 (por sus siglas en inglés T3SS) es heterogénea en el apoplasto de la planta y biestable en condiciones homogéneas de inducción en el laboratorio, identificamos el regulador transcripcional HrpL y el circuito de regulación establecido por HrpG/ Hrp V como esenciales para el establecimiento de biestabilidad, y demostramos que la misma determina cambios en virulencia. Resultados previamente publicados por nuestro laboratorio mostraban un efecto represor de HrpL en la motilidad de P. syringae lo que nos ha llevado a analizar la expresión del genfliC que codifica la flagelina, principal componente del flagelo, así como su respuesta a diferentes proteínas reguladoras. Presentamos aquí los resultados y conclusiones de dicho análisis. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Pseudomonas syringae is a model bacterial pathogen that penetrates the leaf to reach the plant apoplast, where it replicates causing disease. In order to do that, the pathogen must interfere and suppress a two-tiered plant defense response: PTI (PAMP-Triggered Immunity, or basal resistance) and ETI (Effector-Triggered Immunity). P. syringae uses a type III secretion system to directly deliver effector proteins inside the plant cell cytosol, many of which are known to suppress PTI, some of which are known to trigger ETI, and a handful of which are known to suppress ETI. Bacterial infection can also trigger a systemic plant defense response that protects the plant against additional pathogen attacks known as SAR (Systemic Acquired Resistance). We are particularly interested in the molecular and cellular mechanisms involved in effector-mediated defense evasion by P. syringae, in particular those involved in the suppression of ETI and SAR, and/or mediation of hormone signaling. Here we present data describing effector-mediated interference with plant immunity, by means of acetylation of a key positive regulator of local and systemic responses. Our work identifies a novel plant target for effector function, and characterizes its function. This work illustrates how analyzing the means by which a given effector interferes with its target can provide novel information regarding eukaryotic molecular mechanisms. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. MINECO BIO2015-64391R y FEDER

Bacterial microcolonies with heterogeneous sizes are formed during colonization of Phaseolus vulgaris by Pseudomonas syringae. Heterogeneous expression of structural and regulatory components of the P. syringae type III secretion system (T3SS), essential for colonization of the host apoplast and disease development, is likewise detected within the plant apoplast. T3SS expression is bistable in the homogeneous environment of nutrient-limited T3SS-inducing medium, suggesting that subpopulation formation is not a response to different environmental cues. T3SS bistability is reversible, indicating a non-genetic origin, and the T3SSHIGH and T3SSLOW subpopulations show differences in virulence. T3SS bistability requires the transcriptional activator HrpL, the double negative regulatory loop established by HrpV and HrpG, and may be enhanced through a positive feedback loop involving HrpA, the main component of the T3SS pilus. To our knowledge, this is the first example of phenotypic heterogeneity in the expression of virulence determinants during colonization of a non-mammalian host. Ministerio de Ciencia e Innovación BIO2009-11516, AGL2010-22287-C02-2 Ministerio de Economía y Competitividad BIO2012-35641, BIO2015-64391- R

El silenciamiento génico es un mecanismo de regulación de la expresión génica mediado por pequeños RNAs. En plantas, los precursores de estos pequeños RNAs, son procesados por proteinas Dicer-Like (RNAse III). Existen dos tipos principales de pequeños RNAs involucrados en silenciamiento génico: Los pequeños RNAs interferentes (siRNAs) y los microRNAs (miRNAs), difiriendo estos en su biogénesis y modo de acción pero compartiendo tamaños similares (20-24 nt). Esta regulación mediada por pequeños RNAs puede ocurrir tanto a nivel transcripcional (TGS) como post-transcripcional(PTGS). Durante el proceso de infección, las plantas modulan la expresión de una variedad de genes implicados en la respuesta de defensa, donde recientemente se ha demostrado que los pequeños RNAs desempeñan un papel fundamental. El análisis de los perfiles de expresión de diferentes mutantes afectados en la biogénesis de pequeños RNAs y plantas infectadas con Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000, nos ha permitido identificar una serie de genes “R” no caracterizados (TIR-NBS-LRR) expresados diferencialmente en ambas condiciones. Con el uso de diferentes herramientas bioinformáticas, identificamos un miRNA* de 22 nt como potencial regulador de la expresión de dichos genes “R” a través de la generación de siRNAs. Hemos demostrado que la expresión del precursor de dicho miRNA* (pri-miRNA) es reprimida durante la infección tras la detección de Patrones Moleculares Asociados a Patogenos (PAMPs) y de una forma dependiente del Ácido Salicílico (SA). Además hemos observado que plantas con niveles alterados de dicho miRNA* muestran fenotipos alterados de PTI, lo cual sugiere un papel del miRNA* en este mecanismo de defensa frente a la bacteria. Finalmente hemos identificado uno de los genes diana de este miRNA como un regulador negativo de a respuesta de defensa frente a Pseudomonas syringae. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Plant hormones are small molecules involved in the regulation of plant growth, development, reproduction and stress responses. Salicylic acid (SA) and jasmonates (JA) are essential for the activation of defence responses against pathogens. SA signaling is involved in triggering immunity against biotrophic pathogens while JA activates resistance against necrotrophic pathogens. The SA and JA pathways are mostly antagonistic: elevated biotroph resistance correlates with increased necrotroph susceptibility, and vice versa. Using transcriptomics to look for a functional overlap between plant gene silencing and type III-mediated plant responses we found that genes associated to JA signaling were overrepresented in the overlapping set, more so than SA-related genes. We present here the results of the ensuing analysis, showing effector-mediated activation of the JA pathway as a virulence mechanism, and establishing a novel role for gene silencing in the regulation of the JA pathway. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech - See more at: http://riuma.uma.es/xmlui/handle/10630/5393/submit/12176e8e39815b4d6112192a6815221718868c2f.continue#sthash.RYCQTkwy.dpuf