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Resumen del póster presentado al XXXVI Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Madrid del 3 al 6 de septiembre de 2013., Las arrestinas tienen un papel clave en el tráfico intracelular de los receptores de siete hélices transmembrana. En laruta de señalización por pH ambiental de levadura están implicadas tanto una proteína de la familia de las arrestinas, Rim8, como la maquinaria ESCRT (complejos de clasificación endosomal necesarios para el transporte). Hemos demostrado previamente que la E3 ubiquitina ligasa Rsp5 monoubiquitina el extremo C-terminal de Rim8. Además, esta modificación es dependiente de su asociación con el dominio UEV de unión a ubiquitina de la subunidad Vps23 del complejo ESCRT-I. Para determinar si este dominio de unión a ubiquitina participa activamente en la modificación de Rim8, hemos puesto a punto un ensayo de ubiquitinación in vitro en el que utilizamos el extremo C-terminal de Rim8 como sustrato. Nuestros resultados indican que Rim8 se poliubiquitina in vitro y que esta modificación es dependiente de la unión de Rsp5 a un motivo PXY en Rim8. De forma notable, la adición del dominio UEV de Vps23 a la mezcla de reacción inhibe la formación de cadenas de ubiquitina y genera la formación de sustrato modificado con una única molécula de ubiquitina (monoubiquitinado). Este efecto es específico ya que no se observa con el dominio UEV de la proteína Mms2. Por otra parte, la inhibición de la poliubiquitinación de Rim8 es dependiente de la unión del dominio UEV de Vps23 con ubiquitina y con un motivo SXP próximo al residuo ubiquitinado. Finalmente, confirmamos in vivo el papel de Vps23 en el bloqueo de la poliubiquitinación de Rim8 ya que la expresión de ubiquitina mutante, que no permite la formación de cadenas de ubiquitina, restaura la ubiquitinación de Rim8 en ausencia de Vps23. Ya que la extensión de la cadena de ubiquitina requiere la unión del lóbulo N del dominio HECT de Rsp5 a la primera molécula de ubiquitina conjugada, proponemos un modelo en el que el dominio UEV de Vps23 compite con esta interacción, y evita así que se produzcan las sucesivas rondas de reacción. Estos hallazgos revelan un nuevo mecanismo de control de la longitud de cadenas de ubiquitina conjugadas a proteínas sustrato.

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LAT1, also named SLC7A5, is a human plasma membrane transporter covalently associated with the glycoprotein CD98 (SLC3A2). It catalyses the uptake of several essential amino acids, including leucine, thereby contributing to the activation of the mTORC1 (mechanistic Target of Rapamycin Complex 1) kinase complex. This control of mTORC1 by LAT1 is notably important for the rapid proliferation of tumour cells. Moreover, LAT1 overexpression has been observed in numerous cancers, and is often associated with a poor prognosis. Despite the importance of LAT1 in normal and tumour cells, the mechanisms controlling the intracellular traffic of this transporter, and particularly its endocytosis, are still poorly known.Many plasma membrane transporters are downregulated by endocytosis, in response to various signals. In yeast, endocytosis of plasma membrane permeases is triggered by their ubiquitylation mediated by the ubiquitin ligase Rsp5, acting in association with adaptors of the α-arrestin family. Ubiquitin also plays an important role in endocytosis of many human transporters. The main objective of this thesis work was to characterize the mechanisms mediating endocytosis of LAT1 in HeLa tumour cells.In the first part of this work, we studied the effect of FTY720, an analog of sphingoid bases with antitumor properties, on a HeLa T-Rex stable cell line expressing a LAT1-GFP construct. We also analysed the effect of FTY720 on several yeast plasma membrane permeases. Our results show that FTY720 induces a loss of activity and the endocytosis of permeases in yeast and of LAT1 in HeLa cells. Yeast permease internalization is associated with their ubiquitylation by the Rsp5 ubiquitin ligase. Moreover, FTY720 decreases TORC1/mTORC1 activity. Based on these results, we propose a model for the effect of FTY720 in yeast: this drug, by decreasing the activity of numerous nutrient transporters, leads to TORC1 inhibition. This loss of TORC1 activity promotes, via a still unknown mechanism, the Rsp5-dependent ubiquitylation and endocytosis of permeases. A similar mechanism could be responsible for FTY720-induced endocytosis of LAT1 in HeLa cells.In the second part of this work, we further investigated the mechanisms involved in LAT1 endocytosis. We found that LAT1 is internalized and degraded upon activation of protein kinase C (PKC) by the phorbol ester PMA. This treatment also elicited the ubiquitylation of LAT1 via the Nedd4-2 ubiquitin ligase. Finally, we identified the lysines 19, 25 and 30 in the N-terminal tail of LAT1 as the major sites of its ubiquitylation in response to PMA, and we showed that these lysines are important for PMA-induced downregulation. Future work will determine the importance of this control mechanism of LAT1 in the context of normal and tumour cells., Ce travail porte sur l’étude du transporteur d’acides aminés humain LAT1, également appelé SLC7A5. LAT1, situé à la membrane plasmique où il est associé à la protéine CD98 (SLC3A2), est le transporteur principal de leucine dans les cellules et joue un rôle central dans l’activation de mTORC1 par cet acide aminé. Ce transporteur est surexprimé dans les cellules de nombreuses tumeurs, dans lesquelles il est souvent associé à un mauvais pronostic. Le trafic intracellulaire de LAT1 et, en particulier, son endocytose sont très peu connus. Mon travail de thèse a eu pour but d’étudier l’endocytose de LAT1 et les facteurs impliqués dans ce mécanisme. Dans la première partie de cette recherche, nous avons étudié l’effet du FTY720, un analogue de bases sphingoïdes, sur une lignée stable de cellules HeLa TRex exprimant LAT1-GFP, et nous l’avons comparé à son effet dans la levure. Nous avons observé que ce composé induisait une diminution de l’activité et l’endocytose de nombreux transporteurs de nutriments chez la levure ainsi que de LAT1 dans les cellules HeLa. De plus, l’internalisation des perméases de levure en réponse au FTY720 est associée à leur ubiquitylation, via l’ubiquitine ligase Rsp5. Nous avons également montré que ce composé diminue l’activité du complexe kinase TOR1/mTOR1. Ces différents résultats nous ont amené à l’hypothèse suivante :le FTY720, en induisant une perte d’activité de nombreux transporteurs de nutriments chez la levure, inhibe TORC1. Cette perte d’activité de TORC1 activerait, via un mécanisme encore inconnu, l’ubiquitylation et l’endocytose Rsp5-dépendante des perméases. Un mécanisme similaire pourrait être responsable de l’endocytose de LAT1 dans les cellules HeLa.Dans une seconde partie, nous avons étudié les facteurs impliqués dans l’endocytose de LAT1 en réponse à un second composé, le PMA, un activateur de la PKC. Nous avons montré que ce composé induit l’internalisation et l’ubiquitylation de LAT1 via l’activation de la PKC. Nous avons trouvé que cette modification dépend de l’ubiquitine ligase Nedd4-2. De plus, les lysines 19, 25 et 30 semblent être les cibles principales de l’ubiquitine ligase. En effet, une diminution importante de l’ubiquitylation et de la localisation intracellulaire de LAT1 en réponse au PMA est observée dans un mutant LAT1K19R,K25R,K30R. D’autres études seront nécessaires pour évaluer l’importance de ce mécanisme de régulation de LAT1 dans les cellules saines et cancéreuses., Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished