Search

Biologiska läkemedel är läkemedel som tillverkas från cellodling och är en växande industri. Varje år tillverkas nya biologiska läkemedel, vilket ställer högre krav på metoder för att kunna mäta och kontrollera processparametrar av tillverkningen. Cellodlingsmediet är en viktig parameter som påverkar läkemedlets karaktär och omsättning, vilket gör att pålitliga metoder för att kunna övervaka viktiga egenskaper i cellodlingsmediet behövs. Sackarider är en komponent i cellodlingsmediet som både utgör kol- och energikälla till cellerna under odlingen. I den här avhandlingen beskrivs en metod för att separera och kvantifiera fem olika sackarider som används i cellodlingsmedium, för användning i ett automatiserat system för analys. Sackariderna laktos, mannos, glukos, fukos och galaktos derivatiserades med fluoroforen APTS och separerades med microchip-kapillärelektrofores (MCCE) och laser-inducerad fluorescencedetektion (LIF). Den här studien omfattade prover med koncentrationer i intervallet som förväntas ingå i cellodlingsmedium, 0,5 50 mM. Metoden är linjär i detta område, med R2-värden från 0,87-0,99. Migrationstiden för sackariderna var repeterbar med RSD-värden 2,35 5,47%, men RSD för topparean var 9 22,80% vilket inte är repeterbart. Fukos användes som en intern standard, vilket förbättrade RSD för topparean till 1 6,54%, som faller inom accepterade gränsen på maximalt 10%. Fyra disackarider som inte fanns i proven testades som kandidater för en intern standard, men inga slutsatser kunde göras på deras lämplighet på grund av misstag och begränsad tid. Alla 5 sackarider som testades i studien används sällan tillsammans, därför är det lämpligt att använda en sackarid som inte är med i provet som en intern standard. Resultaten från den här studien visar att metoden är både linjär och repeterbar när en intern standard används. Den här studien utgör en lovande grund för ytterligare validering på riktiga prover med cellodlingsmedium samt i den slutliga automatiserade systemet för analys. Biopharmaceuticals is a growing field of pharmaceutical development, and monitoring of key process parameters in the cell culture medium is critical for good yield and precise products. Saccharides are both the main carbon source and energy source for cells during bioprocesses and therefore important to monitor. In this paper, a method to separate and quantify five saccharides in cell culture medium is validated for use in at-line monitoring of bioprocesses. The saccharides lactose, mannose, glucose, fucose, and galactose were derivatized with the fluorophore APTS and separated with microchip capillary electrophoresis (MCCE) and laser-induced fluorescence detection (LIF). All five saccharides were separate with a run time of less than 10 minutes. The method was tested for linearity over the range 0.5-50 mM, and was linear with R2 values ranging from 0.87 to 0.99. Migration times for the saccharides were repeatable with an RSD of 2.35-5.47%, but the peak areas were not repeatable with an RSD of 9-22.80%. The RSD for the peak areas was improved to 1-6.54% when fucose was used as an internal standard (IS), which shows that the method was repeatable if a suitable internal standard was used. Four disaccharides were tested as internal standards, but no conclusion could be drawn on their suitability because of operator error and time constraints. These results show that the method is linear and repeatable with the use of an internal standard, and form a promising foundation for further validation. The method was developed with the intention of being used in the integrated system, ALIAS, and needs to be validated in the integrated system first.

Mass spectrometry (MS) is an important analytical tool. Its most importantadvantages are sensitivity, resolution, and accurate and precise m/zmeasurements. To get the best results from an instrument, the user musthave knowledge of its limitation and requirements.The sensitivity of matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSis dependent on the surface concentration of the sample. In Paper I, ahighly hydrophobic surface coating was developed and applied to MALDItarget plates. This allowed applied sample droplets to dry down ontosmaller areas. Compared to untreated and commercial concentrationplates, the surface treated plates gave on average twice the signal to noisefor peptide analysis.Signal suppression and signal overlap in MS can obscure analyte signals.In Paper II, an automated system for coupling capillary electrophoresis toMALDI-MS was developed. Separation of butterfly spermatophoreproteins into 32 fractions revealed some otherwise not detected oroverlapping MS signals.Calibration is vital for accurate MS measurements. In Paper III, adendrimer-based calibration solution for electrospray ionization (ESI)-MSwas developed, intended for peptide analysis. With a larger number ofsignals in the m/z range of interest, precision, and probably accuracy,improved compared to a commercial calibration solution.In Paper IV, calibration options for ESI-MS were reviewed. Factorsaffecting accuracy and precision, in general and for different instruments,were summarized, and a comprehensive list of calibrants was compiled.Paper V further investigated accuracy and precision in MS, specificallyregarding chemical mass shifts in ion traps. It was shown that clusters andsome adduct ions would be unsuitable for calibration of ion traps, and thatlinear ion traps showed mass shifts similar to spherical ion traps. Masspektrometri (MS) är ett viktigt analytiskt verktyg. Dess viktigastefördelar är känslighet, upplösning, och exakta och precisa m/z mätvärden.För att få bästa resultat från ett instrument måste användaren känna tilldess begränsningar och krav.Känsligheten för matrisassisterad laser desorbtion/jonisering (MALDI)-MS är beroende av ytkoncentrationen av provet. I Paper I utvecklades enmycket hydrofob ytbehandling som applicerades på MALDI-provplattor.Det gjorde att provdroppar torkade på en mindre yta. Jämfört medobehandlade och kommersiella koncentrationsplattor gav ytbehandladeprovplattor i genomsnitt två gånger högre signal-till-brus vid peptidanalys.Signalkonkurrens och överlapp i MS kan dölja provsignaler. I Paper IIutvecklades ett automatiserat system för att koppla kapillärelektrofores tillMALDI-MS. Separation av fjärilsspermatoforproteiner i 32 fraktionervisade några annars odetekterade eller överlappande MS-signaler.Kalibrering är avgörande för exakta MS-mätningar. I Paper III utveckladesen dendrimerbaserad kalibrerlösning för elektrospray-jonisering (ESI)-MS, ämnad för peptidanalys. Med fler signaler i m/z-området av intresseförbättrades precision, och antagligen exakthet, jämfört med enkommersiell kalibrerlösning.I Paper IV utfördes en litteraturstudie av kalibreringsalternativ för ESIMS. Faktorer som påverkar exakthet och precision, i allmänhet och förolika instrument, sammanfattades, och en omfattande lista överkalibranter sammanställdes.I Paper V undersöktes exakthet och precision närmare i MS, specifikt medavseende på kemiska masskift i jonfällor. Det påvisades att kluster- ochadduktjoner vore olämpliga som kalibranter i jonfällor, och att linjärajonfällor gav masskift som liknade dem i sfäriska jonfällor. QC 2021-05-17

Allt eftersom problemen med fossila ämnen blir mer tydliga dras industrins uppmärksamhet till trä som en förnybar råvara och energikälla. I Sverige finns stora resurser av barrträd, vilket har betytt mycket för landets ekonomi och kommer förmodligen att göra det i framtiden också. Ett stort problem vid nyplantering av barrträd är dock angrepp av skadeinsekter, som kan leda till att så mycket som 40 % av trädplantorna dör inom ett år. Nyligen har ett ämne som förekommer i barrträd, metyljasmonat, uppmärksammats för sina skyddande effekter. Då det är naturligt och helt bionedbrytbart har det föreslagits som ett miljövänligt alternativ till traditionella pesticider. För kommersialisering och vidare utveckling bör dock ämnets påverkan på trädet undersökas. Vi undersökte sammansättningen av aminosyror i barken hos behandlade och obehandlade plantor med kapillärelektrofores. Metoden som användes visade sig dock ha dålig reproducerbarhet, vilket gjorde resultaten opålitliga. De tydde på att metyljasmonatbehandlingen inte ändrade sammansättningen dramatiskt, men det krävs en mer robust metod för att dra säkra slutsatser. Vi undersökte även förekomst och mängd av terpener i barkproverna med GC-MS. Fem stycken terpener karakteriserades: 3-karen, D-limonen, β-fellandren, geranyl linalool och thunbergol. Metoden visade god reproducerbarhet och tillförlitlighet, men mer data behövdes för att kunna dra slutsatser med statistisk säkerhet. Samtliga prover visade sig innehålla mätbara halter av 3-karen, β-fellandren och thunbergol. Resultaten antyder att koncentrationen av terpener överlag ökade efter metyljasmonatbehandling och detta var särskilt tydligt för β-fellandren. Det fanns anledning att tro att genetiska faktorer påverkade resultatet av behandlingen, då vissa kloner svarade starkare på behandlingen än andra.

Allt eftersom problemen med fossila ämnen blir mer tydliga dras industrins uppmärksamhet till trä som en förnybar råvara och energikälla. I Sverige finns stora resurser av barrträd, vilket har betytt mycket för landets ekonomi och kommer förmodligen att göra det i framtiden också. Ett stort problem vid nyplantering av barrträd är dock angrepp av skadeinsekter, som kan leda till att så mycket som 40 % av trädplantorna dör inom ett år. Nyligen har ett ämne som förekommer i barrträd, metyljasmonat, uppmärksammats för sina skyddande effekter. Då det är naturligt och helt bionedbrytbart har det föreslagits som ett miljövänligt alternativ till traditionella pesticider. För kommersialisering och vidare utveckling bör dock ämnets påverkan på trädet undersökas. Vi undersökte sammansättningen av aminosyror i barken hos behandlade och obehandlade plantor med kapillärelektrofores. Metoden som användes visade sig dock ha dålig reproducerbarhet, vilket gjorde resultaten opålitliga. De tydde på att metyljasmonatbehandlingen inte ändrade sammansättningen dramatiskt, men det krävs en mer robust metod för att dra säkra slutsatser. Vi undersökte även förekomst och mängd av terpener i barkproverna med GC-MS. Fem stycken terpener karakteriserades: 3-karen, D-limonen, β-fellandren, geranyl linalool och thunbergol. Metoden visade god reproducerbarhet och tillförlitlighet, men mer data behövdes för att kunna dra slutsatser med statistisk säkerhet. Samtliga prover visade sig innehålla mätbara halter av 3-karen, β-fellandren och thunbergol. Resultaten antyder att koncentrationen av terpener överlag ökade efter metyljasmonatbehandling och detta var särskilt tydligt för β-fellandren. Det fanns anledning att tro att genetiska faktorer påverkade resultatet av behandlingen, då vissa kloner svarade starkare på behandlingen än andra.

Due to the hydrophobic nature of integral membrane proteins (IMP) they give rise to several difficulties concerning handling and analysis, which is not the case for the most water soluble proteins. New analysis methods are needed, where the insolubility problems of the hydrophobic proteins due to aggregation and adhesion are tackled. Those problems also affect digestion performance and equipment compatibility for the analysis. Protocols for analysis and separation specified for IMP are presented in Paper I and III. The instrumentation used in this work was capillary electrophoresis (CE) and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). Both instruments are suitable for peptide/proteins analysis. In Paper I, protocols for a CE separation of bacteriorhodopsin (BR) peptides as model IMP peptides are established. Also, a partially automated manufacturing procedure of a concentration MALDI-target is presented, suitable for fractions from CE. The MS analysis detected 9 out of 10 cyanogen bromide (CNBr) digested BR peptides. A novel technique for the off-line integration of CE to MALDI-MS using a closed-open-closed system is presented in Paper II, where the open part is a microcanal functioning as a MALDI target window. Investigation of the microcanal electro-osmotic flow (EOF) properties and band broadening characteristics was performed. A protein separation was obtained and detected with MALDI-MS analysis in the microcanal. Different protein digestion methods were evaluated using BR in Paper III through MALDI-MS. Several digestion methods as well as MS media were investigated alongside different MALDI matrices. For example, matrices as the hydrophobic 2,6-dihydroxyacetophenone (DHAP) and 2-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid (2H3MBA) or 2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid (2H5MBA) mixed with DHB, appeared to be promising matrices for analysis of BR. Med anledning av integrala membranproteiners (IMP) hydrofoba egenskaper uppstår flera svårigheter vid hantering och analys av IMP, vilket inte är fallet för vattenlösliga proteiner. Nya analysmetoder krävs, som löser löslighetsproblemen för de hydrofoba proteinerna som tex flockning och adsorbtion. Dessa problem påverkar även klyvningsgrad och kompatibilitet med analysutrustningen. I Artikel I och Artikel III presenteras protokoll för analys och separation specifikt för IMP. Instrumenteringen som har använts i detta arbete är kapillärelektrofores (CE) och matris-assisterad laserdesorptions-joniserings-masspektrometri (MALDI-MS). Båda instrumenten är lämpade för peptid/protein analyser. I Artikel I, presenteras protokoll för en CE separation av peptider från bacteriorhodopsin (BR), som användes som modellpeptider för IMP. En delvis automatiserat tillverkningsprocedur för en koncentrerande MALDI-platta, som är anpassad för CE fraktionerna beskrivs också. MS-analysen detekterade 9 av 10 BR-peptider från cyanobromid-klyvning (CNBr). En ny teknik för off line-integrering av CE till MALDI-MS genom ett slutet-öppet-slutet system presenteras i Artikel II, där den öppna delen är en mikrokanal som fungerar som detektionsfönster i MALDI. Undersökning av mikrokanalens egenskaper som tex det elektroosmotiska flödet (EOF) och bandbreddningen utvärderades. En proteinseparation genomfördes och detekterades med MALDI–MS i mikrokanalen. Olika proteinklyvningsmetoder för BR undersöktes i Artikel III med MALDI-MS. Flera proteinklyvningsmetoder samt MS-medier utvärderades tillsammans med olika MALDI-matriser. Den hydrofoba matrisen 2,6-dihydroxyacetophenone (DHAP) och 2-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid (2H3MBA) eller 2-Hydroxy-5-methoxybenzoic acid (2H5MBA) blandade med DHB, visade sig exempelvis vara lovande matriser för BR-analyser. QC 20101109