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Hereditäre Kardiomyopathien sind durch klinische und genetische Heterogenität gekennzeichnet, welche die Kardiogenetik vor Herausforderungen stellt. In dieser Arbeit wurden manche dieser Herausforderungen angegangen, indem anhand einer Kohorte von 61 Patienten mit Kardiomyopathie bzw. primärer Arrhythmie eine Exom-Diagnostik mit anschließender stufenweiser Datenanalyse vorgenommen wurde. Ein Ziel der Arbeit war, die aktuellen diagnostischen Detektionsraten zu prüfen sowie zu bewerten, ob eine erweiterte Exom-Diagnostik im Vergleich zur üblichen Genpanel-Analyse einen diagnostischen Zugewinn bringt. Zudem sollten potenzielle Krankheitsgene sowie komplexe Genotypen identifiziert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass bei insgesamt 64% der Patienten eine Variante von Interesse gefunden wurde. Hervorzuheben ist die hohe Detektionsrate in der größten Subkohorte, die aus Patienten mit dilatativer bzw. linksventrikulärer Non-Compaction Kardiomyopathie bestand: 69% und damit höher im Vergleich zur in der Literatur berichteten Detektionsrate von bis zu 50%. Im Rahmen der stufenweisen Daten-Auswertung zeigte sich zwar, dass die meisten kausalen Varianten in den phänotypspezifischen Panels zu finden waren, die Analyse eines erweiterten Panels mit 79 Genen sowie der Gesamtexom-Daten aber zu einer zusätzlichen Aufklärungsquote von 13% bzw. 5% führte. Durch die Erweiterung der Diagnostik konnten interessante, teilweise neue Assoziationen zwischen Genotyp und Phänotyp sowie neue Kandidatengene identifiziert werden. Das beste Beispiel dafür ist eine trunkierende Variante im STK38-Gen, das an der Phosphorylierung eines Regulators der Expression kardialer Gene beteiligt ist. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Detektionsrate von Genpanels für die Routine-Diagnostik akzeptabel ist, die Anwendung von Exom-Diagnostik einen diagnostischen Zugewinn, die Entdeckung von interessanten Genotyp-Phänotyp-Korrelationen sowie die Identifizierung von Kandidatengenen ermöglicht., Hereditary cardiomyopathies are characterized by clinical and genetic heterogeneity, which poses challenges to genetic diagnostics in cardiogenetics. In this study, some of these challenges were addressed on the basis of the genetic analysis of 61 cardiomyopathy and arrhythmia patients using exome sequencing with subsequent stepwise analysis of the genetic data. One objective of the study was to examine the current diagnostic yield of genetic analysis as well as to assess the diagnostic benefit of an extended exome analysis vs. targeted gene panel analysis. Another aim was to identify novel candidate genes and describe new genotype-phenotype correlations. Regarding the results, a variant of interest could be detected in 64% of the patients. Of note is the high detection rate in the main subcohort of patients with dilated cardiomyopathy and/or left ventricular noncompaction cardiomyopathy: 69% vs. the reported detection rate of max. 50% in the literature. To evaluate the additional diagnostic benefit of extensive exome testing, a stepwise analysis of the exome data was performed. It was shown here that most of the variants of interest were detected in the phenotype-specific core gene panels; however, the analysis of an extended gene set with 79 genes and subsequently of the complete exome data led to an additional diagnostic yield of 13% and 5% respectively. Through the expansion of the genetic analysis, interesting or new genotype-phenotype correlations could be documented and candidate genes could be identified. The best candidate was a truncating variant in STK38, a gene coding for a kinase that phosphorylates a transcription regulator of genes encoding for cardiac sarcomere proteins. In conclusion, although the detection rate of gene panels is acceptable for the clinical routine, the use of exome analysis enables the highest possible diagnostic yield, the detection of interesting genotype-phenotype correlations as well as the identification of new candidate genes.

Ziel dieser Dissertation war eine Identifizierung von Kandidatengenen für das Poland-Möbius-Syndrom (PMBS) mittels Exomsequenzierung. Es wurden die Exome von fünf Patienten mit PMBS auf Varianten in bekannten Krankheits- und Kandidatengenen des PMBS, der Poland-Sequenz und des Möbius-Syndroms hin überprüft. Des Weiteren wurde nach de novo-Varianten sowie nach homozygoten, compound heterozygoten und X-chromosomalen Varianten gesucht. Zusätzlich wurden diejenigen Gene als mögliche Kandidatengene betrachtet, in denen mindestens zwei der fünf Patienten potentiell deletäre Varianten aufwiesen. Durch diese Auswertung fand sich zwar kein klares Kandidaten- oder Krankheitsgen des PMBS, dennoch konnten potentielle Kandidatengene identifiziert werden, die sich möglicherweise in weiteren Studien mit größeren Kohorten bestätigen lassen.

Eine frühzeitige und ausreichende Kolostrumaufnahme innerhalb der ersten Stunden nach der Geburt ist essentiell für die passive Immunisierung neugeborener Kälber. Hierdurch wird der Grundstein für die Aufzucht vitaler und leistungsstarker Tiere gelegt. Ist die Kolostrumaufnahme der neugeborenen Kälber eingeschränkt, so hat dies nicht nur Entwicklungsstörungen und eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit der Tiere zur Folge, sondern birgt auch das Risiko von erhöhter postnataler Sterblichkeit. Eine eingeschränkte Kolostrumaufnahme hat daher sowohl aus Sicht des Tierschutzes eine hohe Relevanz, als auch für die Wirtschaftlichkeit betroffener landwirtschaftlicher Betriebe. In der Rinderrasse Braunvieh zeigt sich das Problem trinkschwacher Kälber (Inzidenz: 10 %) häufiger als in anderen Rassen. Durch Studien innerhalb der italienischen Braunviehpopulation konnte bereits eine genetische Komponente mit Heritabilitäten im mittleren Bereich für ein fehlerhaftes Trinkverhalten der neugeborenen Kälber festgestellt werden. Dies deutet darauf hin, dass das Trinkverhalten durch die Genetik der Tiere beeinflusst wird und somit züchterisch zu bearbeiten ist. Aus diesem Grund wurde in der hier vorgestellten Arbeit die Charakterisierung der genetischen Hintergründe des perinatalen Saugreflexes und des Trinkverhaltens bei neugeborenen Kälbern in der Braunviehpopulation vorgenommen. Hierfür wurden auf über 220 braunviehhaltenden und in Baden-Württemberg lokalisierten Milchviehbetrieben Daten erhoben. Neben einer Evaluierung des Haltungs- und Fütterungsmanagements der Betriebe wurden zur Durchführung Pedigree-basierter genetischer Analysen, mittels uni- und multivariater Vaterschwellenwertmodelle, die Phänotypdaten von über 10.000 Kälbern erhoben. Zusätzlich erfolgte die Sammlung von Gewebeproben von über 3.000 Kälbern für die Durchführung genomischer Analysen. Unter Verwendung von hochdichten Markerkarten wurden genomweite Assoziationskartierungen sowohl mit Single-Marker-Modellen, als auch mit bayesschen Multi-Marker-Modellen durchgeführt. Gewebeproben von circa 900 Müttern wurden ebenfalls gesammelt und deren 50K-typisierte Genotypen analysiert. Anhand der mütterlichen Markergenotypen wurden maternale genetische Effekte auf einen fehlerhaften Saugreflex der Kälber untersucht. Es konnten niedrige Heritabilitäten für die Merkmale Trinkverhalten und Saugreflex ermittelt werden. Diese lagen in Abhängigkeit des betrachteten Merkmals, der angewandten Merkmalskodierungen und der verwendeten Modelle im Bereich zwischen 0,06 bis 0,23. Die für das Trinkverhalten geschätzte Heritabilität war sowohl im univariaten Modell, als auch im multivariaten Modell etwas höher, als für das Merkmal Saugreflex. Die genomweiten Assoziationsanalysen zeigten deutlich einen quantitativ-genetischen Hintergrund beider betrachteter Merkmale. Aus diesen Erkenntnissen lässt sich für die praktische Züchtung ableiten, dass eine Verbesserung der Problematik anhand von Gentests, wie dies beispielsweise bei monogenen Erbkrankheiten erfolgt, nicht zielführend ist. Stattdessen ist ein Zuchtfortschritt über den Einsatz der genomischen Selektion zu empfehlen. Dafür ist eine konstante Merkmalserfassung erforderlich. Die Erfassung des Trinkverhaltens der Kälber sollte dafür innerhalb der ersten 12 Stunden postpartum erfolgen. Die Ergebnisse der Gen-Annotation mittels GO-Termen und der Pfadanalysen zeigten die Überrepräsentation von Genen mit Funktionen bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems, der Neurogenese und Signalübertragung. Um maternale genetische Effekte auf die Trinkschwäche der Kälber effektiv schätzen zu können, waren sowohl die Markerdichte von 50K zu gering, als auch der verwendete Datensatz zu klein. Es konnte ein hoch signifikanter allgemeiner Betriebseinfluss auf die untersuchten Merkmale festgestellt werden. Allerdings ergaben die durchgeführten Auswertungen hinsichtlich spezifischer Einflüsse in Bezug auf die Haltungs- und Fütterungsumwelten der Kühe und Kälber auf den Betrieben keine signifikanten Unterschiede. A healthy sucking behavior is important for newborn calves to ensure sufficient colostrum intake in the first few hours postpartum. This is essential for the passive immunization of newborn calves and provides the foundation for raising vital and well developed animals. Insufficient colostrum intake not only results in developmental disorders and increased susceptibility to certain diseases, but also inherits the risk of increased postnatal mortality. Therefore, an insufficient colostrum intake is an animal welfare problem and it also leads to economic losses for the farmers. Brown Swiss breeders are more likely to experience the problem of non-sucking calves (incidence: 10%) than is apparent in other breeds. Studies in the Italian Brown Swiss population have already identified a genetic component with mid-range heritabilities for erroneous perinatal sucking behavior. This indicates that the trait sucking behavior is partly influenced by the genes of the animals and thus breeding for this trait might lead to a selection response. Therefore, the characterization of the genetic background of perinatal sucking reflex and sucking behavior in neonatal calves in the Brown Swiss population was carried out in this work. For this purpose, data were collected on more than 220 dairy cattle farms located in Baden-Württemberg. In addition to an evaluation of the husbandry and feeding management of the farms, the phenotype data of more than 10,000 calves were collected to carry out pedigree-based genetic analyzes using univariate and multivariate sire threshold models. In addition, the collection of tissue samples from over 3,000 calves was carried out for the performance of genomic analyzes. Using high-density marker maps, genome-wide association mapping was performed using both single-marker models and Bayesian multi-marker models. Tissue samples of approximately 900 mothers were also collected and their 50K-genotypes were analyzed. Based on the maternal marker genotypes, maternal genetic effects on an erroneous sucking reflex of the calves were investigated. Low heritabilities for the traits sucking behavior and sucking reflex could be determined. These ranged from 0.06 to 0.23, depending on the trait, the trait coding used and the models used. The heritability estimates for sucking behavior were slightly higher in the univariate model as well as in the multivariate model than for sucking reflex. The GWAS results clearly showed a quantitative-genetic background of both traits. From these findings, it can be deduced for practical breeding strategies that improving the problem by means of genetic tests, as is the case, for example, with monogenic hereditary diseases, would not be expedient. Instead, breeding progress through the use of genomic selection is recommended. A constant trait recording is required for this purpose. The sucking behavior of the calves should be recorded within the first 12 hours postpartum. The results of gene annotation using GO terms and pathway analysis revealed the overrepresentation of genes with functions in the development of the central nervous system, neurogenesis, and signal transduction. In order to effectively estimate maternal genetic effects on calf sucking weakness, both the marker density of 50K was too low and the data set too small. A highly significant farm effect on the investigated traits was found. However, the evaluations carried out with regard to specific influences of the housing and feeding environments on farms did not show any significant differences.

Mithilfe von GWA-Studien konnten zwei neue Kandidatengene, OLFML2B und NOS1AP, identifiziert werden, die in einer Assoziation mit Veränderungen des QT-Intervalls stehen. Sowohl ein SQTS als auch ein LQTS geht mit einer Zunahme an kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität (SCD und SIDS) einher. Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen eine der häufigsten Todesursachen in der heutigen Zeit dar. Über die Pathologie und den zugrundeliegenden Ursachen von SCD und SIDS ist bisher noch wenig bekannt. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die neu entdeckten Kandidatengene OLFML2B und NOS1AP unter dem entwicklungsbiologischen Aspekt des Herzens im Zebrafisch zu untersuchen, um weitere Erkenntnisse über ihre Funktionen zu erhalten. Zunächst soll mittels in situ Hybridisierung die Lokalisation der Genexpression ermittelt werden. Danach sollte ein Morpholino-vermittelter Knock-down der Gene folgen, mit dem Ziel, die entstandene Pathologie hinsichtlich seiner Herzfrequenz und Rhythmus, dem fractional shortening und auf histologischer Ebene zu charakterisieren. Außerdem sollten die im OLFML2B gefundenen Mutationen als mRNA in die befruchtete Eizelle injiziert werden und Auswirkungen der Expression der potentiell pathologischen Variationen auf die Herzentwicklung beschrieben werden.

Der Begriff „Myeloproliferative Neoplasien“ (MPN) umfasst gemäß der WHO-Klassifikation von 2008 heterogene Formen myeloischer Stammzellerkrankungen. Eine wichtige Gruppe bilden die BCR-ABL1-negativen MPN essentielle Thrombozythämie (ET), Polyzythämia vera (PV) und primäre Myelofibrose (PMF). Grundsätzlich zeigen die oben genannten Entitäten einen chronischen, langsam progredienten Verlauf, ihnen ist jedoch gemein, dass sie in eine sekundäre, akute myeloische Leukämie (sAML) transformieren können, was mit einer sehr schlechten Prognose für die betroffenen Patienten einhergeht. Basierte die Einteilung der BCR-ABL1-negativen MPN vormals ausschließlich auf Blut- und Knochenmarkveränderungen sowie den damit verbundenen klinischen Symptomen, so erlauben moderne molekulargenetische Untersuchungen seit einiger Zeit auch bei diesen Entitäten eine an den jeweils vorliegenden genetischen Aberrationen orientierte Einteilung. Inzwischen ist eine Vielzahl den MPN zugrunde liegender genetischer Aberrationen bekannt, deren prominentester Vertreter die Punktmutation V617F im JAK2-Gen darstellt, von der weit über 90% der PV-Patienten bzw. gut die Hälfte der ET/MF-Patienten betroffen sind und die nach Entwicklung eines JAK-Inhibitors ein potentes therapeutisches Target darstellt. Die vorliegende Arbeit soll zum einen einen Beitrag zur weiteren molekularen Charakterisierung der MPN leisten und zum anderen die Benennung von Kandidatengenen und deren pathogenetischer Relevanz ermöglichen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Identifizierung von möglicherweise leukämierelevanten Genveränderungen gelegt. Dazu wurde in einem ersten Schritt ein Kollektiv von 87 Myelofibrose-Patienten mittels SNP-Arrays analysiert: Diese Arrays ermöglichen eine genomweite Detektion von Kopiezahlveränderungen (copy number alterations, CNA) und kopiezahlneutraler Heterozygotieverluste (uniparentale Disomien, UPD). Dabei konnten im untersuchten Kollektiv 83 CNA und 27 UPD in 53/87 (60%) Patienten identifiziert werden. Besonders interessant sind dabei Mikrodeletionen (

Silymarin, ein Flavonolignangemisch aus der Mariendistel (Silybum marianum, Asteraceae), wird überwiegend zur unterstützenden Therapie von chron. Lebererkrankungen sowie zur Prävention tox. Leberschäden genutzt. Zusätzlich werden positive Effekte wie Tumorhemmung und immunmodulatorische Mechanismen beschrieben. Die Pflanze reichert Silymarin hauptsächlich in der Samenschale und Fruchtwand an. Dies dient zum Schutz des Keimlings gegen Pflanzenfresser und um Bakterien-, Pilz- oder Virusinfektionen einzudämmen oder zu verhindern. Der letzte Schritt im Biosyntheseweg von Silymarin ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ausgangssubstrat ist die Aminosäure L-Phenylalanin, die zu 4-Cumaroyl-CoA umgewandelt wird, welches eine essentielle Vorstufe für die Synthese von Flavonoiden und Monolignolen ist. Ein Flavonoid (Taxifolin) und ein Monolignol (Coniferylalkohol) reagieren dann über Radikalbildung, Verknüpfung, Umlagerung und anschließendem Ringschluss zu Silymarin. Dabei entstehen mehrere Positionsisomere (hauptsächlich Silychristin, Silydianin, Silybin und Isosilybin), wobei die beiden zuletzt genannten als Diastereomerenpaare vorliegen. Die Verteilung der Regioisomere unterscheidet sich in Ökotypen/Kultursorten und Genotypen. Für die Radikalbildung ist sehr wahrscheinlich eine Peroxidase verantwortlich. Es ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie die Differenzierung zwischen den Regioisomeren und Diastereomeren in der Pflanze abläuft, deshalb wurde eine mögliche Beteiligung von dirigierenden Proteinen untersucht. Aus Keimlingen dreier S. m. Varianten wurden in-vitro Kulturen angelegt, um zusätzliche Erkenntnisse über Gehalt und Zusammensetzung der Flavonolignane zu erhalten. Weiterhin wurde die Sekretion der Sekundärstoffe in Zellwand und Medium von Suspensionskulturen untersucht. Eine Kulturlinie wurde über einen zweiwöchigen Zeitraum in Bezug auf verschiedene Mediumskenngrößen, Silymarinbildung und entsprechende Enzymaktivitäten charakterisiert. Mit der gleichen Kulturlinie wurde auch eine Elicitierung durchgeführt. Obwohl eine geringe Zunahme an Silymarinkomponenten beobachtet werden konnte, sind die in Suspensionszellen von S. m. produzierten Mengen an Flavonolignanen leider sehr gering. Bemerkenswert dabei war ein Zusammenhang zwischen den einzelnen Positionsisomeren des Silymarins, extrahiert aus den reifen Fruchtschalen, und den entsprechenden in-vitro Kulturen. Die Zusammensetzung der Regioisomere in den Suspensionszellen hat Ähnlichkeit mit dem Chemotyp der Pflanzenherkunft. Dies untermauert die Annahme von genotypischen Variationen und eine mögliche Beteiligung regulatorischer Mechanismen. Erhöhte Taxifolinkonzentrationen in Enzymassays steigerten zwar die Bildung von zwei spezifischen Regioisomeren, weitere direkte Wege der Differenzierung konnten jedoch nicht gefunden werden. Da auch das Medium der Suspensionszellen Enzymaktivität und Flavonolignane aufwies, spielen vermutlich auch Transportsysteme eine Rolle. Durch molekularbiologische Methoden konnten eine sekretorische Peroxidase (Klasse III), eine Laccase der Cupredoxin-Familie und zwei dirigierende Proteine im Genpool von S. m. identifiziert werden. Die Expression dieser Gene in verschiedenen E. coli und Hefestämmen erwies sich leider als sehr schwierig. Diese Problematik wurde verstärkt durch die Anwesenheit von Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, welche wichtig für Aufbau und Funktion der Proteine sind. Für die Gewinnung rekombinanter Proteine wäre eine weitere Optimierung notwendig. Die an der Kopplungsreaktion zwischen Taxifolin und Coniferylalkohol beteiligen Enzyme konnten auch aus in-vitro Zellen und dem Medium gewonnen werden. Das verantwortliche Enzym konnte durch chromatographische Trennverfahren erfolgreich als Peroxidase mit einem Molekulargewicht von etwa 45 kDa bestimmt werden. Im Allgemeinen sollte sie in Struktur und Funktion der Meerrettich-Peroxidase (HRP) ähneln. Allerdings konnte dieses Protein allein nicht die Bildung einzelner Regioisomere des Silymarins gezielt steuern. Obwohl dirigierende Proteine auf genomischer Ebene nachgewiesen wurden, konnte ihre Gegenwart in Enzymextrakten oder ihre tatsächliche Beteiligung an der Bildung unterschiedlicher Silymarinkomponenten nicht belegt werden. Sie könnten organspezifisch oder zu verschiedenen Entwicklungstadien der Pflanze exprimiert werden. Eine Beteiligung nur während der Fruchtentwicklung und Reifungsphase wäre denkbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit Enzyme untersucht wurden, die vermutlich den letzten Schritt der Silymarin-Biosynthese katalysieren. Zahlreiche Faktoren wurden angesprochen, die möglicherweise die Zusammensetzung der Positionsisomere regulieren. Während die Expression der rekombinanten Proteine eine Herausforderung bleibt, wurden weitere Lösungsvorschläge vorgestellt. Eine Fortsetzung dieses Projektes scheint vielversprechend und hinsichtlich einer weiteren Aufklärung dieses Themas sehr interessant., Silymarin, a flavonolignan mixture from milk thistle (Silybum marianum, Asteraceae), is mainly used for the supportive therapy of chronic liver diseases or to prevent toxic liver damage. In addition, beneficial effects for human health like tumor inhibition and immunomodulatory mechanisms have been reported. The plant produces and accumulates silymarin mainly in the testa and pericarp for protection of its sporophytic embryo against plant herbivores and to limit or prevent bacterial, fungal or viral infections. The final step in the biosynthetic pathway of silymarin is not yet fully elucidated. Starting point is the amino acid L-phenylalanine which is converted to 4-coumaroyl-CoA which is the essential precursor for flavonoids and monolignols. A flavonoid (taxifolin) and a monolignol (coniferyl alcohol) then are transformed to silymarin by radical formation (oxidation), coupling, rearrangement and subsequent cyclisation. Several positional isomers (mainly silychristin, silydianin, silybin and isosilybin) occur, the latter two being present as diastereomeric pairs. The distribution of these regioisomers differs in ecotypes/cultivars and genotypes. Whereas a peroxidase (POD) is probably responsible for the radical formation, very little is known about how the plant discriminates between its regioisomers and diastereomers. A potential involvement of dirigent proteins (DIRs), controlling the formation, has been investigated. In vitro cultures have been established from seedlings of three Silybum marianum varieties for further insights into flavonolignan content and composition in suspension cultures and the release of flavonolignans to the outer compartments. Additionally, over a period of two weeks, one culture line was characterised based on various medium parameters, silymarin formation and corresponding enzyme activities. The same culture line was also subjected to an elicitation attempt. However, despite a slight increase in the quantities of the specialised metabolites of the silymarin mixture, the amounts of flavonolignans produced in suspension cells of Silybum marianum are very low. Interestingly, a connection between the individual positional isomer amounts of silymarin extracted from the mature fruit skins and the respective in vitro cells could be determined. The regioisomer composition in suspension cells resembled the chemotype of the plant origin. This underlined the assumption of the existence of high genotypic variations and the possible presence of involved regulatory mechanisms. Higher taxifolin concentrations increased the formation of two specific regioisomers in enzyme assays but no further direct mechanism for discrimination could be found. Since enzyme activity and flavonolignans could also be detected in the medium of suspension cells, transport systems might play a role as well. A class III secretory peroxidase, a laccase of the cupredoxin superfamily and two different dirigent proteins could be identified to be a part of the gene pool of Silybum marianum. Unfortunately, the expression of these genes in different E. coli and yeast strains turned out to be a big hurdle. Signal peptides and several glycosylation sites, crucial for structure and activity, greatly contribute to this. Optimisation at some points would be necessary in order to yield recombinant proteins. On the other hand, the enzyme(s) involved in the coupling reaction between taxifolin and coniferyl alcohol could be extracted from in vitro cells and the respective medium. The radical-forming protein could successfully be identified as a peroxidase with a molecular weight of about 45 kDa using chromatographical methods. In general, structure and function should be similar to the versatile used horseradish peroxidase (HRP). However, this protein alone could not specifically regulate the formation of individual silymarin regioisomers. Even though dirigent proteins could be identified on the genomic level their presence in enzyme preparations or an actual involvement could never be proven. Their expression and utilisation could be plant organ- and/or time-specific, namely active only during the fruit development and maturation phase. In summary, in the scope of this thesis, enzymes probably involved in the final step of the silymarin biosynthesis and numerous factors possibly regulating the positional isomer ratios were discussed and highlighted. While issues concerning the expression of recombinant proteins remained to be challenging, reasonable solutions were presented. A continuation of this project seems promising and very interesting for further clarification of this subject.

Die Erkrankung Autismus stellt eine neuropsychiatrische Entwicklungsstörung dar. Ausprägung und Erscheinungsbild von Autismus variieren oftmals stark. Die Hauptursache, die zu Autismus führt, ist die Genetische Mutation. Bis heute wurde eine Vielzahl von Genen entdeckt, die mit Autismus assoziiert sind. Eines dieser Kandidatengene ist das SHANK- Gen. Die Shankproteine Shank1, Shank2 und Shank3 finden sich in hoher Konzentration an den Postsynapsen exzitatorischer Synapsen. Hier sind sie innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD) sehr stark mit den Kanälen, Rezeptoren und dem Aktin-Zytoskelett vernetzt. Shankproteine sind wichtig für Plastizität und Funktionalität von Synapsen. Neuere Studien unterstreichen die Bedeutung des Cerebellums zur Klärung der Pathogenese von Autismus. In dieser Arbeit wurde die Morphologie cerebellärer PSDs und Spines von Shank2-/- bzw. Shank3-/- Mutanten anhand verschiedener morphologischer Parameter untersucht und mit Wildtypen verglichen. Die Ergebnisse der hier durchgeführten morphologischen Analysen legen nahe, dass der genetische Verlust von Shankproteinen keinen signifikanten Einfluss auf die Morphologie der hier untersuchten cerebellären Spines und PSDs hat. Die morphologische Analyse zur Klärung der Pathogenese des Krankheitsbildes ist jedoch noch nicht abgeschlossen. Morphologische Untersuchungen in anderen Hirnregionen stehen noch aus.

Die Variation in der Lebensspanne wird beim Menschen bis zu 30% durch genetische Faktoren beinflusst, während ca. 70% dieser Variation auf Umweltbedingungen zurückzuführen ist. Bisher zeigen nur Einzelbasenvariationen (SNVs) in den Genen Apolipoprotein E (APOE) und Forkhead-Box-Protein O3A (FOXO3A) eine konsistente Assoziation mit Langlebigkeit beim Menschen in verschiedenen Populationen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, über Kandidatengenstudien und mittels ImmunochipTechnologie neue Suszeptibilitätsfaktoren und funktionell relevante Varianten in der deutschen Population zu identifizieren. Kandidatengenstudien wurden jeweils für die Superoxiddismutasen (SODs), das Cholesterinester-Transferprotein (CETP) und die FOXO3A-Genregion durchgeführt. Die SNV-Auswahl für die SODs und CETP erfolgte über einen umfassenden haplotype tagging Ansatz, während für die FOXO3A-Genregion drei verschiedene Sequenzierungs-Technologien (SOLiD, Illumina und Sanger) genutzt wurden, um potentielle funktionell relevante Varianten zu detektieren. In einem weiteren Ansatz sind mittels Immunochip-Technologie ca. 200.000 SNVs getestet worden. Der Immunochip umfasst genetische Varianten, die potentiell für immunvermittelte und altersbedingte Erkrankungen relevant sind. ... Up to 30% of variation in human lifespan is influenced by genetic factors, whereas 70% is attributed to environmental factors. However, thus far, only single nucleotide variants (SNVs) in the Apolipoprotein E and Forkhead box protein O3 (FOXO3A) genes have been consistently associated with human longevity in many populations. The aim of the current study was, therefore, to identify new susceptibility loci and functional relevant variants for human longevity in a German population by candidate gene studies and immunochip technology. Individual candidate gene studies were performed for the superoxide dismutases (SODs), the cholesterol ester transfer protein (CETP), and the FOXO3A gene regions. Selection of SNVs for SODs and CETP was conducted using a comprehensive haplotype tagging approach while for the FOXO3A gene region, three different sequencing technologies (SOLiD, Illumina, and Sanger) were applied to detect potentially functional relevant variants. In a parallel approach, about 200,000 SNVs were tested using immunochip technology. The immunochip contains genetic variants that are thought to be relevant for immune mediated and age-related diseases....

[no abstract]

vorgelegt von Andreas Homolka Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2013 OeBB

Eine wesentliche Rolle hinsichtlich der Pathophysiologie der ADHS scheint der komplexe Prozess der Signaltransduktion an der neuronalen Synapse innezuhaben. Dieser wird bewerkstelligt durch ein komplexes Zusammenspiel sogenannter SNARE-Proteine, unter anderem dem synaptosomal-assoziiertem Protein SNAP-25. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung potentiell-funktioneller Varianten des Kandidatengens SNAP-25 auf eine Assoziation mit der ADHS in einer deutschen Stichprobe. Bei den untersuchten Single-Nukleotid-Polymorphsimen handelt es sich dabei um SNP rs6077690 im Promotorbereich und SNP rs363006 in Intron 8 des Kandidatengens SNAP-25, deren Assoziation mit der ADHS in der Fachliteratur beschrieben ist. Desweiteren wurde ein bis lang nicht untersuchter SNP,rs6039769 in diese Studie miteinbezogen., This family based study was applied to detect preferential transmission of genetic variants of the candidate gene SNAP-25 in ADHD. As neurotransmission has been suggested to be a crucial factor in the pathophysiology of ADHD, genes encoding for synaptic proteins are supposed to be involved. One of the core proteins of this so called "SNARE-complex" is the synaptosomal-associated protein SNAP-25. According to meta-analyses it is one of the most validated candidate genes in ADHD. This study investigated the association of genetic variants of SNAP25, located in the putative promoter region SNP ( rs6077690 )of SNAP25 and a SNP ( rs363006 ) in intron 8, previously reported to be associated with ADHD. Furthermore another SNP( rs6039769 ), also located in the core promotor region, was checked for association with ADHD.

vorgelegt von Tania García-Libreros Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2012 OeBB

The branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) is a rare autosomal dominant disorder with variable symptoms like: cervical skin lesions, branchial sinus defects, cleft lip/palate, hearing loss, renal anomalies, nasolacrimal duct obstruction, microphthalmia malformed pinnae and auricular pits. I analyzed marker allels on DNA of a family (three affected, three unaffected individuals) with BOFS. I detected a region on chromosome 6 which was highly suspicious containing the candidate gene. Afterwards I detected three new mutations in additional patients with BOFS, which are restricted to exons 4 - 6 of the TFAP2A gene (transcription factor AP-2A), using DNA sequencing.

Als potentielle genetische Risikofaktoren der koronaren Herzerkrankung wurden in dieser Arbeit auf Basis einer populationsbasierten Fall-Kontroll-Assoziationsstudie 73 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) aus zwölf Kandidatengenen des IL-6 Signaltransduktionsweges in einer explorativen Studie mit 1096 Fällen und 636 Kontrollen untersucht. Dabei wurden Assoziationen von drei SNPs innerhalb des Gens MAPK1 (Mitogen activated protein kinase 1) identifiziert, mit SNP rs6928 als am stärksten assoziiert (p=0,0026 OR=1,41 95% CI 1,13-1,77). Dieses SNP wurde in einer Replikationsstudie mit unabhängigen Kohorten überprüft. Die Genotypisierung erfolgte mittels der SNPlex und TaqMan Technologie. Beide Ansätze wurden soweit möglich auf die KHK relevanten klassischen Risikofaktoren mittels logistischer Regression adjustiert und auf multiples Testen korrigiert. In der Replikationsstudie konnte die Assoziation der explorativen Studie nicht bestätigt werden.

Pancreatic cancer is a highly aggressive malignancy with poor prognosis because of the late disease stage at diagnosis. A comprehensive analysis of DNA amplifications was undertaken to identify genes involved in pathogenesis of pancreatic carcinoma which can potentially serve as diagnostic markers and drug targets for this dismal disease. Initially, 26 fresh frozen primary pancreatic carcinomas were profiled by matrix-CGH with a spatial resolution of 2 Mb across the whole genome. Thus, 50 commonly amplified regions (CARs) were identified; they were covered by 1,113 contiguous genomic DNA clones on the newly-developed 1.1k contig chip. High-resolution profiles of 42 fresh frozen primary pancreatic tumors narrowed the 50 CARs down to 55 recurrent amplifications containing 60 minimal CARs (MCARs) and allowed the identification of target genes that might confer a selective advantage on the tumor. Furthermore, transcription profiles of six pancreatic ductal adenocarcinomas were created with the Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 platform. The superimposition of genomic and transcription profiles revealed that 280 and 48 of 1474 overexpressed genes were enriched in recurrent amplifications and MCARs, respectively, thus emphasizing the contribution of genomic instability to disease formation. Quantitative RT-PCR verification and functional in vitro characterization led to a set of novel candidate oncogenes comprising CD14, COL1A1, COL5A1, COL6A3, CORO1A, CTSK, DOK5, ECM1, EMILIN1, FPR1, HCK, MMP9, NUSAP1, PLAUR, S100A9, SPON2, SULF2, TSPAN2, TUBA1B and TUBA1C. The results demonstrate a strong influence of tumor cells on the composition of the extracellular matrix and an enhanced reaction to those changes by overexpression of certain surface molecules and downstream associated proteins. Furthermore, also structural and regulatory components of the actin and tubulin cytoskeleton contribute significantly to the increase of migration, invasion and proliferation of tumor cells.

vorgelegt von Renáta Milčevičová Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2009 OeBB

In der vorliegenden Promotion "Zur Genetik des Morbus Crohn - Erweiterter Assoziationsscreen mittels 245 Mikrosatelliten und Analyse des PTPN22-Gens" wurde mittels genetischer Verfahren nach prädisponierenden genetischen Faktoren für die multifaktorielle chronisch entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn gesucht. Dabei wurde eine Genotypisierung der PTPN22 R620W-Variation mit der RFLP-Methode durchgeführt, die keine Assoziation ergab. Im Hauptteil der Arbeit erfolgte die Untersuchung von 245 Apoptose- und Immun-relevanter Gene mittels eines erweiterten Assoziationsscreenings (EAS) mit Mikrosatelliten, wobei nach der individuellen Genotypisierung der signifikanten Marker die Signifikanzen für die Gene TNFRSF17, FLIP und CARD15 (Positivkontrolle) bestehen blieben. Die folgende SNP-Analysen mittels RFLP lieferten keine weiteren Hinweise auf eine Assoziation der Gene TNFRSF17 und FLIP. Zusätzliche Markerstudien in den betreffenden Regionen müssen folgen.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung der genetischen Variabilität im \(\it PRKCA\)- und im \(\it TNFSF13B\)-Gen für die Entstehung der Multiplen Sklerose. Das \(\it PRKCA\)-Gen ist beteiligt an Proliferation und T-Zellregulation und war teilweise als mit MS assoziiert beschrieben worden. Das \(\it TNFSF13B\)-Gen wirkt bei der Stimulation, Differenzierung und Proliferation von B-Zellen mit. Im \(\it PRKCA\)-Gen wurden drei Mikrosatelliten untersucht. Wegen initialer Frequenzunterschiede zwischen MS-Untergruppen und Kontrollen für einen Mikrosatelliten wurden zwei SNPs in der Nähe dieses Markers genotypisiert. Im Anschluss wurde in der Untergruppe der Patienten mit chronischer MS ein Exon auf Sequenzvariationen gescreent und bei drei dieser Patienten eine Sequenzanalyse durchgeführt. Im \(\it TNFSF13B\)-Gen wurden zwei SNPs genotypisiert. In dieser Studie wurden sowohl für das \(\it PRKCA\)- als auch für das \(\it TNFSF13B\)-Gen keine Hinweise auf statistisch gesicherte Assoziationen der untersuchten Variationen mit MS gefunden.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung der genetischen Variabilität im PRKCA- und im TNFSF13B-Gen für die Entstehung der Multiplen Sklerose. Das PRKCA-Gen ist beteiligt an Proliferation und T-Zellregulation und war teilweise als mit MS assoziiert beschrieben worden. Das TNFSF13B-Gen wirkt bei der Stimulation, Differenzierung und Proliferation von B-Zellen mit. Im PRKCA-Gen wurden drei Mikrosatelliten untersucht. Wegen initialer Frequenzunterschiede zwischen MS-Untergruppen und Kontrollen für einen Mikrosatelliten wurden zwei SNPs in der Nähe dieses Markers genotypisiert. Im Anschluss wurde in der Untergruppe der Patienten mit chronischer MS ein Exon auf Sequenzvariationen gescreent und bei drei dieser Patienten eine Sequenzanalyse durchgeführt. Im TNFSF13B-Gen wurden zwei SNPs genotypisiert. In dieser Studie wurden sowohl für das PRKCA- als auch für das TNFSF13B-Gen keine Hinweise auf statistisch gesicherte Assoziationen der untersuchten Variationen mit MS gefunden.

In den vergangenen Jahren wurde vermehrt das Gen, welches für Catechol-O-Methyltransferase codiert, als starker Kandidat für ein erhöhtes Schizophrenierisiko diskutiert. Grund dafür ist die zentrale Rolle der Catechol-O-Methyltransferase beim Katecholaminabbau im menschlichen präfrontalen Cortex. Aufgrund der zunehmend akzeptierten Tatsache, daß die singuläre Betrachtung einzelner Marker bei der komplexen genetischen Textur von Kandidatengenen nur wenig zur Erhellung komplexer Erkrankungen beizutragen vermag (Licinio, 2003), untersuchten wir neben dem Val108/158Met-Polymorphismus (rs4680) vier weitere, die COMT-Gen-Region umspannende SNPs (rs2097603, rs740603, rs4818, rs165599) an einer Stichprobe von 459 Schizophrenen und 150 Kontrollpersonen. Zwar ergab sich für den Marker rs740603 auf Intron 1 eine signifikante Allel- (p = 0.0060) und Genotypassoziation (p = 0.019), der funktionelle Val108/158Met-Polymorphismus (rs4680) zeigte aber keinen signifikanten Zusammenhang mit der Erkrankung. Zudem fand sich in unserer Haplotypanalyse keine Markerkombination, die in überdurchschnittlichem Zusammenhang mit schizophrenen Psychosen stand. Für die Untergruppe der zykloiden Psychosen ließ sich bei einem p-Wert von 0.031 eine 4-Marker-Kombination ermitteln, die die SNPs rs740603, rs4818, rs4680 und rs165599 einschliesst und die Region von Intron 1 bis 3´-UTR umspannt. Zusätzlich ergab sich in der Subgruppe der zykloiden Psychosen ein geschlechtsspezifischer Effekt im Sinne eines signifikanten 3-Marker-Haplotypen (rs4818-rs4680-rs165599) (p = .0044) in der Gruppe der Frauen (n = 27) mit rs165599 als stärkstem Einzelmarker. Aufgrund des komplexen genetischen Zusammenhangs zwischen den untersuchten Markern und der Erkrankung sollte auch in der zukünftigen Forschung eine differenzierte Betrachtung der verschiedenen schizophrenen Zustandsbilder angestrebt werden, wie dies die Klassifikation nach Leonhard ermöglicht. Neben gewebsspezifischen Transkriptionsfaktoren könnten auch epigenetische Faktoren, wie die Cytosinmethylierung von CpG-Stellen in promotorregulierenden Regionen, einen Erklärungsansatz für die Entstehung schizophrener Störungsbilder darstellen., Since several years, the gene encoding catechol-O-methyltransferase (COMT) at chromosome 22q11 is discussed as a strong candidate for schizophrenia susceptibility due to its key function in degredation of catecholamines in the prefrontal cortex, a critical region of the human brain, involved in cognitive control processes, monitoring of information in working memory and in active judgments on information (Petrides, 2005). To test the association of the COMT gene locus with schizophrenia, we analysed five SNPs (rs2097603, rs740603, rs4818, rs4680, rs165599) spanning from the P2 promotor region (MB-COMT) to the 3´-UTR in 459 index cases, which fulfilled diagnistic criteria of schizophrenia according to DSM IV as well as 150 blood donors as population controls. According to differentiated psychopathology (Leonhard, 1999) probands were categorized into cycloid psychosis, unsystematic schizophrenia and systematic schizophrenia prior to genotyping. In intron 1 the marker rs740603 showed significant allele (p = 0.0060) and genotype (p = 0.019) association, but the functional Val105/158Met variant (rs4680) failed significant association with disease. Considering COMT haplotypes none of the marker combinations showed evidence for an association with schizophrenia. In the subgroup of cycloid psychosis we found 4-locus marker combinations rs740603-rs4818-rs4680-rs165599 associated with disease at p-level 0.031, spanning a region from intron 1 to the 3´-UTR. In conclusion, the genetic interaction of COMT SNPs and haplotypes and schizophrenia susceptibility appears complex across different populations and psychopathological phenotypes. Particularly structures potentially involved in mRNA expression levels need further scrutiny.

Mutation search in the Ghrelin gene of extremely over-weighted children and adolescents and standard weight controls., Die Regulation des Körpergewichts beruht auf einer Interaktion von genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen (Hebebrand und Remschmidt, 1995a). Zwillings- und Familienstudien (Moll et al., 1991; Bouchard et al., 1990; Zonta et al., 1987; Stunkard et al., 1986) deuten auf eine starke genetische Prädisposition des menschlichen Körpergewichts hin. Das Gleichgewicht zwischen Energieaufnahme und –verbrauch ist beim Menschen über längere Zeitabschnitte bemerkenswert präzise. Eine längerfristige Störung dieser Energiehomöostase führt entweder zu Unter- oder Übergewicht. In den westlichen Industrieländern und zunehmend auch in den Entwicklungsländern steigt Adipositas in Zahl und Schweregrad bei Erwachsenen und Kindern. Jeder zweite Deutsche ist übergewichtig, 16 % der deutschen schulpflichtigen Kinder und Jugendlichen sind übergewichtig (Kurth et al., 2007). Nach Angaben der Deutschen Adipositas Gesellschaft entfallen etwa 5 % der Kosten des Gesundheitssystems auf Interventionen gegen Adipositas und deren Folgeerkrankungen. Diese Arbeit untersucht die Pathogenese der Adipositas auf genetischer Ebene. Tiermodelle belegen, dass Adipositas durch monogene Erbgänge hervorgerufen werden kann. Für einzelne Mausmodelle wurden bereits menschliche Homologe identifiziert und auf Mutationen untersucht. Bis Oktober 2005 wurde von 50 nach klassischem Mendelschen Erbgang bedingten Adipositasformen berichtet (Rankinen et al., 2006). Des Weiteren wird nach so genannten Kandidatengenen geforscht. Das sind Gene, die aufgrund ihrer Funktion und/oder ihres Expressionsmusters in einen möglichen Zusammenhang mit der Pathogenese von Adipositas gestellt werden. Immer mehr Studien berichteten (bis Oktober 2005) von bisher 127 solcher Kandidatengene, von denen ungefähr 52 mit zwei oder mehr positiven Ergebnissen bestätigt wurden. Auf der zum zwölften Mal überarbeiteten Adipositas-Gen-Karte wurden auf jedem Chromosom, bis auf dem Y-Chromosom, mögliche Adipositas-Gene eingezeichnet (Rankinen et al., 2006). Adipositas beruht jedoch überwiegend nicht auf monogener sondern vielmehr auf polygenetischer Basis. Um zugrunde liegenden Gene zu finden, verfolgt man u. a. den Ansatz der Quantitative Trait Loci (QTL). Derzeit sind 408 QTLs in Tiermodellen und 253 homologe QTL-Regionen bekannt (Rankinen et al., 2006). Der hohe Grad der Komplexität in der Regulation des menschlichen Körpergewichts resultiert aus der Vielzahl der involvierten hormonellen Regelkreisläufe und der sie beeinflussenden Faktoren ( Bell et al., 2005; Schartz et al. 2000). Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein Kandidatengen auf dessen Beteiligung an der menschlichen Gewichtsregulation und Adipositasentwicklung zu analysieren. Hierfür wurde das Ghrelin-Gen in Studiengruppen aus Patienten mit Adipositas, normalgewichtigen und untergewichtigen Kontrollen untersucht. Ghrelin wurde im Dezember 1999 von Kojima et al. als ein endogener Ligand für den Wachstumshormonsekretionsrezeptor („growth hormon secretagogues receptor“, GHSR) identifiziert. Studien an Tiermodellen belegen, dass Ghrelin neben der stimulierenden Wirkung auf die Wachstumshormon-Sekretion auch an der Regulierung der Energiehomöostase beteiligt ist. Letzteres wird über Nahrungsaufnahme und Fettstoffwechsel gesteuert (Wren et al., 2000; Nakazato et al., 2001; Cowley et al., 2003; Wortley et al., 2005; Zigman et al., 2005; Bhatti et al., 2006). Zuerst wurden mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die kodierenden Regionen des Ghrelin-Gens amplifiziert. Die Mutationssuche im Pre-Pro-Ghrelin, welches aus vier Exons besteht, erfolgte mittels Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCP). Das erste und zweite Exon kodieren zusammen für das biologisch aktive Protein (Wajnrajch et al., 2000). Die Mutationssuche in dem 694 bp umfassenden Sequenzabschnitt führte über Sequenzierung zur Identifikation folgenden Varianten: Im ersten Exon fand sich eine Zwei-Basenpaar-Deletion mit resultierendem Frameshift ab der 34. Aminosäure und Einbau von 36 aberranten Aminosäuren. Bei der Mutationssuche des zweiten Exons bestätigten sich die zwei bereits bekannte Polymorphismen (152 G>A, Arg-51-Gln und 214 C>A, Leu-72-Met; Wajnrajch et al., 2000; Korbonits et al., 2002; Ukkola et al., 2001). Des Weiteren wurde eine Ein-Basenpaar-Deletion im davor liegenden Intron gefunden. Im dritten Exon konnte ein bis dahin unbekannter Polymorphismus (269 A>T, Gln-90-Leu) entdeckt werden, der, wie die beiden anderen SNPs, zu einem Aminosäuren (AS)-Austausch führt. Die Untersuchung des vierten -und mit 18 Basenpaaren- kleinsten Exons erbrachte keine Auffälligkeiten gegenüber dem Wildtyp. Die detektierten Polymorphismen wurden über Restriktionslängen-Polymorphismus-PCR (RFLP-PCR) und allelspezifische Amplifikation (ARMS) verifiziert. Die beiden gefundenen Deletionen traten jeweils nur bei einem Probanden auf und sind daher seltene genetische Varianten. Die Deletion mit Frameshift im ersten Exon fand sich bei einem normalgewichtigen Probanden, der laut anschließender Analyse der Gewichtsentwicklung und des Essverhaltens keine pathologischen Besonderheiten aufwies. Es ist von einer Haplo-Insuffizienz auszugehen, die mit einem Normalgewicht einhergehen kann. Die andere Deletion, die bei einem adipösen Probanden gefunden wurde, lag im Intron. Eine Beteiligung an der Pathophysiologie von Adipositas ist für eine im Intron liegende und somit ohne Auswirkung auf die Aminosäurensequenz des Genproduktes eher unwahrscheinlich. Es könnte jedoch ein Kopplungsungleichgewicht mit einem anderen Allel vorliegen. Letztlich wurde diese Sequenzvariante nur bei einem Probanden nachgewiesen. Die identifizierten und sequenzierten Polymorphismen wurden für Assoziationsstudien zum Phänotyp Adipositas eingesetzt. Im Gegensatz zu den bereits veröffentlichten Ergebnissen von Korbonits et al. (2002), Ukkola et al. (2001) und einer später veröffentlichten Studie von Steinle et al. (2005) lag bei unsrer Studie keine Assoziation zur Adipositas vor. Die beschriebenen Polymorphismen traten bei adipösen wie bei normalgewichtigen Probanden ohne signifikanten Unterschied auf. Die Assoziationsstudie zum neu identifizierten Polymorphismus (269 A>T; Gln-90-Leu) im dritten Exon führte zuerst zu einem nominellen p-Wert < 0,05. Diese Assoziation konnte in einer mit untergewichtigen Studenten und normalgewichtigen Erwachsenen unabhängigen Stichprobe jedoch nicht bestätigt werden.

Apoptose ist ein gemeinsamer Pathomechanismus vieler Autoimmunerkrankungen, so auch im Rahmen der Schilddrüsenautoimmunerkrankungen, deren häufigste Hashimoto Thyreoiditis und Morbus Basedow (Graves’ disease) darstellen. Während eine gesteigerte Apoptoserate der Schilddrüsenzellen bei Hashimoto Thyreoiditis zur Entwicklung einer Hypothyreose führt, sind es bei Morbus Basedow die infiltrierenden Lymphozyten, die durch Apoptose zu Grunde gehen, während die Schilddrüsenzellen unter dem protektiven Einfluß anti-apoptotischer Signale proliferieren können. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus wird in der Reifung und Aktivierung des Immunsystems angenommen. Einige potentielle Ursachen sind eine insuffiziente systemische Elimination autoreaktiver Lymphozyten im Rahmen der positiven und negativen Selektion im Thymus, ein Versagen der peripheren immunological ignorance, oder eine inadäquate Aktivierung von Lymphozyten in einem pro-inflammatorischen Milieu. All diese Mechanismen können durch eine inadäquate Apoptose ausgelöst oder verstärkt werden. Die Fas/FasL-induzierte Kaskade ist einer der Haupt-Signalwege in der Apoptose-Induktion. Seine Bedeutung im Rahmen von Autoimmunerkrankungen ist vielfach untersucht, und eine Assoziation genetischer Polymorphismen in Fas und seinem Liganden wurde bereits für einige organspezifische und generalisierte Erkrankungen gezeigt (Typ I Diabetes, Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis u.a.). Das genetisch vermittelte Risiko dieser Erkrankungen wird bisher vor allem der HLA DQ-Region und Polymorphismen im CTLA-4-Gen zugeschrieben. Aufgrund der funktionellen Relevanz der Fas/FasL-vermittelten Apoptose im Rahmen autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Kandidatengene untersucht, die von funktioneller Relevanz für die Entstehung autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen sind: die Apoptose-regulierenden Faktoren Fas, FasL und Bcl-2. 209 Familien kaukasischen Ursprungs mit insgesamt 730 Individuen, bei denen mindestens eines der Kinder an Hashimoto Thyreoiditis (n = 100) oder an Morbus Basedow (n = 109) erkrankt war, wurden genotypisiert auf zwei Polymorphismen des Fas-Gens (g-670 G-A in der Promotorregion, g-154 C-T in Exon 7), drei FasL Genpolymorphismen (C -843 T und EBP im Promotor, A IVS2nt-124 G in Intron 2) und einen Polymorphismus im Bcl-2-Gen. Nach Durchführung einer indirekten Haplotypisierung, Chi2- und Extended Transmission Disequilibrium-Test waren weder einzelne Fas- bzw. FasL-Polymorphismen noch kombinierte Haplotypen mit Hashimoto Thyreoiditis oder Morbus Basedow assoziiert. Bei der Analyse des Bcl-2 Polymorphismus ergab sich eine Tendenz zu einer Assoziation des G-Allels mit beiden Thyreopathien. Subgruppen-Analysen (männliche vs. weibliche Patienten, CTLA-4-Genotypen, DQ-Haplotypen) ergaben keinen weiteren Informationsgehalt, die Daten italienischer und deutscher Familien unterschieden sich ebenfalls nicht. Zusammenfassend ergeben die Daten keinen signifikanten Beitrag der untersuchten Varianten in Bcl-2, Fas oder FasL zum genetischen Risiko autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen. Zur Entwicklung möglicher diagnostischer und therapeutischer Optionen für autoimmune Schilddrüsenerkrankungen wird die Untersuchung weiterer funktionell bedeutsamer Regulatoren der apoptotischen Signaltransduktionswege von Bedeutung sein. Apoptosis is a joint pathogenic process underlying autoimmune thyroid disease. Hashimoto’s thyroiditis and Graves’ disease represent the two most common autoimmune thyroid disorders. Increased programmed cell death in thyrocytes causes hypothyroidism in Hashimoto’s thyroiditis, whereas in Graves’ disease infiltrating lymphocytes undergo apoptosis while thyrocytes appear to proliferate under protection of anti-apoptotic signals. Some of the potential mechanisms of disease are insufficient systemic elimination of autoreactive lymphocytes during positive and negative selection in the thymus, breakdown of immunological ignorance, or inadequate local activation and proliferation in a pro-inflammatory environment. All of these can be provoked or amplified through lack or overdrive of apoptosis. The Fas/Fas ligand cascade represents a major pathway initiating apoptosis. Its role in autoimmunity is well studied and genetic polymorphisms in gene loci of Fas and its ligand have been shown to be associated with autoimmune diseases such as Type I Diabetes, Multiple Sclerosis, Rheumatoid Arthritis and others. Given the functional relevance of the Fas/FasL pathway in autoimmune thyroid disease, this work investigated the possible contribution of polymorphisms in functionally relevant genes (Fas, FasL, Bcl-2) to the genetic risk of thyroid autoimmunity, which so far is mainly, but incompletely, attributed to the HLA DQ region and polymorphisms in the CTLA-4 gene. 209 Caucasian families comprising 730 individuals with at least one offspring affected by Hashimoto’s thyroiditis (n = 100) and Graves’ disease (n = 109) were genotyped for two Fas gene polymorphisms (g-670 G / A in the promoter region, g-154 C / T in exon 7), three FasL gene polymorphisms (C -843 T and EBP in the promoter, A IVS2nt-124 G in intron 2) and one polymorphism in the Bcl-2 gene. Indirect haplotyping, Chi2 and extended transmission disequilibrium testing were performed. Neither FasL polymorphism alone nor the promoter/exon 7 haplotypes were associated with Hashimoto’s thyroiditis or Graves’ disease. Neither polymorphism alone nor the promoter/ intron02 haplotypes encoded in the Fas gene were associated with Hashimoto’s thyroiditis or Graves’ disease. The Bcl-2 polymorphism showed a tendency toward an association of the G-allele with both thyreopathies. Subgroup analyses (male vs. female patients, CTLA-4-genotypes, DQ-haplotypes) did not reveal any further information. Italian and German families did not differ for the studied polymorphisms. In summary, the data do not suggest any significant contribution of common genetic Bcl-2, Fas or FasL variants to the genetic risk of developing Hashimoto’s thyroiditis or Graves’ disease. Nevertheless, the functional relevance of this and other regulators of apoptotic pathways in emergence and maintenance of the inflammatory process and tissue destruction in thyroid autoimmune disorders warrants further studies to develop future therapeutic options.

Im Mittelpunkt steht der genetische Hintergrund von Morbus Parkinson (MP), insbesondere der häufigen Late-Onset Form der Erkrankung. Eine Mutationsanalyse der Gene Parkin und PINK1 wurde in zwei großen europäischen MP Patientenkohorten durchgeführt. In einer deutschen MP Kohorte erfolgte eine Analyse des zuletzt beschriebenen Kandidatengens LRRK2. Im Parkin Gen wurden 3 verschiedene Mutationen (T240M, R402C und R256C) bei insgesamt 4 Late-Onset Patienten identifiziert. Die Analyse des LRRK2 Gens zeigte insgesamt 3 Patienten (2,5%) mit putativ pathogenen Mutationen (G2019S, A1151T), einschließlich der erstmals beschriebenen Mutation A1151T. Bei der Analyse des PINK1 Gens wurden keine pathogene Mutationen gefunden. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein - wenn auch kleiner - Anteil von Patienten mit MP Mutationen in den bisher bekannten Kandidatengenen Parkin und LRRK2 vorweist. Das PINK1 Gen scheint keine Rolle bei der Pathogenese der Late-Onset Form zu spielen.

In der vorliegenden Promotion "Zur Genetik des Morbus Crohn - Erweiterter Assoziationsscreen mittels 245 Mikrosatelliten und Analyse des PTPN22-Gens" wurde mittels genetischer Verfahren nach prädisponierenden genetischen Faktoren für die multifaktorielle chronisch entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn gesucht. Dabei wurde eine Genotypisierung der PTPN22 R620W-Variation mit der RFLP-Methode durchgeführt, die keine Assoziation ergab. Im Hauptteil der Arbeit erfolgte die Untersuchung von 245 Apoptose- und Immun-relevanter Gene mittels eines erweiterten Assoziationsscreenings (EAS) mit Mikrosatelliten, wobei nach der individuellen Genotypisierung der signifikanten Marker die Signifikanzen für die Gene TNFRSF17, FLIP und CARD15 (Positivkontrolle) bestehen blieben. Die folgende SNP-Analysen mittels RFLP lieferten keine weiteren Hinweise auf eine Assoziation der Gene TNFRSF17 und FLIP. Zusätzliche Markerstudien in den betreffenden Regionen müssen folgen.

Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) zählen mit ihren beiden Subphänotypen Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU) zu den komplexen Erkrankungen, denen eine polygenetische und umweltbedingte Ätiologie zu Grunde liegt. Das bisher stärkste Risikogen für die CED konnte in Form von NOD2 auf der Basis einer Kopplungsregion (IBD1) auf dem Chromosom 16 identifiziert werden. Eine Stratifizierung gegen die NOD2-Riskovarianten in unabhängigen Kopplungsanalysen erbrachte den Hinweis auf ein weiteres, NOD2-unabhängiges Krankheitsgen auf dem Chromosom 16q; dieses galt es in einer Kandidatengenstudie zu identifizieren. In einem umfassenden Feinkartierungsexperiment wurden 436 SNP-Marker einer 35Mb großen Region in insgesamt 6.688 Individuen genotypisiert. Das Studiendesign war als familien- und populationsbasierte Assoziationsstudie angelegt und die Auswertung über die TDT- und Fall-Kontroll-Statistik konnte die Gene BRD7, GPR56, ZFP90, ZNF19 und ZNF23 als Kandidatengene ausweisen. Ein 5-Marker-Haplotyp des ZFP90-Gens zeigte eine deutliche CED-Assoziation (p=0,00035) basierend auf einer gerichteten Vererbung in den Patienten. Desweiteren konnte eine statistische Erhöhung des Krankheitsrisikos für den Phänotyp MC um den Faktor 1,4 (OR=0,74, 95%-KI 0,61-0,91) für einzelne Varianten der Gene ZNF19 und ZNF23 identifiziert werden. Zwei Mutationen der 5’-UTR-Region des GPR56-Locus zählten durch eine starke allelische Assoziation in der Fall-Kontroll-Statistik (p=0,0009 und p=0,0008) ebenfalls zu den ermittelten Risikovarianten für diesen Krankheitsphänotyp. Das Gen BRD7 erhielt den bedeutesten Kandidatengenstatus in dieser Studie, da eine Replikation der assoziierten Genvarianten in einer unabhängigen Studienpopulation erbracht werden konnte. Fünf Einzelbasenpolymorphismen (SNPs) des BRD7-Locus zeigten sowohl in der familien- als auch populationsbasierten Teststatistik eine starke Assoziation mit dem Phänotyp CED (p=0,006-0,003) und eine moderate Bedeutung für die Subphänotypen MC und CU (p=0,03-0,003). Die physikalische Nähe (328Kb) des BRD7-Locus zu dem MC-Krankheitsgen NOD2 wurde als potentieller Einflussfaktor auf die BRD7-Assoziation betrachtet und mittels einer LD-Block-basierten Genotypenpaarung der Patienten und Kontrollindividuen als nicht relevant für den Phänotyp CED und CU beurteilt. Die D’-basierte LD-Analyse der BRD7-NOD2-Region unterstrich diese Annahme durch eine schwache Kopplung der beiden Genloci (D’

Ziel war, das Proteinkinase Cβ (PKCβ) Gen mit Hilfe des Mikrosatelliten PRKCB1-S42 bezüglich Entstehung und Komplikationen des Typ 2-Diabetes (T2D) zu untersuchen. Die Assoziationsstudie zeigte eine Häufung von Allel 9 bei T2D (n=464) gegenüber Kontrollpersonen (n=449). Für Alter, Geschlecht und BMI fand sich ein Zusammenhang mit T2D, nicht aber für die Allele. Die Geschwisterpaaranalyse (n=46) ergab keine unterschiedlichen Allel- Übereinstimmungen zu statistisch erwarteten Werten. Paare mit Übereinstimmungen bei Allel 7 hatten seltener keine Neuropathie als Paare ohne. Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Pathogenese des T2D mit einem Defekt des PKCß-Gens zusammenhängt, was die Existenz eines Suszeptibilitätslokus für den T2D auf Chromosom 16p12 vermuten lässt.

The formation of cholesterol gallstones is a polygenic disease. This implies, that the interaction of multiple genetic factors with the environment determines the quantitative expression of the phenotype. Gallstone genes co-localize with Quantitative Trait Loci (QTLs), chromosomal regions associated with cholesterol cholelithiasis. In this thesis a candidate gene for the cholesterol gallstone locus Lith 1, the gene encoding the canalicular bile salt export pump of the liver Abcb11, was characterized in detail and overexpressed in vivo by generating a BAC (bacterial artificial chromosome) transgenic mouse. In a molecular biological analysis, sequence information in unknown regions of the Abcb11 gene was generated and the genomic structure of the gene was determined by using DNA fragments cloned in plasmids or BACs as well as by adapter ligated PCR (genome walking). The sequences of the gallstone sensitive mouse strain C57L/J and the resistant strain AKR/J were compared by single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and by direct sequencing of PCR fragments. The cDNA of both strains is identical. In the 5' region of the gene a C/T polymorphism was detected at -3.757, and in intron 1 19 single nucleotide exchanges as well as a 5 bp insertion and a 3 bp deletion were identified. The functional relevance of these polymorphisms was investigated in dual luciferase assays by cotransfection with nuclear receptors and in electrophoretic mobility shift assays (EMSAs). The experimental procedures were complemented by in silico sequence analyses. Even though a regulatory potential was shown for the analyzed regions, their function for the differential transcriptional regulation between the inbred mouse strain could not be proven. In order to investigate the physiological effect of an increased Abcb11 expression on cholesterol homeostasis, a genomic BAC library was screened for Abcb11 positive clones by using a radioactively labelled probe. Subsequently, the BAC DNA was isolated and purified. After microinjection into pronuclei of selected gallstone resistant mouse strains, two Abcb11 BAC transgenic founder lines on the 129S1/SvImJ background were generated. Employing Southern and Northern hybridizations it could be demonstrated, that both lines have 1 - 2 extra gene copies apart from their endogenous Abcb11 copies, which are integrated into their genomes and expressed correctly. The transgenic mice show a normal development and no visible phenotype. By feeding a cholesterol rich lithogenic diet, cholesterol crystallization and gallstone formation were induced. Transgenic mice display a higher gallstone susceptibility in comparison to wildtype controls. The generation of the BAC transgenic mouse opens new perspectives for in vivo investigations. It will deliver an important contribution to the question of the identity of the cholesterol gallstone locus Lith 1 and the canalicular bile salt export pump Abcb11 as well as to the investigation of the complex protein interactions in biliary cholesterol homeostasis.