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The quorum sensing phenomenon is a process of intra- and inter-species microbial communication involving the production and detection of extracellular signaling molecules. The autoinducer AI-2 has been proposed to serve as a ‘universal signal’ for interspecies communication. This study aimed to evaluate the capability of Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, and Bacillus cereus strains isolated from ricotta processing to produce quorum sensing signalling molecules (AI-2). The strains were evaluated for the presence of the luxS gene using the polymerase chain reaction. AI-2 quorum sensing signalling molecules were measured in relative light units (RLUs) using a luminometer. A total of 74% of E. faecium, 91% of E. faecalis, and 95% of B. cereus isolates were positive for luxS gene. In addition, the induced bioluminescence in Vibrio harveyi BB170 was observed in all strains, indicating the presence of the AI-2 autoinducer. RESUMO: O fenômeno quorum sensing corresponde a um processo de comunicação intra e interespécies microbianas e é mediado por sinais químicos extracelulares, denominados moléculas sinalizadoras ou auto indutoras (AI). A molécula AI2 está envolvida na comunicação interespécies, denominada sistema “universal” de comunicação. Este estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis e Bacillus cereus isolados do processamento de ricota em produzir moléculas sinalizadoras de Quorum sensing (AI-2). Os isolados foram avaliados quanto à presença do gene luxS utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). As moléculas sinalizadoras (AI-2) foram medidas em unidades relativas de luz (RLU) através de um luminômetro. Um total de 74% dos isolados de E. faecium, 91% de E. faecalis e 95% de B. cereus foram positivos para o gene luxS. Além disso, todos os isolados apresentaram capacidade de induzir o fenômeno de bioluminescência em Vibrio harveyi BB170, indicando a presença de auto indutores AI-2.

Orientador: Marcelo Cristianini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A indústria de carnes é constantemente desafiada a buscar novas tecnologias que atendam a demanda dos consumidores por produtos seguros e de qualidade. Controlar micro-organismos é um desafio para a indústria e pode ser enfrentado com o uso do processamento à alta pressão (HPP- High Pressure Processing). Todavia, o efeito baroprotetor causado pela atividade de água (aw) têm sido estudado em diferentes produtos, micro-organismos e parâmetros de processo, porém, informações são limitadas e em algumas vezes contraditórias. Assim, o objetivo dessa pesquisa foi avaliar o efeito da aw em uma emulsão cárnea modelo na inativação microbiana sob alta pressão através de uma metodologia de superfície de resposta. O trabalho foi conduzido separadamente para o estudo de um patógeno e um deteriorante representados por Listeria monocytogenes e uma bactéria ácido lática (BAL) (Latilactobacillus sakei) isolada de um produto cárneo deteriorado, respectivamente. Os parâmetros utilizados para avaliação de L. monocytogenes foram 400-600MPa de pressão, tempo de 180-420s e aw entre 0,94-0,96. As três variáveis influenciaram significativamente (p0,05) na inativação do micro-organismo e a redução logarítmica variou entre 0,99 e 4,12 log UFC/g. Com o presente trabalho foi possível concluir que os parâmetros físico-químicos, de processamento e o micro-organismo interferem no efeito da alta pressão na inativação microbiana. Os modelos matemáticos criados e validados experimentalmente nesse trabalho favorecem a indústria de carnes na otimização do processo, garantia da segurança alimentar, extensão da vida de prateleira, redução do desperdício de alimentos e atendimento de legislações Abstract: The meat industry is constantly challenged to seek new technologies that meet consumer demand for safe and quality products. Controlling pathogenic and spoilage microorganisms is a challenge for the industry and can be faced with the use of High Pressure Processing (HPP). However, the baroprotective effect caused by water activity (aw) has been studied in different products, microorganisms, and process parameters, however, information is limited and sometimes contradictory. Thus, the objective of this research was to evaluate the effect of aw in a model meat emulsion on microbial inactivation under high pressure through a response surface methodology. The work was carried out separately for the study of a pathogen and a spoilage represented by Listeria monocytogenes and a lactic acid bacteria (LAB) (Latilactobacillus sakei) isolated from a spoiled meat product, respectively. The parameters used for the evaluation of L. monocytogenes were 400-600MPa of pressure, time of 180-420s and aw between 0.94-0.96. The three variables significantly (p0.05) on the inactivation of the microorganism and the logarithmic reduction varied between 0.99 and 4.12 log CFU/g. With the present work, it was possible to conclude that the physical-chemical parameters, processing parameters and the microorganism interfere in the effect of high pressure on microbial inactivation. The mathematical models created and experimentally validated in this work favor the meat industry in optimizing the process, ensuring food safety, extending shelf life, reducing food waste and complying with legislation Mestrado Tecnologia de Alimentos Mestra em Tecnologia de Alimentos CAPES 001

Orientador: Liliana de Oliveira Rocha Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O suco de laranja é um produto amplamente consumido no mundo, este fato se deve, principalmente, às suas características sensoriais e nutricionais, visto que possui vitamina C, minerais e carboidratos em sua composição. Devido ao pH ácido da bebida, esta torna-se susceptível à contaminação por microrganismos tolerantes a essa condição, destacando-se os fungos filamentosos e leveduras. Com relação aos fungos filamentosos, Paecilomyces e outros fungos termorresistentes são responsáveis pela deterioração do produto. De forma a minimizar os problemas causados pela contaminação por fungos, o suco de laranja pode ser submetido a diversos tratamentos, sendo estes térmicos ou não. Além disso, o emprego de sanitizantes em ambientes e equipamentos da indústria contribui para a obtenção de um produto com qualidade microbiológica. Este trabalho teve como objetivo identificar potenciais pontos de contaminação por fungos deteriorantes em linha de processamento de suco de laranja em indústria localizada no interior de São Paulo e verificar a susceptibilidade dos isolados de fungos filamentosos aos sanitizantes comumente utilizados na indústria de alimentos. Os resultados revelaram a presença de fungos em todas as coletas realizadas. Observou-se a ocorrência de espécies fúngicas distintas nos sucos antes e após a pasteurização, indicando contaminação durante o processamento e, possivelmente, a formação de biofilmes contendo leveduras e fungos filamentosos nos equipamentos. As espécies fúngicas de maior destaque na contaminação foram Paecilomyces variotii e Wickerhamomyces anomalus. Com relação à susceptibilidade aos sanitizantes, observou-se resistência de P. variotii aos produtos a base de hipoclorito de sódio e ácido peracético mais peróxido de hidrogênio, indicando potencial persistência deste fungo na linha de processamento e problemas futuros de deterioração dos sucos Abstract: Orange juice is a product widely consumed worldwide; this fact is mainly due to its sensory and nutritional characteristics, since it has vitamin C, minerals and carbohydrates in its composition. Due to the acidic pH of the beverage, it is susceptible to the contamination by microorganisms tolerant to this condition, especially filamentous fungi and yeasts. With regard to filamentous fungi, Paecilomyces and other heat-resistant fungi are may be responsible for the spoilage of the product. In order to minimize the problems caused by contamination by fungi, orange juice can be subjected to different treatments, such as thermal processes. In addition, the use of sanitizers in industrial environment and equipment contributes to obtaining a product with microbiological quality. This study aimed to identify the main origins of fungal contamination in an orange juice processing line located in the interior of São Paulo and to verify the susceptibility of isolated filamentous fungi to sanitizers commonly used in the food industry. The results revealed the presence of fungi in all samplings performed. It was observed the occurrence of different fungal species in the juices before and after pasteurization, indicating contamination during processing and, possibly, the formation of biofilms containing yeasts and filamentous fungi in the equipment. The most prominent fungal species associated with the contamination were Paecilomyces variotii, and Wickerhamomyces anomalus. Regarding the susceptibility to sanitizers, the resistance of P. variotii to products based on sodium hypochlorite and peracetic acid plus peroxide was observed, indicating potential persistence of this fungus in the processing line and future problems of juice spoilage Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CAPES 156010/2019-4

Orientador: Mirna Lucia Gigante Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do tempo de armazenamento do leite cru e da temperatura de estocagem do leite pasteurizado sobre sua qualidade físicoquímica, microbiológica e vida de prateleira. Para cada experimento utilizouse 150 litros de leite cru que foram divididos em 3 latões de 50 litros armazenados por 0, 4 ou 7 dias a 5 ± 1ºC antes da pasteurização. Durante o armazenamento refrigerado, amostras de leite cru foram avaliadas quando a presença de resíduos de antibióticos, contagem de células somáticas, pH, acidez, densidade, extrato seco total, gordura, nitrogênio total e solúvel em pH 4,6 e em TCA 24%, coliformes a 3035 ºC e a 45ºC e a contagem dos seguintes microorganismos: aeróbios mesófilos, psicrotróficos, Pseudomonas spp., termodúricos mesófilos e psicrotróficos, esporos mesófilos e psicrotróficos. Após o período de armazenamento refrigerado o leite foi pasteurizado (7275 ºC/1520 segundos), refrigerado (5±1ºC) e envasado em embalagens plásticas de polietileno, as quais foram divididas em dois lotes e estocadas a 5±1ºC ou a 10±1ºC. Durante o armazenamento refrigerado amostras dos leites pasteurizados foram avaliadas para as mesmas características, excetuandose contagem de células somáticas e a presença de resíduos de antibióticos e incluindose os testes de eficiência de pasteurização (peroxidase e fosfatase) e a pesquisa de Salmonela spp. O final da vida de prateleira do leite pasteurizado foi estabelecido como sendo o primeiro dia em que as amostras apresentassem contagem total de microorganismos mesófilos aeróbios superior a 8 x 10 4 UFC/mL. O experimento completo foi repetido três vezes e o delineamento experimental utilizado foi o Splitsplitplot com três fatores. Durante o armazenamento refrigerado do leite cru observouse o aumento significativo da proteólise, da acidez e das contagens de todas as classes de microrganismos avaliadas. A contagem total de microrganismo, cujo valor máximo permitido pela legislação brasileira é 10 6 UFC/ml foi plenamente atendida no dia de recebimento do leite, entretanto atingiu valores de 6,10 x 10 6 e 1,83 x10 8 UFC/ml após 4 e 7 dias de armazenamento refrigerado. Todas as amostras de leite pasteurizado apresentaram teste negativo para fosfatase e positivo para peroxidase e atenderam aos padrões microbiológicos definidos pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária, que estabelece a tolerância indicativa de coliformes 45ºC igual a 4 NMP/mL e ausência de Salmonela spp/25 mL. A contagem inicial de microorganismos mesófilos aeróbios no leite pasteurizado aumentou significativamente com o aumento do tempo de armazenamento do leite cru e foi, em média, de 5,2x10, 1,9 x10 2 e 4,0 x10 2 UFC/mL, para o leite cru armazenado por 0, 4 e 7 dias respectivamente. Além disso, quanto maior a temperatura de estocagem do leite pasteurizado, maior a contagem de microorganismos, que foi, em média, de 1,5x10 2 e 2,8x10 2 UFC/mL para o leite estocado a 5±1 e 10±1ºC, respectivamente. A interação entre os tratamentos afetou significativamente a fase lag de todas as classes de microorganismo estudadas, exceto esporos mesófilos e psicrotróficos. O tempo de fase lag apresentou tendência de ser maior quanto menor o tempo de armazenamento do leite cru (0 dia) e menor a temperatura (5±1ºC) de estocagem do leite pasteurizado. Nesta condição a vida de prateleira do leite pasteurizado foi de 10,7 dias. Quando o leite cru foi armazenado por 7 dias antes da pasteurização e foi estocado a 10±1ºC a vida de prateleira foi apenas de 2,3 dias. Estes resultados confirmam que para aumentar a vida de prateleira do leite pasteurizado é necessário, além da boa qualidade, um curto tempo de armazenamento do leite cru e uma baixa temperatura para a estocagem do leite pasteurizado Abstract: The objective of this work was to evaluate the effect of raw milk storage time and pasteurized milk storage temperature on milk physical, chemical and microbiological quality and shelf life. For each experiment, 150 liters of raw milk were used, divided into three 50 liter milk cans, stored during 0, 4 or 7 days at 5 ± 1ºC before pasteurization. During refrigerated storage, samples of raw milk were evaluated with respect to the presence of antibiotic residues, somatic cell count, pH, acidity, density, total dry extract, fat, total nitrogen and nitrogen soluble at pH 4.6 and in 24% TCA, total and fecal coliforms and the counts of the following microorganisms: aerobic mesophiles, psychrotrophs, Pseudomonas spp., thermoduric mesophiles and psychrotrophs, mesophilic and psychrotrophic spores. After the refrigerated storage period, the milk was pasteurized (7275 ºC/1520 seconds), refrigerated (5 ± 1ºC) and packaged in polyethylene plastic bags, which were divided into two lots and stored at 5 ± 1ºC or at 10 ± 1ºC. During the refrigerated storage, samples of the pasteurized milks were evaluated for the same characteristics as the raw milk, except for somatic cell count and the presence of antibiotic residues, and including pasteurization efficiency tests (peroxidase and phosphatase) and testing for Salmonella spp. The end of the shelf life of the pasteurized milk was established as the first day in which the samples presented a total count of aerobic mesophilic microorganisms above 8 x 10 4 CFU/mL. The complete experiment was repeated three times and the experimental design used was the Splitsplitplot with three factors. During the refrigerated storage of the raw milk, a significant increase of proteolysis, acidity and counts of all the classes of microorganisms evaluated was observed. The total microorganism count, which was within the limit permitted by the Brazilian legislation of 10 6 CFU/mL on the day of reception, reached values of 6.10 x 10 6 and 1.83 x 10 8 CFU/mL, after 4 and 7 days of refrigerated storage, respectively. All the samples of pasteurized milk presented a negative test for phosphatase and a positive test for peroxidase and attended the microbiological standards defined by the Brazilian Sanitary Vigilance Agency (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), that establishes an indicative tolerance for fecal coliforms equal to 4 MPN/mL and the absence of Salmonella spp/25 mL. The initial count of aerobic mesophilic microorganisms in the pasteurized milk increased significantly with the increase of the raw milk storage time and was, in average, of 5.2 x 10, 1.9 x 10 2 and 4.0 x 10 2 CFU/mL, for the raw milk stored for 0, 4 and 7 days, respectively. Furthermore, the higher the pasteurized milk storage temperature, the higher the microorganism count, that was, in average, of 1.5 x 10 2 and 2.8 x 10 2 CFU/mL for the milk stored at 5 ± 1 and 10 ± 1ºC, respectively. The interaction between the treatments significantly affected the lag phase of all the classes of microorganisms studied, except for mesophilic and psychrotrophic spores. The lag phase period presented a tendency to be greater for shorter raw milk storage times (0 day) and lower pasteurized milk storage temperatures (5 ± 1ºC). In this condition, the shelf life of the pasteurized milk was 10.7 days. When the raw milk was stored for 7 days before pasteurization and stored at 10 ± 1ºC, the shelf life was only 2.3 days. These results confirm that to increase the shelf life of pasteurized milk, apart from good quality, a short raw milk storage time and a low pasteurized milk storage temperature are necessary Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Jose Luiz Pereira, Valeria Chritina Amstalden Junqueira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Ranulfo Monte Alegre Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O ácido y-poliglutâmico, também conhecido como y-PGA, é um polímero largamente estudado com capacidade de produzir polímeros e monômeros de ácido glutâmico quando hidrolisado. Por ser solúvel em água, biodegradável e atóxico, o y-PGA é aplicado em indústrias alimentícias, cosméticas e medicina. Com o objetivo de estudar a produção de y-PGA e sua hidrólise, foram avaliadas diferentes cepas de Bacillus spp e condições experimentais, além disso, meios de cultivos sem a presença do ácido glutâmico a partir de subprodutos industriais, como glicerol e melaço. O estudo iniciou com a escolha do meio de cultivo e aplicação de substratos alternativos e baixo custo. Foram determinadas as possíveis espécies do Bacillus produtoras de y-PGA, analisou-se os componentes do meio fermentativo e as condições de cultivo que interferem na produção de y-PGA através do planejamento experimental e aplicou-se um delineamento composto central rotacional (DCCR) para otimização das condições de cultivo. Por fim, avaliou-se o consumo de y-PGA e a hidrólise de y-PGA pela enzima presente no meio de cultivo. O micro-organismo Bacillus velezensis NRRL B-23189 foi o selecionado para a produção de y-PGA. A produção de y-PGA em meio de cultivo sem ácido glutâmico contendo glicerol (100 g/L) foi otimizado, obtendo-se o ponto ótimo em meio cuja composição foi de sulfato de amônio, 8 g/L, ácido cítrico, 20 g/L, temperatura de 27 °C, agitação de 200 rpm, pHinicial 6,5 em cultivo submerso conduzido por agitador orbital. Nas condições otimizadas a produção de y-PGA sem utilização do ácido glutâmico foi de 4,17 g/L. Ao substituir o glicerol por melaço, obteve-se uma produção de 4,82 g/L do y-PGA em meio contendo melaço, 200 g/L, sulfato de amônio, 8 g/L, ácido cítrico, 12,5 g/L , temperatura de 27 °C, agitação de 200 rpm, pHinicial 6,5 em cultivo submerso conduzido por agitador orbital. A avaliação das condições de cultivo em biorreator com capacidade de 5 L, agitação de 500 rpm, taxa de aeração de 2 VVM, 27 °C e as mesmas condições otimizadas, mostrou um aumento na produção do y-PGA quando o subproduto de glicerol foi utilizado, a produção de y-PGA foi de 28 g/L. Um aumento na produção de ?-PGA para 6,69 g/L foi determinado quando utilizou melaço. O Bacillus velezensis NRRL B-23189 utiliza o y-PGA como fonte de carbono quando outras fontes não estão no meio fermentativo. Para isto o microorganismo libera uma enzima no meio de cultura responsável pela hidrólise do y-PGA Abstract: The poly(y-glutamic acid), also known as y-PGA, is a polymer that much research has been done on this metabolite and it produces glutamic acid polymers and monomers when hydrolyzed. y-PGA is a water-soluble, biodegradable and non toxic biopolymer with applications in medicine, food, cosmetic industries. This work aims to study the process of y-PGA production and hydrolysis. Bacillus strains and experimental conditions had been determined, as well as different culture conditions without glutamic acid as alternative industrial substrates by-products (glycerol and molasses). Firstly, culture media and alternative and cheap substrates were selected and Bacillus strains was evaluated. A fractional central composite design was utilized to evaluate the effects of fermentative compounds and culture conditions on y-PGA production. The optimization of culture conditions was determined using central composite design (CCD). Finally, consumption and enzymatic hydrolysis of y-PGA in culture media was studied. The Bacillus velezensis NRRL B-23189 strain was selected. The culture media without glutamic acid with 100 g/L of glycerol was optimized. The CCD showed the best y-PGA production in culture media with ammonium sulphate, 8 g/L, citric acid, 20 g/L, the temperature of 27 °C, the agitation of 200 rpm, the initial pH 6,5 in shaker. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 4,17 g/L. The production of y-PGA was 4,82 g/L when the molasses, 200 g/L, was supplemented with ammonium sulphate, 8 g/L, citric acid, 12,5 g/L, temperature of 27 °C, agitation of 200 rpm, initial pH 6,5 in shaker. Experimental conditions of 5 L in stirred bioreactor with stirring rates of 500 rpm, aeration rate of 2 VVM, the temperature of 27 °C and same optimal conditions, showed higher y-PGA production than when used glycerol in culture media, 28 g/L. When it was used molasses the y-PGA production was 6,69 g/L. The Bacillus velezensis NRRL B-23189 uses y-PGA as only carbon source or when the carbon at the medium was not sufficient. Thus, the microrganism produces the enzyme that hydrolyses y-PGA Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Dirce Yorika Kabuki Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Clostridium difficile é um bacilo anaeróbio responsável por doença intestinal associada ao tratamento prévio com antibióticos, manifestando desde uma diarreia leve até casos graves de colite pseudomembranosa. Os casos de infecção estão relacionados à contaminação em hospitais, porém pesquisas recentes sugerem possível associação ao consumo de alimentos contaminados, pois C. difficile já foi isolado de animais de produção. O C. difficile é um micro-organismo capaz de aderir e formar biofilmes em superfícies de equipamentos e utensílios utilizados no processamento de carnes, causando um elevado risco de contaminação de alimentos. Desta forma os objetivos do estudo foram: a) avaliar o comportamento de cepas de C. difficile isolados de carnes em diferentes meios de cultura, PYG (Peptone yeast extract glucose) e BHI (Brain heart infusion), a 4 ºC e 7 ºC por 28 dias e, a 15 ºC por 10 dias e em carnes embaladas a vácuo a 7 ºC e 15 ºC por 35 e 15 dias, respectivamente; b) avaliar a capacidade de adesão e/ou formação de biofilme de C. difficile (VPI 10463 e LHCD 809) em diferentes matrizes, BHI, BHI modificado com cisteína e BHI modificado para pH 5,6-5,8 sob duas temperaturas, 15 ºC e 25 ºC por até 10 dias, em superfície de cupons de aço inoxidável AISI 304; c) avaliar estratégias para controle e inibição de C. difficile, dentre elas aplicação de sanitizantes em biofilmes formados após 6 dias de contato e sobre suspensão de esporos de C. difficile; d) avaliar o perfil de susceptibilidade de cepas isoladas de carnes a 8 antimicrobianos (ampicilina, clindamicina, ceftizoxime, moxifloxacina, metronidazol, tetraciclina, ceftriaxone e vancomicina). Os resultados revelaram o efeito bacteriostático da estocagem às temperaturas de 4 ºC e 7 ºC, no entanto, um abuso de temperatura (15 ºC) proporcionou a multiplicação de C. difficile. O desenvolvimento de C. difficile VPI 10463 em carnes embaladas a vácuo é favorecido pelo aumento de temperatura. Tanto a cepa de C. difficile padrão VPI 10463, quanto a cepa LHCD 809 isolada de carne de frango foram capazes de aderir e formar biofilmes multiformes em superfície de aço inoxidável. Embora o sanitizante a base de hipoclorito de sódio tenha apresentado maior redução do biofilme de C. difficile a sua eliminação não foi total, indicando a necessidade de um processo mais efetivo de higienização. Para eliminação de esporos de C. difficile o hipoclorito de sódio foi o agente com maior efeito esporicida, seguido do ácido peracético. A biguanida e o quaternário de amônio não apresentaram nenhuma atividade sobre os esporos de C. difficile. A multirresistência a pelo menos três agentes antimicrobianos foi encontrada em 36,4% dos isolados, o que evidência a importância do monitoramento periódico para avaliar o surgimento de cepas resistentes. Dessa forma, os alimentos in natura e os processados representam um risco para saúde pública, agindo como possíveis veículos para transmissão de C. difficile, portanto, estratégias adequadas para reduzir a contaminação de alimentos são extremamente recomendadas Abstract: Clostridium difficile is an anaerobic bacillus responsible for intestinal disease associated with previous treatment with antibiotics, ranging from mild diarrhea to severe cases of pseudomembranous colitis. Infection cases are related to contamination in hospitals, but recent research suggests a possible association with the consumption of contaminated foods, since C. difficile has already been isolated from production animals. C. difficile is a microorganism capable of adhering and forming biofilms on surfaces of equipment and utensils used in meat processing, causing a high risk of food contamination. In this way the objectives of this study were: a) to evaluate the behavior of C. difficile strains isolated from meat in different culture media, PYG (Peptone yeast extract glucose) and BHI (Brain heart infusion) at 4 ºC and 7 ºC for 28 days and at 15 ºC for 10 days and in vacuum packed meats at 7 ºC and 15 ºC for 35 and 15 days, respectively; b) to evaluate the adhesion and/or biofilm formation capacity of C. difficile (VPI 10463 and LHCD 809) in different matrices, BHI, cysteine-modified BHI and BHI modified to pH 5.6-5.8 under two temperatures, 15 ºC and 25 ºC for up to 10 days, on stainless steel AISI 304 coupon surfaces; c) to evaluate strategies for C. difficile control and inhibition, among them application of sanitizers in biofilms formed after 6 days of contact and on spore suspension of C. difficile; d) to evaluate the susceptibility profile of strains isolated from meat to 8 antimicrobials (ampicillin, clindamycin, ceftizoxime, moxifloxacin, metronidazole, tetracycline, ceftriaxone and vancomycin). The results revealed the bacteriostatic effect of storage at temperatures of 4 ºC and 7 ºC, however, a temperature abuse (15 ºC) resulted in the multiplication of C. difficile. The development of C. difficile VPI 10463 in vacuum packed meats is favored by the increase in temperature. Both the C. difficile strain VPI 10463 and the LHCD 809 strain isolated from chicken meat were able to adhere and form multiform biofilms on stainless steel surfaces. Although the sanitizer based on sodium hypochlorite showed a greater reduction of C. difficile biofilm, its elimination was not complete, indicating the need for a more effective hygienization process. For elimination of C. difficile spores sodium hypochlorite was the agent with the highest sporicidal effect, followed by peracetic acid. Biguanide and quaternary ammonium showed no activity on C. difficile spores. The multiresistance of at least three antimicrobial agents was found in 36.4% of the isolates, evidencing the importance of periodic monitoring to evaluate the emergence of resistant strains. Thus, in natura and processed foods represent a risk to public health, acting as possible vehicles for transmission of C. difficile, therefore, adequate strategies to reduce food contamination are highly recommended Doutorado Tecnologia de Alimentos Doutora em Tecnologia de Alimentos CAPES

Orientadores: José Luiz Pereira, Alessandra Regina da Silva Marques Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Segundo o Ministério da Saúde (2013), no Brasil, de 2000 a 2013 foram notificados 8,857 surtos de Doenças Veiculadas por Alimentos (DVA), envolvendo mais de 163,000 doentes e pelo menos 112 óbitos (Brasil, 2013). Os agentes mais frequentes nos surtos são, em primeiro lugar, a Salmonella spp. (aprox. 40%) e em seguida Staphylococcus spp. (aprox. 20%), sendo as crianças de até 4 anos as mais susceptíveis. Neste cenário, as instituições de ensino representam o terceiro local de maior ocorrência das DVAs (8%), atrás de residências (40%) e restaurantes (15%). A assepsia dos manipuladores e superfícies de contato com alimentos (SCA) são de extrema importância no controle e distribuição de patógenos. Além do nível de contaminação por Staphylococcus spp., é importante o conhecimento de sua capacidade de produção de enterotoxinas e como a sua produção varia em função de mudanças em condições ambientais. Sendo assim, esta pesquisa teve como objetivos estabelecer o perfil de contaminação por Staphylococcus produtores de enterotoxinas em cozinhas institucionais (creches) e cozinhas residenciais, além de estabelecer um modelo matemático que descreva os limites críticos para produção de toxinas. Para tanto, foram realizadas coletas em pontos específicos dentro da área de manipulação de 4 cozinhas institucionais e 10 cozinhas residenciais, localizadas na cidade de Campinas, SP (utensílios, tábuas de corte, pias, maçanetas das geladeiras e botão de acionamento do fogão). Além dos pontos supracitados, foram analisadas 8 amostras de frango cozido e 8 amostras de chuchu, servidos na hora do almoço nas creches, além de 20 doces a base de creme de confeiteiro adquiridos em comércio local. Foi elaborado um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp para coleta de Staphylococcus a partir das mãos e narinas dos manipuladores presentes nas cozinhas das creches. Cinquenta e sete isoaldos caracterizados como pertencentes ao gênero Staphylococcus tiveram seu perfil bioquímico determinado e as espécies confirmadas de Staphylococcus seguiram para análise de detecção de enterotoxinas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE). A modelagem matemática de produção da toxina em carne de frango foi realizada utilizando como variáveis temperatura, pH e concentração de sal. Foi elaborado um modelo polinomial de superfície de resposta com os fatores significativos para modelagem do tempo para aparecimento da toxina. Os modelos obtidos foram avaliados estatisticamente utilizando o coeficiente de ajuste (R2), fator bias, fator exatidão e relação Fcalc/Ftab. Seis isolados recuperados a partir das instalações de cozinhas institucionais tiveram seus genes codificadores para SEs quantificados a partir de análise Real Time quantitative PCR (RT-qPCR). O presente trabalho identificou falhas nas práticas de manipulação de alimentos em creches municipais e sugestões de melhorias foram recomendadas. A construção de um modelo polinomial que descreva o tempo para produção de SE pode ser utilizado por microbiologistas de alimentos para análise de risco em carne de frango. Além disso, o conhecimento da expressão de genes codificadores de SE, ao longo da curva de crescimento bacteriano, colaboram para o melhor entendimento da epidemiologia da enfermidade Abstract: According to Brazilian Ministry of Health (Brasil, 2013), between 2000-2013 were reported 8,857 outbreaks of diseases transmitted by food (DVA), involving more than 163,000 cases and at least 112 deaths (Brasil, 2013). The most common agents in outbreaks are Salmonella spp. (approx. 40%) and Staphylococcus spp. (approx. 20 %), and children under 4 years are most likely. In this scenario, the educational institutions represent the third most frequent location of DVAs (8%), behind residences (40 %) and restaurants (15%). Asepsis of handlers and food contact surfaces (SCA) are of utmost importance in the control and distribution of pathogens. Beyond the level of contamination by Staphylococcus spp., it is important to be aware of their ability to produce enterotoxin and how these vary according to changes in environmental conditions. Thus, this research aimed to establish the profile of contamination by potential producers of enterotoxins in institutional kitchens (childcare centers) and domestic kitchens, besides establishing a mathematical model that dictates the critical limits for toxin production. For this, samples were taken at specific points within the area of manipulation of 4 institutional kitchens and 10 residential kitchens in the city of Campinas, SP (utensils, cutting boards, sinks, refrigerators door handles and stove trigger button). In addition to the above points, 8 samples of cooked chicken meat and 8 samples of chayote, served in the lunchtime at childcare centers in and 20 sweet cream-based icing food purchased at local shops were analyzed. A Term of Free and Informed Consent Form (TCLE), approved by the Ethics Committee of the Faculty of Medical Sciences, Unicamp, for sampling of Staphylococcus from the nostrils and hands of food handlers was prepared. Fifty-seven isolates characterized as belonging to the Staphylococcus genus were determined and their biochemical profile established. Confirmed species of Staphylococcus followed for enterotoxin detection analysis (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED and SEE). Mathematical modeling of toxin production in chicken meat was performed using as variables temperature, pH and salt concentration. One polynomial response surface model with significant values for modeling the time to onset of the toxin factors was developed. The obtained models were statistically evaluated using the adjustment coefficient (R2), bias and accuracy factors and Fcalc/Ftab relation. Six isolates recovered from institutional kitchen premisses had their SE encoding genes quantified by Real Time quantittative PCR analysis. The present research identified flaws in handling practices at isntitutional kitchens and was and improvement in food handling was suggested. The construction of a polynomial model that describes the SE production can be used by food microbiologists for risk analysis in chicken meat. Besides, the knowledge of SE encoding genes expression, along the bacteria growth curve, helps to a better understanding of illness epidemiology Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Marta Cristina Teixeira Duarte Tese (doutorado) ¿ Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O uso de antimicrobianos é o principal tratamento para o controle das bacterioses em peixes e, consequentemente, seu largo emprego leva ao desenvolvimento e seleção de bactérias resistentes, podendo ocasionar a contaminação de outros animais e do homem. Adicionalmente, a falta de legislação nacional específica quanto à regulamentação de medicamentos veterinários para uso na aquicultura, assim como a evidente necessidade do uso desse recurso no tratamento de doenças, tem levado o piscicultor a empregar medicamentos antimicrobianos disponíveis no mercado para outras espécies animais. A pressão social para redução do uso de antimicrobianos na piscicultura tem incentivado a pesquisa de outras substâncias para melhorarem a produção, garantir segurança aos consumidores e não causar danos ambientais. Neste contexto, os óleos voláteis têm recebido grande atenção como alternativa ao uso das moléculas sintéticas. A atividade antimicrobiana dos óleos voláteis é conhecida há anos e seu mecanismo de ação geralmente é o mesmo dos antimicrobianos tradicionais, porém não há evidências de resistência bacteriana. Em vista do problema de desenvolvimento de resistência bacteriana torna-se urgente o estabelecimento de regras para o uso racional de antibióticos e o emprego de terapias alternativas para o controle dessas bacterioses. A administração dos óleos voláteis via ração requer sua proteção contra as perdas por volatilização, reações de oxidação, redução e rearranjos, o que é normalmente alcançada através do processo de veiculação dos óleos na presença de polímeros carreadores. Assim, foi avaliada a atividade antibacteriana de 71 óleos voláteis entre os obtidos experimentalmente a partir de espécies pertencentes à Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas ¿ CPMA, do CPQBA ¿ UNICAMP e os adquiridos junto ao comércio, sendo essas nativas e exóticas. Os resultados obtidos neste trabalho demostram que foi possível o desenvolver uma ração recheada com produto natural à base de óleos voláteis de espécies aromáticas (tomilho, tomilho vermelho e alecrim pimenta) efetiva contra Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare e Aeromonas hydrophila, que poderá ser administrado de forma simples e eficaz. Os resultados dos ensaios in vivo com Tilápias desafiadas com Aeromonas hydrophila (Fase I e Fase II) apresentados evidenciam que os níveis das substâncias administradas aos animais via dieta apresentam aumento nos leucócitos totais dos animais e nenhuma toxicidade, sugerindo assim, um aumento da resposta imune a partir da utilização de um produto seguro e não toxico. O desenvolvimento dessas alternativas terapêuticas na piscicultura tem caráter inovador e proporciona redução nos prejuízos relacionados à falta de qualidade, além de reduzir o uso indiscriminado de antimicrobianos e o impacto ambiental Abstract: The use of antimicrobials is the main treatment for the control of bacterioses in fish and, consequently, their wide use leads to the development and selection of resistant bacteria, which can cause the contamination of other animals and man. In addition, the lack of specific national legislation on the regulation of veterinary medicinal products for use in aquaculture, as well as the evident need for the use of this resource in the treatment of diseases, has led the fish farmer to use antimicrobial drugs available on the market for other animal species. Social pressure to reduce the use of antimicrobials in fish farming has encouraged the search for other substances to improve production, ensure consumer safety and not cause environmental damage. In this context, volatile oils have received great attention as an alternative to the use of synthetic molecules. The antimicrobial activity of volatile oils has been known for years and its mechanism of action is generally the same as traditional antimicrobials, but there is no evidence of bacterial resistance. In view of the problem of development of bacterial resistance, it is urgent to establish rules for the rational use of antibiotics and the use of alternative therapies for the control of these bacterioses. The administration of volatile oils via feed requires protection against losses by volatilization, oxidation, reduction and rearrangement reactions, which is usually achieved through the process of transporting the oils in the presence of carrier polymers. Thus, the antibacterial activity of 71 volatile oils was evaluated between those obtained experimentally from species belonging to the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA, from CPQBA - UNICAMP and those acquired from the trade, being these native and exotic. The results of this demonstrate work that it was possible to develop a fat diet with natural product based volatile oils from aromatic species (thyme, red thyme and rosemary pepper) effective against Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare and Aeromonas hydrophila, which may be administered simple and effective way. The results of the in vivo tests with Aeromonas hydrophila challenged Tilapia (Phase I and Phase II) presented evidence that the levels of the substances administered to the animals via the diet show increase in the total leukocytes of the animals and no toxicity, thus suggesting an increase in the immune response from the use of a safe and non-toxic product. The development of these therapeutic alternatives in fish farming has an innovative character and provides reduction in the damages related to the lack of quality, besides reducing the indiscriminate use of antimicrobials and the environmental impact Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos FAPESP 2013/11981-2

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Algumas espécies de Aeromonas podem causar patologias gastroentéricas, meningite, endocardite, artrite, osteomielite, infecções cutâneas e outras desordens, sendo considerados patógenos emergentes com crescente importância para a saúde pública, especialmente por serem veiculados pela água e alimentos crus. Tendo em vista esta significância, os objetivos deste projeto foram avaliar: i) a ocorrência de Aeromonas sp. potencialmente patogênicas em água de irrigação e vegetais de cultivo convencional, hidropônico e orgânico coletados de propriedades rurais no município de Capão Bonito-SP e em vegetais convencionais, hidropônicos e minimamente processados, comercializados na cidade de Campinas-SP; ii) o potencial patogênico dos isolados através da detecção dos genes codificadores dos principais fatores de virulência para gastroenterites (genes aer, codificador da aerolisina; hlyA, codificador da hemolisina HlyA; e act, alt e ast codificadores das enterotoxinas Act, Alt e Ast, respectivamente) e iii) a suscetibilidade das cepas isoladas aos antimicrobianos gentamicina, tetraciclina, ciprofloxacina, cloranfenicol cepepime, clindamicina e moxifloxacina. Foram avaliadas 18 amostras de água de irrigação e 74 de vegetais do município de Capão Bonito-SP e 103 vegetais do comércio de Campinas-SP. Houve quantificação direta de Aeromonas sp. em 66,7% (12/18) das amostras de água de irrigação, com contagens entre 4 e 1,7 x 102 UFC.100ml-1. Para os vegetais de Capão Bonito, as frequências de ocorrência de Aeromonas sp. nas amostras de cultivo convencional, hidropônico e orgânico foram, respectivamente, de 23,0% (6/26), 37,5% (9/24) e 45,8% (11/24) e suas contagens variaram de

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: No Brasil, as frutas minimamente processadas e polpas de frutas estão ganhando mais espaço no mercado, uma vez que são produtos similares ao original mantendo o sabor e textura da fruta in natura, assim como seu apelo saudável. Contudo, são alimentos que passam por várias etapas de manipulação, podendo, portanto, ocorrer contaminação por diversos micro-organismos durante sua produção. Os objetivos do trabalho foram: verificar se amostras de polpas de frutas e frutas minimamente processadas estavam de acordo com a RDC nº 12/2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária para coliformes termotolerantes e ausência de Salmonella sp., realizar a contagem de bolores e leveduras para observar a qualidade do produto em relação à Instrução Normativa nº1/2000 do Ministério da Agricultura, realizar a caracterização genética de E. coli quanto ao potencial de virulência e avaliar o perfil de resistência aos antimicrobianos. A identificação dos isolados de Salmonella sp. e o perfil de patogenicidade de E. coli foram realizados pela técnica da Polymerase Chain Reaction (PCR) e a susceptibilidade aos antimicrobianos ácido nalidíxico, ampicillina, ceftadizima, ciprofloxacino, cloranfenicol, e trimetroprima/sulfametoxazol foi testada através da técnica do disco difusão. As polpas de frutas congeladas (n=100) estavam dentro dos padrões da legislação, porém foi encontrado o patógeno Escherichia coli, caracterizado como ETEC, através da identificação do gene est1b em uma amostra de polpa de manga não pasteurizada. As frutas minimamente processadas (n=80) estavam contaminadas com altas contagens de bolores e leveduras, variando entre 4,2x103 a 7,2 x 106 UFC.g-1, em 36,25% (29/80)das amostras e 12,5% (10/80) apresentaram coliformes termotolerantes acima do limite da legislação. Além de uma amostra de coco ralado estar contaminada com Escherichia coli e uma de melão com Salmonella sp. Os isolados de E. coli apresentaram maior taxa de resistência a ampicilina e ao cloranfenicol o que resultou em 14,3% (2/14) apresentando multirresistência. Apenas uma cepa dos isolados de Salmonella sp. foi resistente ao sulfametoxazol/trimetroprima. Sugere-se, portanto, que a etapa de pasteurização no processamento da polpa de fruta seja adotada por todas as indústrias. O controle higiênico-sanitário e da temperatura no preparo de alimentos minimamente processados devem ser usados como medidas para produção de alimentos seguros ao consumidor Abstract: In Brazil, the consumption of minimally processed fruits and fruit pulps are increasing, because they are similar to original products maintaining the flavor and texture of in natura fruit, likewise as its appeal as healthy foods. However, they are foods that go through several stages of handling, and may occur, therefore, contamination by several microorganisms during their production. The objectives of the research were: to verify if samples of fruit pulps and fruits minimally processed are in accordance with RDC nº 12/2001 for thermotolerant coliforms and absence of Salmonella, in addition counting of molds and yeasts in order to assert the quality of the product in relation to the Normative Instruction nº1/2000 from Agriculture Ministry, carry out genetic characterization regarding virulence potential of Escherichia coli and evaluate its antimicrobial resistance profile. The identification of Salmonella sp. and E. coli pathogenicity profile were performed with Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. The susceptibility to antimicrobials, nalidixic acid, ampicillin, ceftadizime, ciprofloxacin, chloramphenicol, and trimetroprima/sulfamethoxazole were tested with diffusion disc technique. The frozen fruit pulps (n=100) were in occordance with Brazilian regulations, but pathogenic Escherichia coli was found, characterized as ETEC by identification of gene est1b in a sample of unpasteurized mango pulp. Minimally processed fruits were contaminated with high yeast and mold counts between, 2x103 to 7,2 x 106 UFC.g-1, in 36.25% (29/80) of the samples, and 12,5% (10/80) of the samples presented thermotolerant coliforms above regulation limit. In addition one sample of grated coconut was contaminated with Escherichia coli and one samples of yellow melon was positive for Salmonella sp. E. coli strains presented higher resistance rates to ampicillin and chloramphenicol resulting in 14,3% (2/14) with multi-resistance. One strain of Salmonella sp. was resistant to sulfamethoxazole / trimethoprim. It is, therefore, suggested that the pasteurization step in the processing of fruit pulps must be adopted by all industries. The hygienic-sanitary control during preparation of minimally processed foods and the temperature control in storage and distribution ought to be adopted as measures for safer food production to the consumer Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CAPES FAEPEX

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Listeria monocytogenes é um patógeno alimentar psicrotrófico, presente em diversos tipos de alimentos e pode causar doença severa com alto índice de mortalidade. As frutas são susceptíveis de serem contaminadas com micro-organismos e a ocorrência depende do tipo de fruta e das condições de crescimento e colheita. Nos Estados Unidos da América e Europa, as frutas têm sido reconhecidas como responsáveis por surtos de listeriose, mas no Brasil, a listeriose é desconhecida pela maioria da população e poucos estudos sobre a ocorrência e multiplicação de L. monocytogenes em frutas têm sido relatados. Diante do exposto, os objetivos deste trabalho foram avaliar a ocorrência de L. monocytogenes em polpas de frutas congeladas e frutas minimamente processadas, caracterizar o perfil genético dos isolados de L. monocytogenes mediante a detecção dos genes de virulência inlA, inlB, plcA, plcB, prfA e actA por PCR convencional, e analisar o perfil de susceptibilidade dos isolados aos antimicrobianos: ampicilina, ciprofloxacina, gentamicina, ceftriaxona, cefalotina, cloranfenicol, tetraciclina, penicilina G e sulfametoxazol/trimetoprim pelo método de disco difusão em ágar. Foi analisado um total de 160 amostras (80 de polpas de frutas congeladas e 80 de frutas minimamente processadas), utilizando-se a metodologia proposta pelo "Health Protection Branch" do Canadá. Listeria spp. não foi isolada de polpas de frutas congeladas. Nas amostras de frutas minimamente processadas foi encontrada Listeria sp. em 5% (4/80) das amostras, sendo: uma amostra de coco ralado, uma de seleta de frutas, uma de melão Orange e uma de melão Gália. A espécie L. monocytogenes foi identificada mediante ensaio da PCR do gene hlyA e a espécie foi confirmada em uma amostra de melão Gália e uma de melão Orange. Na pesquisa dos genes de virulência, 100% (9/9) dos isolados apresentaram resultados positivos para os genes inlA, inlB, plcA, plcB, prfA e actA, apresentando este último gene um polimorfismo alélico que o caracteriza como tipo alélico 3 de actA. Quanto à resistência aos antimicrobianos, 100% (9/9) dos isolados de L. monocytogenes apresentaram susceptibilidade a 6 dos 9 antibióticos testados. Tais agentes antimicrobianos foram: ampicilina, ciprofloxacina, tetraciclina, cefalotina, cloranfenicol e sulfametoxazol/trimetoprim. Todos os isolados apresentaram resistência apenas à ceftriaxona (100%) e nenhuma cepa apresentou multirresistência. O presente trabalho evidencia que o melão constitui uma potencial fonte de transmissão de L. monocytogenes, deste modo é importante o controle rigoroso durante a produção de frutas minimamente processadas, para que este patógeno não represente um risco para a saúde pública Abstract: Listeria monocytogenes is a psychotropic food pathogen, present in several types of food and can cause severe disease with high mortality rate. Fruits are contaminated with microorganisms and the occurrence depends on the type of fruit and growth and harvest conditions. In the United States and Europe, fruits have been recognized as responsible for outbreaks of listeriosis, but in Brazil, listeriosis is unknown by most of people and few studies on the occurrence and multiplication of L. monocytogenes in fruits have been reported. Thus, the objectives of this work were to evaluate the occurrence of L. monocytogenes in frozen fruit pulps and minimally processed fruits, to characterize the genetic profile of L. monocytogenes isolates by detecting the virulence genes inlA, inlB, plcA, plcB, prfA and actA by conventional PCR, and to analyze the susceptibility profile of the isolates to antimicrobial agents: ampicillin, ciprofloxacin, gentamicin, ceftriaxone, cephalothin, chloramphenicol, tetracycline, penicillin G and sulfamethoxazole / trimethoprim by the disk diffusion method. A total of 160 samples was analyzed (80 of frozen fruit pulps and 80 of minimally processed fruits), using the methodology proposed by the "Health Protection Branch of Canada". Listeria spp. was not isolated from frozen fruit pulps. Among the of minimally processed fruits, Listeria sp. was found in 5% (4/80) of the samples corresponding to one sample of grated coconut, one fruit salad, one Orange melon and one Galia melon. L. monocytogenes was identified by PCR assay for gene hlyA and the species was confirmed in a sample one Galia melon and one of Orange melon. In the study of virulence genes, 100% (9/9) of the isolates presented positive results for the genes inlA, inlB, plcA, plcB, prfA and actA. The gene actA was characterized as allelic type 3. Regarding to antimicrobial resistance, 100% (9/9) of the L. monocytogenes isolates showed susceptibility to 6 of the 9 antibiotics tested. Such antimicrobial agents were: ampicillin, ciprofloxacin, tetracycline, cephalothin, chloramphenicol and sulfamethoxazole / trimethoprim. All isolates presented resistance to ceftriaxone (100%) and none of isolates presented multi-resistance. The present work shows that melon constitutes a potential source of transmission of L. monocytogenes, therefore, strict control during the production of minimally processed fruits is important, so that this pathogen does not present a risk to public health Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CNPQ 132974/2015-0

Orientador: Jose de Assis Fonseca Faria Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho estudou um sistema comercial de embalagem a vácuo para carne bovina resfriada, alcatra (M. Gluteus medius) com relação à influência da temperatura de estocagem nos atributos de qualidade. As transformações na qualidade da carne foi avaliada com relação aos microrganismos deteriorantes (contagem padrão de mesófilos, bactérias láticas, psicrotróficos aeróbios e anaeróbios), coliformes fecais, Salmonella sp. e estafilococos coagulase positiva; aspectos físico-químicos (pH, exsudação, composição gasosa, nível de vácuo, cor, textura e perda na cocção) e aspectos sensoriais (aparência, aroma, sabor, maciez, suculência, impressão global e intenção de compra). Verificou-se que a temperatura (0, 2, 4, 7 e 10°C) interferiu em vários aspectos de qualidade da carne, afetando diretamente sua vida útil. A carne estocada a 0°C apresentou sinais nítidos de deterioração após 63 dias de armazenamento. O corte estocado a 2°C apresentou as mesmas características aos 49 dias, enquanto as estocadas a 4, 7 e 10ºC deterioram-se em 35, 21 e 15 dias, respectivamente. Não se detectou a presença de microrganismos estabelecidos pela RDC 12 (BRASIL, 2001), mas o desenvolvimento dos deteriorantes apresentou diferente perfil com o aumento da temperatura que, consequentemente, afetou outros parâmetros de qualidade. Foi observada uma tendência de queda nos valores de pH, possivelmente, provocada pela produção de ácidos orgânicos e de CO2, sendo que tal queda foi mais acentuada no exsudato. Observou-se, também, uma perda do vácuo ao longo da estocagem, devido à produção de CO2. A alteração de cor foi maior na superfície do que na parte interna do corte, notando-se uma regeneração da cor da carne, mesmo estando deteriorada. A exsudação, produção de CO2 e perda de massa por cocção aumentaram com o tempo e à temperatura de estocagem. Houve uma redução na força de cisalhamento, sendo essa inversamente proporcional ao tempo e temperatura de estocagem Abstract: The objective of this research was to evaluate the efficiency of a commercial vacuum packaging system on the quality of beef (M. Gluteus medius) as affected by refrigeration temperature at 0, 2, 4, 7, and 10°C. The evaluation of the beef quality changes were based on: deteriorant microbial counts (aerobic plate, lactic bacteria, psychrotrophic aerobic, and anaerobic bacteria); fecal coliforms, Salmonella sp, and coagulase positive staphylococci; physicochemical characteristics (pH, exudation, gas composition, vacuum level, color, and texture, and cooking loss) and sensory (appearance, flavor, tenderness, juiciness, overall impression and purchase intention). It was not found any bacteria established by RDC 12 (BRASIL, 2001), but the deteriorant increased as a function of temperature and storage time, which consequently affected the beef quality. The changes caused by high microbial counts defined the end of shelflife of meat samples in 63, 49, 35, 21, and 15 days, respectively to 0, 2, 4, 7, and 10°C. The physicochemical changes also increased as function of temperature and storage time, but the sensory quality decreased accordingly. The typical red color changed to darker more at the surface than in the inner part of the beef and the blooming phenomenon happened even on the microbial spoiled beef. The production of CO2 by the microorganisms caused a decrease on the beef pH and more intensive on the exsudate. The CO2 evolution inside the package caused the loss of vacuum. The shear force value decreased within the time and storage temperature Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Patógenos causadores de Doenças transmitidas por alimentos (DTAs), frequentemente são encontrados em produtos lácteos e preocupam a indústria de alimentos por sua capacidade de formação de biofilme em superfícies de aço inoxidável. Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus são patógenos Gram positivos encontrados em produtos lácteos e, neste estudo, a capacidade de formação de biofilme monoespécie e multiespécies em superfície de aço inoxidável a 25ºC em diferentes substratos foram avaliadas. A formação de biofilmes foi verificada pela técnica da contagem em placas nos tempos 6h, 24h, 48h, 96h, 168h e 220h. Os cupons de aço inoxidável (AISI 304) foram colocados em diferentes substratos, caldo infusão de cerebro e coração (BHI), soro de leite e leite desnatado, inoculados com aproximadamente 103 UFC/ml de patógenos de origem láctea. Os micro-organismos avaliados foram capazes de formar biofilmes monoespécie e multiespécies, com contagens de até 7 log UFC/cm2. Foi observado maior esporulação do B. cereus em caldo BHI e leite desnatado, quando comparado com soro de leite. E. faecalis apresentou maior crescimento quando em biofilme multiespécies e quando em monoespécie maior equilíbrio entre os diferentes substratos. Por outro lado, S. aureus, B. cereus e L. monocytogenes quando em biofilme multiespécies no soro de leite, apresentaram pouco crescimento, sendo que L. monocytogenes apresentou o mesmo padrão de comportamento também no leite desnatado Abstract: Pathogens that cause food-borne diseases are often found in dairy products and are concerned about the food industry for their ability to form biofilm on surfaces of stainless steel. Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus are pathogens Gram-positive found in milk products and, in this study, the ability to form biofilm highly industrialized and single-species fishing and multi-species in stainless steel surface at 25C in different substrates were evaluated.The formation of biofilms was verified by the technique of counting cards in time 6h, 24h, 48h, 96h, 168h and 220H. The coupons of stainless steel (AISI 304) were placed in different substrates, broth brain heart infusion (BHI), whey and skimmed milk, inoculated with approximately 103 CFU/ml of pathogens of dairy origin. The microorganism, were capable of forming biofilms highly industrialized and single-species fishing and multi-species, with counts of up to 7 log CFU/cm2. There was a higher sporulation of B. cereus in BHI broth and skimmed milk, when compared with whey. E. faecalis showed greater growth when in multi-species biofilm and when in highly industrialised and single-species fishing greater balance between the different substrates. Moreover a reduction of S. aureus, B. cereus and L. monocytogenes was observed in the presence of the in multi-species biofilm in whey, showed little growth, and L. monocytogenes presented the same pattern of behavior also in skimmed milk Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CAPES

Orientador: José Luiz Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Staphylococcus são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais suas principais fontes. A contaminação cruzada após a pasteurização do leite, especialmente por manipulação inadequada, é apontada como a mais importante forma de contaminação dos derivados do leite por estes patógenos, que são importantes em alimentos devido à sua habilidade de produzir uma grande quantidade de proteínas extracelulares (enterotoxinas) que, se pré-formadas no alimento e ingeridas, causam a intoxicação estafilocócica. Apesar da legislação brasileira (RDC 12/2001, Anvisa) preconizar apenas a contagem de Staphylococcus coagulase positiva, relacionando a produção da coagulase com o risco de produção de enterotoxinas, já foi comprovado que espécies coagulase negativas também são capazes de produzir enterotoxinas nos alimentos. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: i) quantificar e analisar a presença de Staphylococcus coagulase positiva e negativa em 104 amostras de derivados lácteos, sendo 24 de sorvete artesanal, 20 de creme de leite pasteurizado, 20 de patê à base de queijo, 20 de queijo Minas frescal e 20 de queijo Minas meia cura; ii) identificar fenotipicamente as espécies isoladas; iii) avaliar a produção de enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE) in vitro pelo sistema VIDAS e relacionar os resultados obtidos com a presença de possíveis genes codificadores destas enterotoxinas, pela aplicação da técnica de PCR. Os valores médios de contagens preliminares nos diferentes grupos de alimentos analisados foram: 5 x 103 UFC/g em sorvete, 2,9 x 105 UFC/g em creme de leite, 6,2 x 103 UFC/g em patê, 6,6 x 105 UFC/g em queijo Minas frescal e 6,4 x 105 UFC/g em queijo Minas meia cura. Do total de isolados, 83,6% (148/177) foram classificados como sendo do gênero Staphylococcus e 16,4% (29/177) como Micrococcus. Staphylococcus foram isolados de 43,3% (45/104) das amostras, sendo detectados em 25 amostras de queijos, em 16 sorvetes, em 3 patês e em apenas 1 amostra de creme de leite. Entre os isolados de Staphylococcus, 74,3% (110/148) eram coagulase negativa e 25,7% (38/148) eram coagulase positiva recuperados apenas nas amostras de queijos. Dos 111 isolados selecionados (27 coagulase positiva e 84 coagulase negativa), foram identificadas 13 espécies através do sistema API-Staph (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas clássicas, foi utilizado o kit (bioMérieux-SA). Dos?imunoenzimático ViDAS SET ¿Staph enterotoxin¿ 111 isolados, apenas um (0,9%) produziu enterotoxina, sendo este identificado como S. aureus, coagulase positiva, isolado a partir de queijo Minas meia cura, cuja contagem foi de 1,9 x 106 UFC/g. Ao contrário do esperado, não foram detectados genes codificadores das 5 enterotoxinas em nunhum dos isolados analisados. Discrepâncias entre resultados de testes fenotípicos e genotípicos para detecção de enterotoxinas são comuns, sendo necessária a realização de outros testes imunológicos e moleculares para confirmação destes resultados. Possíveis justificativas seriam a existência de variações nas sequências dos genes do isolado ou a presença de uma toxina que possui reação imunológica cruzada com as enterotoxinas clássicas. Neste estudo, apesar da quase totalidade dos isolados não terem produzido enterotoxinas clássicas, havia um número bem elevado de Staphylococcus em diversos produtos analisados, não excluindo um possível risco de produção das demais enterotoxinas já descritas e demonstrando a falta de cuidados higiênico-sanitários e de boas práticas durante a produção e comercialização destes alimentos Abstract: Staphylococcus are microorganisms widespread in nature and humans and animals are their main sources. Cross-contamination after milk pasteurization, caused especially by improper handling, is considered the most recurrent source of dairy products contamination by these pathogens. Staphylococus deserves our close attention due their ability to produce a large amount of extracellular proteins (enterotoxins), that if preformed in food and ingested, cause staphylococcal food poisoning. Although the Brazilian legislation (RDC 12/2001, Anvisa) only recommends coagulase-positive staphylococci count monitoring (relating coagulase production to the risk of enterotoxins production), previous researches showed that coagulase-negative species are also capable of producing enterotoxins in foods. Thus, this research aimed: i) to quantify and analyze the presence of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci from 104 dairy products samples, being: 24 homemade ice cream, 20 pasteurized dairy cream, 20 cheese pate, 20 Minas fresh cheese, and 20 Minas half cured cheese; ii) to identify phenotypically the species; iii) to evaluate the production of classic enterotoxins (SEA, SEB, Sec1, 2.3, SED and SEE) in vitro by using VIDAS system and correlate the results to the presence of possible coding genes of these enterotoxins, applying the PCR technique. The average staphylococcal preliminary count values in different food groups analyzed were: 5 x 103 CFU/g in ice cream, 2,9 x 105 CFU/g in dairy cream, 6,2 x 103 CFU/g in pate, 6,6 x 105 CFU/g in Minas fresh cheese and 6,4 x 105 CFU/g in Minas half cured cheese. From isolated strains, 83,6% (148/177) were classified as genus Staphylococcus and 16,4% (29/177) as Micrococcus. Staphylococcus were isolated from 43,3% (45/104) of samples, being found in 25 cheese samples, in 16 ice creams, in 3 pates and in just one dairy cream sample. Among staphylococcal strains, 74,3% (110/148) were coagulase-negative Staphylococcus and 25,7% (38/148) were coagulase-positive Staphylococcus, being these recovered only from cheeses samples. On 111 selected isolates (27 coagulase-positive and 84 coagulase-negative), were identified 13 staphylococcal species by using API-Staph system (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. For classical staphylococcal enterotoxins detection was used VIDAS SET Staph- Enterotoxin immunoassay kit (bioMérieux-SA). From 111 isolates, just one (0,9%) produced enterotoxin, which was identified as S. aureus, coagulasepositive, isolated from Minas half cured cheese, whose count was 1,9 x 106 CFU/g. Contrary to expectations, no coding genes were present in isolates analyzed. Discrepancies between phenotypic and genotypic results of enterotoxin detection tests are common, requiring the application of other immunological and molecular tests for the confirmation of the results. Possible explanations would be that there are genes sequences variations or another enterotoxin that has immunological cross-reaction with classic enterotoxins. For this research, although the higher number of the isolates did not produce classical enterotoxins, the analyzed samples showed high staphylococcal concentration, that do not exclude a newly described enterotoxins risk production. It also demonstrates the lack of hygiene, health care and good practices during the production and commercialization of dairy products Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O leite cru é a base para a formulação de diversos produtos, o que torna o microbioma inicial a principal preocupação da cadeia láctea. As bactérias que permanecem nas fábricas de leite ultra alta temperatura (UAT) influenciam os parâmetros já estabelecidos para o processamento em laticínios, tais como o tempo, temperatura, tratamentos de inativação bacteriana e etapas de limpeza. Embora o tratamento UAT seja capaz de eliminar a maioria das células vegetativas, bacilos esporulados geralmente permanecem em superfícies abióticas, principalmente porque se aderem facilmente ao aço inoxidável. Neste contexto, o trabalho inicial desta tese foi coletar dados sobre a diversidade de bactérias aeróbias formadoras de esporos em leite UAT comercializado no Brasil, explorando 100 amostras (leite desnatado e integral). Foi possível identificar 12 Bacillus cereus que foram isolados de 7 amostras, 38 Bacillus sporothermodurans de 19, e 47 Geobacillus stearothermophilus de 27 amostras. Em seguida observamos a motilidade e formação de biofilme em microplacas após 24 horas. A maioria dos isolados foi capaz de formar biofilmes e os valores em densidade ótica OD595 na formação de biofilme variaram de 0,14 a 1,04 para B. cereus, 0,20 a 1,87 para B. sporothermodurans, e 0,49 a 2,77 para G. stearothermophilus. Na próxima etapa, focamos em entender como é a formação de biofilme de B. sporothermodurans sobre aço inoxidável durante o período de 10 dias. A adesão e formação de biofilme foram comparadas em diferentes condições quando expostas às proteínas do leite (soro e caseína). Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizado para avaliar arquitetura do biofilme em aço inoxidável e o espectroscopia de fotoemissão por raio-X (XPS), como técnica complementar, sondou o condicionamento da superfície do substrato após 24 h. As proteínas afetaram a contagem bacteriana total nos biofilmes e influenciaram a arquitetura do biofilme. Assim, este é o primeiro trabalho sobre ciclo de vida do biofilme B. sporothermodurans sob a influência das proteínas do leite (soro de leite e caseínas). Por fim, tratamentos enzimáticos e químicos foram avaliados como estratégia para prevenir e reduzir o impacto prejudicial desses biofilmes na indústria de laticínios. Esses tratamentos enzimáticos e químicos foram eficazes na redução de biofilmes de B. sporothermodurans. Os dados obtidos nesta tese evidenciam que as indústrias de laticínios precisam controlar a qualidade da matéria prima, a eficiência dos processos térmicos e dos procedimentos de limpeza e sanitização; reduzindo a contaminação do produto e evitando a formação de biofilme e, consequentemente, uma microbiota persistente nas plantas de processamento, que podem abrigar espécies patogênicas como B. cereus s.s. Abstract: Raw milk is the basis for the formulation of several products, which makes the initial microbiome the primary concern in the dairy chain. The bacteria that remain in the ultra-high temperature (UHT) milk plants influence the parameters already established for processing, such as time, temperature, bacterial inactivation treatments and cleaning steps. Although the UHT treatment is able to eliminate most vegetative bacteria cells, aerobic spore-forming bacilli commonly remain on abiotic surfaces, mainly because they easily attach on stainless steel. In this context, the initial work of this thesis was to collect data on the diversity of spore-forming bacteria in UHT milk sold in Brazil, exploring 100 samples (skimmed and whole milk). It was possible to identify 12 Bacillus cereus which were isolated from 7 samples, 38 Bacillus sporothermodurans from 19, and 47 Geobacillus stearothermophilus from 27 samples. Then, the study observed the motility and biofilm formation in microplates for 24 hours. Most isolates were able to form biofilms and the OD 595 values observed for biofilm formation varied from 0.14 to 1.04 for B. cereus, 0.20 to 1.87 for B. sporothermodurans, and 0.49 to 2.77 for G. stearothermophilus. In the next step, we were focused on understanding how is the biofilm formation of B. sporothermodurans on stainless steel during 10 days. The adhesion and biofilm formation were compared in different conditions when exposed to milk proteins (whey and casein). Scanning electron microscopy (SEM) was used to evaluate the biofilm architecture on stainless steel and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as a complementary technique, probed the surface substrate conditioning after 24 h. The proteins affect the total bacterial count in the biofilms and they influence the biofilm architecture. This study is the first life cycle report of the B. sporothermodurans biofilm under the influence of milk proteins (whey and caseins). Finally, enzymatic and chemical treatments have been evaluated as a strategy to prevent and reduce the harmful impact of these biofilms in the dairy industry. These enzymatic and chemical treatments were effectives on reduction of B. sporothermodurans biofilms. The data obtained in this thesis show that the dairy industry needs to quality control of the raw material,and in the cleaning and sanitization procedures,reducing the contamination of the product and avoiding the formation of biofilm and, consequently, a persistent microbiota in processing plants, which can shelter pathogenic species such as \textit{B. cereus s.s.}. Doutorado Ciência de Alimentos Doutora em Ciência de Alimentos CAPES 1553852/2015

Orientador: Dirce Yorika Kabuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: "Aeromonas" spp. são considerados patógenos emergentes, podendo causar, entre outras doenças, gastroenterites. Sua principal rota de transmissão é a água, porém diferentes tipos de alimentos podem ser veículos para sua disseminação. O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a presença de "Aeromonas" em alimentos prontos para o consumo. Foram avaliadas amostras de queijo, frutas minimamente processadas e temakis. Como objetivo específico foi verificada a ocorrência das espécies "A. hydrophila", "A. caviae" e "A. veronii", identificadas através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), que posteriormente foi comparada com a técnica de espectrometria de massas com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF/MS). Avaliou-se também o potencial patogênico dos isolados através da detecção dos genes codificadores dos fatores de virulência: aerA, codificador da aerolisina; hlyA, codificador da hemolisina HlyA; e act, alt e ast codificadores, respectivamente, das enterotoxinas Act, Alt e Ast através de PCR; e verificou-se o perfil de resistência aos antimicrobianos: cefepima, ceftazidima, aztreonam, ciprofloxacino, levofloxacino, tetraciclina, amoxicilina-ácido clavulânico e imipenem pelo método de disco-difusão. "Aeromonas" sp. foi isolada de 66,77% (20/30) das amostras de temakis, 3,23% (1/31) das de frutas minimamente processadas e em nenhuma (0/30) das de queijo. Entre os isolados a prevalência foi de 26,39% de A. caviae, 20,83% de A. hydrophila, 8,34% de A. veronii e 44,44% foram classificadas como Aeromonas sp (outras espécies não identificadas). As contagens variaram de menor do que 1,0x102 a 2,6x105UFC. g-1. Entre os genes de virulência analisados, aerA apresentou a maior frequência ocorrendo em 47,2% (34/72) dos isolados, seguido de act em 41,7% (30/72), os genes hlyA e alt apresentaram se em 38,9% (28/72) e o gene ast em 18,1% (13/72). A. hydrophila foi a espécie que apresentou todos os genes ao mesmo tempo, considerado, assim, a mais virulenta. Os isolados apresentaram 90 % de resistência a amoxicilina-ácido clavulânico, 17% a tetraciclina, 10% ao imipenem e 3% ao aztreonam. Os resultados obtidos através da comparação da identificação por Maldi-TOF/MS com a PCR para as espécies A. caviae, "A. hydrophila" e "A. veronii" obtiveram correspondência de 92,86%, 84,62% e 83,33%, respectivamente. Estes resultados demonstraram que os temakis são veiculadores de Aeromonas spp. potencialmente patogênicas, devido à ocorrência em altas contagens e apresentação de fatores de virulência e devem ser evitados por crianças, idosos, grávidas e pessoas imunocomprometidas Abstract: "Aeromonas" spp. are considered emerging pathogens and can cause, among other diseases, gastroenteritis. Its main route of transmission is water, but different foods can be vehicles for its dissemination. The present work aimed to evaluate the presence of "Aeromonas" in ready-to-eat foods. Samples of cheese, minimally processed fruits and temakis were evaluated. As a specific objective, the occurrence of the species "A.hydrophila", "A.caviae" and "A.veronii" was identified, through the polymerase chain reaction (PCR) technique, which was later compared with the matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) technique. The pathogenic potential of the isolates was also evaluated by detecting the genes encoding virulence factors: aerA, aerolysin coder; hlyA, hemolysin encoder HlyA; and act, alt and ast encoding, respectively, the Act, Alt and Ast enterotoxins by PCR; and the antimicrobial resistance profile was verified: cefepime, ceftazidime, aztreonam, ciprofloxacin, levofloxacin, tetracycline, amoxicillin-clavulanic acid and imipenem by disk-diffusion method. "Aeromonas" sp. was isolated from 66.77% (20/30) of the samples of temaki, 3.23% (1/31) of the minimally processed fruits and in none (0/30) of the cheese. Among the isolates, the prevalence was "A. caviae" (26.39%), "A.hydrophila" (20.83%), "A.veronii" (8.34%) and 44.44% were classified as "Aeromonas" sp. (other unidentified species). Counts ranged from less than 1.0X102 to 2.6X105 UFC.g-1. Among the virulence genes analyzed, aerA presented the highest frequency, occurring in 47.2% (34/72) of the isolates, followed by act in 41.7% (30/72), the hlyA and alt genes were found in 38,9% (28/72) and the ast gene in 18.1% (13/72). A. hydrophila was the species that presented all the genes at the same time, considered, thus, the most virulent. The isolates showed 90% resistance to amoxicillin-clavulanic acid, 17% to tetracycline, 10% to imipenem and 3% to aztreonam. The results obtained by comparing the identification by MALDI-TOF/MS with PCR for the species "A. caviae", "A. hydrophila" and "A. veronii" obtained correspondence of 92.86%, 84.62%, 83.33%, respectively. These results demonstrated that the temakis are carriers of "Aeromonas" spp. potentially pathogenic, due to the occurrence in high counts and presentation of virulence factors and should be avoided by children, the elderly, pregnant women and immunocompromised people Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos CNPQ 130031/2018-6 CAPES 88887.485460/2020-00