Search

In this thesis, the structures of proteins involved in carbon fixation by enzymes of the 3 hydroxypropionate (3 HP) cycle of Chloroflexus aurantiacus, and the acetone carboxylase from Xanthobacter autrophicus were investigated. The crystal structures of C-terminal and N-terminal domains of malonyl CoA reductase, and mesaconyl C1-CoA hydratase were solved. Preliminary structural information was obtained for mesaconyl-CoA transferase and mesaconyl-C4-CoA hydratase, the right-hand side 3 HP cycle enzymes. The mechanism of 3 HP formation from malonyl CoA, catalysed by malonyl CoA reductase was studied using ligand bound structures, site-directed mutagenesis, and kinetics. The ATP dependent acetone carboxylation mechanism was examined structurally. Acetone carboxylase was natively purified from Xanthobacter autotrophicus and the AMP and acetate bound structure was determined at 1.9 Å. This thesis has applications in the biotechnology of carbon fixation. Open Access

Bu çalısmanın amacı, genelde sulu ortamda yapılan biyokatalizlemenin organikçözücü ortamlarında kullanılabilirliginin arastırılmasıdır. Tutuklanmıs bir lipaz olanNovozym 435 ile çalısılmıstır. Model substrat olarak bir trigliserit olan tribütirinseçilmistir. Novozym 435 ile tribütirin hidrolizi ve tribütirinin transesterlesme veinteresterlesme tepkimeleri incelenmistir.Hidroliz kısmında, tribütirinin suda çözünür halde ve emülsiyon halinde hidroliziincelenmis, optimum pH, 7.0, optimum sıcaklık, 50 oC, optimum karıstırma hızı,300 rpm, optimum enzim derisimi, 100 mg tutuklanmıs enzim/30 mL tepkimehacmi olarak belirlenmistir. Enzim aktivitesi, tribütirinin hem çözünür halde hem deemülsiyon halinde oldugu durumda, Michaelis&Menten kinetigine uygun davranısgöstermis, Michaelis&Menten parametreleri, Vm, 0.425 ?mol BA/(mg E.dak), Kmise, 15.736 mM olarak saptanmıstır. Novozym 435' in isletme kararlılıgınıincelemek için tutuklanmıs enzim tepkime sonrası süzülüp tekrar aynı tepkimesartlarında kullanılmıs, enzim aktivitesi 6 kullanım sonrasında yaklasık % 60oranında düsmüstür. Hidroliz tepkimesi ortamına katılan organik çözücülerinhidroliz hızını düsürdügü tespit edilmistir. Ancak, hidrofobiklik ile hidroliz hızıarasında dogrudan bir baglantı kurulamamıstır.Tribütirinin metanol ile transesterlesme ve metil asetat ile interesterlesmetepkimesi aynı anda gerçeklestirilmis ve metanol ile beraber metil asetatkullanımının yararları arastırılmıstır. % 100 fazla miktarda (1:6 mol oranında)metanol-metil asetat karısımı kullanımının enzim aktivitesinde negatif bir etkiyapmadıgı görülmüstür. Tribütirin derisimi arttıkça baslangıç tepkime hızıazalmıstır. Dolayısıyla tribütirin yüksek derisimlerde inhibisyona neden olmaktadır.Tribütirin derisimi, sitokiyometrik oranın (1:3 mol oranı) üzerinde kullanıldıgıdurumda, enzim aktivitesini düsürmektedir. Tribütirin ve metanol-metil asetat içinMichaelis-Menten sabitleri (Km) sırasıyla 0.1 M ve 50 M olarak hesaplanmıs,tribütirinin yarı yarısmalı substrat inhibisyonu yaptıgı belirlenerek, tribütirininhibisyon sabiti, KSI, 22.42 M olarak bulunmustur. Deneysel veriler substratinhibisyonlu ping-pong bi-bi mekanizması sonucunda çıkarılan kinetik modelleuyum göstermektedir. Yarı-sürekli sistemde akıskan yatakta düsük enzimyüzdesiyle (% 1) % 90' lara varan dönüsümler gözlenmistir. Akıs hızı arttıkçadönüsüm azalmıstır.Anahtar kelimeler : Lipaz, hidroliz, transesterlesme (transesterifikasyon), organikçözücü, ping-pong bi-bi mekanizması. The aim of this study is to investigate the applicability of biocatalysis in organicsolvent media rather than aqueous media. An immobilized lipase, Novozym 435,and a triglyceride, tributyrin as a model substrate were used. Tributyrin hydrolysisand transesterification / interesterification reactions by Novozym 435 wereinvestigated.Hydrolysis reactions for both solution and emulsion of tributyrin were observed,and optimum pH, 7.0, optimum temperature, 50 oC, optimum mixing rate, 300 rpm,optimum enzyme concentration, 100 mg immobilized enzyme/30 mL weredetermined. The enzyme activity obeyed the Michaelis&Menten kinetics for boththe solution and emulsion systems. Michaelis&Menten parameters weredetermined as, Vm, 0.425 ?mol BA/(mg E.min), Km, 15.736 mM. The operationalstability of Novozym 435 was investigated, and the enzyme activity decreased by60 % after 6 batch uses. The organic solvents added to the reaction mediadecreased the hydrolysis rate. However, there is no correlation between thehidrophobicity of organic solvents and hydrolysis rate.Transesterification reaction by methanol and interesterification reaction by methylacetate were performed simultaneously, and the advantages of using methylacetate with methanol were investigated. It was observed that 100 % excessamount (1:6 mole ratio) of methanol-methyl acetate makes no negative effect onthe enzyme activity. The initial reaction rate decreases as the tributyrinconcentration increases. Consequently, tributyrin causes an inhibition at highconcentrations. When the tributyrin concentration was used above thesitoichiometric ratio (1:3 mole ratio), it decreased the activity of enzyme. Michaelis-Menten parameters (Km) for tributyrin, and methanol-methyl acetate werecalculated as 0.1 M and 50 M, respectively. Uncompetitive substrate inhibitionconstant for tributyrin was determined as 22.42 M. Experimental results werefound to correlate well with the results of kinetic model according to the ping-pongbi-bi mechanism. High conversions up to 90 % were observed in semi-continuousfluidized bed with low enzyme levels (1 %). Conversions decreased withincreasing flow rates. Conversions decreased with increasing flow rates.Key words : Lipase, hidrolysis, transesterification, organic solvent, ping-pong bibimechanism. 97