Search

Amaç: İmplant materyallerinin hücre canlılığı ve hücre adezyo-nu üzerindeki in vitro etkilerinin değerlendirilmesi, implantların biyo-uyumluluklarının tahmin edilmesi yönünde değerli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, basit ve maliyetli olmayan bir yöntem kul-lanılarak, farklı yüzey özelliklerine sahip implantların hücre canlılığı ve adezyonunu etkileyip etkilemeyeceğinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Farklı diş implant yüzeylerinin (anotlanmış (AN), patlatılmış buruşuk (BW), kum/asitle aşındırılmış (GA), püs-kürtülmüş hidroksi apatit yüzey (HB)) yapışma ve canlılık üzerin-deki etkileri, adherent insan osteoblast hücre soyunda agar bazlı bir in vitro teknik kullanılarak karşılaştırılmıştır. Hücre canlılıklarının belirlenmesinde, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) ve tripan mavisi boyama teknikleri uygulanmıştır. Bulgular: Hücre adezyonunun, dental implantların yüzey özellik-lerindeki farklılıklardan önemli ölçüde etkilenmediği görülmüştür (AN: 78,21±0,52; BW: 78,22±0,48; GA: 78,44±0,85; HB: 77,26±0,96). Ancak, diş implantlarının yüzey özelliklerinin, implantlara tutunan hücrelerin canlılığı üzerinde etkisi olduğu tespit edilmiştir. Tutu-nan hücrelerin canlılığının, HB yüzeyine kıyasla AN, BW, GA yüzeylerinde anlamlı olarak daha yüksek olduğu bulunmuştur (AN: 72,28±6,04, BW: 67,02±3,47, GA: 85,82±5,05 ve HB: 27,98±10,47).Sonuçlar: Çalışma kapsamında yapılan in vitro deneylerden elde edilen bulgular; AN, BW, GA yüzeylerinin adherent hücrelerin canlı-lığını korumaları için HB yüzeylerinden daha iyi bir platform sağla-yabileceğini göstermektedir., Objective:In vitro evaluation of implant materials' effects on cell adhesion and viability can provide useful information for predict-ing implant biocompatibility. Therefore by using a simple and in-expensive method, it was aimed to investigate whether different implant surface-features might have distinct effects on the viabili-ty and adherence of the cells. Material and Methods: Different dental implant surfaces (anod-ized (AN), blasted wrinkled (BW), grit/acid etched (GA), and hy-droxylapatite sprayed (HB)) were tested for their possible effects on adhesion and viability of the adherent human osteoblast cells by using an agar-based in vitro technique. Viability of the cells was assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and trypan blue staining.Results: The rate of cell adhesion did not seem to be significantly affected by the differences in surface features of dental implants (AN:78.21±0.52; BW:78.22±0.48; GA:78.44±0.85; HB:77.26±0.96). The surface features of the dental implants had an impact on the viability of the attached cells on the implants. Viability of the at-tached cells was significantly higher on AN, BW, GA surfaces when compared to the HB surface (AN: 72.28±6.04, BW: 67.02±3.47, GA: 85.82±5.05, and HB: 27.98±10.47). Conclusions:In vitro findings suggests that AN, BW, GA surfaces may provide a better platform than HB surfaces to maintain the viability of bound cells.

Memeli hücrelerinde önemli fizyolojik olayların düzenlenmesinde rol oynadığı bilinen nitrik oksidin (NO) memeliler dışında, prokaryotlardan gelişmiş yapılı ökaryotlara kadar çok çeşitli canlı türünde de bazı fizyolojik işlevleri üstlenebildiği ve bu organizmalarda nitrik oksit sentazınkine (NOS) benzer aktivite göstererek NO oluşumunu katalizleyen enzimlerin varlığı gösterilmiştir. Moleküler düzeydeki özellikleri bakımından memeli hücrelerine benzerlik gösterdiği için uygun bir model organizma olarak kabul edilen Schizosaccharomyces pombe maya türünde ise NOS aktivitesinin varlığı bilinmemekte ve NO'nun fizyolojik işlevleri hakkında çok sınırlı bilgi bulunmaktadır.Bu çalışmada, S. pombe'de NOS aktivitesinin var olup olmadığının belirlenmesi, eğer aktivite varsa anlatımları hücre içi NO konsantrasyonundaki artma ve azalma şeklindeki değişimlere duyarlı olan genlerin saptanması ve bu genlerin işlevlerinden yola çıkılarak NO'nun bazı fizyolojik olayların düzenlenmesinde sinyal molekülü olarak etki gösterip gösteremeyeceğinin araştırılması amaçlandı.Çalışmada, spektrofluorometrik bir yöntemle S. pombe ham hücre özütlerinde NOS'unkine benzer aktivitenin varlığı ilk kez gösterildi. Anlatımları hücre içi NO düzeyindeki değişimlere duyarlı olabilen genlerin saptamasına yönelik olarak, farklılık gösterimi tekniği ile NOS engelleyicisi olan NG-nitro-L-arjinin metil ester (L-NAME) etkisinde bırakılan hücrelerde anlatımları azalan veya duran, NO vericisi olan sodyum nitropurissid (SNP) uygulamasıyla da anlatımları artan cDNA'lar belirlendi. Nükleotid dizilemeleri yapılan cDNA'ların, S. pombe genom veri tabanında gerçekleştirilen BLAST analizleriyle PBC17A3.09c, SPCC553.12c, byr1, pek1, sid1, wis1, ppk14 ve ubp12 genlerine benzerlik gösterdikleri saptandı. Bu genlerden pek1, sid1 ve ubp12'nin NO düzeyindeki değişimlere yanıt olarak anlatımlarında gözlenen değişimler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle kantitatif olarak doğrulandı.pek1, sid1 ve ubp12 genlerinin bilinen işlevleriyle ilişkili olarak yapılan morfolojik ve fizyolojik düzeydeki bazı denemeler, NO'nun S. pombe'de mitoz bölünme, mayoz bölünme, spor oluşumu, programlı hücre ölümü ve hücre bütünlüğünün korunması gibi işlevlerin düzenlenmesinde rol oynayabileceğini işaret etti. Ayrıca, elde edilen bulgular NO'nun genel olarak hücre bölünmeleri ve stres yanıtı ile ilişkili etkilerinin MAPK sinyal yolundaki bazı bileşenlerin uyarılması aracılığıyla meydana gelebileceğini düşündürdü. Ek olarak, S. pombe'de NO'ya duyarlı olduğu belirlenen bu genlerin memelilerdeki homologlarının da benzer işlevlere sahip olmaları, bu mayanın NO'nun hücrelerdeki moleküler düzeydeki etkilerinin araştırılmasında uygun bir model sistem olarak kullanılabileceğini ortaya koydu. Nitric oxide (NO) which is known to play important regulatory roles in various physiological processes in mammals is also shown to have some phsysiological functions in broad range of species other than the mammals, and nitric oxide synthase (NOS) like enzymes catalyzing NO production were found in these organisms. Presence of NOS activity has not been reported to date in Schizosaccharomyces pombe which is believed to be a convenient model organism since it shares a number of characteristic similarities with the mammalian cells at the molecular level, and very little is known about the phsysiological roles of NO in this yeast species.In this study, we firstly aimed to find out whether S. pombe cell extracts had NOS activity, then in order to detect the genes which are sensitive to both decreased and elevated intracellular NO levels. We also aimed to investigate if NO could function in regulation of some phsyiological processes as a signaling molecule in relation with the cellular functions of NO sensitive genes to be detected in S. pombe cells.NOS like activity was detected in the S. pombe crude cell extracts for the first time using a spectrofluorometric NOS assay. In order to detect the NO responsive genes, the cDNAs whose expression ratios decreased or repressed upon exposure to a NOS inhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), and elevated in response to a NO donor sodium nitroprusside (SNP) treatment were determined by employing differential display technique. BLAST analysis of the differentially expressed cDNAs sequences, performed in S. pombe genome database, produced significant similarities to PBC17A3.09c, SPCC553.12c, byr1, pek1, sid1, wis1, ppk14 and ubp12 genes of S. pombe. pek1, sid1 and ubp12 genes were quantitatively confirmed to be sensitive to the changes in the intracellular NO levels by employing real time polymerase chain reaction.The data obtained from the experiments regarding the functions of pek1, sid1 and ubp12 genes addressed to the possibility that NO could have some regulatory roles in mitosis, meiosis, sporulation and apoptosis in S. pombe. Moreover, it may also be possible to suggest that the effects of NO on cell divisions and stress response pathways in this yeast are exerted through activation of some MAPK signaling pathway components. In addition, these findings may also imply that S. pombe can be used as a convenient model system for investigating the cellular effects of NO at the molecular level, as the NO responsive genes detected in S. pombe share similar functions with those of the mammalian homologs. 149

ÖZET Schizosaccharomycespombe'de İnvertaz Aktivitesine İlişkin Çalışmalar Bu çalışmada Schizosaccharomyces pombe'de, karbohidrat metabolizmasının düzenlenmesi süreciyle ilişkili olarak, sukrozun monomerlerine ayrılmasını kataliz eden invertaz enzimini şifreleyen gen(ler)in anlatımının glukoz baskılaması ile düzenlenmesi konusunda ön bilgiler sağlanması hedeflendi. Bu amaçla yapılan çalışmalar kapsamında öncelikle invertaz sentezini baskılayan (>% 2) ve baskılamayan (% 0.1) glukoz konsantrasyonları saptandı. Ayrıca diploid ve haploid hücrelerde yapılan analizlerde gen dozajının, invertaz sentezi açısından, glukoz baskılamasına karşı verilen yanıtta etkili olmadığı belirlendi. Mutasyon çalışmalarında 1 saatlik etilmetansulfonat (EMS) (% 3) uygulamasının ardından 2-deoksi-D-glukoz (2-DOG)'a karşı dirence göre yapılan seleksiyonla katabolit represyona dirençli olan 14 adet konstitütif invertaz mutantı (gdi/-/4) (glukoz-baskılamasına dirençli mvertaz mutantı) elde edildi. Mutantların hepsinin yabani tipe göre resesif olduğu ve biyosentez yollarına ilişkin mutasyon taşımadıkları saptandı. Hücre morfolojileri bakımından büyük çoğunluğu yabani tipe benzeyen mutantların bazılarında yalancı hif benzeri yapılar ve anormal hücre şekilleri gözlendi. Baskılayıcı ve baskılama yapmayan glukoz konsantrasyonlarında yapılan kantitatif invertaz aktivitesi tayinlerinde mutantlar, baskılamaya karşı gösterdikleri direnç derecelerine göre 3 grup altında toplandı. Bu gruplardan seçilen birer temsilciyle yapılan çalışmalarda, glukoz ve sukroz içeren sıvı besi ortamlarında mutantların yabani tipe göre daha yavaş ürediği gözlendi. Glukoz içeren besi ortamında mutantlara ait kültürlerdeki üreme profilleri birbirine paralellik gösterirken, sukroz içeren ortamdaki üreme eğrileri bakımından kendi aralarında farklılıklar olduğu bulundu. Ayrıca maltozu kullanma yetenekleri açısından da değerlendirilen mutantların, 2-DOG'a direnç dereceleri bakımından kendi aralarında farklılıklar gösterdiği saptandı. Bununla birlikte mutantlarda maltoz ve sukrozun kullanımındaki katabolit represyona direnç derecelerinin paralellik göstermediği belirlendi. Elde edilen bulguların çeşitli kaynaklardaki sonuçlarla da irdelenmesiyle, mutantlarda alternatif karbon kaynaklarının kullanımına ilişkin genel düzenleme aşamalarına ilişkin mutasyon(lar) yerine özgül olarak invertaz sentezinin düzenlenmesinde rol oynayan gen(ler)de meydana gelmiş ve büyük olasılıkla birden fazla farklı mutasyonun olabileceği şeklinde yorumlandı. VIII SUMMARY Studies on the Invertase Activity in Schizosaccharomyces pombe In this study we aimed to gain some prelimenary information about the regulation of the invertase (catalysing the hydrolysis of sucrose to its' monomers) gene(s) expression by catabolite repression, which is also involved in the regulation of carbohydrate metabolism, in Schizosaccharomyces pombe. Glucose concentrations that causes repression (> % 2) and derepression (% 0. 1 ) of invertase synthesis have been determined at the first stage. We have also shown that gene dosage had no effect on the response to catabolite repression in terms of invertase synthesis. We have isolated 14 constitutive invertase mutants (gdi 1 -14) (glucose- repression resistant invertase mutants) resistant to catabolite repression. The selection was made on the basis of 2-deoxy-D-glucose (2-DOG) resistance, following EMS (% 3, 1 hour) mutagenesis. All of the mutants were found to be recessive for the wild type and none of the mutants have failed to grow on minimal agar indicating that they had no defects with the biosynthetic pathways. Some of the mutant cells, though most of them resemble to that of wild type, posessed abnormal cell morphology and pseudo-hyphaeal formations. Quantitative invertase assays performed either in repressing and derepressing conditions have lead us to categorize the mutants in 3 different groups according to their levels of resistance to repression. One representative for each group has been chosen and further studies were carried on with them. We have observed that mutant cell cultures have grown slower than the wild type on media containing glucose or sucrose. Although the growth profiles of the representative mutant cultures were found to be parallel with each other on glucose, their growth curves showed considerable differences when sucrose had been used as a carbon source. When the mutants have been tested for their ability to use maltose, we have observed that mutant cells had different levels of resistance to 2-DOG regarding their maltase activity. We have also determined that the levels of resistance to 2-DOG in mutants were not parallel for the utilization of maltose and sucrose. In the light of other similar studies, these findings have lead us to conclude that there might have been more than one mutation that are exclusively involved in the regulation of invertase synthesis, rather than the general regulatory mechanisms related to the utilization of alternative carbohydrate sources. IX 54