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Streptomyces species have been successfully used in diverse biotechnological processes; however, little is known about actinobacterial biofilm formation and its use as a biofilmed inoculant. The present study assessed and compared the ability of some plant growth-promoting actinobacterial strains to form biofilms on a carrier to improve microbial survival and colonize the rhizosphere and roots of Triticum aestivum, resulting in positive interactions and benefits to the plant. Forty-one actinobacterial isolates from Persea americana organic rhizosphere farms were tested on plant growth and biofilm-forming capacities, showing their potential use as bio-fertilizers in agriculture. Three Streptomyces strains were selected and tested for biofilm formation and plant growth-promoting (PGP) features. Biofilms were induced on the perlite carrier and used to inoculate seven treatments with T. aestivum in pot essays, resulting in a >200% increase in root weight and a >400% increase in total biomass. Endophytic colonization was achieved in all the treatments. Microbial survival ranged between 108 and 109 CFU/g after 12 weeks of treatment, indicating actinobacterial permanence on the carrier. Successful consortia formation was observed for mixed-strain treatments, suggesting long-term plant recolonization.

Early life stress induced by maternal separation (MS) causes neuroendocrine, behavioral, and metabolic alterations that are related to gut dysbiosis. MS also increases microglial activation and decreases neurogenesis. Whether these long-term alterations are maintained or worsened in the absence of gut microbiota remains unknown. Hence, this study evaluated the effect of MS symptomatology after antibiotic-induced microbiota depletion (AIMD) in adult rats. Control and maternally separated (3 h per day from postnatal day one to 14, MS180) rats were subjected to AIMD for one month, then assessed for behavioral, metabolic, and neuroendocrine responses. Effects of MS180 and AIMD on gut microbiota were confirmed by qPCR. The data indicate that MS180 caused a passive coping strategy in the forced swimming test and decreased hippocampal neurogenesis. In addition, fasting glucose, cholesterol, and corticosterone levels increased, which correlated with a decrease in Lactobacillus spp counts in the caecum. AIMD also increased immobility in the forced swimming test, decreased hippocampal neurogenesis, and augmented corticosterone levels. However, it had no effects on glucose homeostasis or plasma lipid levels. Furthermore, the MS180-induced long-term effects on behavior and neurogenesis were not affected by microbiota depletion. Meanwhile, the metabolic imbalance was partially reversed in MS180 + AIMD rats. These results show that AIMD mimics the behavioral consequences of MS180 but may prevent metabolic imbalance, suggesting that gut dysbiosis could be part of the mechanisms involved in the maintenance of the long-term consequences of early life stress.

Salmonella spp. is a facultative intracellular pathogen causing localized or systemic infections, involving economic and public health significance, and remains the leading pathogen of food safety concern worldwide, with poultry being the primary transmission vector. Antibiotics have been the main strategy for Salmonella control for many years, which has allowed producers to improve the growth and health of food-producing animals. However, the utilization of antibiotics has been reconsidered since bacterial pathogens have established and shared a variety of antibiotic resistance mechanisms that can quickly increase within microbial communities. The use of alternatives to antibiotics has been recommended and successfully applied in many countries, leading to the core aim of this review, focused on (1) describing the importance of Salmonella infection in poultry and the effects associated with the use of antibiotics for disease control; (2) discussing the use of feeding-based (prebiotics, probiotics, bacterial subproducts, phytobiotics) and non-feeding-based (bacteriophages, in ovo injection, vaccines) strategies in poultry production for Salmonella control; and (3) exploring the use of complementary strategies, highlighting those based on -omics tools, to assess the effects of using the available antibiotic-free alternatives and their role in lowering dependency on the existing antimicrobial substances to manage bacterial infections in poultry effectively.

Simple Summary This review is focused on describing the main available antibiotic-free strategies that may be implemented to control or reduce the impact associated with Salmonella infection in poultry. These alternatives have been cataloged in two groups: feeding-based (prebiotics, probiotics, synbiotics, postbiotics, and phytobiotics) and non-feeding-based strategies (bacteriophages, in ovo applications, and vaccines). Moreover, we highlighted the relevance of the omics as a tool to design and validate the effects and efficacy of these kinds of treatments when Salmonella control is pursued. Abstract Salmonella spp. is a facultative intracellular pathogen causing localized or systemic infections, involving economic and public health significance, and remains the leading pathogen of food safety concern worldwide, with poultry being the primary transmission vector. Antibiotics have been the main strategy for Salmonella control for many years, which has allowed producers to improve the growth and health of food-producing animals. However, the utilization of antibiotics has been reconsidered since bacterial pathogens have established and shared a variety of antibiotic resistance mechanisms that can quickly increase within microbial communities. The use of alternatives to antibiotics has been recommended and successfully applied in many countries, leading to the core aim of this review, focused on (1) describing the importance of Salmonella infection in poultry and the effects associated with the use of antibiotics for disease control; (2) discussing the use of feeding-based (prebiotics, probiotics, bacterial subproducts, phytobiotics) and non-feeding-based (bacteriophages, in ovo injection, vaccines) strategies in poultry production for Salmonella control; and (3) exploring the use of complementary strategies, highlighting those based on -omics tools, to assess the effects of using the available antibiotic-free alternatives and their role in lowering dependency on the existing antimicrobial substances to manage bacterial infections in poultry effectively.

The RNA polymerase II drives the biogenesis of coding and non-coding RNAs for gene expression. Here, we describe new roles for its second-largest subunit, NRPB2, on root organogenesis and regeneration. Down-regulation of NRPB2 activates a determinate developmental program, which correlated with a reduction in mitotic activity, cell elongation, and size of the root apical meristem. Noteworthy, nrpb2-3 mutants manifest cell death in pro-vascular cells within primary root tips of plants grown in darkness or exposed to light, which triggers the expression of the regeneration gene marker ERF115 in neighbor cells close to damage. Auxin and stem cell niche (SCN) gene expression as well as structural analysis revealed that NRPB2 maintains SCN activity through distribution of PIN transporters in root tissues. Wild-type seedlings regenerated the root tip after excision of the QC and SCN, but nrpb2-3 mutants did not rebuild the missing tissues, and this process could be genotypified using pERF115:GFP, DR5:GFP, and pWOX5:GFP reporter constructs. The levels of reactive oxygen species increased in the mutants four days after germination and strongly decreased at later times, whereas nitric oxide accumulated as the root tip differentiates. These results show the importance of the transcriptional machinery for root organogenesis, cell viability, and regenerative capacity for reconstruction of tissues and organs upon injury.

Los virus son partículas que infectan a todas las formas de vida. Los virus bacteriófagos, que infectan bacterias, fueron descubiertos antes que los antibióticos. A pesar de su tamaño pequeño, han contribuido al desarrollo científico desde hace décadas, como en el descubrimiento de numerosas enzimas con aplicaciones en la biología molecular1. En este trabajo se analizarán aspectos generales de la biología de los virus bacteriófagos, su contribución a la salud y se presentarán algunos casos exitosos de la terapia antimicrobiana usando bacteriófagos en humanos y animales. Aunque la terapia con bacteriófagos no cuenta con autorización para su uso global, ya existen formulaciones comerciales de bacteriófagos para la industria alimentaria. Se describirá el arma principal de los bacteriófagos, la endolisina, enzima que “revienta” a las bacterias. Las endolisinas se consideran una alternativa más segura que los bacteriófagos, al carecer de material genético. Los bacteriófagos y las endolisinas tienen aplicaciones revolucionarias en la medicina, como vehículos de transporte de moléculas y generación de vacunas, de fantasmas bacterianos, o en la detección diagnóstica de bacterias patógenas.

La mastitis es una enfermedad que afecta al ganado bovino lechero a nivel mundial, provocando una disminución en la calidad y cantidad de la leche producida, lo cual genera pérdidas económicas considerables. Esta enfermedad es causada por una variedad de microorganismos, entre los cuales Staphyloccocus aureus es uno de los más importantes. El objetivo del trabajo fue caracterizar 20 aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos de la glándula mamaria de vacas lactantes con mastitis en un sistema de producción de traspatio, mediante el uso de polimorfismos derivados de la amplificación al azar de ADN (RAPD’s) y su sensibilidad hacia trece antibióticos y 1 detergente. Las pruebas de sensibilidad a los 13 antibióticos demostraron que todos los aislamientos fueron resistentes a penicilina y sensibles a cefalotina, eritromicina y trimetoprim. Todos los aislamientos fueron susceptibles a una concentración menor de 6 µg/ml de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). La caracterización molecular permitió determinar que los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, presentaron una similitud superior al 90 % en el patrón de bandas obtenida por RAPD, mientras que los aislamientos SA35 y SA36 fueron idénticos, sin embargo, el resto de los aislamientos presentaron perfiles de amplificación distintos. Los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, SA35 y SA36, tuvieron patrones de resistencia a antibióticos y de RAPD similares, por lo que probablemente se trató de reaislamientos. Los aislamientos de Staphylococcus de Tarímbaro, Michoacán presentaron una diversidad de perfiles de amplificación.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas In recent years, there have been an startling increase in antimicrobial resistance in pathogenic bacteria. That is the case for Staphylococcus aureus, which is known to present several mechanisms to resist antibiotics, and for being the causal agent of mutliple infections both in humans and other animals. In this work we proposed the heterologous expresión of LysK, and endolysin from bacteriophage for the treatment and control of infections caused by S. aureus. Advantages over endolysins over other antimicrobial agents are that there are no reports of resistance in bacteria and that they may be the subject of genetic engineering to widen host range. Escherichia coli was proposed as a model for the expression of LysK, due to the great amount of knowledge of this microorganism as a tool for gene expression. Lactic acid bacteria were also used due to its inocuity for human been, thus eliminating the potential risk of other bacteria as expression vectors. An expression vector was designed for lactic ácid bacteria. LysK endolysin was expressed and purified in E. coli using a commercial expression vector. En los últimos años se ha presentado un incremento alarmante en la resistencia a antimicrobianos por parte de bacterias patógenas. Tal es el caso de Staphylococcus aureus, la cual es conocida por poseer una serie de mecanismos que le confieren resistencia a los anibióticos, y por ser el agente causal de multiples infecciónes, no solo en humanos, si no también en animales. En este trabajo se propone la expresión heterologa de LysK una endolisina de bacteriofago para el tratamiento y control de infecciones causadas por S. aureus. Las ventajas que tienen las endolisinas sobre el uso de otros agentes antimicrobianos es que hasta la fecha no se ha reportado resistencia por parte de las bacterias, y es posible diseñarlas genéticamente y ampliar el rango de hospedero. Como modelo de expresión se proponen Escherichia coli, debido al amplio conocimiento que se tiene sobre este microorganismo como herramienta para la expresión de genes. También su utilizaron bacterias ácido lácticas, debido a que estas son inocuas para el ser humano, con lo que se elimina el riesgo potencial que representa el uso de otras bacterias como vectores de expresión. Se diseñó y evaluó un vector de expresión para bacterias ácido lácticas. La endolisina LysK se expresó y purificó de E. coli en un vector de expresión comercial.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas The Notch signaling pathway (NSP) is a highly conserved cell communication mechanism in most animals and its deregulation is involved with several diseases such as cancer. Several proteins responsible for the negative regulation of the NSP target genes have been reported and all these co-repressor proteins interact with the DNA-binding transcription factor CSL to, potentially, repress the transcription of these genes. Recently, in our laboratory, the transcriptional repressor protein NAC-2 was identified as a protein possibly involved in the regulation of NSP in mammals. Therefore, we decided to investigate the possible participation of NAC-2 in the regulation of the NSP target genes. Using a vector that contains a reporter gene of the luciferase enzyme sensitive to the activity of the NSP, that contains has some consensus regulatory elements of binding to CSL, we evaluate the effect of NAC-2 on the activity of the luciferase enzyme, by transfection of MCF-7 cells. The data obtained showed that NAC-2 decreased the activity of luciferase by 50%, which suggests that NAC-2 functions as an inhibitor of the expression of the target genes of the NSP. It is likely that this NAC-2 inhibitory activity requires the interaction with the transcriptional factor CSL. La vía de señalización Notch (VSN) es un mecanismo de comunicación celular altamente conservado en casi todos los animales, y su desregulación está involucrada con diversas enfermedades como el cáncer. Varias proteínas responsables de la regulación negativa de los genes blanco de la VSN, han sido reportadas, y todas estas proteínas co-represoras interaccionan con el factor transcripcional de unión a ADN, CSL, para eventualmente, reprimir la transcripción de estos genes. Recientemente, en nuestro laboratorio se identificó a la proteína represora transcripcional NAC-2, como una proteína probablemente involucrada en la regulación de la VSN en mamíferos. Por lo anterior, decidimos investigar la posible participación de NAC-2, en la regulación de los genes blanco de la VSN. Empleando un vector que contiene un gen reportero de la enzima luciferasa sensible a la actividad de la VSN, debido a que tiene algunos elementos regulatorios consenso de unión a CSL, evaluamos el efecto de NAC-2 sobre la actividad de la enzima luciferasa, por transfección de las células MCF-7. Los datos obtenidos demostraron que NAC-2 disminuyó en un 50% la actividad de la luciferasa, lo cual sugiere que NAC-2 funciona como un inhibidor de la expresión de los genes blanco de la VSN. Es probable que esta actividad inhibidora de NAC-2 requiera de la interacción con el factor transcripcional CSL.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Maestría en Desarrollo Tecnológico en Sistemas de Producción Animal The aim of this research was to evaluate nopal as a dietary supplement for Holstein cows and to determine its effects on milk yield, as well as, in the physicochemical and the microbiological quality of raw milk and fresh cheese. In addition, three microbiological DNA extraction techniques were evaluated (DNAzol; enzymatic and combined), from milk and fresh cheese samples, in order to determine the most feasible technique which allowed for future evaluation of dairy products, from DNA amplifications. For this purpose, there were used milk yield sample determinations from a group of cows supplemented with nopal (n=5), and from other equal size group, which was considered as a control one, receiving a conventional diet. There were daily measurements for a 29 days period; during days 0, 15 and 29 d, cheese was made from 500 ml milk from each cow. At the same time, ultrasonography measurements of physicochemical analysis were made. The data were analyzed through mixed models methodology with repeated measurements. Statistical differences between treatments means were estimated by using the least squares means. El objetivo general de la presente investigación fue evaluar el efecto del uso del nopal como complemento alimenticio en la dieta de vacas lecheras de raza Holstein sobre la producción láctea (PL) y calidad fisicoquímica y microbiológica de la misma, así como de su subproducto (queso fresco). Adicionalmente, se evaluaron tres técnicas de extracción de ADN microbiológico (DNAzol, enzimática y combinada) a partir de muestras de leche y de queso fresco para determinar una técnica viable de extracción que permitiera futuros análisis moleculares para la evaluación de la calidad microbiológica de productos lácteos, a partir de amplificaciones del ADN obtenido. Para ello, se midió la producción de leche a un grupo de vacas lecheras complementadas en su dieta con nopal (n=5) y a otro grupo testigo (n=5), se realizaron mediciones diarias durante 29 días; en los días 0, 7, 15 y 29 se llevó a cabo la manufactura de queso fresco a partir de 500 ml de la leche de cada animal, adicionalmente se realizó análisis fisicoquímico a las muestras de leche mediante ultrasonografía. Los datos fueron analizados con la metodología de modelos mixtos con mediciones repetidas (SAS, 2000). Las diferencias estadísticas entre tratamientos se obtuvieron mediante el método de medias de mínimos cuadrados (SAS, 2000).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Safety is one aspect that restricts the marketing of raw milk and its by-products obtained in family systems, because of the risk that may lead to public health. It has been documented that milk obtained small producers, which does not carry a strict sanitary control, not only is sold in local markets, but also is used for household consumption or for the manufacture of fresh artisan cheeses same as intended for sale or consumption. In this situation, our preliminary studies establish that working group, use of nopal (Opuntia ficus-indica) to supplement the diet of dairy cows, specifically the epidermis of the nopal, has positive effects on the bacteriological quality of the raw milk and artisanal cheese. Therefore, the objective of this research was to investigate if the direct addition of the epidermis (Ep) of Opuntia ficus-indica on raw milk reduces the number of CFU/ml of aerobic mesophilic (BMA) and total coliforms (CT) in compared with liquid mucilage (ML), dried mucilage (MD) and pulp (Pa) of nopal. Using for this, the assessment of post direct addition of Ep, ML, and MD Pa Opuntia ficus-indica bacterial load of BMA and CT raw milk inoculated with Escherichia coli XL-1 Blue plsd1.4 and added with antibiotics (ampicillin + tetracycline). To reinforce the information a second stage of research, where determined, the antimicrobial effect of Ep, ML, MD, Pa Opuntia ficus-indica on Staphylococcus aureus 29213 under the inhibition in disk methodology. La inocuidad es uno de los aspectos que limita la comercialización de la leche cruda y sus subproductos obtenidos en los sistemas familiares, debido al riesgo que puede ocasionar a la salud pública. Se ha documentado que, la leche que obtienen los pequeños productores, que no lleva un control sanitario estricto, no solo es comercializada en los mercados locales, sino, además, se utiliza para consumo familiar o para la fabricación de quesos fresco artesanal, mismo que se destina a la venta o para autoconsumo. Ante esta situación, estudios preliminares de nuestro grupo de trabajo establecen que, el uso de nopal (Opuntia ficus-indica) como complemento de la dieta de vacas productoras de leche, específicamente la epidermis del nopal, tiene efectos positivos sobre la calidad bacteriológica de la leche cruda y el queso fresco artesanal. Por ello, el objetivo de la presente investigación fue investigar si la adición directa de la epidermis (Ep) de O. ficus-indica a la leche cruda reduce el número de UFC/ml de mesófilas aerobias (BMA) y Coliformes totales (CT) en comparación con el mucílago líquido (ML), mucílago deshidratado (MD) y la pulpa (Pa) de nopal. Utilizando para ello, la evaluación de la carga bacteriana de BMA y CT posterior a la adición directa de Ep, ML, MD y Pa de O. ficus-indica a la leche cruda inoculada con Escherichia coli XL-1 Blue plsd1.4 y adicionada con antibióticos (tetraciclina + ampicilina). Para reforzar la información se estableció una segunda etapa de investigación, en donde se determinó, el efecto antimicrobiano de las fracciones Ep, ML, MD, Pa de O. ficus-indica sobre Staphylococcus aureus 29213 bajo la metodología de inhibición en disco.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Staphylococcus aureus is a bacterium with a worldwide distribution, which is responsible for a number of infectious diseases found in various hosts. Protein A is one of the many virulence factors of S. aureus. The polymorphic nature of protein A is used for molecular characterization of S. aureus. Several functions of protein A have been described such as activation of interferon gene expression and tumor necrosis factor α1 receptor (TNFR1). In this work we were able to establish an association between protein A polymorphisms and the source of the S. aureus strain. These data allowed us to determine an evolutive trend of SpA. In addition, a new criteria for SpA characterization and acceptance is proposed, which is based on single nucleotide polymorphisms (SNP’s) identification in the signature sequences that flank the Xr region of SpA Staphylococcus aureus es una bacteria de distribución mundial que es responsable de una amplia gama de enfermedades infecciosas en diversos hospederos. La proteína A, uno de los múltiples factores de virulencia de S. aureus, es de naturaleza polimórfica y en epidemiología molecular se utiliza para la caracterización de S. aureus. Se han descrito diversas funciones que la proteína A ejerce sobre células del hospedero como la activación de la expresión de interferón y del receptor al factor de necrosis tumoral alfa 1 (TNFR1). En este trabajo se logró establecer una asociación entre el polimorfismo de la proteína A y el origen de la cepa de S. aureus a la que pertenece, lo cual permitió determinar una tendencia evolutiva de la proteína A de S. aureus. Además, se identificaron Polimorfismos de nucleótido único (SNP´s) en las secuencias “firma” que delimitan la región Xr del gen de la proteína A, por lo que se propone un criterio nuevo de aceptación.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Milking industry is one of the main economical activities in Michoacán. However, important losses have been quantified due to bovine mastitis. Dissemination of Staphylococcus aureus is considered a public health problem because it has been associated with bovine mastitis, mainly, in animals, but it also causes community- and hospital-acquired infections in humans. The diversity and environmental adaptation of S. aureus strains had lead to failure in successful control and treatment. In this work S. aureus isolated from mastitic cows and humans working in the milk production system in the municipality of Tarímbaro, Michoacán were subject to molecular characterization. 13 backyard farms were analyzed. The prevalence of mastitis was 44.58% (subclinical 42.03, clinical 2.54%). From multilocus sequence typing analysis (MLST) 6 reported Sequence- Type (STs), 4 new alleles (Nas) and 12 new STs (NSTs) were identified. The most ubiquitous ST was NST-4. It was identified in isolates from bovine, human and fomites. Most of the bovine isolates and one human isolate were grouped in the Clonal Complex 97 (CC97), associated to bovine. The ST8, which has been associated with community infections in humans, was found in two bovine isolates. The analysis of strains distribution pointed to NST-4 as the founder strain, from which some of the rest NSTs in bovine have evolved. These findings suggest a transmission between hosts. A statistical correlation was found between coagulase and STs genotypes with the grade of mastitis. Genotypes coa A and D and ST1476 were related to subclinical mastitis and, in clinical mastitis, genotypes coa B and STs 188, NST-1 and NST-12 were involved. La industria lechera es una actividad económica importante en el estado de Michoacán. La diseminación de Staphylococcus aureus es un grave problema de salud pública, ya que es el principal agente causal de mastitis bovina e infecciones nosocomiales y de comunidad abierta en humanos. Su control y tratamiento han fracasado, debido a la diversidad de cepas existentes y a la ubicuidad del microorganismo. En este trabajo se caracterizaron molecularmente aislados de Staphylococcus aureus provenientes de vacas con mastitis y de humanos involucrados en la producción lechera del municipio de Tarímbaro, Michoacán. El estudio se realizó en 13 granjas familiares. La prevalencia de mastitis fue del 44.58% (subclínica 42.03%, clínica de 2.54%). Mediante el análisis de secuencias multilocus (MLST) se identificaron 6 Secuencias Tipo (STs) reportados y, 4 alelos (Nas) y 12 STs nuevos (NSTs). El NST-4 fue el ST más ubicuo, ya que se identificó en aislados de S. aureus de origen bovino, humano y fomite. La mayoría de los aislados de bovino y un aislado de humano se agruparon en el complejo clonal 97 (CC97) reportado como asociado a bovinos. Se encontraron dos aislados de bovinos con ST8, la cual se ha reportado como asociada a infecciones de comunidad en humanos. Análisis de distribución de las cepas sugieren que el NST-4 se comporta como la clona fundadora de la cual se derivan varios de los NSTs encontrados en bovinos. Estos hallazgos sugieren una transmisión entre hospederos, representando un riesgo para la salud pública. Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre genotipos específicos de coagulasa y/o STs y la forma de presentación de mastitis. Los genotipos asociados a mastitis subclínica fueron aquellos con alotipos A y D del gen coa y ST1476 y, en el caso de mastitis clínica los genotipos con alotipo B del gen coa y los STs 188, NST-1 y NST-12.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Nowadays consumers are more conscious about the relationship between their health and diet, which has promoted the development of functional foods. This group includes some fructans like inulin, fructooligosaccharides (FOS) and levans. As prebiotics, levans have received great attention for their beneficial effects on consumer´s health. Demand forlevanis increasing, mainly because of its wide spread use in the food industry, as well as cosmetic and medical industries, so the development of production of levans at larger scale is being implemented to make it more viable. Among production methods of levans for industrial application, enzymatic synthesis and submerged fermentation with levansucrase producing microorganisms have been described. Our goal is the development of a continuous process which increases the levan production from Gluconacetobacter diazotrophicus. G. diazotrophicus PAl 5 strain was cultured on LGI Emedium supplemented with glycerol. Sucrose was used as substrate for levan synthesis. Fermentation was conducted in shaken flasks at 150 rpm with a temperature of 30°C and initial pH of 6, for a minimum of 90 hours. The biomass concentration was evaluated by measuring absorbance at 590 nm every 12 hours. The absorb and evalues were converted to dry weight (g/L) using a calibration curve based on gravimetrical measurements of dry samples of G. diazotrophicus. The residual and produced carbohydrates were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and thin layer chromatography (TLC). The data derived from the fermentation experiments were analyzed with the purpose of kinetically characterize the process and propose strategies for a better performance. En la actualidad el consumidor es más consciente de la relación existente entre su salud y su dieta, lo cual ha impulsado el desarrollo de los alimentos funcionales. Dentro de este grupo encontramos algunos fructanos como inulina, fructooligosacaridos (FOS) y levanas. Estos compuestos prebióticos han recibido gran atención por sus diversos efectos benéficos para la salud del consumidor. La demanda de las levanas está aumentando, sobre todo por su uso extendido en la industria alimentaria, así como en las industriascosmética y médica, por lo cual se está buscando condiciones para la producción de éstasa mayor escala para hacerla más viable.La producción de levanas para aplicaciones industriales puede llevarse a cabo mediante síntesis por la acción de enzimas aisladaso síntesis por fermentación sumergida con microorganismos.Elobjetivo de este trabajo es el desarrollo de un proceso continuo que incremente la producción de levanas. Para ello se utilizó la cepaG. diazotrophicus PAl 5, en medio de cultivo LGIE suplementado con glicerol para producción de biomasa (Cavalcante and Döbereiner 1988), y se adicionó sacarosa para la síntesis de levanas. La fermentación se desarrolló en matraces agitados a150 rpm y una temperatura de 30°C, pH 6, manteniéndosecomo mínimo por 90 horas. La concentración de biomasa se evaluó por medición de absorbencia a 590 nm cada 12 horas, y los carbohidratos sintetizados se analizaron por cromatografía de alta resolución de líquidos (HPLC)y cromatografía de capa fina(TLC).La fase estacionaria de la curva de crecimiento de G. diazotrophicus se presentó entre las 60 y 80 h de incubación y la velocidad máxima de crecimiento (μmax) aquí obtenida se alcanzó dentro de las 19 h, con valor de 0.0365h-1con glicerol yentre las 26 a 34 h, con valores de 0.0135h-1 con sacarosa.Se demostró que en estas condiciones de cultivo existe acumulación de levanas y FOS en el medio.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Bacillus thuringiensis is a Gram positive bacterium widely studied because Cry proteins are used as bioinsecticides. B. thuringiensis strains contain a complex pattern of plasmids (1-17) which vary in size from 2 to 200 kilobases (kb). The genes encoding the insecticidal proteins are located on large conjugative plasmids. Most of the small plasmids (< 15 kb) studied in B. thuringiensis replicate by the rolling circle mechanism (RC plasmids) in which single stranded DNA intermediates (ssDNA) are produced. The functions of these RC plasmids in B. thuringiensis are unknown; additionally the number of cloning vectors for gene transfer in B. thuringiensis is limited. The objective of this work was to characterize the genetic elements of plasmid pBMBt1 from B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14 -4. Southern blot and S1 nuclease digestion analysis show that pBMBt1 contains ssDNA intermediates. Subsequently, pBMBt1 was completely sequenced and the analysis of sequence showed that pBMBt1 is a circular molecule of 6700 bases of pairs (bp) with a GC content of 32%, furthermore three open reading frames (ORFs) were identified. The predicted protein of ORF1 (Cry14-4) showed the highest identity with the CryC53 protein from B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa from B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) and Mtx2/3 from B. sphaericus (27.8%). This is the first report that shows the presence of a cry-like gene (cry14-4) in a RC plasmid from B. thuringiensis. The ORF2 (Mob14-4) encodes a Mob protein which is involved in the conjugative mobilization of small plasmids. The Mob14-4 protein showed 74% identity with a Mob protein encoded by plasmid pUIBI-1 from B. thuringiensis subsp. entomocidus and 64% identity with a Mob protein from pBMY1 plasmid from Bacillus mycoides. The mob14-4 gene is functional, as shown by determination of transfer frequencies of 9.1 x 10-6 transconjugants/recipient cell of plasmid pHTmob14-4, which contain the mob14-4 gene from pBMBt1. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva ampliamente estudiada debido al uso de sus proteínas Cry como bioinsecticidas. Las cepas de B. thuringiensis se caracterizan por contener un numero variable de plásmidos (1-17) cuyos tamaños varían de 2 hasta 200 kilobases (kb). Los genes que codifican estas proteínas insecticidas se encuentran en plásmidos grandes y conjugativos. La mayoría de los plásmidos pequeños (< 15 kb) estudiados de B. thuringiensis se replican por el mecanismo del circulo rodante (plásmidos RC), caracterizado por producir intermediarios de ADN de cadena sencilla (ADNcs). La función que desempeñan estos plásmidos RC en B. thuringiensis se desconoce; adicionalmente, el nu?mero de vectores de clonación para la transferencia de genes a B. thuringiensis es limitado. Debido a esto, el objetivo del presente trabajo fue la caracterización de los elementos genéticos del plásmido pBMBt1 de B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14-4. Mediante hibridaciones tipo Southern y digestio?n con nucleasa S1 se detectaron intermediarios de ADNcs provenientes del plásmido pBMBt1, característica distintiva de los plásmidos RC. Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos de pBMBt1. El análisis revelo? que pBMBt1 es una molécula circular de 6,700 pares de bases (pb) con un contenido de GC del 32% y se identificaron tres marcos de lectura abiertos (ORFs). La proteína del ORF1 (Cry14-4) mostro? identidad con las proteínas CryC53 de B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa de B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) y Mtx2/3 de B. sphaericus (27.8%). Este es el primer reporte de la presencia de un gen que codifica una protei?na con identidad a proteínas Cry y que se encuentra en un pla?smido RC de B. thuringiensis. El ORF2 (Mob14-4) codifica la protei?na Mob involucrada en la movilización conjugativa de pla?smidos pequen?os.