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The avocado fruit (Persea americana) has become a significant fruit in the human diet for its nutritional properties. However, the seed is a source of bioactive molecules and has been poorly utilized. Previously, we reported that the PaSn gene is expressed in the avocado seeds, a cysteine-rich antimicrobial peptide (GASA/Snakin), and demonstrated its antibacterial activity. In this work, we report the recombinant production of PaSn in the Escherichia coli system and evaluate its antifungal activity against plant and human pathogen fungi. The recombinant peptide showed antifungal activity at 200 μg/mL against phytopathogens Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum and human pathogens Candida albicans and C. glabrata. Our results demonstrate the usefulness of a prokaryotic expression system for avocado antimicrobial peptide production. In conclusion, the snakin PaSn could be helpful in the control of postharvest avocado and other fruits’ fungal diseases and human fungal pathogens.

Osteosarcoma is the most common malignant bone tumor in both children and dogs. It is an aggressive and metastatic cancer with a poor prognosis for long-term survival. The search for new anti-cancer drugs with fewer side effects has become an essential goal for cancer chemotherapy; in this sense, the bioactive compounds from avocado have proved their efficacy as cytotoxic molecules. The objective of this study was to determine the cytotoxic and antiproliferative effect of a lipid-rich extract (LEAS) from Mexican native avocado seed (Persea americana var. drymifolia) on canine osteosarcoma D-17 cell line. Also, the combined activity with cytostatic drugs was evaluated. LEAS was cytotoxic to D-17 cells in a concentration-dependent manner with an IC50 = 15.5 µg/mL. Besides, LEAS induced caspase-dependent cell apoptosis by the extrinsic and intrinsic pathways. Moreover, LEAS induced a significant loss of mitochondrial membrane potential and increased superoxide anion production and mitochondrial ROS. Also, LEAS induced the arrest of the cell cycle in the G0/G1 phase. Finally, LEAS improved the cytotoxic activity of cisplatin, carboplatin, and in less extension, doxorubicin against the canine osteosarcoma cell line through a synergistic effect. In conclusion, avocado could be a potential source of bioactive molecules in the searching treatments for osteosarcoma.

Changes in the levels of reproductive hormones compromise the bovine innate immune response (IIR). Changes in 17β-estradiol (E2) and prolactin (bPRL) levels affect the IIR of bovine mammary epithelial cells (bMECs), the target tissue of these hormones. In this work, we explored the effect of the combined hormones on bMEC IIR during Staphylococcus aureus infection, and if they can modulate epigenetic marks. By gentamicin protection assays, we determined that combined hormones (bPRL (5 ng/mL) and E2 (50 pg/mL)] decrease S. aureus internalization into bMECs (~50%), which was associated with a reduction in integrin α5β1 membrane abundance (MA) (~80%) determined by flow cytometry. Additionally, combined hormones increased Toll-like receptor 2 (TLR2) MA (~25%). By RT-qPCR, we showed that combined hormones induce the expression of pro- and anti-inflammatory cytokine genes, as well as up-regulate antimicrobial peptide gene expression. The combined hormones induced H3K9Ac at 12 h of treatment, which coincides with the reduction in histone deacetylase (HDAC, ~15%) activity. In addition, hormones increased the H3K9me2 mark at 12 h, which correlates with a reduction in the expression of KDM4A. In conclusion, bPRL and E2 modulate the IIR of bMECs, an effect that can be related to the regulation of histone H3 modifications such as H3K9Ac and H3K9me2.

The cytotoxic effect of the tetrameric peptide LfcinB (20–25)4 against breast cancer cell line ATCC® HTB-22™ (MCF-7) was evaluated. The tetrameric peptide exhibited a concentration-dependent cytotoxic effect against MCF-7 cancer cells. The peptide at 22 µM had the maximum cytotoxic effect against MCF-7 cancer cells, reducing their cell viability to ∼20%. The cytotoxic effect of the tetrameric peptide against MCF-7 cells was sustained for 24 hours. Furthermore, the tetrameric peptide did not exhibit a significant cytotoxic effect against the non-tumorogenic trophoblastic cell line, which confirms their selectivity for breast cancer cell lines. The MCF-7 cells treated at 12.2 µM for 1 h exhibited morphological changes characteristic of apoptosis, such as rounded forms and cellular shrinkage. Furthermore, this peptide induces severe cellular damage to MCF-7 cells, mitochondrial membrane depolarization, and increase of cytoplasmic calcium concentration. Our results suggest that it has a significant selective cytotoxic effect against MCF-7 cells, which may be mainly associated with the apoptotic pathway. This peptide, which contains the RRWQWR motif, could be considered to be a promising candidate for developing therapeutic agents for the treatment of breast cancer.

Diabetic nephropathy is a polygenic and multifactorial disease. Studies of familial clustering and genetic predisposition suggest that genetic factors are involved. Among candidate genes, the coding for angiotensin-converting enzyme (ACE) polymorphism has been described. Our objective was to investigate the association ACE gene insertion/deletion (I/D) polymorphism with the development of diabetic nephropathy in a Mexican population.In a cross-sectional study, we evaluated 204 patients with type 2 diabetes: 43 with incipient diabetic nephropathy, 45 with established diabetic nephropathy and 116 without diabetic nephropathy. Diabetic nephropathy was defined according the American Diabetes Association criteria. The ACE I/D gene polymorphism was detected by polymerase chain reaction.Patients with type 2 diabetes with both incipient diabetic nephropathy and established diabetic nephropathy significantly differed from controls with respect to variables that determined kidney damage (P.0001) and serum lipids ( P.01). The genotype DD was strongly associated with the development of incipient diabetic nephropathy (odds ratio [OR] adjusted = 2.83; 95% confidence interval, 1.74-4.59; P.0001) and established diabetic nephropathy (OR adjusted = 2.95; 95% CI, 1.83-4.73; P.0001).The ACE DD genotype is associated with the development of incipient diabetic nephropathy and established diabetic nephropathy in a Mexican population.

La mastitis bovina provoca la infl amación de la glándula mamaria y es ocasionada principalmente por Staphylococcus aureus. Presenta una incidencia mayor durante el parto o después de la lactancia, periodos en que la prolactina (PRL) tiene función relevante, aunque se desconoce su participación en la infección. En este trabajo se evaluó in vitro, el efecto de la PRL bovina (1-50 ng/mL) sobre la endocitosis y proliferación intracelular de S. aureus (ATCC 27543) en células epiteliales mamarias bovinas (CEMB). Las CEMB tratadas durante 24 h con 5 ng/mL de bPRL incrementan ~3 veces la endocitosis de S. aureus, además de inducir la proliferación bacteriana. Este efecto fue revertido de manera específi ca tratando las CEMB con IgG anti-bPRL. Las CEMB tratadas con bPRL (5 ng/mL) presentaron mayor endocitosis de S. aureus (~3 veces), pero el número de células infectadas no se modifi có. En conclusión, la presencia de bPRL favorece la endocitosis y la proliferación de S. aureus en las CEMB.

La mastitis es una enfermedad que afecta al ganado bovino lechero a nivel mundial, provocando una disminución en la calidad y cantidad de la leche producida, lo cual genera pérdidas económicas considerables. Esta enfermedad es causada por una variedad de microorganismos, entre los cuales Staphyloccocus aureus es uno de los más importantes. El objetivo del trabajo fue caracterizar 20 aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos de la glándula mamaria de vacas lactantes con mastitis en un sistema de producción de traspatio, mediante el uso de polimorfismos derivados de la amplificación al azar de ADN (RAPD’s) y su sensibilidad hacia trece antibióticos y 1 detergente. Las pruebas de sensibilidad a los 13 antibióticos demostraron que todos los aislamientos fueron resistentes a penicilina y sensibles a cefalotina, eritromicina y trimetoprim. Todos los aislamientos fueron susceptibles a una concentración menor de 6 µg/ml de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). La caracterización molecular permitió determinar que los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, presentaron una similitud superior al 90 % en el patrón de bandas obtenida por RAPD, mientras que los aislamientos SA35 y SA36 fueron idénticos, sin embargo, el resto de los aislamientos presentaron perfiles de amplificación distintos. Los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, SA35 y SA36, tuvieron patrones de resistencia a antibióticos y de RAPD similares, por lo que probablemente se trató de reaislamientos. Los aislamientos de Staphylococcus de Tarímbaro, Michoacán presentaron una diversidad de perfiles de amplificación.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Staphylococcus aureus is a bacterium that causes chronic infections in humans and animals. S. aureus is the main pathogen associated with chronic bovine mastitis, which has been related with bacterial internalization capacity into bovine mammary epithelial cells (bMECs) that allow to it evade the host's innate immune response (IIR). In addition, S. aureus inhibits the activation of transcriptional factors and favors epigenetic changes (chemical modifications on histones and microRNAs), both are related with gene expression modulation of the IIR. Another characteristic of S. aureus is its high rate of antimicrobial resistance, especially in the case of bovine mastitis, because the classic treatments are unsuccessful, therefore it is necessary to searching for alternative treatments. Avocado seed is a source of phytochemicals with antiinflammatory and immunomodulatory properties. Previously, our group of work reported that a lipid-rich extract from Mexican avocado seed (Persea americana var. drymifolia) (LEAS) decreased the internalization of S. aureus into bMECs by ~80%. In addition, LEAS increased IL -10 expression and decreased the expression of TNF-?, which suggest that LEAS has antiinflammatory effects; however, the mechanisms involved in these effects, as well as the molecule responsible, has not been analyzed. In this work it was shown that LEAS inhibit the adhesion of S. aureus to bMECs (~40%); also, pre-treatment during 24 h favored the production of antimicrobial molecules such as reactive nitrogen species (ca. nitric oxide) which was related with elimination of extracellular bacteria. Staphylococcus aureus es una bacteria que provoca infecciones crónicas en humanos y animales. Es el principal agente causal de la mastitis bovina crónica y que tiene la capacidad de internalizarse en las células del epitelio mamario bovino (CEMB), proceso que le permite evadir la respuesta inmune innata (RII) del hospedero. Además, esta bacteria inhibe la activación de factores transcripcionales y provoca cambios químicos sobre las histonas y microRNAs, ambos considerados como cambios epigenéticos que se han relacionado con una inhibición de la expresión de genes de la RII. Otra característica de S. aureus es su alta resistencia a los antimicrobianos, que en el caso de la mastitis bovina resultan poco exitosos, por lo que se requiere la búsqueda de tratamientos más eficientes. Los extractos derivados de plantas son una alternativa ya que tienen compuestos con actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora, la semilla del aguacate es una fuente de fitoquímicos con este tipo de propiedades. Previamente, el grupo de trabajo reportó que un extracto lipídico de semilla de aguacate nativo mexicano (Persea americana var. drymifolia) rico en derivados lipídicos de cadena larga (DLCL) disminuyó la internalización de S. aureus en las CEMB (~80%), además indujo la expresión de IL-10 y disminuyó la expresión de TNF-?, lo que sugiere que los DLCL presentan efectos antiinflamatorios. Sin embargo, los mecanismos involucrados durante estos efectos, así como la molécula responsable de ellos no se conoce. En esta investigación se demostró que los DLCL inhiben la adhesión de S. aureus en las CEMB (~40%), además el pre-tratamiento durante 24 h indujo la producción de moléculas antimicrobianas como las especies reactivas de nitrógeno (ej. óxido nitrico) que se relacionan con la eliminación de la bacteria en el medio extracelular.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Bovine mastitis is the main disease that affects dairy cattle worldwide causing important economic losses, being Staphylococcus aureus the main microorganism associated. S. aureus is able to internalize into non-professional phagocytic cells such as bovine mammary epithelial cells (bMEC) through the "zipper" mechanism. In the search for control alternatives, during the last decade our working group has evaluated the immunomodulatory activities of short and medium chain fatty acids (FA) [propionate (NaP), butyrate (NaB), hexanoate (NaH) and octanoate (NaO)], demonstrating that these molecules reduce S. aureus internalization into bMEC; however, it is unknown whether their inhibitory activity is related to α5β1/FAK integrin signaling pathway affectation. Therefore, the aim of this study was to determine the FA effects on the α5β1/FAK integrin signaling pathway during S. aureus internalization into bMEC. The data obtained regarding the FAK participation in S. aureus internalization into bMEC showed that the kinase is necessary for bacterial internalization, since by inhibiting its activity a significant internalization reduction was observed (63%), which was increased when cells were treated with different FA (73-77%). La mastitis bovina es la principal enfermedad que afecta a la ganadería lechera y es de importancia económica a nivel mundial, siendo Staphylococcus aureus el principal microorganismo asociado a ella. S. aureus tiene la capacidad de internalizarse en fagocitos no profesionales, como las células epiteliales mamarias bovinas (CEMB), a través del mecanismo tipo “zipper”. La internalización le permite al patógeno evadir la respuesta inmune causando infecciones crónicas y recurrentes, además de que dificulta la terapia antimicrobiana. En la búsqueda de alternativas de control, nuestro grupo de trabajo ha evaluado la actividad inmunomoduladora de ácidos grasos (AG) [propionato (NaP), butirato (NaB), hexanoato (NaH) y octanoato (NaO)], demostrando que reducen la internalización de S. aureus en las CEMB; sin embargo, se desconoce si su actividad inhibitoria está relacionada con una afectación directa de la ruta de señalización integrinas α5β1/FAK. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de los AG sobre la ruta de señalización integrinas α5β1/FAK durante la internalización de S. aureus en las CEMB. Los resultados mostraron que los AG no modifican la expresión del gen de la subunidad 1 de integrinas. Sin embargo, el NaP y NaH disminuyeron la abundancia de los receptores en la membrana (~50%), así como la adhesión bacteriana (47% y 50%, respectivamente); mientras que el NaB y NaO favorecieron la adhesión de S. aureus a las CEMB (137% y 129%, respectivamente). Con respecto a la participación de FAK en la internalización de S. aureus en las CEMB, los resultados obtenidos demostraron que esta cinasa es necesaria para la internalización de la bacteria, ya que al inhibir su actividad se observó una disminución significativa de la internalización (63%), dicho efecto se incrementó al tratar a las células con los diferentes AG (73-77%).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Cancer worldwide caused 8.8 million deaths in 2015, being leukemia one of the ten most important cancer due to the high number of deaths. The conventional treatments against cancer are surgery, radiotherapy and chemotherapy. However, these have several drawbacks such as low specificity, development of tolerance mechanisms and side effects in patients. These limitations have led to the search for new alternative therapies such as vaccines, nanotechnology and natural products such as antimicrobial peptides (AMP's). AMP's represent a new family of anti-cancer agents that reduce the limitations of conventional treatments. So far more than 3000 AMP’s have been described, of which 217 have anticancer activity. Of the 12 families of plant AMP’s, 3 of them have cytotoxic and anticancer activity: defensins, thionins and cyclotides. However, the mechanisms of cytotoxicity are poorly known. In this work, the cytotoxicity of plant defensins PaDef (Persea americana var. drymifolia) and γ-thionin (Capsicum chinense) against the human chronic myeloid leukemia cell line K562 was evaluated and their mechanisms of action were analyzed. The PaDef and γ-thionin AMP’s inhibited the viability of K562 cells in a concentrationdependent manner, with an IC50 = 97.3 μg/ml and 290 μg/ml, respectively. Both AMP’s showed no cytotoxic activity on peripheral blood mononuclear cells (PBMC). To establish the cytotoxic mechanism of defensins PaDef and γ- thionin, damage to the cellular membrane was evaluated, which was not affected by both defensins. El cáncer a nivel mundial causó 8.8 millones de muertes en el 2015, siendo la leucemia uno de los diez tipos de cáncer más importantes por el alto número de muertes que genera. Los tratamientos convencionales contra el cáncer son la cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, estos tienen varios inconvenientes como su baja especificidad, el desarrollo de mecanismos de tolerancia y los efectos secundarios en el paciente. Estas limitaciones han llevado a la búsqueda de nuevas terapias alternativas como las vacunas, nanotecnología y productos naturales como los péptidos antimicrobianos (PA’s). Los PA’s representan una nueva familia de agentes anticancerosos que disminuyen las limitaciones de los tratamientos convencionales. Hasta el momento se han descrito más de 3000 PA’s, de los cuales 217 poseen actividad anticancerosa. De las 12 familias de PA’s de plantas, 3 de ellas tienen actividad citotóxica y anticancerosa: las defensinas, tioninas y ciclótidos. Sin embargo, los mecanismos de citotoxicidad no se conocen a detalle. En este trabajo se evaluó la citotoxicidad de las defensinas de plantas PaDef (Persea americana var. drymifolia) y γ-tionina (Capsicum chinense) contra la línea celular de leucemia mieloide crónica humana K562 y se analizó su mecanismo de acción. Los PA’s PaDef y γ-tionina inhibieron la viabilidad de las células K562 de una manera dependiente de la concentración, con una IC50= 97.3 μg/ml y 290 μg/ml, respectivamente. Ambos péptidos antimicrobianos no mostraron actividad citotóxica sobre las células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) de un paciente sano. Para definir el mecanismo de muerte celular de las defensinas PaDef y γ-tionina primero se evaluó el daño a la membrana celular, la cual no se afectó por ninguna de las defensinas.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Colorectal cancer (CRC) is the third type of cancer with the highest incidence and the fourth cause of death in the world, responsible for nearly 700,000 deaths per year. The chemotherapy currently used in patients with CRC is associated with severe side effects and a low therapeutic index. In the search for alternatives, the use of combinations of natural compounds increases the chances of finding therapeutic targets. In this sense, avocado is an important source of secondary metabolites with anticarcinogenic potential, especially the Mexican native avocado (P. americana var. drymifolia) is a fruit rich in lipids, biomolecules with cytotoxicity towards cancer cells that affect the proliferation and cell viability. Interestingly, the avocado seed has received attention because it has a greater amount of selective lipid compounds towards cancer cells. The objective of this study was to determine the cytotoxic effect of the long-chain lipids of the Mexican native avocado seed on Caco-2 and HCT 116 colon cancer cells. In addition, in the Caco-2 cells the effect on the cell cycle and the induction of apoptosis, as well as the regulation of the inflammatory response and the metabolism of fatty acids was evaluated. The lipid extract was cytotoxic for Caco-2 and HCT 116 cells with an IC50 of 28 and 8 ?g/mL, respectively. In the Caco-2 cells, it was detected the simultaneous activation of caspases 8 and 9, loss of mitochondrial potential (68%), inhibition of fatty acid oxidation (45%) and an increase in the O2- production (30%) and mitochondrial ROS (52%). El cáncer colorrectal (CRC) es el tercer tipo de cáncer con mayor incidencia y la cuarta causa de muerte en el mundo, siendo responsable de cerca de 700,000 muertes al año. La quimioterapia utilizada actualmente en pacientes con CRC se asocia con efectos secundarios severos y un bajo índice terapéutico. En la búsqueda de alternativas, el uso de combinaciones de compuestos naturales favorece las posibilidades de encontrar blancos terapéuticos. En este sentido, el aguacate es una fuente importante de metabolitos secundarios con potencial anticanceroso, de manera especial, el aguacate nativo mexicano (P. americana var. drymifolia) es un fruto rico en lipídos, las cuales son biomoléculas con citotoxicidad hacia las células cancerosas ya que afectan la viabilidad celular. Interesantemente la semilla de aguacate ha cobrado atención debido a que posee una mayor cantidad de compuestos lipídicos selectivos hacia las células cancerosas. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto citotóxico de las moléculas lipídicas de cadena larga de la semilla de aguacate nativo mexicano sobre células de cáncer de colon Caco-2 y HCT 116. Además, en las células Caco-2 se determinó el efecto sobre el ciclo celular y la inducción de apoptosis, así como en la regulación de la respuesta inflamatoria y en el metabolismo de ácidos grasos (AG). El extracto lipídico fue citotóxico para las células Caco-2 y HCT 116 con una IC50 de 28 ?g/mL y 8 ?g/mL, respectivamente. En las células Caco-2 se observó la activación simultánea de las caspasas 8 y 9, una pérdida de potencial mitocondrial (68%), así como la inhibición de la oxidación de ácidos AG (45%) y un aumento en la producción de O2- (30%) y especies reactivas de oxígeno (ERO) mitocondrial (52%).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas During the peripartum, cattle are more susceptible to infectious diseases (i.e. Mastitis). This period is characterized by changes in the concentrations of sexual hormones, such as 17-estradiol (E2), which compromises the innate immune response (IIR) of the animal. Bovine mammary epithelial cells (bMECs) are target tissue for this hormone, which regulates their proliferation and differentiation through estrogen receptors (ERs). In addition, E2 has shown anti-inflammatory effects because reverts the inflammatory response after the stimulation with bacterial components. This hormone mediates signaling pathways by inducing the production of antimicrobial peptides (AP). Staphylococcus aureus (principal mastitis pathogen) is able to internalize into bMECs using the “zipper” mechanism associated to α5β1 integrin/FAK. The aim of this work was to evaluate the effects of E2 on elements of the IIR of bMECs during S. aureus internalization. bMECs were treated with E2 (24 h) and infected with S. aureus (ATCC- 27543). We evaluated bacterial internalization by gentamicin protection assays. To measure surface receptors and kinase activity we used flow cytometry. Using Western Blot, we analyzed the phosphorylation state of FAK and ERs. The expression of IIR genes and protein secretion were analyzed by RT-qPCR and ELISA, respectively. We evaluated the activated IIR transcriptional factors using a microarray (Panomics). The results indicate that E2 (50 pg/ml) decreased S. aureus internalization (~60%), which was associated with the integrin surface reduction (~40%) and FAK inhibition (~50%). Durante el periparto, el ganado es más susceptible a infecciones (Mastitis). Este periodo se caracteriza por cambios en los niveles de hormonas sexuales, como el 17-estradiol (E2), el cual compromete la respuesta inmune innata (RII) del animal. Las células de epitelio mamario bovino (CEMB) son blanco de esta hormona, la cual regula su proliferación y diferenciación a través de sus receptores de estrógenos (RE). Se ha demostrado que el E2 presenta efectos anti inflamatorios, al revertir la respuesta inflamatoria causada por bacterias. Esta inmunomodulación se logra regulando distintas rutas de señalización, las cuales además, inducen la producción de péptidos antimicrobianos (PA). Staphylococcus aureus (principal agente causal de mastitis) tiene la capacidad de internalizarse en las CEMB usando el mecanismo zipper, en el cual participan el receptor integrina α5β1 y la cinasa FAK. El objetivo del trabajo fue evaluar los efectos del E2 sobre la RII en las CEMB durante la internalización de S. aureus. Las CEMB fueron tratadas con E2 e infectadas con S. aureus (ATCC-27543). Primeramente, se evaluó el efecto del E2 sobre la internalización bacteriana (ensayos de protección con gentamicina). Posteriormente, se midieron los receptores de superficie y la actividad de las cinasas asociadas a la RII (citometría de flujo). Seguido del estado de fosforilación de FAK y de los RE (Western blot). Se midió la expresión de genes de la RII y la secreción de las proteínas por RT-PCR y ELISA, respectivamente. Finalmente se evaluó la actividad de los factores transcripcionales asociados a la RII, mediante un ensayo de hibridación con un microarreglo. Los resultados mostraron que el E2 (50 pg/ml) disminuyó la internalización de S. aureus en las CEMB (~60%), lo cual se asoció con la reducción de la integrina en membrana (40%) y a la inhibición de FAK (50%).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Staphylococcus aureus es una bacteria Gram (+) asociada a enfermedades crónicas y persistentes tanto en la medicina humana (ej. osteomielitis) como en la veterinaria (ej. mastitis). Es el principal patógeno relacionado con la mastitis bovina subclínica (crónica y asintomática), enfermedad de gran importancia en la ganadería bovina lechera a nivel mundial. Esta bacteria es facultativa intracelular lo que le permite evadir la respuesta inmune del hospedero y la terapia antimicrobiana. Esto favorece la generación de variantes de colonia pequeña (SCVs) que presentan características distintas a la cepa silvestre (ej. crecimiento lento, auxotróficas, no hemolíticas). Las SCVs se asocian con la persistencia y cronicidad de diversas enfermedades en humanos, pero hasta el momento existen pocos estudios de SCVs de S. aureus asociados a mastitis bovina. El objetivo del trabajo fue generar y caracterizar una SCVs de S. aureus y evaluar su persistencia intracelular en células de epitelio mamario bovino (CEMB). Se utilizó la cepa S. aureus ATCC27543 aislada de un caso de mastitis clínica y con capacidad de internalizar diferentes tipos celulares. Se generó una SCV estable utilizando gentamicina (1 g/ml) como molécula inductora. Esta presentó un crecimiento lento (tiempo de generación de 523 min) con respecto a la cepa silvestre S. aureus ATCC27543 (tiempo de generación de 119 min), auxotrofía para menadiona y una disminución en la expresión de los genes de virulencia agrA, RNAIII y fnbpA. A través de ensayos de protección con gentamicina se observó que la SCV persistió intracelularmente en las CEMB aún a las 72 h, sin inducir apoptosis. En conclusión, se obtuvo una SCV de la cepa de S. aureus ATCC27543 que persiste intracelularmente sin afectar la viabilidad de las CEMB. Staphylococcus aureus es una bacteria Gram (+) asociada a enfermedades crónicas y persistentes tanto en la medicina humana (ej. osteomielitis) como en la veterinaria (ej. mastitis). Es el principal patógeno relacionado con la mastitis bovina subclínica (crónica y asintomática), enfermedad de gran importancia en la ganadería bovina lechera a nivel mundial. Esta bacteria es facultativa intracelular lo que le permite evadir la respuesta inmune del hospedero y la terapia antimicrobiana. Esto favorece la generación de variantes de colonia pequeña (SCVs) que presentan características distintas a la cepa silvestre (ej. crecimiento lento, auxotróficas, no hemolíticas). Las SCVs se asocian con la persistencia y cronicidad de diversas enfermedades en humanos, pero hasta el momento existen pocos estudios de SCVs de S. aureus asociados a mastitis bovina. El objetivo del trabajo fue generar y caracterizar una SCVs de S. aureus y evaluar su persistencia intracelular en células de epitelio mamario bovino (CEMB). Se utilizó la cepa S. aureus ATCC27543 aislada de un caso de mastitis clínica y con capacidad de internalizar diferentes tipos celulares. Se generó una SCV estable utilizando gentamicina (1 ?g/ml) como molécula inductora. Esta presentó un crecimiento lento (tiempo de generación de 523 min) con respecto a la cepa silvestre S. aureus ATCC27543 (tiempo de generación de 119 min), auxotrofía para menadiona y una disminución en la expresión de los genes de virulencia agrA, RNAIII y fnbpA. A través de ensayos de protección con gentamicina se observó que la SCV persistió intracelularmente en las CEMB aún a las 72 h, sin inducir apoptosis. En conclusión, se obtuvo una SCV de la cepa de S. aureus ATCC27543 que persiste intracelularmente sin afectar la viabilidad de las CEMB.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Maestría en Producción Agropecuaria The most common ocular disease affecting cattle is the Infectious Bovine Keratoconjunctivitis (IBK), which has been associated with Moraxella bovis. In this study, the IBK prevalence was assessed in two dairy regions from Michoacan (Altiplano and The Cienega) and the causal agent of the disease was identified. A total of 761 individuals were analyzed and only 17 showed IBK. Ocular samples were obtained from animal with IBK and 38 bacterial isolates were obtained, which were characterized by Gram stain and antibiotic sensitivity. Identification of the bacterial isolates was performed by PCR amplification of a region of the 16S ribosomal gene, the nucleotide sequence was determined and it was used to carried out comparisons in the GenBank. The animals proportion with IBK was 2.23% and the bacterial microbiota associated with IBK included Staphylococcus saprophyticus, S. agnetis, S. chromogenes, S. haemolyticus, S. xylosus, Streptococcus dysgalactiae, S. suis, S. uberis, Enterococcus mundi, Bacillus aerius, B. toyonensis, B. pumilus, Rhotia nasimurium, Arthobacter gandavensis, A. luteolus, Peptoniphilus indolicus, Corynebacterium Aquilae, Pseudomonas aeruginosa, P. zhaodongensis, Mannheimia granulomatis, Acinetobacter schindler, Enterobacter mori, Moraxella equi and M. bovoculi. To our knowledge, the present study is the first of its kind in Mexico, however it is necessary perform more research to estimate the animals proportion with IBK and the microbiota associated to this disease. La enfermedad ocular más común que afecta a los bovinos es la Queratoconjuntivitis Infecciosa Bovina (QIB), la cual se ha asociado a la bacteria Moraxella bovis. En el presente estudio se estimó la prevalencia de QIB en las cuencas lecheras del altiplano Michoacano y la región de la Ciénega y se identificó el agente causal de la enfermedad. Se obtuvieron muestras oculares de 17 bovinos que presentaban QIB de una población de 761 cabezas. De estas muestras se obtuvieron 38 aislados, los cuales se caracterizaron mediante tinción de Gram y prueba de sensibilidad a antibióticos. La identificación de los aislados se realizó mediante la amplificación por PCR de una región del gen ribosomal 16S, a la cual se le determinó la secuencia de nucleótidos y se usó para realizar comparaciones en la base GenBank. La proporción de animales con QIB fue 2.23% y se identificó a la microbiota bacteriana asociada a ella. Las especies bacterianas identificadas fueron Staphylococcus saprophyticus, S. agnetis, S. chromogenes, S. haemolyticus, S. xylosus, Streptococcus dysgalactiae, S. suis, S. uberis, Enterococcus mundtii, Bacillus aerius, B. toyonensis, B. pumilus, Rhotia nasimurium, Arthobacter gandavensis, A. luteolus, Peptoniphilus indolicus, Corynebacterium Aquilae, Pseudomonas aeruginosa, P. zhaodongensis, Mannheimia granulomatis, Acinetobacter schindler, Enterobacter mori, Moraxella equi y M. bovoculi. Hasta nuestro conocimiento el presente estudio es el primero de este tipo que se ha realizado en México, por lo que es necesario más investigación para estimar la proporción de animales con QIB y la microbiota asociada a ella.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Cancer is a major health problem worldwide. In Mexico is the third cause of death, being the breast cancer one of the most prevalent. Conventional therapies have a low therapeutic index and severe side effects therefore alternative therapies are necessary. Antimicrobial peptides (APs) have been considered as promising anticancer agents because their ability to inactivate a wide range of cancer cells. The anticancer activities of APs include the lysis of cytoplasmic membrane and apoptosis induction. In this work, we assessed the cytotoxicity of plant APs PaDef (Persea americana var. drymifolia) and γ-thionin (Capsicum chinense) defensins against cancer cell line MCF-7 and we analyzed their mechanism of action. The PaDef defensin decreased the viability of MCF-7 cells in a concentration dependent manner showing an IC50 of 141.62 μg/ml. In addition, PBMC viability was unaffected but BMEC viability decreased. On the other hand, γ-thionin significantly inhibited MCF-7 viability with an IC50= 117.29 μg/ml. Interestingly, BMEC and PBMC viability was unaffected; suggesting that γ-thionin is selective to cancer cells. To determine the cytotoxicity mechanism of PaDef and γ-thionin on MCF-7 cells, we evaluated calcium efflux and membrane electrical potential. Both plant defensins did not modify these parameters, which indicate that the mechanism of these peptides on MCF-7 cells is not related to pore formation. On the other hand, both defensins increased the rate of apoptosis in a time-dependent manner reaching a maximum of 44 and 76%, respectively. To elucidate the apoptosis pathway induced by both plant defensins in MCF-7 cells, we evaluated the mitochondrial membrane potential (ΔΨm). Cells treated with PaDef and γ-thionin IC50 showed the loss of ΔΨm suggesting that intrinsic apoptosis has been activated. El cáncer es un problema de salud importante a nivel mundial. En México es la tercera causa de muerte siendo el cáncer de mama uno de los de mayor incidencia. Las terapias convencionales tienen índices terapéuticos bajos y efectos secundarios severos por lo que es necesaria la búsqueda de nuevas terapias alternativas. Los péptidos antimicrobianos (PAs) son moléculas que han sido considerados una prometedora alternativa para tratar el cáncer debido a su habilidad para inactivar un amplio rango de células cancerosas. La actividad anticancerosa de los PAs incluye la lisis de la membrana citoplasmática y la inducción de apoptosis. En este trabajo se evaluó la citotoxicidad de las defensinas de plantas PaDef (Persea americana var. drymifolia) y γ-tionina (Capsicum chinense) contra la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y se analizó su mecanismo de acción. La defensina PaDef disminuyó la viabilidad de las células MCF-7 de manera dependiente de la concentración, con una concentración inhibitoria 50 (IC50) de 141.62 μg/ml; las células PBMC no se vieron afectadas con la defensina, pero la viabilidad de las CEMB disminuyó por el tratamiento con la defensina PaDef (datos no mostrados). La defensina γ-tionina tuvo un efecto mayor sobre la viabilidad de las células MCF-7 respecto a PaDef, con una IC50 de 117.29 μg/ml; sin embargo, la viabilidad de las CEMB y PBMC no se vio afectada, sugiriendo que la γ-tionina es selectiva hacia las células cancerosas. Para determinar el mecanismo citotóxico de las defensinas PaDef y γ-tionina (IC50) se evaluó el daño a la membrana citoplasmática, el calcio extracelular y el potencial eléctrico de la membrana citoplasmática. Ninguna de las defensinas modificó estos parámetros, lo que sugiere que el mecanismo no está relacionado con la formación de poros.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas We reported previously that immunomodulatory molecules are able to (i) inhibit the S. aureus internalization into bMECs, such as butyrate (0.5 mM NaB) or 1 mM octanoate (NaO), or (ii) increase the bacterial internalization (0.25 mM NaO). Nonetheless, the molecular mechanisms of these processes have not been described, which are the aim of this study. The results showed that NaB treatment (0.5 mM, 24 h) activated the bMECs by increasing the TLR2 membrane abundance (MA), the p38 phosphorylation and the activation of 8 TF, including AP- 1. Furthermore, the gene expression of AP (TAP, BNBD5 and BNBD10), the cytokine TNF- and the chemokine IL-8 was increased, which favors the antimicrobial and pro-inflammatory responses. The activation of the TLR2/p38 pathway modulated by NaB was inhibited in the NaB-treated and S. aureuschallenged bMECs. Nonetheless, an anti-inflammatory profile and a higher antimicrobial response was observed due to an increased in the gene expression of IL-10 and the AP LAP, TAP, BNBD5 and BNBD10. On the other hand, NaO exerts a dual effect on S. aureus internalization into bMECs; the 0.25 mM NaO (24 h) treatment increases the bacterial internalization, while this process is reduced in 1 mM NaO-treated cells. The bacterial internalization induction modulated by 0.25 mM NaO is associated with an increase in the integrin MA. The kinases phosphorylation was reduced with this treatment, and the TF MEF-1 and Stat-4 were activated. Additionally, the anti-inflammatory response was induced (upregulation of gene expression of IL-10). This effect was reverted by infection. Otherwise, 1 mM NaO treatment did not modify the integrin MA; however, this treatment activated the bMECs by increasing the TLR2 MA, the kinases phosphorylation, and the slightly activation of 14 TF. Likewise, the gene expression of AP (LAP and BNBD10), IL-1 , IL-8 and RANTES was up-regulated which favors the antimicrobial and pro-inflammatory responses. Trabajos previos de nuestro grupo demostraron que moléculas inmunomoduladoras como el butirato (0.5 mM NaB) u octanoato (1 mM NaO) inhiben la internalización de S. aureus en las CEMB, o la estimulan (0.25 mM NaO). Sin embargo, no se conocen los mecanismos involucrados en ello, lo que fue el objetivo de este trabajo. Los resultados mostraron que el NaB (0.5 mM, 24 h) activó a las CEMB al favorecer la abundancia en membrana (AM) del TLR2, la fosforilación de p38 y la activación de 8 FT, como AP-1. Además, se indujo la expresión de genes de los péptidos antimicrobianos (PA) TAP, BNBD5 y BNBD10, de la citocina TNF- la quimiocina IL-8, favoreciendo la respuesta antimicrobiana y pro-inflamatoria. La infección (2 h) inhibió la activación de la ruta TLR2/p38 inducida por el AG. No obstante, se observó una respuesta anti -inflamatoria y una mayor respuesta antimicrobiana, determinada por la expresión del gen de la IL-10 y de los PA LAP, TAP, BNBD5 y BNBD10, respectivamente. El NaO ejerce una acción dual en la internalización de S. aureus en las CEMB. El aumento de la internalización regulada por 0.25 mM NaO está relacionado con un incremento de la AM de las integrinas, pero disminuyó la fosforilación de las cinasas, y sólo activó a los FT MEF-1 y Stat-4. Además, indujo la respuesta antiinflamatoria (aumentó la expresión del gen de la IL-10). Por otro lado, 1 mM NaO (inhibición de la internalización) activó a las CEMB al incrementar la AM de TLR2, la fosforilación de p38, JNK y ERK1/2, y la ligera activación de 14 FT. Asimismo, se indujo la expresión de los genes de los PA LAP y BNBD10, favoreciendo la respuesta antimicrobiana, y se observó una respuesta pro-inflamatoria (aumentó la expresión de los genes de IL- -8 y RANTES). La infección revirtió la fosforilación de las cinasas, la activación de los FT y el perfil pro-inflamatoria generada por el AG. Sin embargo, la respuesta antimicrobiana aumentó y se observó un perfil anti-inflamatorio.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Antimicrobial peptides (PA) are essential components in the defense mechanisms of living organisms. They are molecules 12-100 a, cationic and amphipathic with antimicrobial and cytotoxic properties. Additionally, immunomodulatory properties attributed to them, therefore, the PA represent a therapeutic alternative against strains of microorganisms with multidrug resistance. However, it is unknown whether the plant PA (PAPs) have this activity in mammals. Therefore, the aim of this study was to evaluate the immunomodulatory effect of PAPs (chemically synthesized) the Thi2.1 thionine of Arabidopsis thaliana and g-methionine defensin Capsicum chinense on internalization of Staphylococcus aureus in bovine mammary epithelial cells (bMEC). Bovine mammary epithelial cells (bBMEC) infected with Staphylococcus aureus: To do this, a model of host-pathogen interaction is established. For each evaluation BMEC and S. aureus were treated with the PAPs (0.1-10 ?g/ml) independently. Viability assays (trypan blue exclusion, MTT bBMEC and S. aureus growth kinetics, MTT and count CFU) were performed. For bMEC internalization assays were pretreated with PAPs (24 h) prior to infection with S. aureus. On gene expression of the innate immune response (RII) of bMEC (RT-qPCR), secretion of cytokines (ELISA), NO production (NO2 concentration) and: then the effect was evaluated PAPs presence of the TLR2 receptor (flow cytometry). Based on the results, a cytotoxic effect of PAP Thi2.1 and g-thionin on the feasibility of the bMEC and S. aureus was discarded. The Thi2.1 thionin concentrations of 5 and 10 g/ml inhibited the internalization of S. aureus in 20% CMEB. Furthermore, g-thionin defensin showed an inhibitory effect on the more pronounced (40%) at the concentration of 0.1 mg/ml internalization. Los péptidos antimicrobianos (PA) son componentes esenciales en los mecanismos de defensa de los seres vivos. Son moléculas de 12-100 aa, catiónicos y anfipáticos con propiedades antimicrobianas y citotóxicas. Adicionalmente, se les han atribuido propiedades inmunomoduladoras, por lo cual, los PA representan una alternativa terapéutica contra cepas de microorganismos con resistencia a múltiples fármacos. Sin embargo, se desconoce si los PA de plantas (PAPs) tienen esta actividad en los mamíferos. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto inmunomodulador de los PAPs (sintetizados químicamente) la tionina Thi2.1 de Arabidopsis thaliana y la defensina g-tionina de Capsicum chinense sobre la internalización de Staphylococcus aureus en células de epitelio mamario bovino (CEMB). Para ello, se estableció un modelo de interacción hospedero-patógeno: células de epitelio mamario bovino (CEMB) infectadas con Staphylococcus aureus. Para cada evaluación las CEMB y S. aureus se trataron con los PAPs (0.1-10 ?g/ml) de manera independiente. Se realizaron ensayos de viabilidad (CEMB: MTT y exclusión de azul tripano; S. aureus: cinética de crecimiento, MTT y conteo de UFCs). Para los ensayos de internalización las CEMB se pre-trataron con los PAPs (24 h) previo a la infección con S. aureus. Posteriormente se evaluó el efecto de los PAPs: sobre la expresión de genes de la respuesta inmune innata (RII) de las CEMB (RT-qPCR), la secreción de citocinas (ELISA), la producción de NO (concentración de NO2) y la presencia del receptor TLR2 (citometría de flujo). Con base en los resultados, se descartó un efecto citotóxico de los PAP Thi2.1 y g-tionina sobre la viabilidad de las CEMB y S. aureus. La tionina Thi2.1 a las concentraciones de 5 y 10 g/ml inhibe la internalización de S. aureus en las CMEB en un 20%.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Bovine mastitis is considered one of the most expensive in dairy cattle diseases. One of the main pathogens causing this disease is Staphylococcus aureus. Some strains are able to survive and internalize in various cell types, including cells of bovine mammary epithelium (BMEC). The short-chain fatty acid (SCFA) have different properties among which its immunomodulatory and anti-inflammatory effects. Recently it demonstrated that SCFA recognize receptors in the membrane of BMEC, which were called GPR43 GPR41 and (G protein-coupled receptor). Studies in our working group showed that various salts of AGCC (propionate, butyrate and hexanoate) reduce the internalization of S. aureus in the CBSS. On this basis, the aim of this study was to evaluate the expression of GPR41 and GPR43 receptors in bovine mammary epithelial cells treated with salts AGCC (acetic, propionic, butyric, hexanoic and octanoic) and infected with S. aureus. In none of the conditions and under no treatment was possible to identify any amplification product for the GPR41 receptor. However, it was found that infection was able to induce the expression of GPR43 receptor. Moreover, the five AGCC evaluated (at various concentrations) induce expression of GPR43 receptor. In most treatments, except hexanoate, SCFA reverse the inductor effect of infection, this in a manner dependent on the concentration. Furthermore, the Bordetella pertussis toxin PTX (200 ng/ml) did not affect bacterial growth or viability of BMEC (4 h). Invasion assays S. aureus in BMEC showed that treatment with 200 ng/ml PTX toxin inhibits endocytosis of the bacteria up to 84%. La mastitis bovina es considerada una de las enfermedades más costosas dentro de la ganadería lechera. Uno de los principales agentes patógenos causantes de esta enfermedad es Staphylococcus aureus. Algunas de las cepas tienen la capacidad de internalizarse y sobrevivir en diversos tipos celulares, entre ellos las células de epitelio mamario bovino (CEMB). Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) cuentan con diversas propiedades entre las que destacan sus efectos inmunorreguladores y antiinflamatorios. Recientemente se demostró que los AGCC reconocen receptores en la membrana de las CEMB, los cuales fueron denominados GPR41 y GPR43 (receptores acoplados a proteínas G). Estudios realizados en nuestro grupo de trabajo demostraron que diversas sales de AGCC (propionato, butirato y hexanoato) reducen la internalización de S. aureus en las CEMB. Partiendo de ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de los receptores GPR41 y GPR43 en células de epitelio mamario bovino tratadas con sales de AGCC (acético, propiónico, butírico, hexanoico y octanoico) e infectadas con S. aureus. En ninguna de las condiciones y bajo ningún tratamiento se logró identificar algún producto de amplificación para el receptor GPR41. Sin embargo, se observó que la infección fue capaz de inducir la expresión del receptor GPR43. Además, los cinco AGCC evaluados (a diferentes concentraciones) inducen la expresión del receptor GPR43. En la mayoría de los tratamientos, a excepción del hexanoato, los AGCC revierten el efecto inductor de la infección, esto de una manera dependiente de la concentración. Por otro lado, la toxina PTX de Bordetella pertussis (200 ng/ml) no afectó el crecimiento bacteriano ni la viabilidad de las CEMB (4 h). Los ensayos de invasión de S. aureus en las CEMB mostraron que el tratamiento con 200 ng/ml de la toxina PTX inhibe la endocitosis de la bacteria hasta en un 84%.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Mastitis (inflammation of the mammary gland) bovine is mainly caused by Staphylococcus aureus, facultative intracellular bacterium, which allows it to evade the immune system of the host. The short-chain fatty acid (SCFA) possess anti-inflammatory and immunoregulatory properties. It has been demonstrated that in primary cultures of bovine mammary epithelial cells (BMEC) sodium butyrate reduces invasion (~ 50%) of S. aureus and modulates gene expression of the innate immune response. The objective of this study was to determine the effect of propionate, hexanoate and sodium octanoate BMEC invasion by S. aureus and in the regulation of gene expression of inflammatory and antimicrobial response. SCFA salts (0.25 to 10 mM) did not affect bacterial growth (2h). Hexanoate did not affect the viability of the CBSS, while propionate fell slightly to 24 h; however, octanoate (≥5 mM) decreased it to 24 h, this being more evident at 48 h. Invasion assays S. aureus in BMEC showed reduced hexanoate propionate and invasion in a 27-55% and 39-65% respectively. Octanoate induced invasion of 0.0625 to 0.5 mM; however, he inhibited from 0.75 to 3 mm. There was no relationship between the production of nitric oxide and bacterial invasion. The analysis of gene expression showed that octanoate propionate and, in conjunction with infection, stimulated the expression of tracheal antimicrobial peptide (TAP) and decreased to BNBD5 (β-defensin). Hexanoate inhibited expression of both genes during infection. The three AGCC inhibited mRNA expression of tumor necrosis factor (TNF-α). La mastitis (inflamación de la glándula mamaria) bovina es causada principalmente por Staphylococcus aureus, bacteria facultativa intracelular, que le permite evadir el sistema inmune del hospedero. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) poseen propiedades antiinflamatorias e inmunorreguladoras. Se ha demostrado que en cultivos primarios de células epiteliales mamarias bovinas (CEMB) el butirato de sodio reduce la invasión (~50%) de S. aureus y modula la expresión de genes de la respuesta inmune innata. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del propionato, hexanoato y octanoato de sodio en la invasión de CEMB por S. aureus y en la regulación de la expresión de genes de la respuesta inflamatoria y antimicrobiana. Las sales de los AGCC (0.25-10 mM) no afectaron el crecimiento bacteriano (2 h). El hexanoato no afectó la viabilidad de las CEMB, mientras que el propionato la disminuyó ligeramente a las 24 h; sin embargo, el octanoato (≥5 mM) la disminuyó a las 24 h, siendo esto más evidente a las 48 h. Los ensayos de invasión de S. aureus en las CEMB mostraron que el propionato y hexanoato redujeron la invasión en un 27-55 % y 39-65 %, respectivamente. El octanoato indujo la invasión a 0.0625-0.5 mM; sin embargo, a 0.75-3 mM la inhibió. No hubo relación entre la producción de óxido nítrico y la invasión bacteriana. El análisis de la expresión de genes mostró que el propionato y el octanoato, en conjunto con la infección, estimularon la expresión del péptido antimicrobiano traqueal (TAP) y disminuyeron la de BNBD5 (β-defensina). El hexanoato inhibió la expresión de ambos genes durante la infección. Los tres AGCC inhibieron la expresión del ARNm del factor de necrosis tumoral (TNF-α).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Bovine mastitis is considered one of the most important diseases in dairy farming worldwide. This condition is characterized by an inflammatory response of the mammary gland of multifactorial origin, mainly caused by bacterial infections. Staphylococcus aureus is the prevalent isolates pathogen most often in cases of mastitis (> 70%), it has the characteristic of being a facultative intracellular pathogen, invading epithelial cells by a mechanism of endocytosis. In a previous study it showed that the bovine prolactin (bPRL, 5 ng / ml) stimulates endocytosis of S. aureus (ATCC 27543) by bovine mammary epithelial cells (CBSS), and together with the infection, regulates elements of the response innate immune in CBSS. The expression of these elements depends on the activation of the transcription factor NF-kB, and has recently been shown to activate NF-kB bPRL factor in bovine mammary epithelium regulating the expression of proinflammatory cytokines. However, activation of this transcription factor is regulated by the PRL during the infectious process with S. aureus is itself known. Based on the above, the objective of this study was to determine the regulation of signaling pathway NF-kB during endocytosis of S. aureus in bovine mammary epithelial cells stimulated with bPRL. The results showed that the bPRL induces activation of NF-kB in the CBSS. While S. aureus inhibits nuclear translocation of this factor, even in bPRL (5 ng / ml), which promotes the endocytosis of the bacteria. Regarding the regulation of expression of elements of the innate immune response, the data showed that bPRL (5 ng / ml) induces the expression of mRNA of TNF-a, TAP, iNOS, besides NO production in the CBSS. La mastitis bovina es considerada una de las enfermedades de mayor relevancia en la ganadería lechera a nivel mundial. Esta patología se caracteriza por una respuesta inflamatoria de la glándula mamaria de origen multifactorial, ocasionada principalmente por infecciones bacterianas. Staphylococcus aureus es el patógeno prevalente que se aísla con mayor frecuencia en casos de mastitis (> 70%), éste posee la característica de ser un patógeno facultativo intracelular, invadiendo a las células epiteliales por un mecanismo de endocitosis. En un trabajo previo se demostró que la prolactina bovina (bPRL, 5 ng/ml) estimula la endocitosis de S. aureus (ATCC 27543) por células epiteliales mamarias bovinas (CEMB), y en conjunto con la infección, regula elementos de la respuesta inmune innata en las CEMB. La expresión de estos elementos depende de la activación del factor transcripcional NF-kB, y recientemente se ha demostrado que la bPRL activa al factor NF-kB en el epitelio mamario bovino regulando la expresión de citocinas proinflamatorias. Sin embargo, se desconoce sí la activación de este factor de transcripción es regulado por la PRL durante el proceso infeccioso con S. aureus. Con base en lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la regulación de la vía de señalización de NF-kB durante la endocitosis de S. aureus en células de epitelio mamario bovino estimuladas con bPRL. Los resultados mostraron que la bPRL induce la activación de NF-kB en las CEMB. Mientras que S. aureus inhibe la translocación nuclear de este factor, aún en presencia de bPRL (5 ng/ml), lo cual favorece la endocitosis de la bacteria. Con respecto a la regulación de la expresión de elementos de la respuesta inmune innata, los datos mostraron que la bPRL (5 ng/ml) induce la expresión de los mRNA de TNF-a, TAP, iNOS, además de la producción de NO en las CEMB.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Antimicrobial peptides (PA) are widely distributed in the five kingdoms, its function is to protect living beings against pathogenic organisms. The development of biotechnology has allowed explore the effect of PA on animal pathogens using alternative systems for heterologous expression. Previous reports in the laboratory have shown that the use of bovine endothelium is an appropriate expression pattern PA plant. We assessed the antimicrobial capacity of the g-thionine of Capsicum chinense expressed by bovine endothelial cells, demonstrating its activity on the fungus Candida albicans and the tumor cell line HeLa (Anaya-Lopez et al., 2006a) and activity antimicrobial Thi2.1 of thionine Arabidopsis thaliana also expressed by endothelial cells, which is active against Gram-positive pathogenic bacteria, such as Staphylococcus aureus various cases of bovine mastitis (Ochoa-Zarzosa et al., 2008a), Gram negative pathogenic bacteria such as Escherichia coli, enteropathogenic (responsible for diarrhea in humans) against fungi such as C. albicans and to human tumor cells (Loeza-Angeles et al., 2008). In this sense, the use of PA represents a new strategy for treating infectious diseases, as an alternative to the indiscriminate use of antibiotics and consequently the selection of resistant to them (Brogden, 2005) strains. Recently it has been reported that PA as puroindolines wheat, magainin-2 frog and buforin frog, have antibacterial ability against intracellular pathogens (Takeshima et al., 2003; Capparelli et al., 2007; Imura et al., 2008). Los péptidos antimicrobianos (PA) están ampliamente distribuidos en los cinco reinos, su función es proteger a los seres vivos contra organismos patógenos. El desarrollo de la Biotecnología ha permitido explorar el efecto de los PA sobre microorganismos patógenos de animales empleando sistemas alternativos heterólogos para su expresión. Reportes previos en el laboratorio han mostrado que el empleo del endotelio bovino es un modelo adecuado de expresión de PA de plantas. Se ha evaluado la capacidad antimicrobiana de la g-tionina de Capsicum chinense, expresada por las células endoteliales bovinas, demostrándose su actividad sobre el hongo Candida albicans y la línea tumoral HeLa (Anaya-López et al., 2006a), así como la actividad antimicrobiana de la tionina Thi2.1 de Arabidopsis thaliana expresada también por células endoteliales, la cual presenta actividad contra bacterias patógenas Gram positivas, como lo son diversos aislamientos de Staphylococcus aureus de casos de mastitis bovina (Ochoa-Zarzosa et al., 2008a), bacterias patógenas Gram negativas como Escherichia coli enteropatogénica (responsables de diarreas en humanos), contra hongos como C. albicans y hacia células tumorales de humano (Loeza-Ángeles et al., 2008). En este sentido, el empleo de los PA representa una nueva estrategia de tratamiento de las enfermedades infecciosas, como alternativa al uso indiscriminado de antibióticos y en consecuencia a la selección de cepas resistentes a los mismos (Brogden, 2005). Recientemente se ha reportado que los PA como las puroindolinas del trigo, la magainina-2 de rana y la buforina de sapo, tienen capacidad antibacteriana en contra de patógenos intracelulares (Takeshima et al., 2003; Capparelli et al., 2007; Imura et al., 2008).

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas The main objective of this research was to identify active compounds against the oomycete Phytophthora cinnamomi Rands in rootstocks from Mexican avocado (Persea americana var. drymifolia). Additionally, phenotypic markers linked to that chemical compounds were identified, and the standardization of the methodology for detect molecular markers linked to disease resistance genes analogs (RGAs) in the avocado genome was carried out. Accordingly, with descriptors for collecting site, 48 accessions from the avocado germplasm bank of INIFAP (Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias) were pre-selected for their potential resistance to P. cinnamomi. Root extracts (aqueous and organic phase) were extracted from these accessions and evaluated in vitro against P. cinnamomi mycelium. Eight out of the 48 extracts evaluated exhibited between 50% and 100% inhibition on mycelia growth. Extracts from the accessions 765-01 and 773-01 showed an inhibition of 100%, which were fractionated by thin-layer chromatography on silica gel plates and six fractions were detected under UV light. Fractions IV and V from both extracts with Rf values 0.85 and 0.9 respectively, exhibited 100% in vitro inhibition against mycelia growth of P. cinnamomi. Fraction IV showed a maximum absorbance of 245 nm under UV light and was analyzed by GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrum) in order to identify the active compound. Our results show the presence of a compound (derived from some phytosterol), identified as Stigmastan-3,5-dien (C29H48), which completely inhibited mycelia growth of P. cinnamomi at 100 ppm concentration. The descriptors used in the morphological characterization did not allowed to identify any phenotypic marker for resistance. The standardization process for RGAP methodology could be promissory for detecting molecular markers for disease resistance genes in avocado. El objetivo principal de esta investigación fue identificar compuestos activos contra el oomiceto Phytophthora cinnamomi Rands en portainjertos derivados de plantas de aguacate mexicano (Persea americana Mill. var. drymifolia). Adicionalmente, se trató de identificar marcadores fenotípicos ligados a esos compuestos químicos, y la estandarización de procedimientos en la metodología para detectar marcadores moleculares de genes análogos de resistencia a enfermedades (RGAs) en el genoma de aguacate. Con la información del sitio de colecta, se seleccionaron 48 accesiones de aguacate con potencial resistencia a P. cinnamomi, del Banco de Germoplasma de aguacate del INIFAP (Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas, y Pecuarias), de cuyas raíces fueron obtenidos extractos acuosos y orgánicos. Con el objeto de identificar moléculas bioactivas, los extractos fueron evaluados in vitro contra el micelio de P. cinnamomi. Ocho extractos de las 48 accesiones probadas, exhibieron una inhibición del 50 al 100% del crecimiento micelial. Los extractos de las accesiones 765-01 y 773-01 exhibieron una inhibición del 100%, los cuales fueron fraccionados por cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice, detectando 6 fracciones bajo luz UV. Las fracciones IV y V de ambos extractos, con valores de Rf de 0.85 y 0.90 respectivamente, mostraron inhibición del 100%. La fracción IV presentó una absorbencia máxima de 245 nm, por lo que fue analizada por la técnica de CG-MS (Cromatografía de gases-Espectrometría de masas) para identificar el compuesto activo. Los resultados demostraron la presencia del compuesto (derivado de un fitosterol), Estigmastan-3,5-dieno (C29H48), que inhibió completamente el crecimiento del micelio de P. cinnamomi a una concentración de 100 ppm. Los descriptores usados en la caracterización agromorfológica no condujeron a la identificación de marcadores fenotípicos de resistencia. La estandarización del proceso de análisis RGAP, parece ser promisoria para identificar marcadores moleculares ligados a genes de resistencia a enfermedades en aguacate.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Bacillus thuringiensis is a Gram positive bacterium widely studied because Cry proteins are used as bioinsecticides. B. thuringiensis strains contain a complex pattern of plasmids (1-17) which vary in size from 2 to 200 kilobases (kb). The genes encoding the insecticidal proteins are located on large conjugative plasmids. Most of the small plasmids (< 15 kb) studied in B. thuringiensis replicate by the rolling circle mechanism (RC plasmids) in which single stranded DNA intermediates (ssDNA) are produced. The functions of these RC plasmids in B. thuringiensis are unknown; additionally the number of cloning vectors for gene transfer in B. thuringiensis is limited. The objective of this work was to characterize the genetic elements of plasmid pBMBt1 from B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14 -4. Southern blot and S1 nuclease digestion analysis show that pBMBt1 contains ssDNA intermediates. Subsequently, pBMBt1 was completely sequenced and the analysis of sequence showed that pBMBt1 is a circular molecule of 6700 bases of pairs (bp) with a GC content of 32%, furthermore three open reading frames (ORFs) were identified. The predicted protein of ORF1 (Cry14-4) showed the highest identity with the CryC53 protein from B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa from B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) and Mtx2/3 from B. sphaericus (27.8%). This is the first report that shows the presence of a cry-like gene (cry14-4) in a RC plasmid from B. thuringiensis. The ORF2 (Mob14-4) encodes a Mob protein which is involved in the conjugative mobilization of small plasmids. The Mob14-4 protein showed 74% identity with a Mob protein encoded by plasmid pUIBI-1 from B. thuringiensis subsp. entomocidus and 64% identity with a Mob protein from pBMY1 plasmid from Bacillus mycoides. The mob14-4 gene is functional, as shown by determination of transfer frequencies of 9.1 x 10-6 transconjugants/recipient cell of plasmid pHTmob14-4, which contain the mob14-4 gene from pBMBt1. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva ampliamente estudiada debido al uso de sus proteínas Cry como bioinsecticidas. Las cepas de B. thuringiensis se caracterizan por contener un numero variable de plásmidos (1-17) cuyos tamaños varían de 2 hasta 200 kilobases (kb). Los genes que codifican estas proteínas insecticidas se encuentran en plásmidos grandes y conjugativos. La mayoría de los plásmidos pequeños (< 15 kb) estudiados de B. thuringiensis se replican por el mecanismo del circulo rodante (plásmidos RC), caracterizado por producir intermediarios de ADN de cadena sencilla (ADNcs). La función que desempeñan estos plásmidos RC en B. thuringiensis se desconoce; adicionalmente, el nu?mero de vectores de clonación para la transferencia de genes a B. thuringiensis es limitado. Debido a esto, el objetivo del presente trabajo fue la caracterización de los elementos genéticos del plásmido pBMBt1 de B. thuringiensis subsp. darmstadiensis INTA Mo14-4. Mediante hibridaciones tipo Southern y digestio?n con nucleasa S1 se detectaron intermediarios de ADNcs provenientes del plásmido pBMBt1, característica distintiva de los plásmidos RC. Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos de pBMBt1. El análisis revelo? que pBMBt1 es una molécula circular de 6,700 pares de bases (pb) con un contenido de GC del 32% y se identificaron tres marcos de lectura abiertos (ORFs). La proteína del ORF1 (Cry14-4) mostro? identidad con las proteínas CryC53 de B. thuringiensis subsp. cameroun (24.6%); Cry15Aa de B. thuringiensis subsp. thompsoni (21.9%) y Mtx2/3 de B. sphaericus (27.8%). Este es el primer reporte de la presencia de un gen que codifica una protei?na con identidad a proteínas Cry y que se encuentra en un pla?smido RC de B. thuringiensis. El ORF2 (Mob14-4) codifica la protei?na Mob involucrada en la movilización conjugativa de pla?smidos pequen?os.