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BACKGROUND & AIMS: Acute-on-chronic liver failure (ACLF) is a syndrome that occurs in cirrhosis characterized by organ failure(s) and high mortality rate. There are no biomarkers of ACLF. The LCN2 gene and its product, neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), are upregulated in experimental models of liver injury and cultured hepatocytes as a result of injury by toxins or proinflammatory cytokines, particularly Interleukin-6. The aim of this study was to investigate whether NGAL could be a biomarker of ACLF and whether LCN2 gene may be upregulated in the liver in ACLF. METHODS: We analyzed urine and plasma NGAL levels in 716 patients hospitalized for complications of cirrhosis, 148 with ACLF. LCN2 expression was assessed in liver biopsies from 29 additional patients with decompensated cirrhosis with and without ACLF. RESULTS: Urine NGAL was markedly increased in ACLF vs. no ACLF patients (108(35-400) vs. 29(12-73)μg/g creatinine; p

[eng] Chronic liver diseases are one of the most prevalent diseases worldwide. The study of the signaling pathways involved in the fibrogenic process as well as the evaluation of novel therapies such as nanoparticles (NPs) could be useful to mitigate their progression. In this context, the first objective of this doctoral thesis was to evaluate the role of PTTG1/DLK1 in the profibrogenic process. The expression of PTTG1 and DLK1 was selectively increased in the cirrhotic rat and human liver. Besides, fibrotic mice lacking Pttg1 showed a significant decrease in intrahepatic collagen deposition and the hepatic expression of genes involved in extracellular matrix remodeling in comparison with fibrotic wild type mice. Finally, hepatic Pttg1 interference results in fibrosis attenuation, reduced portal hypertension and diminished transcription of Dlk1 and profibrogenic genes in rats with fibrosis. In conclusion, PTTG1/DLK1 signaling pathway is a promising therapeutic target to mitigate liver fibrosis progression. The second objective of this doctoral thesis was to investigate the potential therapeutic effect of CeO2NPs in experimental hepatocarcinoma. Once administrated in rats with hepatocarcinoma CeO2NPs mainly accumulate in the liver, where they decrease inflammation and cellular proliferation. Besides, CeO2NPs modify the phosphorylation of proteins related to cellular adhesion and RNA splicing. Moreover, the treatment with CeO2NPs results in decreased alpha-fetoprotein serum concentration and increase in animal survival. Finally, the human liver is able to uptake CeO2NPs, which are found free in the cytoplasm and inside endosome-like organelles. In conclusion, CeO2NPs treatment mitigate hepatocarcinoma progression. The third objective was to assess the potential therapeutic effect of a liver-targeted nitric oxide (NO) donor in portal hypertension and liver function in cirrhotic rats with ascites. The targeted NO donor significantly reduces portal hypertension, without modifying mean arterial pressure or cardiac output. Besides, it also ameliorates serum levels of liver function markers, decreases hepatic stellate cell activation and the expression of proinflammatory genes. In conclusion, the liver-specific NO donor reduces portal hypertension and ameliorate liver function in cirrhotic rats with ascites., [cat] Les malalties hepàtiques cròniques son unes de les malalties més prevalents a nivell mundial. L’estudi de les vies de senyalització implicades en la patofisiologia així com l’ús de noves estratègies terapèutiques, incloent les nanopartícules (NPs), podrien ser útils per frenar-ne la progressió. En aquest context, el primer objectiu d’aquesta tesi consistia en avaluar del rol de PTTG1/DLK1 en la fibrogènesi hepàtica. L’expressió de PTTG1 i DLK1 augmenta selectivament en el fetge cirròtic de rata i humà. Ratolins fibròtics deficients pel gen Pttg1 presenten una disminució del col·lagen intrahepàtic i de l’expressió de gens relacionats amb el remodelat de la matriu extracel·lular en comparació amb ratolins fibròtics salvatges. Finalment, la interferència de Pttg1 disminueix la fibrosi, la hipertensió portal i la transcripció de Dlk1 i gens profibrogènics en rates fibròtiques. En conclusió, la via de PTTG1/DLK1 és una diana terapèutica prometedora per frenar la progressió de la fibrosi. El segon objectiu consistia en investigar el potencial terapèutic de les CeO2NPs en l’hepatocarcinoma experimental. Les CeO2NPs s’acumulen al fetge de rates amb hepatocarcinoma, on disminueixen la inflamació i la proliferació i modifiquen la fosforilació de proteïnes relacionades amb l’adhesió cel·lular i l’empalmament del RNA. A més a més, les CeO2NPs redueixen la concentració sèrica d’alfa-proteïna i augmenten la supervivència de rates amb hepatocarcinoma. Finalment, el fetge humà és capaç de captar les CeO2NPs, les quals es localitzen al citoplasma i dins d’orgànuls tipus endosoma. En conclusió, el tractament amb CeO2NPs frena la progressió de l’hepatocarcinoma. El tercer objectiu consistia en avaluar l’efecte d’un donador d’òxid nítric (NO) dirigit específicament al fetge en rates cirròtiques amb ascites. L’administració del donador de NO dirigit disminueix la pressió portal, sense modificar la pressió arterial mitja ni al cabal cardíac. A més, el tractament millora els nivells sèrics de marcadors de funció hepàtica, l’activació de les cèl·lules hepàtiques estelades i l’expressió de gens proinflamatoris. En conclusió, el donador de NO dirigit específicament al fetge disminueix la hipertensió portal i millora la funció hepàtica en cirrosi experimental.

[cat] La detecció precoç de fibrosi hepàtica és de gran rellevància per al diagnòstic i el tractament dels pacients amb una malaltia hepàtica crònica. Actualment, s'utilitzen diversos procediments per a la seva estadificació. No obstant això, aquests mètodes poden comportar complicacions clíniques i/o presentar incertesa diagnòstica principalment en les primeres etapes de la malaltia. En aquest context, el primer estudi de la present tesi doctoral va ser dissenyat per revelar nous biomarcadors no invasius de fibrosi hepàtica en un model in vivo d'inducció a fibrosi i cirrosi mitjançant la inhalació crònica de CCl4. Es van analitzar 94 mostres de sèrum de rates Wistar adultes amb diferents graus de fibrosi hepàtica i 36 rates control. En primer lloc, les mostres de sèrum procedents de 18 rates tractades amb CCl4 es van agrupar en tres conjunts diferents en funció de la gravetat del dany hepàtic i el proteoma sèric es va identificar mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem i lliure de marcatge (label-free LC-MS/MS). A més a més, es van analitzar tres mostres de sèrum obtingudes de la combinació de 16 rates Wistar control. En base a les dades proteòmiques obtingudes, es va realitzar una anàlisi multivariant que va mostrar tres principals vies de senyalització cel·lular alterades en la fibrosi. En estadis cirròtics, es van detectar més desequilibris biològics, així com alteracions multiorgàniques. De les múltiples proteïnes alterades, es va seleccionar l’hemopexina i SIPA1L1 (signal-induced proliferation-associated 1-like 1) com a potencials marcadors sèrics de fibrogènesi hepàtica. Els resultats van ser validats per ELISA en un grup independent de 76 rates fibròtiques/cirròtiques i 20 controls, que van confirmar SIPA1L1 com un potencial biomarcador no invasiu de fibrosi hepàtica. En concret, SIPA1L1 va mostrar una clara disminució en les mostres de sèrum de rates fibròtiques i cirròtiques, així com una gran precisió per identificar estadis primerencs de la malaltia. En conclusió, l'anàlisi proteòmic de mostres sèriques de rates tractades amb CCl4 ha permès la identificació de SIPA1L1 com un marcador no invasiu de fibrosi hepàtica primerenca. El segon estudi es va dissenyar per identificar nous biomarcadors no invasius de fibrosi hepàtica, en un context clínic on el procés fibrogènic es produeix de forma més accelerada: en pacients amb VHC positiu i que es van sotmetre a un trasplantament de fetge (LT). En concret, es van analitzar mostres sèriques de 93 pacients LT amb recidiva del VHC, 41 pacients fibròtics de diferents etiologies no trasplantats i amb un estadi fibròtic F≥1 i, com a grup control, 9 pacients sense recurrència del VHC que van rebre tractament antiviral abans del LT. Finalment, també es va analitzar la sang obtinguda de 16 subjectes sans. Les mostres de sèrum van ser fraccionades per cromatografia d'intercanvi iònic i el seu perfil proteòmic es va analitzar per SELDI-TOF MS. La separació del pèptid d'interès es va realitzar per cromatografia d'intercanvi iònic i electroforesi en gel, seguida de la identificació per espectrometria de masses en tàndem. Es van observar diferències marcades entre el perfil proteic sèric dels pacients LT que van presentar recurrència primerenca de fibrosi i els no recurrents (grup control). De totes elles, l'elevada intensitat que presentava el pic proteic de m/z 5.905 va ser la característica més distintiva dels pacients LT no recurrents. No obstant això, el mateix pic amb prou feines es va detectar en pacients LT recurrents. Aquestes diferències també es van observar en comparar mostres sèriques de subjectes sans amb mostres de pacients fibròtics no trasplantats, fet que indica que els resultats obtinguts no estaven relacionats amb la infecció del VHC o el trasplantament hepàtic. Mitjançant l'ús d'espectrometria de masses en tàndem, es va identificar el pic de m/z 5.905 com un fragment C-terminal de la cadena α de fibrinogen. Els experiments amb cultius cel·lulars van demostrar que TGF-β reduïa l'expressió de mRNA de la cadena α del fibrinogen així com la intensitat del pic proteic en les cèl·lules HepG2, el que suggereix que l'activitat de TGF-β regula els nivells circulants d'aquest fragment . En conclusió, es va identificar un fragment C-terminal de la cadena α del fibrinogen, de 5,9 kDa, com un biomarcador sèric precoç dels processos fibrogènics en pacients amb malaltia hepàtica., [eng] At present, several procedures are used for staging liver fibrosis. However, these methods may involve clinical complications and/or present diagnostic uncertainty mainly in the early stages of the disease. Therefore, the first study was designed to unveil new non-invasive biomarkers of liver fibrosis in an in vivo model of fibrosis/cirrhosis induction by CCl4 inhalation. The study was performed on 94 serum samples obtained from adult Wistar rats with different degrees of fibrosis and 36 control rats. Firstly, 18 serum samples from fibrotic/cirrhotic rats were clustered into 3 different groups according to the severity of hepatic fibrosis and were injected on a LTQ Orbitrap. Three different pooled serum samples obtained from 16 control rats were also analyzed. Among all the identified and quantified proteins, haemopexin and Signal-Induced Proliferation-Associated 1 Like 1 (SIPA1L1) were selected as potential serum markers of liver fibrogenesis. The results were validated by ELISA in an independent group of 76 fibrotic/cirrhotic rats and 20 controls which confirmed SIPA1L1 as a potential non-invasive biomarker of liver fibrosis (AUROC: 0.865). In conclusion, we identified SIPA1L1 as a potential serum marker of early liver fibrosis in an experimental model of hepatic fibrosis. In the second investigation we took advantage of the faster development of hepatic fibrosis in HVC-positive liver transplant patients (LT) to identify early circulating serum biomarkers of active fibrogenesis. We analyzed 93 LT patients with HCV recurrence, 41 non-LT patients with liver disease showing a fibrosis stage F≥1 and 9 patients without HCV recurrence who received antiviral treatment before LT, as control group. Blood obtained from 16 healthy subjects was also analyzed. Serum samples were fractionated by ion exchange chromatography and the proteomic profile was analyzed by a high-throughput proteomic technique (SELDI-TOF MS). Marked differences were observed between the serum proteome profile of LT patients with early fibrosis recurrence and non-recurrent LT patients. The peak located at m/z 5,905 showed the most remarkable difference, since it was fully detected in non-recurrent LT patients but almost suppressed in recurrent LT patients. Similar results were found when comparing samples of healthy subjects with those of non-LT fibrotic patients. Using tandem mass-spectrometry, we identified the protein peak as a C-terminal fragment of the fibrinogen α chain. Finally, cell culture experiments demonstrated that TGF-β reduces α-fibrinogen mRNA expression and m/z 5,905 peak intensity in the secretome of the HepG2 cells. In summary, we identified a 5.9 kDa C-terminal fragment of the fibrinogen α chain as a serum biomarker of early fibrogenic processes in patients with liver disease.

[cat] INTRODUCCIÓ: L'antigen prostàtic específic (PSA) segueix sent el biomarcador més utilitzat per a la detecció del càncer de pròstata (CaP), tot i els problemes relacionats amb resultats falsos positius i el sobrediagnòstic de tumors clínicament insignificants. En els últims anys s'han proposat nous biomarcadors amb l'objectiu d'augmentar l'especificitat i distingir el càncer agressiu del no agressiu. La hipòtesi principal dels estudis inclosos en aquesta tesi és que els biomarcadors de CaP estudiats: % [-2] proPSA, Prostate Health Index (PHI), PCA3 i miARNs són útils per millorar l'eficàcia en el diagnòstic del CaP, permetent així reduir el nombre de biòpsies negatives obtingudes amb l'algoritme utilitzat actualment. D'altra banda, aquests biomarcadors s'associen amb l'agressivitat del tumor, fet que permet distingir els CaP de baix risc dels d'alt risc de progressió. METODOLOGIA: 1. Es va realitzar un primer estudi, que incloïa un total de 354 pacients amb biòpsia positiva o negativa. S’ analitzà [-2] proPSA en sèrum i es féu el càlcul de PHI. També es desenvolupà un model multivariat incloent %[-2] proPSA i PHI per predir el CaP en pacients amb PSA 4 μg/L. Les dades es publicaren a l'article "Real-time PCR PCA3 assay is a useful test Measured in Urine to improve prostate cancer detection". 3. En l'últim estudi, s’analitzaren 5 microARNs en exosomes i sediments de mostres d'orina post massatge prostàtic de 60 pacients amb càncer de pròstata i 10 voluntaris sans. S’estudià la seva expressió mitjançant PCR quantitativa. Les dades es publicaren a l'article "Exosomal and Non-Exosomal Urinary miRNAs in Prostate Cancer Detection and Prognosis". CONCLUSIONS: - % [-2] proPSA i PHI són útils en la detecció del CaP i superen el rendiment diagnòstic de PSA total i % PSA lliure. - % [-2] proPSA i PHI mostren una associació significativa amb l'agressivitat del tumor. - La implementació d'aquests biomarcadors a la clínica milloraria la precisió en la detecció del CaP, reduint el nombre de biòpsies innecessàries i millorant la predicció de l'agressivitat del tumor. - La introducció de PHI i %[-2] proPSA millora el rendiment diagnòstic per detectar el CaP d'un model multivariat que inclou PSA total,% PSA lliure, edat del pacient i volum prostàtic. - El volum prostàtic és un factor clau en la interpretació dels biomarcadors per detectar CaP. - L'índex de PCA3 és útil en la detecció de CaP, superant el rendiment diagnòstic de PSA total i %PSA lliure. - No es trobà associació significativa de l'índex de PCA3 amb l'agressivitat del tumor. - MiR-21, miR-141, miR-214 i miR-375 en els sediments urinaris presenten diferències significatives comparant els grups de pacients amb CaP versus controls sans. - MiR-21, miR-375 i let-7c en exosomes urinaris presenten diferències significatives comparant els grups de pacients amb CaP versus controls sans. - MiR-21, miR-141 i miR-214 en sediments urinaris són capaços de distingir de manera significativa els grups de pacients amb CaP d'alt risc i intermedi versus els de baix risc i controls sans. - MiR-21, miR-375 i let-7c en exosomes urinaris són capaços de distingir de manera significativa els grups de pacients amb CaP d'alt risc i intermedi versus els de baix risc i controls sans., [eng] PSA remains as the most used biomarker in the management of early prostate cancer (PCa), in spite of the problems related to false positive results and overdiagnosis. New biomarkers have been proposed in the last years with the aim to increase specificity and to distinguish aggressive from non-aggressive PCa. The main hypothesis of the studies included in this thesis is that several PCa biomarkers (%[-2] proPSA, PHI, PCA3 and miRNAs) are useful for improving the accuracy in the diagnosis of PCa, reducing the number of negative biopsies obtained with the current algorithm. Moreover, these biomarkers are associated with the aggressiveness of the tumor, distinguishing low-risk PCa from high-risk PCa patients. The results suggest that % [-2] proPSA i PHI are useful in the detection of PCa, with higher accuracy than PSA and % freePSA and that they are significantly associated with the tumor aggressiveness’. Therefore, the implementation of these biomarkers in routine will reduce the percentage of unnecessary biopsies. Besides, the inclusion of PHI and % [-2] proPSA in a multivariate model including total PSA, %free PSA, age and prostate volume improves the diagnostic accuracy for PCa. Available results about PCA3 score showed its usefulness to decide the repetition of biopsy in patients with a previous negative result, although its relationship with the aggressiveness of the tumor is controversial. According to our data, PCA3 score is useful in the detection of PCa, surpassing the diagnostic accuracy of total PSA and % free PSA. However, no significant association between PCA3 score and the aggressiveness of the tumor was found. More recently, aberrant microRNA expression in PCa has been reported by different authors. Our preliminary results suggest the utility of several exosomal and non-exosomal urinary microRNAs in the detection and prognosis of PCa. Although several of these new biomarkers have been recommended by different guidelines, large prospective and comparative studies are necessary to establish their value in PCa detection and prognosis.

En esta tesis se estudian dos aspectos, el desarrollo de herramientas diagnósticas y terapéuticas aplicado a dos enfermedades metabólicas hereditarias: la deficiencia del transportador de creatina (CRTR) y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC). La deficiencia de CRTR, cuya herencia se halla ligada al cromosoma X, se caracteriza por afectación neurológica, retraso en el lenguaje y comportamiento autista, debido a la disminución en el contenido celular de creatina (Cr). La terapia con Cr exógena resulta ineficaz, sin embargo, recientemente, estudios en modelos animales han demostrado la eficacia de algunos derivados de Cr (fosfocreatina-Mg-complex (PCr-Mg-CPLX) y creatina-benzil-éster (CrOBzl)). En esta tesis se ha estudiado la eficacia de estos compuestos en fibroblastos de pacientes con deficiencia de CRTR, iPS generadas a partir de fibroblastos de pacientes, y en células HUVEC y HBMEC silenciadas con siRNA como modelos de endotelio vascular y de barrera hematoencefálica. Desafortunadamente nuestros resultados mostraron que el tratamiento con PCr-MG-CPLX, CrOBzl y nanopartículas de oro (Au-HC-NPs) no incrementaban el contenido intracelular de Cr, por lo que no serían tratamientos eficaces para la deficiencia de CRTR. También se estudió la eficacia del tratamiento con precursores de Cr, arginina y glicina. Sin embargo, no se observó ninguna mejoría en la síntesis endógena de Cr, por lo que no se consideraría una buena estrategia terapéutica. Estos resultados han proporcionado conocimientos acerca de la estabilidad y permeabilidad de estos compuestos; de modo que se ha evidenciado que es necesario mejorar y modificar el diseño de los mismos con el fin de obtener compuestos más estables y lipófilos, capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, para que puedan ser eficaces en la terapia de esta enfermedad. Por otro lado, se evaluó el papel del sistema Cr/CrP/CK/ATP en conjunto como biomarcador de las deficiencias cerebrales de creatina (CCDS), ya que previamente se habían descrito niveles disminuidos de CK en 1 paciente con deficiencia de CRTR y en un paciente con deficiencia de guanidinoacetato metiltransferasa (GAMT). En este trabajo en primer lugar conseguimos obtener un método sensible y robusto mediante HPLC-ESI-MS/MS para el análisis conjunto de ATP, ADP, AMP, Cr, y CrP. El estudio de pacientes con CCDS en plasma mostró niveles bajos de CK en 2 pacientes con deficiencia de CRTR y 1 paciente con deficiencia de GAMT. Sin embargo, en fibroblastos no se observaron diferencias en la actividad CK comparado con los controles. En fibroblastos de los 9 pacientes los niveles de ATP y ADP estaban elevados, y los de Cr y CrP estaban disminuidos. Este es el primer estudio, en el que se analiza en conjunto cada uno de los marcadores involucrados en el sistema energético de la Cr en pacientes con CCDS. Este trabajo corrobora que la actividad CK plasmática podría ser un buen biomarcador de las CCDS y se sugiere que el análisis de cada uno de estos metabolitos podría ser una herramienta útil para la valoración de la respuesta a tratamientos. Previamente también se había descrito que pacientes con enfermedades mitocondriales tenían niveles elevados de Cr, sugiriendo su papel como biomarcador. Dada esta evidencia, hemos estudiado 33 pacientes con enfermedades mitocondriales y se ha observado un aumento notable de Cr en 9 pacientes. La Cr tiene una baja sensibilidad (60%) y una especificidad aceptable (83%) en estas enfermedades. De este estudio se deduce que la Cr, junto con la alteración de otros parámetros debería tenerse en cuenta en la evaluación de una sospecha mitocondrial. Respecto a la enfermedad de NPC, de herencia autosómica recesiva, ésta se caracteriza por neurodegeneración causada por un trastorno en el transporte lisosomal del colesterol libre. El diagnóstico bioquímico convencional se basa en la tinción con filipina de los acúmulos de colesterol libre en fibroblastos. No obstante, esta técnica presenta baja sensibilidad en los pacientes de presentación adulta o con fenotipo bioquímico variante; además de ser una técnica invasiva que implica la obtención de una biopsia de piel y el posterior cultivo de fibroblastos, lo que conduce a largo período de tiempo hasta obtener el diagnóstico. Debido a estas limitaciones surge la necesidad de encontrar biomarcadores rápidos y fiables que ayuden al diagnóstico de la enfermedad. Al inicio de esta tesis se describió el aumento en plasma de dos oxiesteroles, colestano-3β,5α,6β-triol (CT) y 7-cetocolesterol (7-KC), en pacientes NPC sugiriendo su papel como biomarcadores. En este trabajo se ha conseguido obtener un método sensible mediante HPLC-ESI-MS/MS para el análisis de CT y 7-KC capaz de discriminar entre pacientes y sujetos sanos. Se ha analizado por primera vez, el papel de estos oxiesteroles en una cohorte de 16 pacientes NPC diagnosticados en el territorio español y se ha observado que efectivamente tenían niveles elevados de CT y 7-KC, además de correlacionarse perfectamente con el fenotipo clínico. También hemos estudiado 2 pacientes con fenotipo bioquímico variante y un paciente asintomático y en todos CT y 7-KC se encontraban elevados. Para conocer la especificidad de estos biomarcadores estudiamos distintos grupos de enfermedades y se observó que CT estaba también incrementado en pacientes con deficiencia de lipasa ácida lisosomal, Niemann-Pick tipo B y Xantomatosis cerebrotendinosa; 7-KC se encontró elevado en varios grupos de enfermedades. Por ello, CT y 7-KC no son específicos de la enfermedad de NPC aunque sí sensibles, de modo que se ha incluido esta estrategia en la primera línea diagnóstica de la enfermedad de NPC en nuestro laboratorio asistencial. Con esta inclusión, esperamos identificar nuevos pacientes, no sólo de NPC, sino también de otras enfermedades como XCT, deficiencia de LAL, o NPA/NPB.

[spa] La cirrosis afecta a un gran número de pacientes en el mundo, de hecho constituye una de las enfermedades más prevalente en los países occidentales. Puede ser definida como el estadio final de la fibrosis hepática, que consiste en la formación de nódulos y en la alteración de la función hepática. La fibrosis hepática se produce como consecuencia de una cicatrización continua en respuesta a un daño crónico en el hígado. En los últimos 20 años ha habido un gran progreso en el conocimiento de los mecanismos moleculares que se dan en la fibrosis hepática y, en particular, en las vías moleculares que conectan la inflamación crónica del hígado con la fibrosis hepática progresiva. Las investigaciones que están en marcha tienen como diana estos mecanismos moleculares, en un esfuerzo para atenuar la respuesta fibrogénica. Sin embargo, actualmente la mejor terapia para las enfermedades crónicas del hígado continúa siendo la eliminación de la causa primaria de la enfermedad. A pesar de ello existen casos donde no es posible o no es suficiente con eliminar el agente etiológico. Es por tanto fundamental identificar nuevas estrategias terapéuticas que permitan detener o revertir la progresión de la enfermedad hepática. Una de las terapias más prometedoras y que ya ha sido evaluada en pacientes con enfermedad hepática crónica, son los compuestos antioxidantes. El estrés oxidativo se produce por medio de un aumento de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS, RNS) y/o una disminución de los antioxidantes presentes en el hígado. Las ROS y RNS tienen un rol crucial en la inducción y progresión de la enfermedad hepática, independientemente de su etiología. Las nanopartículas de CeO2 debido a su tamaño, estructura y composición química presentan una gran afinidad por el hígado, y a diferencia de otros compuestos antioxidantes, son auto-regenerativas, de manera que permiten evitar una administración continuada. En este sentido, el primer objetivo de la presente tesis doctoral fue investigar el efecto antioxidante de las nanopartículas de CeO2 en ratas con fibrosis hepática, así como el papel que ejerce esta propiedad terapéutica en la inflamación y en la consecuente hipertensión portal. Por otra parte, las nuevas estrategias no sólo se deben dirigir a prevenir y/o revertir la fibrosis hepática, sino que también es importante atenuar los principales trastornos que aparecen en los pacientes con cirrosis hepática avanzada. Dentro de estos trastornos, la hipertensión portal es un síndrome clínico frecuente en los pacientes con cirrosis y se caracteriza por un incremento en la presión venosa portal. En estos pacientes la hipertensión portal es la principal causa de muerte y de trasplante de hígado. Es por ello que se reducción representa una de las principales dianas terapéuticas para mejorar la prognosis en los pacientes con cirrosis avanzada. Estudios han demostrado que los agonistas del receptor de la vasopresina, gracias a su capacidad de vasoconstricción sistémica y mesentérica, son capaces de reducir la presión portal. En este sentido el segundo estudio de la presente tesis analiza el efecto de una nueva generación de agentes farmacológicos capaces de interactuar selectivamente con el receptor V1a de la vasopresina, en la vasodilatación esplácnica y en la hipertensión portal. Globalmente y según los resultados obtenidos en esta tesis doctoral, se puede concluir que la hipertensión portal puede ser tratada, en función del estadio de la enfermedad hepática, mediante dos novedosas y prometedoras estrategias terapéuticas. Por un lado, las CeO2NPs a través de sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios pueden prevenir y/o reducir de forma secundaria la presión portal en animales con fibrosis compensada. Así es como la aplicación de la nanotecnología en el campo de la medicina podría ser una nueva estrategia para tratar en el futuro las enfermedades hepáticas crónicas. Por otra parte, en la cirrosis descompensada hay un aumento de los receptores V1a de la vasopresina a nivel esplácnico. El agonismo parcial de estos receptores permite reducir la hipertensión portal al tener un efecto vasoconstrictor en el mesenterio, movilizando el líquido intravascular hacia la circulación central e incrementando la excreción de sodio y agua., [eng] Chronic liver diseases are characterized by persisting parenchymal injury that can result in chronic activation of inflammatory and wound healing response. Cerium oxide nanoparticles (CeO2NPs) have proven to behave as free radical scavengers and/or anti-inflammatory agents. The aim of the first study was to determine whether CeO2NPs display hepatoprotective properties in experimental chronic liver disease. Most CeO2NPs were located in the liver and it reduced hepatic steatosis, ameliorated systemic inflammatory biomarkers and improved portal pressure without affecting mean arterial pressure. In addition, a marked reduction in mRNA expression of inflammatory cytokines, ET-1 and messengers related to oxidative or endoplasmic reticulum stress signaling pathways was observed in the liver of rats receiving CeO2NPs. This was associated with reduced macrophage infiltration and reduced abundance of caspase-3, a-SMA and inflammatory cytokines. In conclusion, CeO2NPs administration to CCl4-treated rats protects against chronic liver injury by reducing liver steatosis and portal hypertension and markedly attenuating the intensity of the inflammatory response, thereby suggesting that CeO2NPs may be of therapeutic value in chronic liver disease. Patients and rats with advanced cirrhosis have portal hypertension and circulatory dysfunction. Synthetic arginine vasopressin (AVP) receptor agonists able to induce systemic and mesenteric vasoconstriction have shown their usefulness in reducing portal pressure (PP) in this condition. In the second study, we assessed the potential therapeutic value of a new V1a-AVP receptor partial agonist with a preferential splanchnic vasoconstrictor effect (FE-204038) in rats with cirrhosis and ascites. The hemodynamic effects of cumulative intravenous doses of FE-204038, terlipressin, or vehicle were investigated. FE-204038 dose-dependently decreased PP, did not modify mean arterial pressure, and increased SVR. The effect of the V1a-AVP receptor partial agonist on PP was associated with an improvement in urine volume and urinary excretion of sodium during the first day of treatment. SVR was higher and cardiac output and ascites volume were lower in rats with cirrhosis and ascites treated with FE-204038. V1a-AVP receptor expression in rats with cirrhosis and ascites was markedly enhanced in the mesenteric circulation compared to the thoracic aorta. Conclusion: FE-204038 increases sodium excretion and reduces portal hypertension and ascites in experimental cirrhosis. V1a-AVP receptor partial agonism could be a useful pharmacological treatment in decompensated patients with cirrhosis.

El estudio de perfiles peptídicos mediante la tecnología de espectrometría de masas MALDI-TOF es una metodología útil y prometedora para la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico. Sin embargo, existen muchos factores que pueden influir en la variabilidad de los resultados obtenidos. Un análisis previo de dichos factores, así como el diseño de un protocolo estandarizado que sea óptimo para la búsqueda de los biomarcadores que se buscan, es fundamental si no se quiere fracasar en el estudio de investigación. En el presente trabajo se ha diseñado un protocolo estandarizado y optimizado para el estudio de perfiles peptídicos séricos que incluye las fases preanalítica, analítica y postanalítica, con el objetivo de poder ser aplicado a diferentes patologías en la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz. La fase preanalítica se automatizó mediante el uso de un robot, siguiendo el protocolo previamente optimizado de forma manual. Tras la automatización, se evaluó su efecto en la reproducibilidad de los resultados a partir del cálculo del CV interdía del área media de cada uno de los picos presentes en el espectro. El CV interdía pasó de ser un 62%, cuando el proceso se realizaba de forma manual, a un 11.6% cuando se automatizó el proceso. En el presente trabajo también se ha analizado la influencia del género y la edad sobre los perfiles peptídicos séricos llegando a la conclusión de que el efecto de estas dos variables es mínimo y se puede considerar despreciable. Para el análisis estadístico de los resultados, se diseñó un modelo estadístico capaz de buscar la combinación que, con menor número de péptidos, consiguiera discriminar entre los grupos de estudio con una mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica. El protocolo estandarizado y optimizado se aplicó a la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz de cáncer de páncreas. Tras el estudio se obtuvo un panel de biomarcadores que mejoraba la capacidad diagnóstica del marcador clásico CA 19.9 añadiendo los péptidos seleccionados en el estudio (1006,52 Da y 1929,65 Da). Con este panel, se mejora notablemente la sensibilidad diagnóstica de un 75,5% (CA 19.9) a un 89,8% (panel) y la especificidad diagnóstica de un 87,3% (CA 19.9) a un 92,7% (panel). Dichos resultados quedan pendientes de validación e identificación de los péptidos seleccionados. En el estudio de cáncer de páncreas también se concluye que el péptido 4155 Da es característico de enfermedad pancreática. Dicho péptido queda pendiente de validación e identificación. El protocolo estandarizado y optimizado también se aplicó en un estudio de búsqueda de biomarcadores de diagnóstico precoz de ictus isquémico. En este estudio se concluye que el péptido 2155 Da es un buen biomarcador de diagnóstico precoz con un sensibilidad diagnóstica del 88,6% y una especificidad diagnóstica del 96,9% para discriminar entre ictus isquémico y controles sanos. Además, el péptido 2155 Da puede discriminar entre ictus isquémico y enfermedad neurológica aguda al presentar diferente patrón de expresión a lo largo del tiempo en ambas patologías. Queda pendiente la validación de este resultado así como la identificación del péptido. Tras los resultados obtenidos, se puede concluir que el protocolo optimizado y estandarizado propuesto en el presente trabajo de tesis, es útil y se puede aplicar a distintos tipos de patología con el objetivo de encontrar biomarcadores séricos de diagnóstico precoz., The study of peptide profiling by MALDI-TOF MS is a powerful technology in the research of new biomarkers of diagnosis. Nevertheless, there are many factors that can influence in the variability of the results. The aim of this thesis was to design an optimized and standardized protocol for the study of serum peptidome profiling in the research of diagnostic biomarkers. The preanalytical phase was automated by a robot. The automation improved the reproducibility of the results from a 62 % (manual) to an 11.6 % (robot) of coefficient of variation interassay. In the study was analyzed the influence of gender and age in the serum peptidome profiling concluding that the effect of both of them was minimum. In order to analyze the results we designed a new statistical model based in the binary logistic regression. This model tries to search the combination that, with the minimum number of peptides, can distinguish between the groups of the study with the best sensitivity and specificity. The new protocol was applied in two studies. The first study was about the search of new early diagnostic biomarkers in pancreatic cancer. In this study we found a panel of three biomarkers (1006.52 Da, 1929.65 Da and CA 19.9) that improved the sensitivity and the specificity of the CA 19.9 when this biomarker was used alone. Furthermore, we concluded that the peptide 4155 Da is a specific biomarker of pancreatic cancer. The second study was about the search of new early diagnostic biomarkers in ischemic stroke. We concluded that the peptide 2155 Da is a good biomarker to distinguish between ischemic stroke and healthy volunteers. Moreover, the expression of this peptide with time, is different between the group ischemic stroke and the group acute neurological diseases. All these results must be validated with a second study.

El hígado es un órgano que presenta una gran capacidad regenerativa. Para estudiar este fenómeno, el modelo de hepatectomía parcial en ratón es el más adecuado (Higgins GM, Anderson RM. Arch Pathol. 1931). Esta técnica, conjuntamente con el uso de modelos animales modificados genéticamente, nos puede facilitar el estudio de las diferentes moléculas o vías de señalización implicadas en el proceso de regeneración hepática. La resección hepática es una de las medidas terapéuticas más efectivas para el tratamiento del carcinoma hepatocelular. Uno de los problemas a los que se enfrentan estos pacientes es que la aparición de un hepatocarcinoma se asienta sobre un hígado fibrótico o cirrótico. En este contexto clínico, la técnica de la resección se ve comprometida debido a que el hígado cirrótico regenera deficientemente (Bège T, et al. J Gastrointest Surg. 2007). Por este motivo, el procedimiento quirúrgico está asociado a un índice muy elevado de mortalidad (entre el 20 y el 50% según diversos autores). Es por ello, que hipotetizamos que el estudio de la regeneración hepática y el hallazgo de nuevas vías de señalización implicadas en este proceso, posibilitarán el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad hepática crónica. En este contexto, creemos que el estudio de las vías de regulación del metabolismo lipídico hepático tienen más potencialidad terapéutica. Por ejemplo, se ha demostrado que el colesterol es importante en la proliferación celular y se conoce que su deficiencia evita la progresión de las células a través del ciclo celular. Se sabe que cuando hay una acumulación de esteroles, disminuyen la actividad de la proteína HMGCR (HMG-coA reductasa) una enzima limitante en la síntesis del colesterol) y la expresión del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Por el contrario, cuando disminuyen los niveles de colesterol las células mantienen la actividad de la proteína HMGCR y aumenta la expresión del receptor LDL (LDLR). Todo este proceso está regulado por el factor de transcripción SREBP (Brown MS et al. Cell, 1997 y Espenshade PJ. J Cell Sci. 2006). A parte de la implicación del colesterol en la regulación del ciclo celular, también es conocido que durante la regeneración hepática se acumulan grandes cantidades de lípidos en forma de gotas llamadas lipid droplets, las cuales están compuestas mayoritariamente por colesterol y ésteres de colesterol. (Garcia-Arcos I. et al. Lipids. 2010). Aun no se conocen con exactitud los mecanismos y la funcionalidad de esta esteatosis transitoria, ni los mecanismos a través de los cuales la célula es capaz de acumular lípidos durante el proceso regenerativo. Lo que si se ha observado es que tras la hepatectomía parcial existe un descenso de lípidos en el suero, y un aumento de la expresión del gen LDLR. Estos datos sugieren que este receptor estaría involucrado en el transporte de los lípidos hasta el interior de la célula. (Bocchetta M. et al. J Cell Physiol. 1993). Teniendo en cuenta los antecedentes descritos, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue el de investigar como afecta el metabolismo lipídico al ciclo celular y a la regeneración hepática. Específicamente, la tesis se ha dividido en dos estudios: PRIMER ESTUDIO: - El miR-33 se encuentra en el mismo locus genómico que el gen Srebp, y se ha demostrado que este gen regula el ciclo celular. Por lo tanto el objetivo general del primer estudio fue: - Estudiar el papel del miR-33 en la regulación del ciclo celular y su implicación en la regeneración hepática. Objetivos específicos: 1. Estudiar la función de miR-33 en la regulación de las CDKs y las ciclinas y, por tanto, su papel en la regulación del ciclo celular. 2. Identificar posibles dianas de interacción de miR-33 con el 3’UTR de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs). 3. Caracterizar la función del miR-33 durante la regeneración hepática en ratones a los que se les ha practicado una hepatectomía parcial. SEGUNDO ESTUDIO: La hipótesis específica del segundo estudio plantea que la actividad del receptor de las LDL afecta al lipidoma del hepatocito durante el proceso de regeneración hepática. Por lo tanto el objetivo general del estudio fue: • Analizar el efecto de la deficiencia del receptor LDL en la formación de lipid droplets y en la proliferación hepatocelular durante la regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial. Los resultados obtenidos en el primer estudio se resumen en: 1. El miR33 regula la expresión post-transcripcional de la ciclina dependiente de quinasa CDK6 y de la ciclina D1. 2. miR33 se une de manera directa al 3’UTR de los mRNA de Cdk6 y Ccnd1. 3. El miR33 regula la proliferación celular y la progresión del ciclo celular. 4. El antagonismo de miR33 en ratones promueve la regeneración hepática. Los resultados obtenidos en el primer estudio se resumen en: 1. Los ratones LDLR-/- presentan esteatosis y niveles elevados de colesterol circulante. 2. Los ratones LDLR-/- presentan una peor regeneración hepática y presentan una disminución de la función hepática tras la PHx. 3. Los LDLR-/- presentan una alteración en la progresión del ciclo celular y una menor expresión de IL-6, TNF-α y HGF durante la regeneración hepática. 4. La deficiencia del gen LDLR no interfiere en la formación de los lipids droplets pero si en la composición de los mismos. Considerando los resultados presentados en esta Tesis Doctoral formulamos las siguientes conclusiones: 1. miR-33 regula la expresión de los genes Cdk6 y Ccnd1. 2. La regulación de los genes Cdk6 y Ccnd1 se lleva a cabo mediante la unión específica de miR-33 al los transcritos de estos genes. 3. miR-33 regula la proliferación celular de hepatocitos mediante la inhibición de la expresión de Cdk6 y Ccnd1. 4. El tratamiento de ratones hepatectomizados con anti-miR-33 estimula la regeneración hepática. 5. Los ratones deficientes en LDLR presentan una regeneración hepática anómala tras el procedimiento quirúrgico de la hepatectomia parcial. 6. Los ratones deficientes en LDLR muestran una disminución significativa de la función hepática en las etapas iniciales del proceso de regeneración tras una PHx. 7. Los ratones deficientes en LDLR presentan una desregulación de los niveles de IL-6, TNF-alfa y HGF hepáticos durante la regeneración hepática. 8. Los ratones deficientes en LDLR muestran una disminución de la expresión hepática de marcadores de ciclo celular. 9. La deficiencia del gen LDL modifica el lipidoma hepático pero no compromete la formación de lipid droplets. 10. El hígado en regeneración de los ratones deficientes en LDLR-/- presenta una concentración de ésteres de colesterol, colesterol y fosfatidilcolina compatible con un estado quiescente; en contraposición a la composición del lipidoma que predomina en los hígados regenerativos. Considerando las conclusiones expuestas, nuestros datos sugieren que miR-33 tiene potencialidad terapéutica como modulador de la regeneración hepática en el contexto clínico. Además, creemos que el estudio del lipidoma hepático, previo o inmediatamente posterior a la resección hepática, permitiría prever posibles complicaciones hepáticas en pacientes a los que se les ha practicado una hepatectomía terapéutica., Liver shows a well-known regenerative capacity. To study this phenomenon, the partial hepatectomy in rodents has been shown to be the most suitable model. This technique, in combination with the use of genetically modified animal models, can accelerate the study of different molecules or signaling pathways involved in the regeneration process. One of the signaling pathways that potentially have a therapeutically impact are the regulatory pathways of hepatic lipid metabolism. It has been demonstrated that cholesterol is important in cell proliferation and it is known that deficiency prevents the progression of cells through the cell cycle. This process is regulated by the transcription factor SREBP. It is also known that during liver regeneration, there is an accumulation of large amounts of lipids in the form of drops called lipid droplets, which are composed largely of cholesterol and cholesterol esters. It has been observed that after a partial hepatectomy there is a reduction of lipid levels in plasma, and increases the expression of the LDLR gene, suggesting that this receptor might be involved in the transport of lipids through the cell. The overall objective of this thesis was to assess how the lipid metabolism affects the cell cycle during liver regeneration at two different levels. - To study the role of miR-33, a micro RNA encoded in an intronic region of the SREBP gene, in cell cycle regulation and its implication in liver regeneration. -Using genetically modified LDLR-/- mice, analyze the effect of the deficiency of the LDL receptor in the formation of lipid droplets and hepatocellular proliferation during liver regeneration induced by partial hepatectomy. As the results, this thesis proves that miR-33 regulates the post-transcriptional expression of CDK6 and C1 by binding specifically at the 3`UTR of both mRNAs. Therefore miR-33 itself regulates the cell proliferation and cell cycle. A synthetic antagonist of miR-33 stimulates liver regeneration in healthy mice. On the other hand LDLR-/- mice show a deficient liver regeneration and a deficient hepatic function after a partial hepatectomy. Biochemistry and molecular analyses indicate that these mice show altered cell cycle and a decreased expression of different growth factors (IL-6, TNF-alpha and HGF) in the event of hepatic damage. Although LDLR-/- mice are able to form lipid droplets, there are significatively changes on its composition and might be used as an indication of the liver regeneration potential or its performance Our data suggests that miR-33 is an hepatic regeneration modulator and can become a future target molecule in the clinical context because its therapeutical potential. Furthermore the study of hepatic lipidome on patients that need to undergo hepatic surgery might be a tool to foresee failure and decreases the mortality and morbidity of hepatectomy as a therapeutic tool.

PART 1. EFECTE DE LA HIPÒXIA I FACTORS POINFLAMATORIS SOBRE EL REMODELAT CARDÍAC EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. Els mecanismes moleculars pels quals la isquèmia miocardíaca es tradueix en remodelat ventricular i insuficiència cardíaca són poc coneguts. HIPÒTESI. La hipòxia i factors proinflamatoris són inductors específics de recanvi de matriu extracel•lular en els cardiomiòcits humans. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars humans adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condicions de tensió reduïda d’oxigen, CoCl2 (activador del factor de transcripció induïble per hipòxia 1, HIF-1), rotenona (inhibidor de HIF-1), TNFα, IL1β, LPS o vehicle durant intervals de temps variables. Un cop completats els períodes d’incubació, van obtenir-se els sobrenadants i el RNA cel•lulars per determinar la secreció cel•lular i l’expressió gènica de factors relacionats amb el recanvi de matriu extracel•lular. RESULTATS. La hipòxia indueix la producció de PIIINP (propèptid aminoterminal del del procolàgen tipus III) i inhibeix la síntesi i producció de TIMP1 (inhibidor tissular de metaloproteinases tipus 1) en els cardiomiòcits. La IL1β estimula la producció de PIIINP, TIMP1 i àcid hialurònic en cardiomiòcits. CONCLUSIÓ. La hipòxia i la IL1β activen el remodelat de matriu extracel•lular en cardiomiòcits ventriculars humans. Els resultats suggereixen que la hipòxia i la IL1-β són factors contribuents a la dilatació ventricular i insuficiència cardíaca en la malaltia cardíaca isquèmica. PART 2. EFECTE DE LA HIPÒXIA SOBRE LA SECRECIÓ DEL PÈPTID NATRIURÈTIC TIPUS B (BNP) EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. El principal estímul per la síntesi i secreció de BNP es la distensió de la paret cardíaca. Evidències recents suggereixen que la isquèmia cardíaca pot induir també la producció de BNP. HIPÒTESI. La tensió reduïda d’oxigen estimula directament l’expressió gènica i la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans en absència d’estímuls hemodinàmics o neurohormonals. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condiciones normòxiques o hipòxiques amb o sense la presència de rotenona. L’acumulació de BNP, ANP i VEGF es va mesurar en els sobrenadants cel•lulars. L’expressió gènica d’aquests factors va determinar-se mitjançant PCR a temps real. L’activitat transcripcional de HIF-1 va determinar-se en extractes nuclears cel•lulars mitjançant un enziminmunoassaig lligat a la seqüència d’unió de HIF-1 al DNA. RESULTATS. L’activitat transcripcional de HIF-1 va induir-se en condicions hipòxiques. La hipòxia va estimular la secreció i l’expressió gènica de BNP i VEGF però no d’ANP en els cardiomiòcits. La inhibició de HIF-1 en condicions hipòxiques va disminuir la secreció de BNP i VEGF. CONCLUSIONS. La hipòxia indueix la síntesi i secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans a través d’un mecanisme depenent de l’activació transcripcional de HIF-1. PART 3. ESTUDI DE LA SIGNIFICACIÓ CLÍNICA DE LES CONCENTRACIONS PLASMÀTIQUES DE BNP A L’INGRÉS EN PACIENTS AMB SÍNDROME CORONÀRIA AGUDA (SCA). INTRODUCCIÓ. Els pacients SCA presenten concentracions plasmàtiques elevades de BNP atribuïdes a la distensió de la paret ventricular. Existeix poca informació sobre el valor clínic d’aquest marcador cardíac en pacients amb SCA i fracció d’ejecció ventricular esquerra (LVEF) preservada. La demostració que la hipòxia estimula directament la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars permet formular la hipòtesi que els pacients amb SCA sense insuficiència cardíaca i/o disfunció ventricular presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades, en relació al grau d’hipòxia cel•lular. Mètodes. L’estudi es va realitzar en 1806 pacients amb SCA ingressats de forma consecutiva dins les primeres 24 hores posteriors a l’inici dels símptomes. Es va realitzar un seguiment durant un any de l’aparició d’esdeveniments adversos. RESULTATS. La concentració plasmàtica de BNP en els pacients amb SCA i LVEF preservada va ser superior a l’observada en un grup control d’individus sans. Durant el seguiment, l’aparició d’esdeveniments adversos va ser del 10,0% en els pacients amb LVEF reduïda i del 7,9% en els pacients amb LVEF preservada. Els pacients amb BNP>150 pg/ml van presentar una major probabilitat d’esdeveniments adversos. L’anàlisi estadístic multivariat mostra que la contribució de BNP en la predicció d’esdeveniments adversos es manté desprès d’ajustar en funció de la LVEF. CONCLUSIONS. Els pacients amb SCA i LVEF preservada presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades a l’ingrès, que constitueixen un factor predictor independent de presentar nous episodis de SCA i/o mortalitat., MOLECULAR MECHANISMS OF MYOCARDIAL SECRETION: VENTRICULAR REMODELING AND SECRETION OF B-TYPE NATRIURETIC PEPTIDE. The molecular mechanisms by which myocardial ischemia translates in ventricular remodeling and heart failure remain unclear. In the current thesis it was explored whether hypoxia and proinflammatory factors are specific inducers of matrix remodeling in cardiomyocytes. Adult human ventricular cardiomyocytes (AC16 cells) were incubated at normoxic or hypoxic conditions and stimulated with proinflammatory factors. Matrix remodeling and cellular secretion and gene expression of matrix remodeling factors were analyzed. Results show that hypoxia activates matrix remodeling and induces the production of PIIINP (procollagen III N-terminal propeptide) and inhibits the production of TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1). IL1β stimulated the cardiac production of PIIINP, TIMP1 and hyaluronic acid. Results suggest that hypoxia and IL1β may contribute to ventricular dilation and heart failure in ischemic heart diseases. The effect of hypoxia on the cardiac secretion of B-type natriuretic peptid (BNP) was also evaluated. Hypoxia stimulated the protein release and mRNA levels of BNP and VEGF but not ANP in AC16 cells. The analysis of the transcriptional activity of the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) in nuclear extracts showed that HIF-1 activity was induced under hypoxic conditions. The treatment of AC16 cells with the HIF-1 inhibitor rotenone in hypoxia inhibited BNP and VEGF release. In conclusion, data indicate that hypoxia induces the synthesis and secretion of BNP in human ventricular myocytes, likely through HIF-1-enhanced transcriptional activity. This observed direct effect of hypoxia on BNP secretion in human ventricular myocytes allowed hypothesizing that patients with acute coronary syndromes (ACS) without ventricular dysfunction or heart failure present high plasma levels of BNP related with their degree of cardiac hypoxia. Thus, prognostic significance of BNP plasma levels was evaluated in a cohort of 1806 consecutive patients with ACS admitted within the first 24 hours after the onset of symptoms. The follow up for adverse events was of one year. Plasma levels of BNP in ACS patients with preserved left ventricular ejection fraction (LVEF) were higher than in the control group without ACS. During follow-up, adverse events was 10.0 % in patients with reduced LVEF and 7.9 % in patients with preserved LVEF. Patients with BNP>150 pg/ml presented significantly higher probability of adverse events during follow up. Results show that ACS patients with preserved LVEF present higher BNP levels at admission, which constitute an independent predictor of presenting new ACS and mortality.

[eng] Hepatic fibrosis is characterized by intense tissue remodeling. In this study, we assessed whether CO3-610, a new identified neoepitope, could be used as a surrogate biomarker of liver fibrosis and portal hypertension in CCl4-induced experimental fibrosis. Serum CO3-610 was measured by ELISA. Liver fibrosis was quantified by Sirius red staining. Serum hyaluronic acid (HA) was measured with a binding-protein assay. Gene expression of collagens I and III, MMP2 and MMP9, and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1 and 2 was quantified by PCR. Hemodynamic measurements were taken in a subgroup of animals. A close direct relationship was found between serum CO3-610 and hepatic collagen content (r= 0.78; P, [spa] La característica más destacable de la fibrosis es la desregulación de la ME. El equilibrio que existe entre la síntesis y la degradación de la ME en un hígado normal se pierde, y como consecuencia se favorece la síntesis y acumulación de fibras de colágeno, el cual provoca la distorsión de la arquitectura del parénquima y de la red vascular hepática. El CO3-610 es un producto de degradación del colágeno III que ha mostrado estar correlacionado significativamente con el aumento de la cantidad de colágeno y progresión de la fibrosis. Los valores máximos de CO3-610 se han encontrado ratas cirróticas. El resultado más importante es que el CO3-610 ha mostrado tener una estrecha correlación con los valores de presión portal. Existe un gran interés en investigar y desarrollar terapias dirigidas a la prevención de la progresión de la fibrosis. Los endocannabinoides son moléculas lipídicas que participan en un amplio rango de procesos fisiológicos. Los efectos son mediados por dos tipos de receptores, el CB1 y el CB2. El sistema de la apelina es otro sistema endógeno que ha despertado mucho interés en los últimos años. La apelina es el único ligando conocido para el receptor APJ. El tratamiento con AM1241, un agonista selectivo de CB2 y F13A, un antagonista de APJ mejoró la función hepática, la hemodinámica sistémica y portal, y provocó una reducción significativa del grado de fibrosis hepática. Ambos tratamientos produjeron una disminución del infiltrado inflamatorio, angiogénesis y del grado de apoptosis en el parénquima hepático. El análisis de la expresión del mRNA de varios genes importantes implicados en el proceso fibrogénico, reveló que el tratamiento tanto con AM1241 como con F13A, producían una disminución de la expresión del PDGFRβ, del αSMA y de genes de remodelado tisular. La inhibición parcial de la vía de PDGF mediante la administración de un dominante negativo para la fracción soluble del receptor β de PDGF, ha demostrado que mejora la hemodinámica sistémica y la presión portal además de mejorar el grado de fibrosis. Por último, los pacientes cirróticos con ascitis tienen una mayor probabilidad de sufrir infecciones (peritonitis bacteriana espontánea, PBE). Se ha observado que estos pacientes tienen una menor expresión de CB2. In vitro se han realizado experimentos con células monocíticas (U937) y se ha observado que el LPS disminuye drásticamente la expresión de CB2 al igual que afecta a la capacidad de migración de estas células. En conjunto, se puede concluir que la evaluación de la fibrosis hepática es una herramienta muy importante para el diagnostico de la enfermedad hepática y que éste puede mejorarse a través del uso de biomarcadores no invasivos que correlacionen con la hemodinámica y el grado de fibrosis hepática. La prevención de la progresión de la fibrosis a través de fármacos o bien actuando sobre genes clave involucrados en la fibrogénesis son posibles dianas terapéuticas. Finalmente, es posible mejorar la calidad de vida de los pacientes cirróticos con ascitis con infección por PBE mediante terapias que involucren los receptores de cannabinoides CB2.

DE LA TESIS:INTRODUCCIÓN: La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos. Dicho proceso constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se ha implicado a diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua, o la reactividad vascular. Actualmente, se considera que la disfunción renal y el desarrollo de ascitis es el resultado de la vasodilatación arterial en el territorio esplácnico, promovida por la hipertensión portal. Esto da lugar a dos secuencias de acontecimientos bien diferenciados. En primer lugar, la vasodilatación esplácnica aumenta el aflujo sanguíneo en este territorio produciendo un incremento de la presión capilar y de la permeabilidad vascular, así como una mayor formación de linfa. En segundo lugar, la disminución de la presión arterial, como respuesta homeostática compensatoria, activa los sistemas vasoconstrictores endógenos. Estos sistemas, sin embargo, tienen propiedades antidiuréticas y antinatriuréticas, por lo que la activación de los mismos también produce retención renal de sodio y agua. La concurrencia simultánea de estas dos perturbaciones estimula el acumulo de líquido intraperitoneal. Sin embargo, todavía se desconocen los territorios vasculares implicados en la formación de ascitis ni los mecanismos moleculares que regulan la fisiopatología de ese desorden. OBJETIVOS: La presente tesis doctoral tuvo como objetivos investigar cuáles son las áreas vasculares que presentan una permeabilidad vascular alterada en las ratas cirróticas con ascitis y, por otra parte, analizar el impacto de vías de señalización proangiogéncias en los procesos que conducen al aumento de la permeabilidad vascular que origina la ascitis en la cirrosis experimental. RESULTADOS: El hígado y el mesenterio son los tejidos que presentan una permeabilidad vascular aumentada en las ratas cirróticas con ascitis. Los factores vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) y la angiopoyetina-2 se encuentran sobreexpresados en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. El bloqueo agudo del receptor 2 de VEGF reduce drásticamente la permeabilidad vascular en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. Por otra parte, la apelina, un péptido proangiogénico de reciente descubrimiento, se encuentra aumentada en el suero de los pacientes y las ratas con cirrosis. La expresión de dicho péptido y de su receptor se encuentra hiperactivada específicamente en el hígado de las ratas cirróticas con ascitis. Más concretamente, la apelina se sobreexpresa en las células estrelladas hepáticas (CEH), y su receptor, en dichas células y en el parénquima del hígado cirrótico. El bloqueo crónico del receptor de la apelina reduce la angiogénesis y la fibrosis hepática, mejora la hemodinámica sistémica y la función renal en las ratas cirróticas con ascitis. Esos efectos beneficiosos en la hemodinámica y la angiogénesis hepática se vieron asociados con la disminución drástica de la producción de ascitis o incluso la desaparación total de la misma. Para averiguar los agentes que regulan la expresión hepática de este péptido se utilizó una línea de CEH (LX-2). La angiotensina-II y la endotelina-1 (dos factores profibrogénicos) son los principales agentes que estimulan la expresión de apelina en las células LX-2. Precisamente, la apelina actúa de mediador en la estimulación de colágeno-I y de receptor beta de PDGF que realizan angiotensina-II y endotelina-1 en las CEHs. CONCLUSIÓN: El intenso proceso de angiogénesis hepática y mesentérica contribuye de manera significativa al desarrollo de la ascitis en la cirrosis hepática. Por tanto, estos datos apoyan la hipótesis de que el bloqueo de dianas terapéuticas implicadas en angiogénesis puede constituir un avance en el tratamiento de las alteraciones de la permeabilidad vascular que dan lugar a la formación de ascitis en esta enfermedad.

Con frecuencia, la evolución de la cirrosis hepática está asociada a la aparición de transtornos cardiovasculares, caracterizados por la presencia de hipertensión portal, aumento del gasto cardíaco, disminución de la presión arterial media, hiperemia y disminución de las resistencias vasculares periféricas, siendo este último hecho especialmente marcado en el área esplácnica. La aparición de estas alteraciones vasculares tiene como consecuencia la acumulación de líquido ascítico en la cavidad peritoneal. La aparición de ascitis en la cirrosis está asociada a un mal pronóstico, debido tanto a que su aparición implica una mayor desestabilización de la hemodinámica esplácnica y sistémica, como a la facilidad con que es colonizada por bacterias en ausencia de fuentes de infección aparentes, dando lugar a peritonitis bacteriana espontánea (PBE), o a alteraciones en la función pulmonar y oxigenación tisular. Los macrófagos son células especialmente reactivas a estímulos como la presencia de bacterias y sus derivados, a citoquinas proinflamatorias, o a la hipoxia, en respuesta a los cuales pueden producir sustancias con capacidad vasoactiva. Por esta razón, la hipótesis de esta tesis es que los macrófagos residentes en la cavidad esplácnica de los pacientes cirróticos podrían estar produciendo sustancias vasoactivas que actuarían en la vasculatura esplácnica contribuyendo a las alteraciones circulatorias que tienen lugar en esta zona en la cirrosis hepática. El estudio se realizó en macrófagos peritoneales aislados a partir de líquido ascítico de pacientes cirróticos. Estas células fueron mantenidas en condiciones estándar de cultivo durante 48 horas, y en ellas se determinó la síntesis de los factores vasoactivos factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), adrenomedulina (ADM) y endotelina (ET), a nivel de RNA y de proteína, de manera constitutiva y tras la estimulación con las citoquinas proinflamatorias TNF-alfa e IL1-beta, y LPS, o hipoxia (5% O2), así como en macrófagos de pacientes con PBE.Los resultados indican que los macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos sintetizan de manera constitutiva los factores vasodilatadores y proangiogénicos VEGF y ADM, pero no ET (vasoconstrictor), y que esta síntesis es característica de células residentes, ya que no tiene lugar en monocitos de pacientes cirróticos o individuos sanos. Además, la síntesis de VEGF puede ser estimulada in vitro tras la incubación con TNF-alfa, IL1-beta o LPS -solos o en combinación-, mediante un incremento en la transcripción génica de VEGF y en la estabilidad del RNA mensajero. Como las concentraciones de TNF-alfa, IL1-beta y LPS aumentan de manera local en la cavidad esplácnica durante la PBE, a continuación comparamos la síntesis de VEGF por macrófagos aislados de líquido ascítico de pacientes con y sin PBE. De manera espontánea, los macrófagos de pacientes con PBE sintetizan más VEGF que los de pacientes sin infección. Por otro lado, la hipoxia incrementa el RNA mensajero y la síntesis de VEGF y ADM, pero no de ET, por macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos. Este incremento podría estar mediado por el factor de transcripción inducible por hipoxia 1 (HIF1), que es estabilizado en macrófagos en la tensión de oxígeno utilizada (5% O2). Por último, la síntesis de estos mediadores vasoactivos por macrófagos causa proliferación y producción de óxido nítrico en cultivos de células endoteliales, lo que de manera conjunta a la detección de RNA mensajero de los receptores tirosina quinasa de VEGF (KDR y Flt1) en biopsias peritoneales de pacientes cirróticos, sugiere que la síntesis de mediadores vasoactivos por macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos podría tener efectos in vivo, contribuyendo de manera local a las alteraciones circulatorias que tienen lugar en la vasculatura esplácnica.