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Resumo Fundamento: A (-)-carvona é um monoterpeno encontrado em óleos essenciais com atividade antioxidante e anti-inflamátoria. Objetivos: O objetivo deste estudo foi analisar a propriedade antiarrítmica da (-)-carvona no coração de rato e seus efeitos sobre a sinalização de Ca+2 intracelular. Métodos: Os efeitos da (-)-carvona foram avaliados sobre a contratilidade atrial (0,01 – 4 mM) e ventricular (0,5 mM), e no eletrocardiograma (0,5mM). A fração de encurtamento, a corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) e a sinalização de Ca+2 foram medidas no cardiomiócito isolado (0,5 mM). O efeito antiarrítmico foi avaliado no modelo de arritmia induzida por sobrecarga de cálcio (0,5 mM) (n = 5). Um p < 0,05 foi adotado como nível de significância estatística. Resultados: No átrio, a (-)-carvona causou inotropismo negativo de maneira concentração-dependente (EC50 0,44 ± 0,11 mM) e diminuiu o inotropismo positivo induzido pelo CaCl2 (0,1 – 8,0 mM) e BAY K8644 (5 - 500 nM), um agonista de canal de cálcio do tipo L. Em coração isolado, a (-)-carvona (0,5mM) reduziu a contratilidade ventricular em 73% e a frequência cardíaca (em 46%), aumentou o Pri (30,7%, tempo desde o início da onda P até a onda R) e o QTc (9,2%, uma medida de despolarização e repolarização dos ventrículos), sem mudar a duração do complexo QRS. A (-)-carvona diminuiu a fração de encurtamento (61%), a (ICa,L) (79%) e o transiente intracelular de Ca+2 (38%). Além disso, a (-)-carvona apresentou ação antiarrítmica, identificada pela redução do escore de arritmia (85%) e ocorrência de fibrilação ventricular. Conclusão: A (-)-carvona reduz a entrada de Ca+2 através de canais de Ca+2 do tipo L e, assim, diminui a contratilidade cardíaca e o Ca+2 intracelular e apresenta promissora atividade antiarrítmica no coração de ratos.

(-)-Carvone is a monoterpene found in essential oils with antioxidant and anti-inflammatory activity.The aim of this paper was to analyze the antiarrhythmic property of (-)-carvone in the rat heart and its effects on the intracellular Ca2+ signaling.The effects of (-)-carvone were evaluated on the ventricular (0.5 mM) and atrial contractility (0.01 - 4 mM) and on electrocardiogram (0.5 mM). Fractional shortening, L-type calcium current (ICa,L) and Ca2+ signaling were measured in the isolated cardiomyocyte (0.5 mM). Antiarrhythmic effect was evaluated in arrhythmia model induced by calcium overload (0.5 mM) (n = 5). P0.05 was used as the significance level.In the atrium, (-)-carvone evoked negative inotropism that was concentration-dependent (EC50 0.44 ± 0.11 mM) and decreased the positive inotropism evoked by CaCl2 (0.1 to 8.0 mM) or BAY K8644 (5 to 500 nM), an agonist of L-type Ca2+ channel. In isolated heart, (-)-carvone (0.5 mM) promoted reduction of ventricular contractility (73%) and heart rate (46%), increased PRi (30.7%, time from the onset of the P wave until the R wave) and QTc (9.2%, a measure of the depolarization and repolarization of the ventricles) without changing the QRS complex duration. (-)-Carvone decreased the fractional shortening (61%), ICa,L (79%) and Ca2+ intracellular transient (38%). Furthermore, (-)-carvone showed antiarrhythmic action, verified by decrease of the arrhythmia score (85%) and occurrence of ventricular fibrillation.(-)-Carvone decreases Ca2+ entry through L-type Ca2+ channels, reducing the cardiac contractility and intracellular Ca2+, and, therefore, presenting promising antiarrhythmic activity in the rat hearts.A (-)-carvona é um monoterpeno encontrado em óleos essenciais com atividade antioxidante e anti-inflamátoria.O objetivo deste estudo foi analisar a propriedade antiarrítmica da (-)-carvona no coração de rato e seus efeitos sobre a sinalização de Ca+2 intracelular.Os efeitos da (-)-carvona foram avaliados sobre a contratilidade atrial (0,01 – 4 mM) e ventricular (0,5 mM), e no eletrocardiograma (0,5mM). A fração de encurtamento, a corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) e a sinalização de Ca+2 foram medidas no cardiomiócito isolado (0,5 mM). O efeito antiarrítmico foi avaliado no modelo de arritmia induzida por sobrecarga de cálcio (0,5 mM) (n = 5). Um p0,05 foi adotado como nível de significância estatística.No átrio, a (-)-carvona causou inotropismo negativo de maneira concentração-dependente (EC50 0,44 ± 0,11 mM) e diminuiu o inotropismo positivo induzido pelo CaCl2 (0,1 – 8,0 mM) e BAY K8644 (5 - 500 nM), um agonista de canal de cálcio do tipo L. Em coração isolado, a (-)-carvona (0,5mM) reduziu a contratilidade ventricular em 73% e a frequência cardíaca (em 46%), aumentou o Pri (30,7%, tempo desde o início da onda P até a onda R) e o QTc (9,2%, uma medida de despolarização e repolarização dos ventrículos), sem mudar a duração do complexo QRS. A (-)-carvona diminuiu a fração de encurtamento (61%), a (ICa,L) (79%) e o transiente intracelular de Ca+2 (38%). Além disso, a (-)-carvona apresentou ação antiarrítmica, identificada pela redução do escore de arritmia (85%) e ocorrência de fibrilação ventricular.A (-)-carvona reduz a entrada de Ca+2 através de canais de Ca+2 do tipo L e, assim, diminui a contratilidade cardíaca e o Ca+2 intracelular e apresenta promissora atividade antiarrítmica no coração de ratos.

This work correlated the presence of oral streptococci in dental biofilm with clinical indexes of caries and oral hygiene in caries-active and caries-free children. S. mutans and/or S. sobrinus in the dental biofilm does not indicate a direct risk for developing dental caries.Este trabalho correlacionou a presença de estreptococos orais no biofilme dental com índices clínicos de cárie dentária e higiene oral em crianças com alta e baixa atividade de cárie. S. mutans e/ou S. sobrinus no biofilme dental não significa o imediato desenvolvimento de lesões cariosas.

Little is known regarding the role of suppressor of cytokine signaling (SOCS) in the control of cytokine signaling in cardiomyocytes. We investigated the consequences of SOCS2 ablation for leukemia inhibitory factor (LIF)-induced enhancement of intracellular Ca

The effects of a bufadienolide isolated from toad venom, arenobufagin, a potent Na+/K+ pump inhibitor, were studied in single guinea-pig ventricular cells in the whole-cell patch-clamp configuration. Arenobufagin (50 microM) applied extracellularly decreased the amplitude of the delayed rectifier K+ current (IdK) by 30% without affecting the gating kinetics. The L-type Ca2+ current was also depressed, but to a lesser extent. The inward rectifier K+ current was hardly affected. Ouabain and the internal dialysis of cells with the solution containing 20 mM Na+ depressed IdK in a similar way as arenobufagin. On the other hand, arenobufagin also depressed IdK when the Na+/K+ pump was already inhibited in the K(+)-free Tyrode solution. Therefore, both a direct effect on the channel and an indirect effect through the inhibition of the Na+/K+ pump may be involved in the depression of IdK by arenobufagin.

Aerobic capacity is essential to physical performance, and low aerobic capacity is related to the triggering of various cardiovascular diseases.To compare the morphology and contractility of isolated rat cardiomyocytes with low performance and standard performance for exercise.Wistar rats with 10 weeks of age underwent a protocol of treadmill running to fatigue, and were divided into two groups: Low Performance (LP) and Standard Performance (SP). Then, the animals were sacrificed, the heart was quickly removed and, by means of enzymatic dissociation, left ventricular cardiomyocytes were isolated. The cell and sarcomeres length and width of cardiomyocytes were measured using an edge detection system. The isolated cardiomyocytes were electrically stimulated at 1 and 3 Hz and cell contraction was measured by registering the change of their length.The cell length was shorter in the LP group (157.2 ± 1.3 µm; p0.05) compared to SP (161.4 ± 1.3 µm), and the same result was observed for the volume of cardiomyocytes (LP, 25.5 ± 0.4 vs. SP, 26.8 ± 0.4 pL; p0.05). The time to peak contraction (LP, 116 ± 1 vs. SP 111 ± 2 ms) and total relaxation (LP, 143 ± 3 vs. SP 232 ± 3 ms) were higher in the LP group.We conclude that left ventricular myocytes of animals with low performance for exercise are smaller than animals with standard performance. In addition to that, they present losses in contractile capacity.

The effects of arenobufagin, a bufadienolide isolated from toad venom, on the Na + /K + pump were investigated by recording the whole-cell current of dissociated cardiac myocytes. Arenobufagin blocked the Na + /K + pump current in a dose-dependent manner with a half-maximal concentration of 0.29 μM and a Hill coefficient of 1.1. Arenobufagin is 3.5-fold more potent than ouabain.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer de mama é a principal causa de morte em mulheres no mundo e sua incidência aumenta a cada ano. Condições genéticas e ambientais dão suporte para o surgimento de carcinomas com graus de agressividade e processos tumorogênicos distintos. Apesar de ser o câncer mais estudado no mundo, protocolos terapêuticos ainda não são eficientes para conter o número de mortes atuais. A heterogeneidade de tumores sólidos e o estudo in vitro entre linhagens normais e metastáticas dificultam a compreensão do processo carcinogênico e tumorigênico por não conseguirem responder por completo os circuitos celulares que sustem o surgimento e a evolução tumorigênicas das células tumorais. A avaliação de contextos comuns e distintos entre as várias fase da evolução do tumor pode trazer luz a esse processo e subsidiar a construção de medidas diagnósticas e terapêuticas mais eficientes. Utilizando o estudo de linhagens celulares em diferentes estágios tumorigênicos (MCF-10A: origem não tumoral; MGSO-3 e MACL-1: origem de tumor primário; MDA-231-MD: origem metastática), o objetivo desse trabalho foi caracterizar condições que demonstrassem diferenças e semelhanças nos estágios de evolução tumoral através da análise proteômica. Foram identificadas e quantificadas 3.008 proteínas, das quais, após análise estatística com P < 0,05 e fold-change de 1,3, caracterizamos 1.709 proteínas em todas as linhagens celulares. As análises dos gráficos de PCA e do heat map evidenciaram a distinção das linhagens com relação ao seu estágio tumorigênico. Na análise de ontologia gênica, várias vias de sinalização se mostraram alteradas, com enfoque, nesse trabalho, para vias de metabolismo energético, alterações do citoesqueleto e do ciclo celular. Com relação ao metabolismo celular, linhagens tumorais de sítios primários e metastático possuem perfil de regulação distinto, com o catabolismo aeróbico ativo nas células MGSO-3 e MACL-1 e anaeróbico na célula MDA-231-MD. Em conjunto, células tumorais não possuem vias lipolíticas para produção energética, principalmente via β oxidação. Além da via anaeróbica, a linhagem metastática utiliza vias não canônicas para obtenção de energia, como turnover do citoesqueleto de actina. Vias metabólicas correlacionam-se com vias apoptóticas dependentes de mitocôndrias, com vias de BAX e BcL ativas nas linhagens tumorais de origem primária e inativadas pela ação da proteína 14-3-3ε nas linhagens tumorais de origem metastática. Além disso, a densidade de mitocôndrias também está diminuída nas células MGSO-3 e MACL-1 e aumentada na célula MDA-231-MD em comparação a célula MCF-10A. Com relação ao ciclo celular, as linhagens de sítio primário tem suas vias controladas ação do proteassoma 26s, o que não ocorre com a linhagem de sítio metastático. Já a arquitetura do citoesqueleto nas células MGSO-3 e MACL-1 apresentam uma desregulação das suas vias de controle, o que não acontece na célula MDA-231-MD, com processos biológicos de regulação semelhante à célula MCF-10A. Todos os resultados apresentados corroboram para a importância da questão tumorogênica como base da compreensão dos circuitos proteicos que determinam o estabelecimento, sobrevida e maturação de células tumorais e podem subsidiar estudos sobre alvos diagnósticos e terapêuticos mais eficientes. Breast cancer is the leading cause of deaths in women worldwide. Genetic and environmental conditions support the outbreak of carcinomas with varying degrees of aggressiveness and tumorogenesis, leading to the cell transformation to primary cancer cells. Such factors can also give rise to metastasis. Even though breast cancer is one of the most studied type of cancer, yet pharmacological and therapeutic treatments are not efficient to reduce death rate. The ways to study breast cancer are through fragments of solid tumors removed in surgical procedures or in vitro studies using cell lines, though both strategies have limitations. For example, fragment of solid tumor is composed by several cell populations, which leads to high heterogeneity. On the other hand, in vitro studies usually are based on metastatic tumor lines, reflecting only the end of the tumor development process. The main objective of this work was to evaluate the proteome profile of breast cancer cell lines at different tumorigenic stages to better understand the molecular mechanisms underlying the tumorigenic process. Through the comparative analysis of the proteomes of MCF-10A (non-tumor origin), MGSO-3 and MACL-1 (primary tumor origin), and MDA-231-MD (metastatic origin) cell lines, we evaluated the functional state of each cell profile. In total, we identified and quantified 3,008 proteins and 1,709 regulated proteins (P < 0.05 and fold-change = 1.3). The PCA analysis and heat map showed a correlation between tumorigenic profile and proteome profile. Besides, the Venn diagrams demonstrated that similar tumorigenic profiles also shared higher number of proteins. Through gene ontology analysis, several positive and negative regulated biological processes were found across the cell lines. Similar biological processes were grouped into large clusters. In this work, we focused our analyses in terms related to energy metabolism, alterations in the cell cycle, and alterations in the cytoskeleton. Concerning energy metabolism, the tumor cell lines showed downregulation of lipid biosynthesis and the metastatic cell (MDA-231-MD) was the only one showing upregulation of β-oxidation. On the other hand, proteins related with the carbohydrate metabolism were mainly upregulated in the primary cells (MGSO-3 and MACL-1) and downregulated in the metastatic cell, mainly the proteins associated with the aerobic phase. These results are in line with an aerobic metabolism for the primary tumor lines and anaerobic metabolism for the metastatic one. This metabolic dichotomy seems to reflect on mitochondrial activity, as the primary tumor cells had lower mitochondrial density compared with the normal and metastatic cell lines. Furthermore, regulation profile of proteins associated with the mitochondrial BAX-dependent apoptotic pathways suggest that the primary cells are more prone for apoptosis compared with metastatic and normal cells. Regarding the cell cycle, the tumor cell lines have the highest number of upregulated processes. Besides, primary tumor cells seem to have upregulated biological processes related to the 26s proteasome, which is responsible for controlling oxidative processes and signaling pathways, mainly on the MACL-1. Regarding the cytoskeleton, the MDA-231-MD was the only tumor cell line to show upregulated biological processes, mainly related to cell adhesion mechanisms. Moreover, some upregulated proteins associated with cytoskeleton were also related with the glycolytic pathway, demonstrating that the role of cytoskeleton proteins are not only structural and for defense, but also for the survival of the metastatic tumor cell. All the results presented here are important for the better understanding of the molecular grounds of breast cancer tumorigenesis.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Myocardial infarction (MI) is the irreversible injury of the myocardium caused by prolonged myocardial ischemia and is a major cause of heart failure and eventual death among ischemic patients. The current trend of mortality due to MI and shortcomings of available therapeutics informed the need for an alternative remedy that could make the heart more resistant to infarction. Andrographolide is the principal compound in Andrographis paniculata, an indigenous plant commonly included in herbal concoction indicated for cardiovascular diseases and chest pains. Therefore, the present study assessed the protective potentials of andrographolide against isoproterenol-induced myocardial infarction in rats. Animals were randomly divided into four groups: Control (Ctr) group received 0.9 % saline solution once daily for 21 days, Isoproterenol (Iso) group received 0.9 % saline solution once daily for 19 days followed by 80 mg/kg/day of isoproterenol hydrochloride solution on day 20 and 21, Andrographolide (Andro) group received 20 mg/kg/day of andrographolide for 21 days, and Andrographolide plus Isoproterenol (Andro + Iso) group received 20 mg/kg/day of andrographolide for 21 days with co-administration of 80 mg/kg/day of isoproterenol hydrochloride solution on day 20 and 21. At the end of all treatments, cardiac-specific parameters that define cardiac health and MI were evaluated in all groups. Likewise, the mechanical and electrical profiles that shapes the functions of the heart were assessed in cardiomyocytes isolated from each group using standard assay methods. In addition, effects of Andro on these mechanical and electrical profiles were further substantiated with in-vitro tests and compared to standard drug of MI. Iso caused: ST-segment elevation and significant (p

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As serpentes pertencentes aos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus são responsáveis pela maioria dos casos de ofídismos no Brasil. Serpentes do gênero Crotalus spp e Micrurus spp possuem veneno neurotóxico com alta letalidade se não neutalizado a tempo. As serpentes do gênero Bothrops e Lachesis apresentam veneno com ação proteolítica, ocasionando danos permanentes mesmo após o tratamento com soros antiofídicos. O uso tradicional de venenos na imunização de animais para a produção de soros antiofídicos apresenta alguns problemas, uma vez que os animais imunizados podem sofrer com toxicidade dos componentes do veneno, o que diminui sua expectativa de vida. Além disso, a extensa variabilidade inter e intraespecífica na composição bioquímica dos venenos de serpentes podem afetar a eficácia neutralizante dos soros antiofídicos. Dessa forma, é de suma relevância a utilização de novas tecnologias para buscar e produzir imunógenos atóxicos alternativos para serem utilizados na produção de soros antiofídicos. O uso de peptídeos sintéticos e proteínas multiepitópicas que mimetizam epítopos das principais toxinas de cada veneno constituiria uma alternativa para produção de anticorpos neutralizantes com menor impacto sobre os animais experimentais. Esta tese apresenta-se na forma de três artigos, cada um está contido em um capítulo da parte dos resultados. Cada capítulo apresenta seu resumo individualizado. Segue a descrição do conteúdo de cada capítulo: Capítulo 1, (Artigo 1 - Identification of a linear B-cell epitope in the catalytic domain of bothropasin, a metalloproteinase from Bothrops jararaca snake venom), neste artigo descreve-se o mapeamento e síntese de um epítopo linear para células B da bothropasina capaz de induzir anticorpos neutralizantes. Capítulo 2, (Artigo 2 - Engineered protein containing Crotoxin epitopes induces neutralizing antibodies in immunized rabbits), neste artigo descreve-se a produção de uma proteína recombinante multiepitopo da crotoxina capaz de induzir anticorpos neutralizantes do efeito letal da crotoxina. Capítulo 3, (Artigo 3 - Proteomic and toxinological characterization of Peruvian pitviper Bothrops brazili ("jergón shushupe"), venom.), neste artigo, os componentes do veneno de Bothrops brazili (BbV) foram analisados por RP-HPLC, SDS-PAGE e MALDI-TOF/TOF, mostrando que as metaloproteases do veneno de serpentes (SVMPs) foram as proteínas mais abundantes no veneno de B. brazili. Cada artigo apresenta sua discussão em separado. Ao final do terceiro artigo uma discussão geral dos três artigos é apresentada. Snakes belonging to the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and Micrurus are responsible for most cases of snakebites in Brazil. Snakes of the genus Crotalus spp and Micrurus spp have neurotoxic venom with high lethality if not neutralized in time. Bothrops and Lachesis venom display proteolytic action, causing permanent damage even after treatment with antiofidic sera. The traditional use of venoms in the immunization of animals for the production of antiofidic sera have drawbacks, since the immunized animals may suffer because of toxic components of the venom, which reduces their life expectancy. Beside, the extensive inter and intraspecific variability in the biochemical composition of snake venoms can affect the neutralizing efficacy of antiofidic sera. Thus, it is crucial to use new technologies to search for and produce alternative non-toxic immunogens that can be used in the production of antiofidic serums. The use of synthetic peptides and multiepitopic proteins that mimic epitopes of the main toxins of each venom would be an alternative for the production of neutralizing antibodies with less impact on experimental animals. This work is presented in the format of three articles, each one containing in a separated chapter of results. Each chapter presents its individualized abstract. The content description of each chapter is shown below: Chapter 1, (Article 1 - Identification of a linear B-cell epitope in the catalytic domain of bothropasin, metalloproteinase from Bothrops jararaca snake venom), this article describes the mapping and synthesis of a linear B cell epitope for bothropasin, capable of to induce neutralizing antibodies. Chapter 2, (Article 2 - Engineered protein containing Crotoxin epitopes induces neutralizing antibodies in immunized rabbits), this article descridbes the production of a multiepitopic recombinant crotoxin protein, capable of inducing neutralizing antibodies. Chapter 3, (Article 3 - Proteomic and toxinological characterization of Peruvian pitviper Bothrops brazili ("jergón shushupe"), venom.), In this article, the components of Bothrops brazili (BbV) venom were analyzed by RP-HPLC, SDS-PAGE and MALDI-TOF/TOF, showing that snake venom metalloproteinases (SVMPs) were the most abundant proteins in the venom of B. brazili. Each article presents its discussion separately. At the end of the third article a general discussion of the three articles is presented.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Introdução: O carcinoma hepatocelular (CHC) é a terceira cause de morte entre os cânceres em todo o mundo. Várias doenças hepáticas crônicas são fatores predisponentes ao CHC. Diferentes vias de sinalização já foram identificadas na patogênese do CHC, porém nenhuma via comum foi reportada. A sinalização intracelular de cálcio (Ca2+) regula a proliferação de hepatócitos saudáveis e de células tumorais, podendo vir a ser um alvo no desenvolvimento do CHC. Objetivo: Investigar se a metilação do DNA regula a expressão dos receptores de Inositol 1,4,5-trifosfato do tipo 3 (ITPR3) em hepatócitos saudáveis e se a desregulação desse processo está envolvida na tumorigênese hepática. Métodos: A expressão do ITPR3 em amostras de fígado humano, células hepáticas tumorais e fígado de camundongo foi realizada combinando a análise dos níveis de metilação do DNA na região promotora do gene ITPR3 e a caracterização dos efeitos da expressão de ITPR3 na proliferação celular e no processo apoptótico. A expressão de novo de ITPR3 foi avaliada em hepatócitos murino, assim como a sinalização de Ca2+ e a capacidade regenerativa do fígado. Resultados: ITPR3 não é expresso ou é expresso em baixa quantidade em hepatócitos normais, mas sua expressão é aumentada em amostras de CHC de diferentes etiologias e está relacionada a uma menor sobrevida do paciente. O DNA da região promotora do gene ITPR3 é altamente metilado em hepatócitos saudáveis, encontrando-se significativamente desmetilado em pacientes com CHC. Administração de um agente desmetilante em camundongos resultou na expressão de ITPR3 em algumas áreas do fígado, culminando com um aumento na sinalização de Ca2+. Essa expressão de novo de ITPR3 resultou em uma maior proliferação dos hepatócitos, aumentando a capacidade regenerativa do fígado. A deleção de ITPR3 em células de CHC humano resultou em um aumento do apoptose. Conclusão: Juntos, os resultados sugerem que a expressão de novo de ITPR3 é um evento comum ao CHC e pode estar envolvida na patogênese da doença. Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second leading cause of cancer death worldwide. Several types of chronic liver disease predispose to HCC, and several different signaling pathways have been implicated in its pathogenesis, but no common molecular event has been identified. Calcium (Ca2+) signaling regulates the proliferation of both normal hepatocytes and liver cancer cells and can be a target in the HCC development. Objective: We investigated the role of the protein involved on the intracellular Ca2+ signaling in HCC. Design: Expression analyses of the type 3 isoform of the inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (ITPR3) in human liver samples, liver cancer cells and mouse liver were combined with the evaluation of DNA methylation profiles of ITPR3 promoter in HCC and characterization of the effects of ITPR3 expression on cellular proliferation and apoptosis. The effects of de novo ITPR3 expression on calcium signaling and liver growth were evaluated in mice. Results: ITPR3 was absent or expressed in low amounts in hepatocytes from normal liver, but was expressed in HCC specimens from three independent patient cohorts, regardless of the underlying cause of chronic liver disease, its increased expression level was associated with poorer survival. The ITPR3 gene was heavily methylated in control liver specimens but was demethylated at multiple sites in specimens of patient with HCC. Administration of a demethylating agent in a mouse model resulted in ITPR3 expression in discrete areas of the liver, and Ca2+ signalling was enhanced in these regions. In addition, cell proliferation and liver regeneration were enhanced in the mouse model, and deletion of ITPR3 from human HCC cells enhanced apoptosis. Conclusions: These results provide evidence that de novo expression of ITPR3 typically occurs in HCC and may play a role in its pathogenesis.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O presente TCM consiste da aplicação de três atividades e construção de uma sequencia didática, voltadas à educação ambiental no ensino médio, modalidade EJA, utilizando como tema a despoluição em ambientes aquáticos realizada pelos microrganismos. A educação ambiental é garantida na educação básica pela Constituição Nacional de 1988, leis 9.795/99; 6.938/81; LDB/97 e pelo PCN/2000. A EJA é assegurada pela LDB/17. O ensino por investigação presente no PCN/2000, NBCC/17 e estudado por diversos pesquisadores, deve apresentar entre outras características problematização, proposição de hipóteses, comparação das hipóteses com os resultados encontrados e a elaboração de conclusões. O estudo dos microrganismos e suas importantes ações na proteção ambiental são endossados por vários estudos publicados pela comunidade científica, PCN/2000 e pela BNCC/17. Os objetivos foram elaborar e aplicar atividades práticas de natureza investigativa sobre a ação dos microrganismos na despoluição das águas e um questionário pré e outro pós-atividades, realizar uma pesquisa sobre estação de tratamento de esgoto, produzir uma sequencia didática a partir das atividades desenvolvidas, estimular o senso crítico dos estudantes com relação ao papel dos microrganismos da despoluição e na preservação do meio ambiente e fazer uma visita técnica a uma ETE. Foi aplicado o questionário pré-atividade, logo em seguida realizadas as atividades de cunho investigativo e a pesquisa, por último utilizado o questionário pós-atividade e construída a sequencia didática. Os resultados mostraram que a realização das atividades propostas possibilitou um estudo com características investigativas, permitiu um ganho de conhecimento pelos alunos e estimulou a construção do senso crítico e de argumentos com relação ao papel dos microrganismos na depuração de poluentes e na conservação do meio ambiente. Conclui-se que exercícios aplicados foram ferramentas efetivas para o entendimento da ação dos seres vivos microscópicos na limpeza de ambientes aquáticos, oportunizaram o ganho e a consolidação do conhecimento e o diagnóstico de defasagens persistentes após o estudo. The present work describes three distinct activities and a didactic sequence developed for young and adult students in high school focusing on environmental education, more specifically, on water cleaning processes bioremediated by microorganisms. According to the Brazilian Constitution of 1988, environmental education as part of basic education is assured by law (9.795/99; 6.938/81; LDB/97 and PCN/2000), as well as it is the access to education for young and adult people (Portuguese=EJA; law LDB/17). An investigative teaching, as presented in the PCN/2000 and NBCC/17 and studied by several researchers, should combine a clear identification of the problem with formulation of hypotheses, evaluation of the obtained results and eventually statement of conclusions on the topic. The importance of investigating microorganisms, as well as their relevance for habitat conservation, have been demonstrated in several scientific studies and highlighted in the PCN/2000 and BNCC/17. The aims of the present work were to (1) elaborate and apply practical investigative activities on the role microorganisms in water cleaning processes, (2) carry out a survey prior and after the developed activities, (3) perform a research on sewage treatment plant, (4) design a didactic sequence from the activities proposed, (5) stimulate the critical thinking of the students regarding the role of microorganisms in water cleaning processes and habitat conservation, and finally (6) visit a sewage treatment plant for practical purposes. For that, a survey was performed prior to the activities. Thereafter, the investigative and research activities were carried out, a post-activity survey was applied and the didactic sequence was designed. The obtained results show that the approach presented herein allows studies with investigative characteristics, substantially increases the knowledge of the students and favour their critical thinking and argumentation regarding the role of the microorganisms in water cleaning processes and habitat conservation. To conclude, the applied actions formed effective tools for understanding the importance of microscopic organisms for aquatic environments, and allowed for the development and consolidation of the knowledge, as well as the identification of possible gaps that remained after the study.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A Neuropatia Diabética Periférica (NDP) é a complicação mais comum do diabetes, atingindo aproximadamente 50% dos pacientes diabéticos e sendo a principal causa de morbidade por ulceração do pé e amputação. Dentre os pacientes que desenvolvem a NDP, entre 20 e 30% sofrem de Dor Neuropática Diabética (DND). Indivíduos afetados pela DND descrevem os episódios de dor como sensações de formigamento, queimação, dormência e/ou perfuração por agulhas eletrizadas. Estudos clínicos e pré-clínicos têm mostrado que pacientes diabéticos com DND apresentam aumento na concentração sérica de TNF, enquanto estudos com animais diabéticos têm mostrado que o TNF induz o aumento da expressão de canais de sódio Nav 1.7, o que resultaria na sensibilização de terminais periféricos de neurônios nociceptores, fator que contribuiria para o desenvolvimento da DND. Atualmente, os tratamentos disponíveis para a DND resultam em alívio insatisfatório da dor para a maioria destes pacientes. Por isso, o presente trabalho verificou se o tratamento de ratos diabéticos com o Composto A, um agente natural com comprovada atividade anti-inflamatória, é capaz de prevenir o desenvolvimento da hiperalgesia nestes animais. Para tanto, ratos Wistar com 28 dias de vida foram induzidos ao diabetes via injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65 mg/kg). Durante o período de 60 dias, estes ratos tiveram avaliados seu limiar mecânico pelo método de Randall-Selitto. Após coleta de amostras de sangue, a concentração sérica de TNF foi medida nestes ratos no dia anterior à indução ao diabetes e no dia 60 após a indução pelo método de ELISA. No dia 60 após a indução ao diabetes, os ratos foram eutanasiados para obtenção de seus DRGs e dissociação de seus neurônios. Destes neurônios foram aferidas a corrente total de sódio pela técnica de Patch Clamp, na modalidade Whole Cell. Estes protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA – sob o número de protocolo 233/2013. Os ratos do grupo Diabético apresentaram hiperglicemia sustentada em comparação com ratos do grupo Controle (550,7 ± 10,6 mg/dl, n=22 e 117,9 ± 1,7 mg/dl, n= 24, respectivamente, dia 60 após a indução ao diabetes). Neste parâmetro, ratos diabéticos tratados com o Composto A (Diabético + CA) apresentaram valores de glicemia similar aos do grupo Diabético (539,4 ± 30,1 mg/dl, n=7). O grupo Diabético também mostrou redução do limiar mecânico quando comparado com o grupo Controle (116,1 ± 5,8 g, n=16 e 212,1 ± 5,9 g, n=18, respectivamente, dia 60 após a indução ao diabetes), sendo esta redução do limiar mecânico do grupo Diabético atenuada no grupo Diabético + CA (143,9 ± 5,6 g, n=11). Concomitante com estes dados, os ratos do grupo Diabético exibiram elevada concentração sérica de TNF em comparação com os ratos do grupo Controle (624,9 ± 97,8, n=7 e 340,3 ± 16, n=7, respectivamente), enquanto nos ratos do grupo Diabético + CA os valores verificados foram similares aos do grupo Controle (320,8 ± 10, n=7). Em relação aos dados de eletrofisiologia celular, o grupo Diabético apresentou aumento da densidade da corrente total de sódio em comparação com o grupo Controle (231,4 ± 25,1 pA/pF, n = 10 e 189,4 ± 10,7 pA/pF, n = 18, respectivamente). O grupo Diabético + CA, por sua vez, exibiu valores de densidade da corrente total de sódio semelhante aos do grupo Controle (159,2 ± 14,7 pA/pF, n = 12). Estes dados indicam que o tratamento com o Composto A foi capaz de atenuar, mas não impedir completamente, o desenvolvimento da hiperalgesia. Esta atenuação resulta, possivelmente, da redução nos níveis de TNF sérico dos ratos do grupo Diabético + CA. O presente trabalho também verificou os efeitos da exposição de neurônios dissociados do DRG ao TNF na concentração de 700 pg/ml (concentração similar à encontrada no sangue de ratos do grupo Diabéticos) sobre a densidade das correntes de sódio sensível à TTX (TTXs) e resistente à TTX (TTXr) pela técnica de Patch Clamp. Com 6 horas de exposição, o TNF induziu o aumento tanto na densidade da corrente de sódio TTXs (≈89%) quanto na densidade da corrente de sódio TTXs (≈65%). No entanto, se verificou que o TNF sensibiliza tanto a cinética de ativação estacionária rápida quanto a cinética de inativação rápida da corrente de sódio TTXs, apenas, causando hiperpolarização nos valores de V1/2 na ordem de ≈5 mV e ≈3 mV, respectivamente. Com estes dados, nota-se que a concentração sérica de TNF encontrada nos ratos do grupo Diabético é capaz de alterar a alterar a corrente de sódio TTXs e TTXr, de forma a contribuir com o aumento da excitabilidade destes neurônios. Desta forma, a redução nos níveis séricos de TNF nos ratos do grupo Diabético + CA atenuaria o desenvolvimento da hiperalgesia nestes ratos. Peripheral Diabetic Neuropathy (PDN) is the most common complication of diabetes, affecting approximately 50% of diabetic patients and being the main cause of foot ulcer morbidity and amputation. Among patients who develop PDN, between 20 and 30% suffer from Diabetic Neuropathic Pain (DNP). Individuals affected by DNP describe episodes of pain such as tingling sensations, burning, numbness and/or drilling by electrified needles. Clinical and preclinical studies have shown that diabetic patients with DNP show an increase in serum TNF concentration, whereas studies with diabetic animals have shown that TNF induces increased expression of Nav 1.7 sodium channels, which would result in sensitization of terminals periphery of nociceptive neurons, a factor that would contribute to the development of DNP. Currently, treatments available for DNP result in unsatisfactory pain relief for most of these patients. Therefore, the present study verified whether the treatment of diabetic rats with Compound A, a natural agent with proven anti-inflammatory activity, is able to prevent the development of hyperalgesia in these animals. For this, 28-day-old Wistar rats were induced to diabetes via intraperitoneal injection of streptozotocin (65 mg/kg). During the 60 day period, these rats had their mechanical threshold assessed by the Randall-Selitto method. After collection of blood samples, serum TNF concentration was measured in these rats on the day prior to diabetes induction and at day 60 after induction by the ELISA method. At day 60 after induction to diabetes, the rats were euthanized to obtain their DRGs and dissociate their neurons. From these neurons the total sodium current was measured by the Patch Clamp technique, in Whole Cell mode. These protocols were approved by the Ethics Committee on the Use of Animals (CEUA) under the protocol number 233/2013. The rats of the Diabetic group had sustained hyperglycemia in comparison to control rats (550.7 ± 10.6 mg/dl, n=22 and 117.9 ± 1.7 mg/dl, n=24, respectively, day 60 after induction to diabetes). In this parameter, diabetic rats treated with Compound A (Diabetic + CA) showed glycemic values similar to those of the Diabetic group (539.4 ± 30.1 mg/dl, n=7). The Diabetic group also showed a reduction of the mechanical threshold when compared to the Control group (116.1 ± 5.8 g, n=16 and 212.1 ± 5.9 g, n=18, respectively, day 60 after induction to diabetes). This reduction in the mechanical threshold of the diabetic group was attenuated in the Diabetic + CA group (143.9 ± 5.6 g, n=11). Concomitant with these data, the rats of the Diabetic group exhibited a high serum TNF concentration compared to the Control group rats (624.9 ± 97.8, n=7 and 340.3 ± 16, n=7, respectively), while in the Diabetic + CA rats the values verified were similar to those in the Control group (320.8 ± 10, n=7). Regarding to the cellular electrophysiology data, the Diabetic group presented increase of total sodium current density in comparison with the Control group (231.4 ± 25.1 pA/pF, n=10 and 189.4 ± 10.7 pA/pF, n=18, respectively). The Diabetic + CA group, on the other hand, showed values of total sodium current density similar to those in the Control group (159.2 ± 14.7 pA/pF, n=12). These data indicate that treatment with Compound A was able to attenuate, but not completely prevent, the development of hyperalgesia. This attenuation is possibly a result of the reduction in serum TNF levels of the rats from the Diabetic + CA group. The present work also verified the effects of the exposure of neurons dissociated from DRG to TNF at a concentration of 700 pg/ml (concentration similar to that found in the blood of rats from the Diabetic group) over both TTX-sensitive sodium currents (TTXs) and resistant to TTX (TTXr) by the Patch Clamp technique. After 6 hours exposure, TNF induced the increase in both TTX sodium current density (≈89%) and TTX sodium current density (≈65%). However, it was found that TNF sensitizes both the fast stationary activation kinetics and the fast inactivation kinetics of the TTXs sodium current, only, causing hyperpolarization in the V1/2 values in the order of ≈5 mV and ≈3 mV, respectively. With these data, it is noticed that the serum concentration of TNF found in the rats of the Diabetic group is able to induce a change in the sodium current TTXs and TTXr, in order to contribute with the excitability increase of these neurons. Thus, the reduction in serum TNF levels in the Diabetic + CA group rats would attenuate the development of hyperalgesia.

Os glicosídeos cardioativos (GCs) são substâncias que atuam na bomba de sódio e potássio (NKA) do coração exercendo atividade inotrópica. O GC mais conhecido é a digoxina, empregado até hoje no tratamento da insuficiência cardíaca (IC). No entanto, sua restrita margem de segurança impulsiona a descoberta de novas substâncias cardioativas. Nesse âmbito, pouco se sabe sobre a atuação cardiovascular da oleandrina e ouabaína. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos comparativos dos GCs na fisiologia cardiorrenal. Inicialmente, foi realizado estudo da posologia da digoxina determinando-se que a dose efetiva capaz de alterar a contratilidade dos cardiomiócitos sem causar arritmias graves é de 50ug/kg via SC por 21 dias. Determinaram-se os valores de referência para os parâmetros eletrocardiográficos (ECG) e a melhor fórmula de correção do intervalo QT para ratos Wistar. Estabeleceu-se um protocolo anestésico para realização de ECG com isoflurano e determinação dos valores médios, desvio-padrão, mínimo e máximo dos principais parâmetros: frequência cardíaca (FC), duração e amplitude da onda P, duração dos intervalos PR e QT, duração do complexo QRS, amplitude das ondas R e T. Também foi feita a avaliação comparativa das fórmulas de QT, onde a fórmula de Hodges apresentou melhor correlação com a FC. E, finalmente, avaliaram-se os efeitos comparativos da digoxina, ouabaína e oleandrina na fisiologia cardiorrenal. A análise comparativa entre os GCs revelou importantes diferenças quanto à sua ação no sistema cardiovascular. Os GCs alteraram a série vermelha do hemograma, o que foi comprovado pela presença de equinócitos observados pela microscopia de varredura. Os animais que receberam oleandrina apresentaram lesões cardíacas mais graves observadas pela maior atividade sérica de LDH, aumento relativo da CK-MB necrose focal moderada de cardiomiócitos visto na microscopia óptica; ruptura, encurtamento e desorganização das fibras cardíacas como observado na microscopia eletrônica de varredura. Os três tratamentos provocaram aumento relativo da creatinina e discretas lesões observadas na microscopia óptica renal. A expressão da troponina I e isoforma alfa-1 não foram alteradas, no entanto os níveis proteicos de BNP e alfa- 2 foram superiores nos grupos que receberam oleandrina e ouabaína em relação ao grupo digoxina. Todos os GCs afetaram a produção de ROS, sem no entanto causar peroxidação lipídica, por meio da ativação de diferentes vias antioxidantes. Conclui-se que os efeitos dos GCs são variáveis, possivelmente pela diferença entre a afinidade e inibição da bomba NKA. Cardioactive glycosides (GCs) are substances that act on the sodium and potassium pump of the heart (NKA) exerting inotropic activity. The best known GC is digoxin, used to date in the treatment of heart failure (HF). However, its narrow range of safety drives the discovery of new cardioactive substances. In this context, little is known about cardiovascular performance of oleandrin and ouabain. The aim of this study was to evaluate the comparative effects of GCs on cardiorenal physiology. Initially, a digoxin dosage study was performed, determining that the effective dose capable of altering the contractility of cardiomyocytes without causing serious arrhythmias is 50 ug/kg via SC for 21 days. The reference values for the electrocardiographic parameters (ECG) and the best QT interval correction formula were determined for especially Wistar rats. An anesthetic protocol was established for ECG with isoflurane and determination of mean values, standard deviation, minimum and maximum of the main parameters: heart rate (HR), duration and amplitude of P wave, duration of PR and QT intervals, duration of the QRS complex, amplitude of the R and T waves. The comparative evaluation of the QT formulas was also performed, where the Hodges formula presented a better correlation with the HR. Finally, the comparative effects of digoxin, ouabain, and oleandrin on the cardiorenal system were evaluated. The comparative analysis between GCs revealed important differences in their action on the cardiovascular system. GCs altered the red blood cell series, which was confirmed by the presence of echinocytes observed by scanning microscopy. Animals receiving oleandrin had more severe cardiac lesions observed by increased serum LDH activity, relative increase of CK-MB, and moderate focal necrosis of cardiomyocytes seen in light microscopy; rupture, shortening and disorganization of cardiac fibers as observed in scanning electron microscopy. The three treatments caused a relative increase of the creatinine and discrete lesions observed in renal optic microscopy. The expression of troponin I and alpha-1 isoform were not altered, however, the protein levels of BNP and alpha-2 were higher in the groups that received oleandrin and ouabain in relation to digoxin group. All GCs affected the production of ROS, without causing lipid peroxidation, through the activation of different antioxidant pathways. It is concluded that the effects of GCs are variable, possibly due to the difference between the affinity and inhibition of the NKA pump.

O Hipocampo é uma estrutura altamente relacionada à formação e resgate da memória. A neurofisiologia aponta grandes evidências para existência de uma segregação espaço temporal de microcircuitos nessa região e um dinamismo quanto à atividade regido por eventos de plasticidade sináptica. A partir da neurobiologia computacional, é possível combinar parâmetros eletrofisiológicos e anatômicos à estudos comportamentais e modelos matemáticos capazes de elucidar novos caminhos em busca do conhecimento do funcionamento do cérebro. Em nosso trabalho nos baseamos na hipótese de segregação de microcircuitos da região CA1 do Hipocampo para procurar diferenças na susceptibilidade de vias a se potencializarem frente à estimulação de alta frequência. Encontramos padrões de geração de LTP que sugerem uma susceptibilidade intrínseca de potencialização da via ativada, quando estimulamos em uma posição fixa e registramos em posição variada, que independe de valores basais de fEPSP e da distância da posição de registro. Ao aplicarmos três estímulos tetânicos sequencias em intervalos de 15 minutos não encontramos padrões plausíveis que se encaixem em um cenário homogêneo de populações neuronais. Futuras análises permitirão estudar esse fenômeno, que a princípio sugere uma possível segregação espaço-temporal de vias, quanto à susceptibilidade de potencialização evocada por TBS na região dorsal de CA1 do Hipocampo Hippocampus is highly correlated with memory formation and rescue. Neurophysiogy shows great evidences for the existence of a spatio-temporal segregation of microcircuits in this region a dynamism regarding its activity dictated by synaptic plasticity events. By computational neurobiology, it is possible to combine electrophysiological and anatomical partterns to behavioral studies and mathematical models that are able to elucidate new directions on the way for the knowledge of brains physiology. In our study we based on the hypothesis of microcircuits segregation on CA1 region of Hippocampus to look for differences in the susceptibility of microcircuits to potentiate in front of high frequency stimulation. We found patterns of LTP that suggest an intrinsic susceptibility of potentiation of the activated microcircuit, when we stimulate in a fixed position and register in a varied position, that is independent of basal values of fEPSP and the distance of the registration position. By three consecutive tetanic stimuli, with 15 minutes intervals, we did not find plausible patterns that fit into a homogeneous setting of neuronal populations. Future analyzes will allow the study of this phenomenon, which at first suggests a possible space-time segregation of microcircuits regarding its susceptibility of potentiation evoked by TBS in the dorsal CA1 region of Hippocampus

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais O câncer de mama é a principal neoplasia entre as mulheres, totalizando os maiores índices de incidência e mortalidade em todo o mundo. Devido a sua grande importância na saúde pública mundial, a busca por novas formas de diagnóstico e de terapias mais eficientes contra esta patologia se tornou objeto de estudo de diversos grupos ao redor do mundo. Recentemente, a participação de canais iônicos no desenvolvimento de tumores tem sido investigada. Os canais de Na+ dependentes de voltagem são proteínas transmembrana importantes para a excitabilidade celular; alterações em seu funcionamento e expressão são normalmente associados a patologias cardíacas e neurológicas. Entretanto, diferentes estudos têm relatado o envolvimento desses canais com o aumento da agressividade tumoral em neoplasias da mama. O presente trabalho buscou avaliar a presença desses canais em células de tumores primários de mama, buscando indícios da possível participação dessas proteínas nas etapas iniciais do processo de tumorigênese. Os resultados demonstraram a presença de correntes de influxo produzidas por canais de Na+ dependentes de voltagem para ambas as linhagens de tumor primário. Além disso, identificou-se a presença de canais do tipo Nav1.5 e Nav1.7, que estavam expressos não apenas na membrana dessas células, mas também na membrana nuclear e em seu citoplasma. Ao final deste trabalho foi possível concluir que os canais de Na+ dependentes de voltagem estão presentes, ao contrário do que se pensava, em estágios mais iniciais do desenvolvimento tumoral, indicando a participação desses canais em processos importantes para o estabelecimento do tumor. Além disso, observamos que estes canais estão presentes em grande parte do ambiente subcelular, o que foi associado a possível participação destes canais em outros processos celulares que não estejam ligados à permeabilidade iônica.

Introdução: De acordo com a Organização Mundial da Saúde, as doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no mundo. A hipertrofia cardíaca constitui-se em processo adaptativo em resposta a sobrecargas hemodinâmicas crônicas, representando importante fator de risco para doenças cardíacas, tais como isquemia, arritmia e morte súbita. Uma das principais lacunas associadas ao tratamento das doenças cardiovasculares é a complexidade dos eventos que levam à sua progressão e as diversas formas de manifestação. Tonina é uma serinilproteinase, capaz de liberar angiotensina II (Ang II). Estudos preliminares do nosso grupo de pesquisa mostraram que camundongos transgênicos que expressam tonina de rato (TGM(rTon)) são “resistentes” a hipertrofia cardíaca induzida por isoproterenol (ISO). Objetivo: Identificar quais fatores moleculares e vias de sinalização celular levam a resistência à hipertrofia cardíaca observada no animal TGM(rTon). Métodos: TGM(rTon) e seu controle C57 foram submetidos a indução de hipertrofia cardíaca com ISO (20 mg/kg/dia), realizada durante 5 dias. Após processo de indução foi determinado o índice de hipertrofia cardíaca. Tonina de glândula submandibular de rato foi purificada e adicionada à cardiomiócitos neonatais isolados de ratos e submetidos a estímulo hipertrófico com Ang II. Nestes miócitos foram realizadas medidas de área celular e de translocação do GRK-5 para o núcleo, ambos por meio de imunofluorescência. Os níveis de expressão de tonina no coração foram mensurados por Western Blot. Os níveis de expressão de diversos genes relacionados com hipertrofia foram avaliadas por PCR tempo real, nos cardiomiócitos isolados e em coração de TGM(rTon) e seu controle. RNA-seq foi realizado para identificar o transcriptoma do coração. As bibliotecas foram agrupadas e sequenciadas a 300 ciclos, na sequência paired-end, e as análises de enriquecimento de vias foram feitas utilizando a ferramenta enrichr 5. Resultados: Nossos dados confirmam a resistência a hipertrofia do TGM(rTon). Nos cardiomiócitos isolados, tonina reverteu a hipertrofia celular induzida por Ang II e diminuiu a translocação do GRK-5 para o núcleo dos miócitos. Tonina também reduziu os níveis de expressão gênica de BNP, AT1 e MYH7, e aumentou os níveis de expressão gênica do receptor MAS. Não houve alteração nos níveis de expressão gênica do ANP e GRK-5. No coração dos animais TGM(rTon) os níveis de expressão de tonina foram maiores quando comparado a seu controle. Após tratamento com ISO os níveis de expressão de tonina foram ainda maiores no TGM(rTon). Os níveis de expressão gênica do receptor AT1, de MYH7 e de BNP também se mostraram diminuídas no coração de TGM(rTon) tratado com ISO, ao passo que os níveis de expressão de ANP mostraram-se aumentados. Por RNA-seq foi constatado que 18 genes diretamente ligados a hipertrofia cardíaca (POSTN, CRLF1, LTBP2, SSP1, LOX, COL5A2, CTGF, NMRK2, ACTA1, MEOX1, CILP, NPPB (ou BNP), THBS-4, TNC, SERPINB1A, C1QTNF3, 2200002DOIRICK e PRC1) se mostraram negativamente regulados nos TGM(rTon) tratados com ISO, em comparação com os C57 também tratados com ISO. Os resultados foram validados por q-PCR e confirmamos que os genes POSTN, LTBP2, LOX, COL5A2, ACTA1 e NPPB estavam menos expressos nos animais TGM(rTon) tradados com ISO. Conclusão: Tonina, através da regulação negativa de diversos genes exerce papel cardioprotetor importante ao impedir a hipertrofia cardíaca e celular. Introduction: According to the World Health Organization, cardiovascular diseases are the major cause of mortality in the world. Cardiac hypertrophy is an adaptive process in response to chronic hemodynamic overloads, representing an important risk factor for heart diseases, such as ischemia, arrhythmia and sudden death. One of the main gaps associated with the cardiovascular diseases treatment is the complexity of the events that lead to its progression and the various manifestation forms. Tonin is a serineproteinase, capable of releasing angiotensin II (Ang II). Preliminary studies from our research group have shown that transgenic mice expressing rat tonin (TGM(rTon)) are "resistant" to isoproterenol (ISO) induced cardiac hypertrophy. Objective: To identify which molecular factors and cell signaling pathways lead to cardiac hypertrophy resistance observed in the TGM(rTon) animal. Methods: TGM(rTon) and its control C57 were submitted to cardiac hypertrophy induction with ISO (20 mg / kg / day), performed during 5 days. After the induction process, the index of cardiac hypertrophy was determined. Tonina of submandibular mouse gland was purified and added to isolated neonatal cardiomyocytes from rats and subjected to hypertrophic stimulation with Ang II. In these myocytes, cell-area measurements and translocation of GRK-5 to the nucleus were performed, both by immunofluorescence. The tonin expression levels in the heart were measured by Western Blot. The expression levels of several genes related to hypertrophy were evaluated by real-time PCR, in isolated cardiomyocytes and in the TGM (rTon) heart and its control. RNA-seq was performed to identify the heart transcriptome. The libraries were pooled and sequenced at 300 cycles in the paired-end sequence, and pathway enrichment analyzes were performed using enrichr 5 tool. Results: Our data confirm TGM(rTon) cardiac hypertrophy resistance. In the isolated cardiomyocytes tonin prevent cellular hypertrophy Ang II-induced and decreased GRK-5 translocation to the myocyte nucleus. Tonin also reduced BNP, AT1 and MYH7 gene expression levels and increased gene expression levels of MAS receptor. There was no change in the ANP and GRK-5 gene expression levels. TGM(rTon) hearts presented higher tonin expression levels when compared to their control. After ISO treatment, tonin expression levels were even higher in TGM(rTon). AT1, MYH7 and BNP gene expression levels were also decreased in the TGM(rTon) heart after ISO treatment and ANP expression levels were increased. In the present study it was found that 18 genes are directly associated to cardiac hypertrophy: POSTN, CRLF1, LTBP2, SSP1, LOX, COL5A2, CTGF, NMRK2, ACTA1, MEOX1, CILP, NPPB (or BNP), THBS-4, TNC, SERPINB1A, C1QTNF3, 2200002DOIRICK and PRC1. These genes were negatively regulated in the TGM(rTon) treated with ISO compared to C57 also treated with ISO. The results were validated by q-PCR and we confirmed that POSTN, LTBP2, LOX, COL5A2, ACTA1 and NPPB were less expressed in the TGM(rTon) treated with ISO. Conclusion: Tonin, through negative regulation of several genes, plays an important cardioprotective role in preventing cardiac and cellular hypertrophy.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O advento das células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC ou iPSC's) causou uma grande expectativa no campo científico e clínico, pois são derivadas de células somáticas, crescem indefinidamente in vitro sem perder sua "pluripotenticidade" e tem enorme potencial de diferenciação, podendo produzir diversos tipos celulares tais como miócitos cardíacos. Apesar dos imensos esforços para desenvolver uma terapia baseada em células tronco, os cardiomiócitos derivados de iPSC's (iPSC’s-CM’s) possuem função basal ainda aquém de células adultas do tecido cardíaco. Nesse trabalho propomos que o protocolo de maturação que consiste da simples suplementação do meio de cultura com hormônio triiodotironina (T3), fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) e dexametasona, aqui chamado de TDI seja suficiente para o amadurecimento celular. O tratamento com TDI induziu um aumento na área celular, alongamento das células e melhor organização dos sarcômeros. Além disso, foi observado um aumento na expressão de mRNA para alguns marcadores de maturação como MYH7, FKBP5 e PPARα. Quando comparadas com células sem o tratamento, as células expostas ao TDI tinham um transiente de cálcio de maior amplitude e um decaimento mais rápido do mesmo, além de um potencial de ação mais prolongado. Foi observado que essas células também tinham maior carga de cálcio no reticulo sarcoplasmático. Isso pode estar associado ao aumento nos níveis de mRNA para a SERCA2A que foi observado nas iPSC’s-CM’s tratadas com o TDI. Essas células expostas ao TDI foram usadas para construção de microtecidos cardíaco, junto com células endoteliais e fibroblastos. Esses tecidos apresentaram maior força passiva e também maior força durante a contração desse tecido, corroborando com os dados obtidos da morfologia celular e manejo de cálcio. Em conclusão, o uso do TDI se provou um simples e robusto método de maturação de iPSC’s-CM’s e pode ser uma alternativa para obtenção de tecidos in vitro com maiores chances de integração funcional após sua enxertia em coração de pacientes. The advent of induced pluripotent human stem cells (hiPSC or iPSCs) has caused great expectations in the scientific and clinical field. Since they are derived from somatic cells, they can grow indefinitely in vitro without losing their pluripotency and have enormous potential of differentiation, being able to differentiate in many cell types such as cardiac myocytes. Despite the vast efforts to develop therapies based in stem cells, iPSC-derived cardiomyocytes (iPSCs-CMs) have impaired basal function compared with the adult cells in cardiac tissue. In this work, we propose a maturation protocol consisting of the simple supplementation of the culture medium with triiodothyronine (T3) hormone, insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) and dexamethasone, here called TDI, is sufficient for cell maturation. Treatment with TDI induced an increase in cell area, cell elongation and better sarcomere organization. In addition, was observed an increase in mRNA expression for some maturation markers such as MYH7, FKBP5 and PPARα. When compared to non-treated cells, the cells exposed to TDI had a calcium transient larger in amplitude and with faster decay kinetics, with prolonged action potential as well. Also, these cells had larger calcium content on the sarcoplasmic reticulum. This may be associated with the increase in mRNA levels for SERCA2A that was observed in iPSC's-CM's treated with TDI. Furthermore, TDI-treated cells were used to mount cardiac microtissues (CMT), along with endothelial cells and fibroblasts. These tissues had enhanced static force and increase in dynamic force during the contraction of this tissue, corroborating with the data obtained from their cellular morphology and calcium handling. In conclusion, use of TDI has proved a simple and robust method of maturation of iPSC's-CM's and may be an alternative to obtaining cardiac tissues in vitro with better chance to successful engraftment in patients' hearts.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer da mama continua sendo a segunda maior causa de morte em mulheres e a previsão é que a incidência desta doença aumente a cada ano. Apesar do grande número de pesquisas, estudos in vitro de linhagens celulares de câncer de mama derivadas de tumores não metastáticos têm sido raramente relatados ao passo que estes podem oferecer dados relevantes em relação a estágios de desenvolvimento do tumor e contribuir para um melhor entendimento da fisiopatologia da doença. O estudo dos componentes produzidos e secretados (secretoma) pelas células tumorais demonstraram a contribuição desses para o processo de tumorigênese em vários tipos de câncer, tais como câncer de mama e próstata. Entretanto, a atividade do secretoma das células MACL-1 sobre células não tumorais ainda não foi investigada e os componentes ainda não estão bem descritos. Para isso, fibroblastos CCD19-Lu foram expostos ao secretoma das células de adenocarcinoma de mama (MACL-1) verificando a morfologia, proliferação, expressão de proteínas e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os ensaios de co-cultura em Transwell domonstraram que, quando expostas ao secretoma das células MACL-1, as células CCD19-Lu tiveram sua morfologia e proliferação alteradas, bem como aumento na expressão de Vimentina, da proteína de ativação de fibroblastos (FAP), do fator de transcrição nuclear NFκB, de proteases e de IL-6. Essas alterações sugeriram uma mudança no fenótipo dessas células e as análises proteômicas indentificaram uma atividade específica de proteínas decorrente do aumento na produção de ROS pelas células CCD19-Lu expostas a esse secretoma e permitiram estabelecer uma correlação direta com as alterações fenotípicas observadas nesses fibroblastos. Desta forma, sugerimos que as células MACL-1 oriundas de um tumor de mama primário secretam proteínas com atividades capazes de alterar o fenótipo de fibroblastos CCD19-Lu levando à modificações principalmente na expressão de proteínas que apontam para uma possível transformação dessas células em fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Breast cancer remains the second cause of death in women and the incidence of this disease is growing every year. In spite the large studies in vitro of breast cancer cell lines derived from non-metastatic tumors have been rarely reported whereas they may offer relevant data regarding stages of tumor development and contribute to a better understanding of pathophysiology. The components studies produced and secreted (secretoma) by the tumor cells demonstrated their contribution to process of tumorigenesis in several types of cancer, such breast and prostate. However, MACL-1 cells secretome activity on nontumor cells has not been investigated and components are still poorly described. Then, CCD19-Lu fibroblasts were exposed of MACL-1 cells secretome and we evaluated changes in morphology, proliferation rate, protein expression and reactive oxygen species (ROS) production. Co-cultures in Transwells assays showed that, when exposed to MACL-1 cells secretome, CCD19-Lu cells had their morphology and proliferation rate altered and an increased in Vimentin, fibroblast activation protein (FAP), nuclear transcription factor NFκB, proteases and IL-6 expression. These results suggested a phenotype changes of cells and proteomic analyzes identified proteins specific activity to increase of ROS production by CCD19-Lu cells exposed MACL-1 cells secretome establish a direct correlation with the phenotypic alterations observed in fibroblasts. Thus, we suggest that MACL-1 cells from a primary breast tumor secrete proteins with biochemical activities capable of altering CCD19-Lu fibroblasts phenotype leading to modifications mainly in the proteins expression point to a possible transformation of these cells into cancer associated fibroblasts (CAFs).

A hipertrofia cardíaca é um processo adaptativo do miocárdio que resulta em um aumento da massa do coração e pode estar associada a um aumento no risco de morbidade e mortalidade. O treinamento aeróbio resulta em benefícios cardiovasculares, metabólicos e autonômicos, e por esse motivo tem sido utilizado como uma conduta não farmacológica na prevenção e tratamento desta patologia. Foi utilizada uma abordagem proteômica comparativa, por eletroforese em gel bidimensional (2D) acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF/TOF), para investigar os efeitos do treinamento aeróbico no remodelamento do proteoma cardíaco, no ventrículo esquerdo de camundongos com hipertrofia cardíaca patológica induzida por isoproterenol. Camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos experimentais: saudável sedentário (SS), saudável treinado (ST), isoproterenol sedentário (IS) e isoproterenol treinado (IT). Os animais dos grupos IS e IT receberam durante 10 dias consecutivos uma dose diária (45mg/kg/dia) de isoproterenol, a qual foi administrada via subcutânea. Todos os animais foram submetidos a um teste de esforço máximo para definir a carga de treinamento e avaliar o desempenho físico individual. Os animais dos grupos ST e IT, foram submetidos a um protocolo de treinamento aeróbio de intensidade moderada, na esteira, por um período de 8 semanas, e ao final deste período, todos os animais foram submetidos novamente ao teste de esforço máximo. A análise histológica do tecido cardíaco demonstrou integridade da arquitetura e das células do miocárdio dos animais saudáveis - SS e ST - com uma discreta hipertrofia no último grupo, evidenciando a indução da hipertrofia fisiológica pelo treinamento aeróbico. Nos animais que foram submetidos ao tratamento com isoproterenol - IS e IT - foi observada uma hipertrofia patológica no ventrículo esquerdo, com intensa desorganização das fibras e áreas de fibrose, sendo menos intensas no tecido dos animais do grupo que foi submetido ao treinamento aeróbico - IT. Estes resultados evidenciam a indução da hipertrofia patológica pelo tratamento com isoproterenol, bem como o efeito benéfico do treinamento aeróbico na hipertrofia patológica. Os animais sedentários com hipertrofia patológica apresentaram uma menor capacidade aeróbia, o que confirmou um efeito prejudicial da administração do isoproterenol no condicionamento desses animais. Já o treinamento aeróbio melhorou a capacidade aeróbia tantos dos animais saudáveis quanto dos animais com hipertrofia patológica, o que confirma a importância do exercício físico na reabilitação cardíaca. O perfil proteico dos VE revelou diferença na expressão de 105 spots proteicos entre os grupos, e 58 proteínas foram identificadas e pertencem as seguintes classes funcionais: metabolismo energético, estresse oxidativo, proteínas de choque térmico e estruturais. A hipertrofia patológica modulou negativamente a expressão proteica das proteínas envolvidas no metabolismo energético, enquanto a hipertrofia fisiológica modulou positivamente a expressão dessas proteínas. O mesmo aconteceu nos animais com hipertrofia patológica em resposta ao treinamento aeróbio. Por outro lado, ambas as hipertrofias resultaram em um aumento na expressão de proteínas de choque térmico e estruturais. Duas proteínas identificadas – sarcalumenin e PP1ɣ - são importantes proteínas envolvidas no acoplamento excitação-contração, que em resposta ao treinamento aeróbico aumentam suas expressões e atuam na citoproteção cardíaca, sendo responsáveis pela melhora da função cardíaca e condicionamento dos animais com hipertrofia patológica. Diante disso, os resultados sugerem que o treinamento aeróbio induz um remodelamento do proteoma cardíaco na hipertrofia patológica que possibilita que ele seja utilizado como uma importante ferramenta de prevenção e tratamento dessa patologia. Cardiac hypertrophy is an adaptive process of the myocardium that results in an increase in heart mass and may be associated with an increased risk of morbidity and mortality. Aerobic training can promote cardiovascular, metabolic and autonomic benefits; therefore, it has been used as a non-pharmacological alternative in the prevention and treatment of this condition. A comparative proteomic approach, by two-dimensional gel electrophoresis coupled with mass spectrometry (MALDITOF/TOF), was used to investigate the effects of aerobic exercise on cardiac proteome remodeling of pathological isoproterenol-induced left ventricular hypertrophy in mice. C57Bl/6 mice were divided into four experimental groups: sedentary healthy (SH), trained healthy (TH), sedentary isoproterenol (SI) and trained isoproterenol (TI). The animals of the SI and TI groups received daily subcutaneous injection of isoproterenol for 10 consecutive days (45 mg/kg/day). All animals were submitted to a maximum treadmill stress test to determine the training load and assess individual physical performance. The animals of the TH and TI were submitted to a moderate-intensity training on the treadmill for eight weeks. After the training protocol, all animals were resubmitted to a maximum stress test. Histological analysis of the left ventricular myocardium demonstrated integrity of the architecture of the cardiac muscle and muscle cells in healthy animals - SH and TH - with a slight hypertrophy in the latter group, thus providing evidence that aerobic exercise training can induce physiological hypertrophy. In contrast, isoproterenol-treated mice - SI and TI - showed pathological hypertrophy in the left ventricle with severe myofiber disorganization and fibrosis areas, which wasless severe in the tissue of animals of the group submitted to aerobic training - TI. Such results point to both the possibility of inducing pathological hypertrophy by isoproterenol and the beneficial effect of aerobic training on pathological hypertrophy. Sedentary animals with pathological hypertrophy had lower aerobic capacity, which confirmed the detrimental effect of isoproterenol administration on the conditioning of these animals. Aerobic training improved the aerobic capacity of both healthy animals and animals with pathological hypertrophy, which confirms the importance of physical exercise in cardiac rehabilitation. The protein profile of the LV revealed a different expression of 105 protein spots between the groups, and 58 proteins were identified and belong to the following functional classes: energy metabolism, oxidative stress, heat shock and structural proteins. Pathological hypertrophy negatively modulated the expression of proteins involved in energy metabolism, while physiological hypertrophy positively modulated the expression of the same proteins. The same could be observed in animals with pathological hypertrophy in response to aerobic training. However, both hypertrophies resulted in an increase in the expression of heat shock and structural proteins. Two of the identified proteins - sarcalumenin and PP1ɣ - are important for excitation-contraction coupling, which increase in expression in response to aerobic training and act in cardiac cytoprotection, being responsible for the improvement of the cardiac function and conditioning of the animals with pathological hypertrophy. Therefore, the results suggest that aerobic training induces the remodeling of the cardiac proteome in pathological hypertrophy, thus constituting an important instrument in treating and preventing this condition.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Após a aplicação de solução hipertônica nas sinapses, ocorre aumento duradouro na liberação de neurotransmissores, evidenciado pelo aumento no tamanho dos potenciais de placa em miniatura (MEPPs). O aumento no tamanho dos quanta foi interpretado como sendo devido à maior incorporação de acetilcolina mediada pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) nas vesículas prontamente disponíveis para liberação, num processo chamado de segundo estágio de preenchimento vesicular. Nosso objetivo foi testar esta hipótese sem a utilização de fármacos, utilizando animais geneticamente deficientes do VAChT, no intuito de pesquisar o papel deste transportador nestas modificações duradouras na neurotransmissão. Nós utilizamos preparações neuromusculares de camundongos C57BL machos, que apresentam reduzida expressão de VAChT (KDVAChT). Para avaliar o desenvolvimento temporal do segundo estágio de preenchimento vesicular, nós utilizamos animais em diferentes idades. Para medida dos MEPPs, utilizamos a técnica de current clamp. Foram registrados cerca de 100 MEPPs durante 300 segundos, em cinco fibras diferentes de cada animal, antes e após o tratamento com solução hipertônica (234 mM de NaCl, 521 mOsmol/kg). Para medida das correntes de placa em miniatura (MEPCs), utilizamos a técnica de voltage clamp e um protocolo semelhante de amostragem. Nós não observamos diferenças significativas no tamanho dos MEPPs dos camundongos KDVAChT quando comparados aos selvagens (WT). Nos animais de 3 meses, após o tratamento hipertônico, a amplitude nos WT passou de 1,13 ± 0,19 mV para 1,55 ± 0,13 mV (n=9) e nos KDVAChT passou de 0,79 ± 0,09 mV para 1,21 ± 0,11 mV (n=5). Nos animais de 12 meses, após o tratamento hipertônico, a amplitude nos WT passou de 1,29 ± 0,14 mV para 1,69 ± 0,15 mV (n=11) e nos KDVAChT passou de 0,98 ± 0,14 mV para 1,75 ± 0,15 mV (n=9). As diferenças entre as medições pré e pós tratamento hipertônico foram estatisticamente significativas nos grupos WT e KDVAChT. Entretanto não houve diferença no aumento dos MEPPs entre estes grupos. Também não observamos diferenças significativas no tamanho das MEPCs entre os grupos WT e KDVAChT sem o tratamento hipertônico. O tamanho das MEPCs nos animais WT foi de 3,02 ± 0,19 nA (n=3), e nos animais KDVAChT foi de 2.57 ± 0.23 nA (n=4). Nós concluímos que a diminuição do VAChT não alterou o segundo estágio de preenchimento vesicular de acetilcolina, o que sugere que o VAChT pode não ser o alvo deste processo, ou que possam existir mecanismos ainda desconhecidos capazes de suprir a redução desta proteína no transporte vesicular. After application of hypertonic solution to synapses, there is a long lasting increase in neurotransmitter release, as evidenced by an increase in the size of miniature endplate potentials (MEPPs). The increase in quantal size was interpreted as being due to increased incorporation of the acetylcholine into readily available to release vesicles in a process dependent of the vesicle acethylcholine transporter (VAChT). This process was called vesicle second stage loading. Our goal was to test this hypothesis using non pharmacological tools, in order to study the participation of VAChT in this long lasting changes in neurotransmission. We used neuromuscular preparations from genetically modified C57BL male mice with reduced VAChT expression (KDVAChT). We used animals at two different ages to evaluate the temporal development of second stage loading. To measure MEPPs, we used the current clamp technique. We recorded about 100 MEPPs during 300 seconds at five different fibers of each animal, before and after treatment with hypertonic solution (NaCl 234mM). To measure the MEPCs, we used the voltage clamp technique and a similar sampling protocol. We did not detect significant differences between WT and KDVAChT in MEPP size before and after treatment with hypertonic solution. In WT 3 months old animals hypertonic treatment increased MEPPs from 1.13 ± 0.19 to 1.55 ± 0.13 mV (n = 9) and in KDVAChT it increased from 0.79 ± 0, 09 mV to 1.21 ± 0.11 mV (n = 5). In 12 months old animals hypertonic treatment increased MEPP amplitude from 1.29 ± 0.14 mV to 1.69 ± 0.15 mV (n = 11) and in KDVAChT it increased from 0.98 ± 0, 14 mV to 1.75 ± 0.15 mV (n = 9). We did not observe significant differences in the size of MEPCs between WT and KDVAChT mice, when recorded before hypertonic stimulation. MEPCs size in WT animals was 3.02 ± 0.19 nA, n = 3, while in KDVAChT animals it was 2:57 ± 0:23 nA, n = 4. We conclude that reducing VAChT did not change second stage loading, which suggests that VAChT is not the target of hypertonic solution effect, or there may be unknown mechanisms to compensate vesicular filling in reduced VAChT animals.

A obesidade é uma doença epidêmica multifatorial que engloba componentes ambientais e genéticos. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs9930609 do gene FTO (fat mass and obesity associatedgene) é um dos principais envolvidos na obesidade. Apesar de vários estudos avaliarem a influência do SNP do gene FTO no tratamento clínico da obesidade, poucos estudos longitudinais têm sidorealizados com pacientes submetidos à cirurgia bariátrica. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do polimorfismo rs9939609 na resposta de pacientes com obesidade grau III apósa cirurgia bariátrica. O DNA de 165 indivíduos foi genotipado para o SNP rs9930609 do gene FTO, por meio da metodologia TaqManTM SNP genotyping assays. Dados relativos ao estilo de vida; à história familiar de doenças; a comorbidades; a dados bioquímicos e antropométricos, como peso corporal, índice de massa corporal (IMC), perda de excesso de peso (PEP) e composição corporal, foram obtidos antes e seis, 12, 18, 24, 36, 48 e 60 meses após a cirurgia. Os dados foram analisadospor meio da comparação de dois grupos de pacientes de acordo com a presença do polimorfismo rs9939609 do gene FTO (grupo FTO-SNP e Controle) e também pelo genótipo (AA, AT e TT). Foi utilizado o programa SPSS, e, com auxílio do programa R, foram ajustados modelos mistos de regressão para avaliar a dinâmica do peso, o IMC e a PEP ao longo do tempo, na presença ou ausência do alelo de risco em pacientes do sexo feminino. Não foram observadas diferenças entre os gruposdurante os primeiros 24 meses após a cirurgia. Foram excluídos do estudo quatro indivíduos devido ao genótipo inconclusivo e 15 devido ao pouco tempo decorrido da cirurgia. Dos 146 indivíduos classificados para o SNP rs9939609 do gene FTO, 42 indivíduos (28,8%) não apresentaram polimorfismo do gene FTO (TT), 72 (49,3%) tinham um alelo de risco (AT) e 32 (21,9%) apresentavam dois alelos de risco (AA). A idade média dos indivíduos avaliados foi 41,84 anos e a maioria (84,9%) era mulheres. Os dados encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW). A frequência alélica encontrada foi de 70,6% e 29,4% dos indivíduos carreando o alelo A e T, respectivamente. A frequência do menor alelo (MAFs) observada neste estudo (0,465) para rs9939609 foi próxima àquela encontrada no dbSNP (0,340). Após 36, 48 e 60 meses, peso corporal, massa gorda e IMC foram maiores,enquanto PEP foi menor no grupo de pacientes FTO-SNP. A recuperação do peso ocorreu mais cedo no grupo FTO-SNP. O maior peso de ambos os compartimentos corporais (massa gorda e massa livre de gordura) justificou maior peso corporal após alguns anos de cirurgia. Foi encontrada evolução diferente e menor perda de peso em obesos portadores do SNP rs9939609 do gene FTO após a cirurgia bariátrica. No entanto, esse padrão foi evidente apenas 24 meses após a cirurgia, induzindo a uma menor proporção de sucesso da cirurgia e a uma recuperação do peso maior e mais precoce em indivíduos portadores desse polimorfismo. The rs9930609 single nucleotide polymorphism (SNP) in the fat mass and obesity associated gene (FTO) is an important polymorphism involved in obesity. Although several studies have evaluated the influence of the FTO SNP on the clinical treatment of obesity, few studies have been conducted on patients who underwent bariatric surgery. We evaluated the influence of FTO SNP on body weight, body composition, weight regain and metabolic outcomes during a 60-month follow-up period after bariatric surgery. The rs9930609 was genotyped in 165 individuals using a real-time PCR TaqMan assay. Data for life style, comorbidities, biochemical data, body weight, body mass index (BMI), excess weight loss (EWL) and body composition were obtained before and 6, 12, 18, 24, 36, 48 and 60 months after surgery. Data were analyzed by comparing two groups of patients according to the presence of rs9939609 FTO gene polymorphism and genotype. Mixed regression models wereconstructed to evaluate the dynamics of body weight, BMI and EWL over time in female patients. No differences were observed between the groups during the first 24 months after surgery. Four individualswere excluded from the sample due to the inconclusive genotype and 15 given the short time elapsed from surgery . Of the 146 individuals classified for SNP rs9939609 of FTO gene, 42 individuals (28.8%) did not have the FTO gene polymorphism (TT) , 72 (49.3%) had a risk allele(AT) and 32 (21.9%) had two risk allele (AA). The average age of the individuals was 41.84 years and the majority ( 84.9 %) were women. The data are in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). The allelic frequency was 70.6 % and 29.4% of subjects caring allele A and T, respectively. The minor allele frequency (MAF) observed in this study (0.465) for rs9939609 was similar to that found in dbSNP (0.340). After 36, 48 and 60 months, body weight, fat mass and BMI were higher, whereas EWL was lower in the FTO-SNP patient group. Weight regain was more frequent and occurred sooner in the FTO-SNP group. The greater weight of both body compartments (fat mass and fat free mass) justified higher bodyweight after a few years of surgery. There is a different evolution of weightloss in obese carriers of the FTO variant rs9939609 after bariatric surgery. However, this pattern was evident at only two years after surgery, inducing a lower proportion of surgery success and a greater and earlier weight regain

Sugiuchi et al. (1995) desenvolveram um método direto para a determinação de colesterol proveniente da lipoproteína de alta densidade (HDL), sem a necessidade de procedimentos pré-analíticos. O teste consiste na formação de complexos solúveis das apoB100-lipoproteínas com o poliânion -ciclodextrina sulfato, o que reduz a ação das enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase sobre lipoproteínas de baixa densidade (LDL), muito baixa densidade (VLDL) e quilomicra. A inibição total da catálise enzimática sobre as apoB100-lipoproteínas é alcançado após a ligação covalente de moléculas de polietilenoglicol às superfícies das enzimas. Após essa ligação, somente as partículas de HDL ficam disponíveis para ação da colesterol esterase e colesterol oxidase. O presente trabalho verificou a capacidade de inibição da reação catalisada pelas enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase pelos poliânions: ácido fosfotúngstico, sacarose octassulfato, sulfato de condroitina e -ciclodextrina sulfato. Foram determinados parâmetros cinéticos para a enzima colesterol esterase nativa e após adição de polietilinoglicol à sua superfície utilizando calorimetria de titulação isotérmica. Os resultados evidenciaram que o ácido fosfotúngstico é capaz de inibir satisfatoriamente a ação das enzimas sobre as apoB100-lipoproteínas. Os valores da constante de Michaelis-Menten (Km) para colesterol esterase nativa utilizando HDL e LDL foram de 4,26 M de linoleato de colesterila e 13,14 M de linoleato de colesterila, respectivamente. Após a adição do polietilenoglicol à enzima o Km da enzima utilizando HDL como substrato foi alterado para 21,6 M de linoleato de colesterila. Os resultados desse estudo fornecem o embasamento para o desenvolvimento de um reagente para a determinação de colesterol HDL. Sugiuchi et al. (1995) developed a direct method to determine cholesterol from high density lipoprotein, with no need for pre-analytical procedures. The assay consists of the formation apoB100-lipoproteins' soluble complexes with -cyclodextrin sulfate polyanion, which reduces the action of the enzymes cholesterol esterase and cholesterol oxidase over low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and chylomicra. Total inhibition of the enzymatic catalysis over apoB100-lipoproteins is achieved after the covalent bonding of polyethyleneglycol on the enzymes surfaces. Only the HDL's particles are available for the catalysis of cholesterol esterase and cholesterol oxidase. This study verified the inhibition of the reactions catalyzed by cholesterol esterase and cholesterol oxidase by the polyanions: phosphotungstic acid, sucrose octasulfate, chondroitin sulfate and - cyclodextrin sulfated. Kinetics parameters for the native enzyme cholesterol esterase and after the bonding with polyethyleneglycol were also determinate. The results showed that phosphotungstic acid is able to inhibit satisfactorily the enzymes' action over apoB100-lipoproteins. The Km's values for native cholesterol esterase with HDL and LDL were 4,26 M of cholesteryl linoleate and 13,14 M of cholesteryl linoleate, respectively. After the bound of polyethyleneglycol on the cholesterol esterase surface the enzimes Km for HDL was altered to 21,6 M of cholesteryl linoleate. The results of this study provide the knowledge to develop a reagent used to determine HDL cholesterol.

A infecção por Trypanosoma cruzi leva ao desenvolvimento de uma resposta inflamatória intensa. Dentre as consequências dessa inflamação, altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO) são produzidos, os quais atuam como efetores importantes mediando o controle dos parasitas e consequentemente da infecção, mas também podem causar dano tecidual inespecífico quando em concentrações exacerbadas. Em relação ao tecido cardíaco, ROS e NO já foram associados à capacidade de regular a função de muitos componentes envolvidos na manutenção das propriedades mecânicas e elétricas dos cardiomiócitos, bem como no fenômeno do acoplamento excitação-contração nestas células. Portanto, é razoável supor que essa produção de moléculas reativas tem um papel importante durante o estabelecimento da cardiomiopatia chagásica. Dessa forma, este estudo teve como objetivo investigar o envolvimento da produção e equilíbrio entre ROS e NO no remodelamento eletromecânico do coração durante a fase aguda da Doença de Chagas. Camundongos Wild-Type (WT) e deficientes para NADPH oxidase 2 (PHOXKO) foram infectados ou não com T. cruzi da cepa Y (i.p.). Todos os experimentos foram realizados após 15 ± 1 dias de infecção (dpi). Para os ensaios celulares, os cardiomiócitos foram isolados por meio da perfusão de uma solução nutritiva contendo uma mistura de enzimas através de um sistema de Langendorff, seguido por dispersão mecânica, em um gradiente de concentração crescente de cálcio. Foi observado que camundongos PHOXKO 15dpi apresentaram prolongamento do tempo para repolarização do potencial de ação (PA) em comparação com os outros grupos, os quais foram semelhantes entre si. No entanto PHOXKO 15dpi não tiveram alterações nas correntes de cálcio e de potássio de saída em comparação com os controles, em oposição aos cardiomiócitos provenientes de animais WT 15dpi, que tiveram uma redução em ambos os componentes. O aumento da duração do PA (APD) em PHOXKO 15dpi foi acompanhado pelo aumento da alternância do PA neste grupo, a qual tem sido relacionada à geração de arritmias graves. Tais alternâncias da APD foram melhoradas por pré-incubação com o inibidor das sintases de NO, L-NAME, embora o aumento da APD manteve-se inalterado. Além disso, ambos os camundongos WT e PHOXKO infectados apresentaram redução da fração de encurtamento celular, e o L-NAME foi capaz de restaurar este parâmetro apenas no grupo WT 15dpi. Além disso, os cardiomiócitos de PHOXKO 15dpi apresentaram níveis mais elevados de contrações arrítmicas independentes da estimulação de campo, quando comparado com outros grupos, as quais foram abolidas pela exposição ao L-NAME. Essas alterações na excitabilidade e contratilidade celular foram associadas à redução do transiente de cálcio em PHOXKO 15dpi quando comparado aos outros grupos, apesar de nenhuma diferença ter sido observada em sua fase de decaimento. A redução observada no pico do transiente nos animais PHOXKO 15dpi não foi restaurada pelo L-NAME. O conjunto de observações a nível celular refletiu-se em mudanças substanciais na função cardíaca estudada pela técnica de coração isolado, apesar de não haver diferenças significativas na tensão sistólica do coração entre os grupos. Também camundongos PHOXKO 15dpi apresentaram altas taxas de arritmias graves obervadas no eletrocardiograma e redução da pressão arterial média estudada a partir da técnica de plestimografia de cauda. Com esses dados podemos então, concluir que a produção de ROS e NO modula diretamente as alterações eletromecânicas do coração durante a fase aguda da cardiopatia chagásica. The infection by Trypanosoma cruzi leads to the development of an intense inflammatory response. Among the consequences of this inflammation, high levels of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) are produced, which act as important effectors mediating parasites killing and thus the control of infection, but also may cause nonspecific tissue damage under high amounts. Regarding the heart tissue, ROS and NO have been found to regulate the function of many components involved in management of the mechanical and electrical properties of the cardiomyocytes and so as in the excitation-contraction coupling phenomena in these cells. Ergo, it seems reasonable to hypothesize that this reactive molecules production has an important role during the establishment of the cardiomyopathy related to Chagas disease. Therefore, in this study we aimed to investigate the involvement of ROS and NO production and balance in the electromechanical remodeling of the heart during the acute phase of Chagas´ disease. Wild-Type (WT) mice and NADPH phagocyte oxidase-2 (PHOXKO) deficient mice were infected or not with 1000 Y strain T. cruzi i.p. All experiments were performed after 15±1 days of infection (dpi). For cell assays, cardiomyocytes were isolated by perfusing a nutritive solution containing a mix of enzymes through a Langendorff system, followed by mechanical dispersion, in an increasing calcium concentration gradient. We found that PHOXKO 15dpi mice displayed prolonged action potential (AP) repolarization time compared to the other groups, which were similar between themselves. However PHOXKO 15dpi had no changes in calcium and outward potassium currents compared to the controls, in spite of WT 15dpi, which had a reduction in both components. The increase in AP duration (APD) in PHOXKO15dpi was accompanied by increased APD alternans in this group, which has been related to the generation of severe arrhythmias. Such APD alternans was ameliorated by pre-incubation with the NO-synthases inhibitor L-NAME, although the increased APD was remained unchanged. Also, both infected PHOXKO and WT mice exhibited a decreased cell shortening during contraction when compared to the non infected mice, and L-NAME could restore this parameter only in the WT 15dpi group. Also, cardiomyocytes from PHOXKO15dpi displayed higher levels of arrhythmic contractions apart from the field stimulation when compared to other groups, which was fully abolished by exposure to L-NAME. The altered excitability and contractility was associated with reduced calcium transient in PHOXKO 15dpi compared to the other groups, although no difference was observed in the decay phase of the transient. Also the peak transient was not restored by L-NAME. The set of observations at the cellular level reflected in to significant chances in cardiac function studied by the isolated heart technique, despite no significant differences in the systolic tension of the heart between groups. Also PHOXKO 15 dpi mice exhibited high rates of severe arrhythmias in the electrocardiogram and low mean arterial pressure studied by tail plestimography, compared to the other groups. Overall, we conclude that ROS and NO production directly modulates the electromechanical remodeling of the heart during acute phase of chagasic cardiomyopathy.

Os biomateriais são materiais biodegradáveis usados como implantes induzindo a regeneração do tecido lesionado pela promoção do aumento da proliferação, diferenciação e atividades celulares. Com o incremento da nanotecnologia os biomateriais puderam ser melhorados resultando em materiais mais versáteis para a terapêutica. Os nanotubos de carbono são um dos nanomateriais que aparecem nesse cenário e demonstram excelente biocompatibilidade além de promoção da espontânea neuro-diferenciação de progenitores neurais. Com o emprego das células-tronco adultas para terapia celular é possível a complexação dos biomateriais implantáveis (scaffolds) como abordagem mais eficaz na engenharia tecidual. Nesse trabalho, nós desenvolvemos um nanocompósito empregando um biomaterial de uso clínico/comercial, policaprolactona, e nanotubos de carbono de paredes múltiplas para cultivo e neurodiferenciação de células-tronco adultas derivadas do tecido adiposo. As propriedades intrínsecas dos nanotubos, como dimensões, eletrocondutividade e o substrato nanométrico formado por ele é comprovadamente capaz de estimular a neuro-diferenciação de células-tronco. Nossos resultados mostraram que o nanocompósito desenvolvido foi capaz de sustentar o crescimento e proliferação celular mostrando-se biocompatível, eletrocondutor e foi capaz de sustentar o início do processo de diferenciação neuronal demonstrado pela expressão da proteína GFAP. Biomaterials are biodegradable materials used in implants which are able of promote regeneration of injured tissue by stimulating proliferation, differentiation and cell activity. With the development of nanotechnology, the biomaterials have been improved resulting in more versatile materials for therapy. Carbon nanotubes are one of nanomaterials that appear in this scenario and demonstrate excellent biocompatibility besides promoting spontaneous neuronal differentiation of neural progenitors. With the use of adult stem cells in cell therapy allowsthe complexation of implantable biomaterials as scaffolds. This is the most effective approach tissue engineering. In this work, we developed a nanocomposite biomaterials using polycaprolactone and carbon nanotubes multi-walled to growing and diferentiation of stem cells derived from adipose tissue. The intrinsic properties of the nanotubes, such as dimensions, electroconductivity and substrate formed show that nanotubes are to be able of stimulating stem cells neuro differentiation. Our results showed that the nanocomposite developed was able to support cell growth and proliferation proving to be biocompatible, electro-conductive and efficient in start the process of neuronal differentiation that was demonstrated by expression of GFAP protein.

Em corações estimulados a uma frequência constante, quando uma contração é induzida entre os batimentos regulares (contração extrassistólica), a amplitude da mesma é geralmente menor do que aquela observada no batimento prévio. A amplitude da contração extrassistólica será maior quanto mais longo for o intervalo entre ela e a contração prévia. Esse fenômeno é denominado de restituição mecânica. De fato, diversos trabalhos têm associado a restituição mecânica com o aumento gradativo da liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático, deste modo, a restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ é um importante evento no controle da fisiologia cardíaca. O objetivo geral do presente trabalho foi investigar os mecanismos celulares envolvidos na restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ em cardiomiócitos ventriculares isolados de camundongo, mantidos à temperatura fisiológica. Usando a técnica de patch-clamp associada à microscopia confocal, foi constatado que a restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ não se deve à restituição elétrica do miocárdio, uma vez que tanto a restituição da amplitude do potencial de ação cardíaco, quando a recuperação da inativação da corrente de Ca2+ do tipo L, apresentaram um curso temporal mais rápido do que aquele observado para a restituição da amplitude da liberação de Ca2+ pelo RS. De modo interessante, medidas das concentrações de Ca2+ no citosol ([Ca2+]i) e no lúmen do RS ([Ca2+]RS) mostraram que, mesmo após a completa recuperação dos estoques luminais de Ca2+, a amplitude do transiente citosólico de Ca2+ ainda não se encontra plenamente restituída. Os resultados aqui obtidos sugerem que o estado refratário dos receptores de rianodina (RyR2) pode ser um importante mecanismo no controle desse processo celular, uma vez que a manipulação das propriedades de gating desses canais altera significativamente o curso temporal para a restituição da amplitude do transiente citosólico global de Ca2+ em coração de mamífero. Em sumário, esse trabalho mostra que a restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+ não é pura e simplesmente uma função da taxa de recuperação da [Ca2+]RS, sugerindo a existência de um mecanismo no qual o estado de ativação dos RyR2 desempenha papel fundamental. When an extra-beat (extra-systolic contraction) is triggered in hearts cycling at a constant rate the resultant contraction is usually reduced in comparison. The amplitude of the extra-systolic contraction increases with the stimulus interval (time between normal and extra-systolic contraction), a phenomenon known as mechanical restitution. Mechanical restitution is thought to be the consequence of reduced sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ release and reduction of the subsequent cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i) transient during this restitution period. Thus, restitution (or refractoriness) of the [Ca2+]i transient is an important inherent mechanism in cardiac physiology. The aim of this study was to investigate the cellular mechanisms involved in [Ca2+]i transient restitution in mouse ventricular cardiomyocytes at physiological temperature. Simultaneous patch-clamp and confocal microscopy measurements showed that [Ca2+]i transient refractoriness was not due cardiac electrical restitution, since both action potential amplitude and L-type Ca2+ current recover much faster than the SR Ca2+ release restitution. Interestingly, measurements of [Ca2+]i transients and intra-SR Ca2+ ([Ca2+]SR) depletions revealed that [Ca2+]SR recovers to steady-state diastolic levels at a time where [Ca2+]i transient restitution is still observed. Additionally, pharmacological manipulation of the cardiac Ca2+ SR release channel (ryanodine receptors, RyR2) could significantly shift restitution curves, while minor inhibition of SR/ER Ca2+-ATPase could not. Taken together, these results suggest that the ability to subsequently activate an [Ca2+]i transient does not simply track with [Ca2+]SR refilling and also suggest the existence of time-dependent mechanism that induces a RyR2 refractory state.

O coração, órgão pulsátil tetracavitário, tem sido considerado desde os primórdios da ciência como uma das principais peças em seres humanos. Para o filósofo grego Aristóteles, que observou o coração de galinhas, este órgão seria o primeiro a se formar durante o desenvolvimento dos organismos que possuem sangue e portanto, atribuiu a ele importância maior que todos os demais componetes de um ser vivo.

O escorpião Hadruroides lunatus é o mais abundante na costa central do Peru, onde ocorre a maioria dos casos de picadas e envenenamento em humanos. Entretanto, pouco se sabe sobre a composição e mecanismo de ação do veneno. Este trabalho tem como objetivo descrever, em termos gerais, a caracterização bioquímica, imunológica e farmacológica do veneno de H. lunatus, assim como analisar a patofisiologia de seu envenenamento. Análises proteômica mostraram que o veneno é composto por peptídeos e proteínas com massas moleculares que variam entre 2.000 e 70.000 Da. A dose letal média (DL50) via intracranial (i.c.) e via intraperitoneal (i.p.), em camundongos, foram determinadas como 0,1 mg/kg e 21,55 mg/kg, respectivamente. Como parâmetros bioquímicos foram avaliadas as atividades hialuronidásica, proteolítica e fosfolipásica. No que se refere aos estudos imunológicos, demonstramos a existência de reatividade cruzada entre o veneno de H. lunatus e os venenos de Centruroides sculpturatus e Tityus serrulatus. A análise hematológica de ratos envenenados mostrou que houve uma diminuição significativa de leucócitos, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos nesses animais. Além disso, foi detectado um aumento nos níveis séricos de proteínas totais, albumina e proteínas de fase aguda, assim como de CK, CK-MB, AST e LDH. Esses dados, juntamente com a observação de que a produção de IL-6 se encontrou elevada em camundongos envenenados, sugerem a presença de inflamação e lesão muscular. A análise histopatológica dos pulmões de ratos injetados com veneno revelou a presença de hemorragia difusa. Foi observado que o veneno estudado leva ao aumento da frequência cardíaca e causa diversas arritmias, prejudicando assim o funcionamento do coração. A análise do transiente de cálcio em cardiomiócitos confirmou o efeito deletério que o veneno exerce sobre o coração, já que este se apresentou diminuído. Estes dados sugerem que, apesar de apresentar toxicidade moderada para mamíferos o veneno de H. lunatus é capaz de induzir efeitos típicos do envenenamento escorpiônico, como as alterações cardiopulmonares demonstradas, além de apresentar atividades menos comuns nos venenos escorpiônicos, como a proteolítica e fosfolipásica, justificando o estudo mais aprofundado deste veneno. Hadruroides lunatus scorpions are the most abundant in the Peruvian central coast, where occurs most of the cases of stings and envenoming in humans. However, little is known about the composition and mechanism of action of venom. The aim of this study is to describe, in general terms, the biochemical, immunological and pharmacological characterization of H. lunatus venom as well as to analyze the pathophysiology of its envenoming. Proteomic analysis showed that H. lunatus venom is composed of peptides and proteins with molecular weights ranging from less than 2,000 Da to greater than 70,000 Da. The median lethal dose (LD50) via intracranial (i.c.) and intraperitoneal (i.p.) in mice were determined as 0.1 mg/kg to 21.55 mg/kg, respectively. As biochemical parameters it were evaluated hyaluronidasic, proteolytic and phospholipasic activities. Regarding immunological studies, we demonstrated cross-reactivity between H. lunatus venom and Tityus serrulatus and Centruroides sculpturatus venoms. Hematological analysis in envenomed rats showed that there was a significant decrease of leukocytes, neutrophils, eosinophils and lymphocytes in these animals. Furthermore, an increase was detected in serum total proteins, albumin and acute phase proteins, as well as CK, CK-MB, AST and LDH levels. These data, together with the observation that IL-6 production was increased in envenomed mice, suggests the presence of inflammation and muscle injury. Lungs histopathological analysis revealed the presence of diffuse hemorrhage due H. lunatus envenoming. It was observed that H. lunatus venom increased heart rate and causes various arrhythmias, thereby impairing the heart functioning. Calcium transient analysis was measured in isolated cardiomyocytes and appeared diminished, confirming that H. lunatus venom exerts a deleterious effect on heart. These data suggest that, despite having moderate toxicity to mammals, the H. lunatus venom is capable of inducing effects typical of scorpion envenoming, such as the cardio-pulmonary alterations demonstrated, and also presents less common activities observed in scorpion venoms, such as proteolytic and phospholipasic, justifying further studies of this venom.

A tiamina (vitamina B1) é conhecida por desempenhar importantes funções no organismo. Por ser precursora da tiamina pirofosfato, grupo prostético de importantes enzimas do metabolismo, quando ausente, provoca vários distúrbios no organismo, como o estresse oxidativo, que está associado a danos celulares estruturais que comprometem a sua viabilidade. Portanto, as adaptações dos sistemas antioxidantes são essenciais para amenizar os danos causados pelos radicais livres. Na primeira parte deste estudo, ratos foram submetidos a uma dieta deficiente em tiamina durante 35 dias e a atividade e expressão protéica de enzimas antioxidantes e o nível de peroxidação peroxidação lipídica no fígado, rim e no músculo esquelético foram avaliados. Os resultados demonstraram que no fígado a atividade e expressão de catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase não diferiram entre os ratos controles e deficientes em tiamina. No rim, a atividade da catalase foi diminuída em ratos deficientes em tiamina quando comparados aos controles, entretanto, não houve nenhuma mudança na peroxidação lipídica. O músculo esquelético foi o órgão que mais apresentou mudanças nos sistema antioxidantes, mas nenhuma mudança foi verificada na peroxidação lipídica. A atividade da catalase foi aumentada e a expressão protéica da glutationa peroxidase foi diminuída em ratos deficientes quando comparados com os controles. Na segunda parte do estudo, os animais deficientes em tiamina foram submetidos a 5 dias de reposição da tiamina na dieta, para avaliar se haveria uma melhora no quadro de estresse oxidativo no coração destes animais. Tanto a atividade da catalase quanto os níveis de peroxidação lipídica, que se apresentavam alterados com a deficiêcia em tiamina, voltaram aos níveis dos animais controles. Neste estudo podemos concluir que alterações na atividade e expressão protéica de sistemas enzimáticos antioxidantes atuam como um mecanismo para manter a homeostase de diferentes órgãos e para evitar a peroxidação lipídica no modelo de deficiência de tiamina. Podemos concluir também que a reposição de tiamina na dieta reverte o quadro de estresse oxidativo no coração de animais deficientes. Thiamine (Vitamin B1) is known to have a major role in some body functions, once synthesized, originates important metabolic enzymes, whereas its absence can cause numerous unbalances at tissue and cellular levels, example being oxidative stress and associated cellular structure damage which can compromise integrity. In the first part of this study, rats were submitted to a thiamine deficient diet for 35 days and the antioxidant systems activity and expression as well as the lipid peroxidation levels for the liver, kidney and skeletal muscles were evaluated. The results demonstrated that in the liver the activity and expression of catalase, superoxide dismutase and gluthatione peroxidase did not differ between controls and thiamine deficient rats. In the kidney, catalase activity was decreased in thiamine deficient rats when compared to controls, however no change happened in lipid peroxidation between controls and thiamine deficient rats. The skeletal muscle was the organ that presented the most changes in antioxidant system, yet no change was verify in lipid peroxidation. Catalase activity is increased and the expression was decreased in skeletal muscle of thiamine deficient when compared to controls rats. On the second part of this study, the thiamine deficient group was submitted to a 5 day thiamine reposition diet to evaluate the improvement of heart oxidative stress state. Catalase activity as well as lipid peroxidation levels, once altered in thiamine deficient rats, returned to same levels encountered in control rats. In this study is demonstrated alterations in activity and expression of enzymatic antioxidants systems as a mechanism to maintain homeostasis of different organs and to avoid lipid peroxidation in model of thiamine deficiency. Additionally, thiamine reposition reverts the oxidative stress levels in thiamine deficient aminal hearts.

O Diabetes está diretamente relacionado a danos em vários órgãos e sistemas incluindo o sistema vascular. Os problemas vasculares representam a principal causa de morbidade e mortalidade no Diabetes. No entanto, os mecanismos envolvidos nas alterações vasculares associadas ao diabetes não são completamente esclarecidas. O objetivo deste estudo foi investigar as vias de sinalização envolvidas na disfunção vascular em um modelo murino de diabetes tipo I induzida por streptozotocina. Método: Os experimentos funcionais foram conduzidos com a aorta torácica de camundongos C57BL/6 em um sistema de banho de órgãos. As correntes para Ca2+ foram medidas em células recém-dispersas utilizando a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell. A expressão protéica foi medida através da técnica de Western blot. A técnica de antisense foi usada para diminuir agudamente (knockdown) a expressão da PI3Kd. Resultados: A resposta vasorelaxante não foi diferente entre os grupos controle e diabéticos. No entanto, os vasos dos animais diabéticos apresentaram uma resposta contrátil bastante aumentada em relação ao controle quando estimulados com fenilefrina ou KCl. Os dados de Western blot mostraram um aumento da expressão dos canais para cálcio dependentes de voltagem do tipo L (Cav1.2), da PI3Kd e da Rho na aorta dos animais diabéticos. Nos animais diabéticos tratados com antisense para a PI3Kd a expressão da Rho e dos Cav1.2 foi normalizada. A inibição farmacológica ou com antisense para a PI3Kd normalizou a densidade de corrente através dos Cav1.2 para o nível do controle. Os inibidores da RhoK, fasudil (10 mol/L) e Y27632 (5 mol/L) também foram efetivos em normalizar as correntes para Ca2+ através dos Cav1.2 nos animais diabéticos. Os efeitos da inibição da PI3Kd e da RhoK sobre os Cav1.2 não foram aditivos. Surpreendentemente, a nifedipina, bloqueador de Cav1.2, apesar de ter tido um efeito inibitório mais pronunciado sobre a contração dos animais diabéticos, não restaurou completamente a resposta contrátil ao nível do animal controle. Estes resultados sugerem que o aumento de corrente para cálcio através dos Cav1.2 não é o único mecanismo implicado no aumento da contratilidade vascular dos animais diabéticos. A PI3Kd e a RhoK devem agir também em outra via que controla o processo contrátil, além dos Cav1.2. A inibição (farmacológica e com antisense) da PI3Kd normalizou a resposta contrátil do animal diabético sugerindo que todos os mecanismos envolvidos na alteração contrátil do diabetes envolvem a PI3Kd. A inibição da RhoK com Y27632 praticamente aboliu a resposta contrátil do animal controle e do animal diabético, mostrando que esta via é fundamental no controle da contração na aorta dos camundongos. Conclusões e implicações: Os resultados mostram que no diabetes tipo 1 induzido por STZ ocorre uma remodelação dos mecanismos moleculares envolvidos no controle da resposta contrátil do músculo liso da aorta, incluindo o aumento da expressão da PI3Kd, Cav1.2 e Rho. No animal diabético, a PI3Kd, via Rho/RhoK, promove um aumento das correntes para cálcio através dos Cav1.2 e do grau de fosforilação dos filamentos contráteis. Dessa forma, o bloqueio da PI3Kd pode representar um novo alvo terapêutico para o tratamento das disfunções vasculares em pacientes diabéticos. Diabetes is associated to damage in several organs and systems including the vascular system. Vascular diseases are the main cause of mortality and morbidity in diabetes patients. However, the mechanisms that determine vascular modifications on diabetes disease are unclear. Our main goal was to investigate signaling pathways involved in vascular dysfunction in a murine model of streptozotocin-induced diabetes type I. Method: The thoracic aorta of C57BL/6 mice was isolated, cut in rings and mounted in a myograph. Vascular studies were performed using isometric transducers in an organ bath system. Calcium currents were recorded by patch-clamp technique (in whole cell configuration) from aorta cells freshly dissociated. Protein expression was mesuared by western blot technique. Antisense oligonucleotides were used to knockdown PI3K expression. Results: there was no difference in the vasorelaxation response of control and diabetic animals aorta. However, aorta from diabetic animals showed a higher contractility in the presence of phenylephrine or KCl. Western blot data also demonstrated an increased expression of L-type voltage-gated calcium channels (Cav1.2), PI3K and Rho on aorta from diabetic animals. In the diabetic animal treated with antisense for PI3K, the expression of Cav1.2 and Rho was normalized. Both PI3K pharmacological inhibition and the administration of oligodeoxinucleotides antisense against PI3K recovered Cav1.2 current densities to the same level as control animals. Also, Rho inhibitiors, fasudil (10 uMol/L) and Y27632 (5 uMol/L), normalized Cav1.2 calcium currents in diabetic animals. The inhibition of PI3K and Rho did not have additive effect. Surprisingly, althought nifedipine, a Cav1.2 blocker, had the highest inhibitory effect over aorta cells of diabetic animals it still could not recover the contractile response to the same level as control animals. These results suggest that the increased calcium influx throught Cav1.2 channels is not the only mechanism responsible for the diabetic animals increased vascular contractility. Furthermore, the activation of Cav1.2 channels, PI3K and Rho may also act in a different pathway to control the contractile response. Both pharmacological and antisense inhibition of PI3K normalized the contractile response on diabetic animals suggesting that all the mechanisms involved on the regulation of the contractility on diabetic animals are related to PI3K activity. The Y27632 (inhibition of Rho) abollished the contractile response either on diabetic or control animals demonstrating the fundamental role of this pathway in the contractile control aorta from mice. Conclusions and implications: our results showed that diabetes type 1 induced by STZ occurs by a remodeling process of the molecular mechanisms involving the contractile response control in smooth muscle from aorta , including the increase in expression of PI3K, Cav1.2 and Rho. On diabetic animals, PI3K activates the Rho/RhoK pathway inducing an increase in calcium currents through Cav1.2 channels and increase the phosphorilation level of the contractile filaments. Therefore, the PI3K inhibition can represent a new therapeutic target for the treatment of vascular dysfunction in diabetic patients.

Fisiologicamente, os corpos cetônicos -hidroxibutirato, acetona e acetoacetato são produtos da -oxidação de ácidos graxos livres que ocorre em hepatócitos em resposta à hipoglicemia. Este processo ocorre em condições de jejum, dietas hiper-lipídicas (como a dieta cetogênica, utilizada em casos de epilepsia resistente a medicação) e no diabetes mellitus, de modo a suprir as demandas energéticas de alguns tipos celulares, especialmente os neurônios. Visto que já está bem descrito o sucesso da dieta cetogênica no tratamento de crisesepilépticas, e que a maioria das explicações para estes efeitos, de médio e longo prazo, atentam para aspectos metabólicos e de sinalização intracelular com modificações na atividade dos canais para K+ sensíveis ao ATP, uma abordagem eletrofisiológica pode contribuir para a melhor compreensão das ações intrínsecas dessas substâncias sobre as células excitáveis. Neste trabalho, as correntes evocadas de Na+ e K+, registradas utilizando a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell, em neurônios provenientes dos gânglios das raízes dorsais de ratos Wistar adultos, foram utilizadas para testar a hipótese de que o -hidroxibutirato exerce efeitos agudos sobre canaisiônicos sensíveis a voltagem. Os resultados nos mostram que, nas correntes de Na+, o -hidroxibutirato tanto aumentou a densidade das correntes, como deslocou os valores da metade da voltagem máxima dos processos de ativação e inativação (V50), para valores mais hiperpolarizados. No entanto, em células previamente incubadas com tetrodotoxina, não observamos qualquer efeito sobre estes parâmetros. A corrente total de K+ em células dos gânglios das raízes dorsais pode ser dividida em três componentes, de acordo com a sua dependência de voltagem, e cinéticas dos processos de ativação e inativação: IK, é uma corrente ôhmica; IAS, exibe as cinéticas dos processos deativação e inativação lentas, e V50 de inativação hiperpolarizada; IAF, apresenta cinéticas dos processos de ativação e inativação rápidas, e V50 do processo de inativação despolarizada. As correntes foram estimuladas empregando-se três protocolos com diferentes pré-pulsos, e isoladas através de procedimentos de subtração. As análises dos efeitos do -hidroxibutirato sobre as correntes não apresentaram efeitos significativos sobre IK. Por outro lado, o -hidroxibutirato reduziu significativamente a densidade das correntes do componente de IAF,mas não o componente IAS. Além disso, tanto para a componente IAS como para IAF, o -hidroxibutirato causou efeito dual, dependente de concentração (curva em forma de J invertido), sobre a V50 dos processos de ativação e de inativação. Os efeitos do -hidroxibutirato em Na+ e K+ correntes foram reversíveis após a lavagem. Under physiological conditions, the ketone bodies -hydroxybutyrate,acetoacetate and acetone are products of -oxidation of fatty acids that occurs in hepatocytes in response to hypoglycemia. This process occurs during fasting, high fat diets (such as the ketogenic diet, used in cases of drug-resistant epilepsy) and during diabetes mellitus in order to meet the energy requirements of some cell types, especially neurons. Considering the well-described sucess of ketogenic diets in the treatment of epilepsy and that most explainations of these effects point to metabolic effects on cell signalling that modify the activity of ATP-sensitive K+ channels, an electrophysiological approach could contribute to a better understanding of the actions of these substances on excitable cells. In this work, the stimulated Na+- and K+-ion currents were recorded in neurons from the dorsal root ganglia of adult Wistar rats, using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique, in order to test the hypothesis that-hydroxybutyrate exerts acute effects on voltage-gated ion channels. Theresults show that the -hydroxybutyrate both increased the density of Na+currents, and shifted the midpoint of the activation and inactivation processes to more hyperpolarized values. However, when the cells were previously incubated with tetrodotoxin, we observed no effect on these parameters. The total K+ currents in DRGs can be divided into three components accordingly its voltage dependence, and activation/inactivation kinectics: IK, is an ohmic current; IAS, presents slow activation and inactivation kinectics and hyperpolarized midpoint of inactivation; IAF, presents fast activation and inactivation kinectics and depolarized midpoint of inactivation. The currents were stimulated using three protocols with distinct pre-pulses, and isolated using subtraction procedures. The analysis of the effects of -hydroxybutyrate on the currents showed no significant effects on IK. On the other hand, -hydroxybutyrate significantly reduced the current density of the IAF component, but not the IAs component. In addition, both the IAS as for the IAF current, caused dual effect (inverted J shaped curve) on the midpoint of the activation and inactivation processes. The effects of -hydroxybutyrate on Na+ and K+ currents were reversible upon washout.

Recentemente há um interesse crescente na aplicação da Verificação Probabilística de Modelos (PMC) na especificação formal e análise de sistemas biológicos. PMC é uma técnica que permite uma exploração exaustiva do conjunto de estados de um sistema estocástico e pode fornecer visões valiosas do seu comportamento que são mais difíceis de se obter usando somente abordagens tradicionais de análise de sistemas, como as simulações estocástica e determinística. Neste trabalho, propõe-se o uso de PMC para modelar e analisar sistemas em membranas celulares responsáveis pelo transporte de íons e cruciais para a vida das células. Uma especificação formal e quantitativa da bomba de sódio e potássio (Na,K-ATPase) é inicialmente apresentada. Essa bomba é um importante sistema de transporte de íons presente em todas células animais e responsável por manter as concentrações dos íons de sódio e potássio dentro da célula, respectivamente, alta e baixa. O trabalho descreve como modelar o mecanismo da bomba usando PMC, considerando diferentes técnicas de modelagem com o objetivo de lidar com o problema da explosão de estados, inerente da técnica de verificação de modelos, independente do contexto. Importantes propriedades relacionadas à reversibilidade da bomba são verificadas usando PMC. Adicionalmente, o comportamento da bomba é investigado em termos de tendências de reações que computam se existe uma probabilidade superior de certas reações ocorrerem. Essas tendências permitem identificar os gargalos que levam ao lento funcionamento ou mesmo à interrupção da bomba com o passar do tempo.O trabalho também introduz uma abordagem para detectar comportamento periódico com ruídos em sistemas estocásticos usando uma técnica de verificação de modelos estatística. A abordagem proposta é aplicada para um sistema de oscilação intracelular de cálcio, comumentemente encontrado em um grande número de tipos celulares em resposta à estímulos de componentes químicos extracelulares. Finalmente, uma metodologia para lidar com a coexistência de espécies com grandes diferenças em suas concentrações é também introduzida. Os resultados são ainda preliminares, mas indicam os ganhos em escalabilidade de recursos de memória com a abordagem proposta. Recently there has been a growing interest in the application of Probabilistic Model Checking (PMC) for the formal specification and analysis of biological systems. PMC is able to exhaustively explore all states of a stochastic model and can provide valuable insight into its behavior which are more difficult to see using only traditional methods for system analysis such as deterministic and stochastic simulation. In this work we propose the use of PMC for the modeling and analysis of cell membrane systems that are capable of moving ions across cell membranes and are crucial for the living cells. We present a quantitative formal specification of sodium-potassium exchange pump (Na,K-ATPase), which is an important transport system present in all animal cells and responsible for keeping the potassium and sodium concentrations inside the cell, respectively, high and low. We describe how the pump mechanism can be modeled using PMC, taking into consideration different modeling methodologies in order to deal with the state space explosion problem, inherent in model checking, regardless of context. Furthermore, we present some important properties about the pump reversibility that can be addressed directly with model checking, whereas with other traditional approaches they cannot be easily covered. Aditionally, we reason about the pump behavior in terms of trend labels for the pump reactions that compute if there is a greater probability that the system takes specific transitions. These trends allow us to identify the bottlenecks that are responsible for the slow operation of the Na,K-ATPase or even for its interruption over time. The work also introduces an approach to detect noisy periodic behavior in stochastic systems using a statistical probabilistic model checking. The proposed approach is applied to the intracellular calcium oscillations, which is membrane system commonly observed in a large number of cell types in response to stimulation by an extracellular agonist. Finally a modeling methodology to deal with the coexistences of species with huge differences in their concentrations is also introduced. Although the results are still preliminary, they indicate gains in scalability of memory resources using the proposed methodology.

A deficiência de tiamina (vitamina B1) induz lesões em diversas regiões cerebrais podendo afetar os circuitos glutamatérgico e GABAérgico do sistema nervoso central, os quais estão relacionados com vários aspectos comportamentais. Diversos trabalhos sobre alterações cognitivas e bioquímicas em ratos adultos submetidos à deficiência de tiamina têm sido realizados, entretanto, raros estudos abordam este tema utilizando animais que foram submetidos à deficiência durante fases precoces do desenvolvimento. Deste modo, no presente trabalho, avaliou-se os efeitos da restrição de tiamina durante a lactação (Parte I) ou o período peri-natal (Parte II) sobre o desempenho cognitivo espacial e níveis cerebrais de GABA e glutamato da prole. Em ambos os delineamentos, as avaliações foram realizadas na fase jovem (idade = 30 dias) e adulta (idade = 75 dias) de forma independente. As variáveis comportamentais, aprendizado e memória, foram avaliadas durante treze dias utilizando um teste de navegação espacial, o Labirinto Aquático de Morris. No dia seguinte ao término dos testes, os ratos foram decapitados e os níveis de glutamato e GABA presentes no tálamo, hipocampo e córtex pré-frontal (CPF) determinados através de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC). Para este propósito um método cromatográfico para determinação dos dois aminoácidos em uma mesma amostra foi desenvolvido no presente trabalho e implantado no laboratório. A restrição de tiamina durante a lactação (Parte I) não afeta a razão entre peso encefálico e peso corporal nem dos ratos jovens nem dos adultos. Embora a capacidade de aprendizado da tarefa espacial não tenha sido afetada pela restrição de tiamina durante a lactação, a velocidade de aprendizado dos ratos jovens foi significativamente alterada [F(1,27) = 5,91; p = 0,022]. Nenhum dos aspectos comportamentais aprendizado e memória espacial - avaliados na fase adulta foram afetados. Com relação às avaliações bioquímicas, as concentrações de glutamato nas três regiões cerebrais analisadas [tálamo: F(1,26) = 37,98; p = 0,0001; hipocampo: F(1,26) = 13,35; p = 0,001; PFC: F(1,26) = 12,74; p = 0,001] e de GABA no tálamo [F(1,26) = 11,38; p = 0,002] dos animais adultos foram significativamente diminuídas pela restrição de tiamina durante a lactação. Todavia, não foram observadas diferenças significativas na concentração desses neurotransmissores quando a avaliação foi realizada em ratos jovens. Quando a restrição de tiamina foi realizada no período peri-natal (Parte II) observou-se um efeito significativo desse tratamento sobre a razão peso encefálico e peso corporal dos animais jovens [F(1,15) = 9,00; p = 0,009]. Todos os animais jovens foram capazes de aprender a tarefa de navegação espacial, mas a velocidade de aquisição foi prejudicada pelo tratamento [F(1,15) = 4,56; p = 0,049]. A relação entre os pesos encefálico e corporal e os aspectos comportamentais não foram alterados na fase adulta pela restrição peri-natal de tiamina. Esse tratamento também não afetou os níveis de glutamato e GABA em nenhuma das regiões cerebrais analisadas dos ratos jovens e adultos. Os dados obtidos no presente estudo mostram pela primeira vez que a restrição maternal de tiamina pode induzir alterações cognitivas e neuroquímicas na prole, indicando a importância dos níveis de tiamina na mãe durante os processos de gestação e lactação. Alterações na concentração dessa vitamina em períodos precoces do desenvolvimento podem afetar a neurobiologia e o comportamento dos animais da prole. Embora os estudos sobre os efeitos da restrição de tiamina durante a lactação ou durante o período peri-natal tenham sido independentes, uma observação preliminar dos resultados referentes aos efeitos desses tratamentos sobre os parâmetros bioquímicos nos permite supor que a restrição maternal de tiamina durante a lactação (Parte I) parece ocasionar efeitos mais pronunciados na prole do que a restrição no período peri-natal (Parte II). Tanto a restrição durante a lactação quanto a peri-natal causam déficit no aprendizado espacial da prole avaliada na fase jovem. Um estudo fatorial considerando, em um mesmo experimento, essas duas variáveis independentes e um controle do período de recuperação deve ser realizado no futuro. Thiamine (vitamin B1) deficiency causes lesions in different brain regions and may affect glutamatergic and GABAergic circuits of the central nervous system, which are related to a range of behavioral aspects. Several studies on cognitive and biochemical changes in adult rats subjected to thiamine deficiency have been published; however, few studies address this issue using animals that underwent deficiency during the early stages of development. Thus, in the present study, we evaluated the effects of thiamine restriction during lactation (Part I) or peri-natal period (Part II) on spatial cognitive performance and cerebral levels of glutamate and GABA in the offspring. In both designs, evaluations were conducted in the young (age = 30 days) and adult stage (age = 75 days). Behavioral parameters were assessed for thirteen days using a test of spatial navigation, the Morris Water Maze. At the end of the tests, rats were decapitated and the levels of glutamate and GABA present in the thalamus, hippocampus and prefrontal cortex (PFC) were determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). For this purpose, a chromatographic method for determination of the two amino acids was developed in the present work. Thiamine restriction during lactation (Part I) does not affect the relationship between encephalic weight and body weight in either young or adult rats. Although spatial learning was not affected by thiamine restriction during lactation, the speed of learning of young rats was significantly altered [F(1,27) = 5,91; p = 0,022]. None of the behavioral aspects - spatial learning and memory - evaluated in adults were affected. The concentrations of glutamate in the three brain regions examined [thalamus: F(1,26) = 37,98; p = 0,0001; hippocampus: F(1,26) = 13,35; p = 0,001; PFC: F(1,26) = 12,74; p = 0,001] and those of GABA in the thalamus [F(1,26) = 11,38; p = 0,002] of adult rats were significantly decreased by thiamine restriction. However, no significant differences in levels of these neurotransmitters were observed in young rats. When thiamine restriction was carried out in the peri-natal period (Part II) there was a significant effect of treatment on the relationship of encephalic weight and body weight of young animals [F(1,15) = 9,00; p = 0,009]. All young animals were able to learn the spatial navigation task, but the acquisition speed was affected by treatment [F(1,15) = 4,56; p = 0,049]. The relationship between encephalic/body weight and behavioral aspects was not affected at adulthood by the thiamine restriction during the perinatal period. This treatment did not affect the levels of glutamate and GABA in any of the brain regions analyzed in young and adult rats. The data obtained in this study show for the first time that maternal thiamine restriction can lead to cognitive and neurochemical changes in the offspring, indicating the importance of thiamine during pregnancy and lactation processes. Changes in the concentration of this vitamin during early periods of development can affect the neurobiology and behavior of the offspring. Although the studies on the effects of thiamine restriction during lactation or during the perinatal period were independent, preliminary observations of the effects of these treatments on biochemical parameters allow us to suppose that maternal thiamine restriction during lactation (Part I) causes stronger effects in the offspring than restriction in the perinatal period (Part II). Both restrictions during lactation and during the peri-natal period cause deficits in spatial learning in the offspring evaluated at the juvenile stage. A factorial study considering these two independent variables and a control of the recovery period should be conducted in the future.

A mioglobina é uma das hemeproteínas mais estudadas e bem caracterizadas atualmente. A concentração de estudos nessa proteína de aproximadamente 15-17 kDa possui justificativa relevante; apesar dos dados já consolidados sobre a mioglobina, essa vem apresentando cada vez mais versatilidade em termos de função e atividades no organismo, podendo participar indiretamente do surgimento e estabelecimento de patologias. As patologias envolvendo a mioglobina podem variar desde peroxidação de lipídeos de membrana até hepatopatologias graves. Algumas das patologias estão relacionadas à capacidade da mioglobina adquirir atividade enzimática oxidase após uma interação com agentes exógenos, como haletos de alquila ou agentes endógenos, exemplificados pelo peróxido de hidrogênio queé produzido normalmente no organismo como metabólito das reações químicas celulares. Estudos anteriores mostraram que seria necessária a presença de um resíduo de tirosina específico para ligar covalentemente o grupo heme à parte protéica da mioglobina para que ela adquirisse atividade oxidase após ser tratada com peróxido de hidrogênio; a histidina distal e um resíduo de histidina 97 seriam necessários para tal propósito, ao se utilizar um haleto de alquilana transformação. No presente trabalho não foi observada atividade oxidase nas mioglobinas das espécies de Biomphalaria estudadas, após seu tratamento com CCl4, concordando com a literatura arespeito da necessidade dos resíduos de histidina supracitados, os quais não estão presentes nessas mioglobinas, e a atividade residual observada antes do tratamento com o haleto de alquila, foi perdida.Após o tratamento com peróxido de hidrogênio foi observada atividade oxidase nas mioglobinas dos moluscos estudados, as quais não possuem nenhum resíduo de tirosina na sequência primária, o que sugere que outro mecanismo de reação, envolvendo outros resíduos,foi adotado para o surgimento da atividade oxidase. As mioglobinas de Biomphalaria também tiveram alguns parâmetros bioquímicos obtidosexperimentalmente (massa molecular, ponto isoelétrico, etc). Durante as análises foi observada a presença dessa proteína no estômago, além de sua presença na musculatura radular de Biomphalaria, como descrito previamente na literatura. Nesses dois tecidos a coloraçãoobservada devido à presença da mioglobina é diferente, e de acordo com a quantificação do conteúdo de mioglobina e taxas de auto-oxidação obtidas, essas mioglobinas poderiam ser isoformas. Myoglobin is one of the most studied and characterized hemeprotein. The focus in this protein with approximately 15-17 kDa has a relevant justification; spite of the solid data about myoglobin, this protein increasingly presents versatility in its function in the organism, and itcould play an indirect role in appearing and establishing pathologies.Pathologies related with myoglobin can range from membrane lipids peroxidation to serious hepatopathologies. Some pathologies are related with the capability of myoglobin to acquired oxidase activity after an interaction with exogenous agents as alkyl halides, or endogenous agents exemplified by hydrogen peroxide which is normally produced by cellular metabolism. Previous studies showed that it was necessarie a specific tyrosine residue presence to covalently bind heme group at mioglobin proteic part to acquires oxidase activity after being transformed using hydrogen peroxide; distal histidine e histidine residue 97 are recquired for oxidase activity if alkys halide are used. In this work, oxidase activity was not observed in Biomphalaria myoglobins treated withCCl4, according to previous studies about the necessecity of specific histidines, which are not present at Biomphalaria myoglobins; residual oxidase activity observed in these myoglobins before the treatment, was lost. After the hydrogen peroxide treatment oxidase activity wasobserved in Biomphalaria myoglobins. These myoglobins have no tirosine residues; it is suggested that another amino acid residue could be evolved in the reaction mechanism to provide oxidase activity. Some biochemical parameters of these myoglobins were obtained experimentally (molecular mass, isoeletric point, etc). During analysis it was detected the presence of myoglobin in the stomach, and not only in radular muscle as described in the literature. In both radular and stomach tissues the colour due to myoglobin is different, and according with the quantification of the myoglobin content and autoxidation rates, it is possible that the myoglobins in these two organs could be isoforms.

As bradicininas são importantes peptídeos moduladores da função cardiovascular. Elas atuam através da ativação de dois distintos receptores, receptores do tipo 1 e 2, denominados B1R e B2R. Esses receptores são acoplados a proteína G, ativando vias de sinalização intracelular. O papel que ambos desempenham na fisiologia cardíaca ainda é pouco conhecido. Por este motivo, decidimos estudar o animal nocaute para o B2R (B2R-/-), para averiguarmos o papel que este desempenha no controle da função cardíaca. Utilizando a técnica de Langendorff foi caracterizada uma redução na capacidade contrátil do coração isolado. Para melhor investigarmos os mecanismos envolvidos na disfunção cardíaca, estudamos os miócitos cardíacos isolados. Foi constatado que a capacidade contrátil, tanto de células isoladas do ventrículo direito como do esquerdo, apresentou redução significativa, bem como aumento no tempo para 50% da contração e relaxamento. Para caracterizarmos as propriedades elétricas das células isoladas do ventrículo esquerdo utilizamos a técnica de patch-clamp nos modos current- e voltage-clamp e foi constatado que, comparando-se o controle com o B2R-/- o potencial de ação apresenta uma duração maior; o potencial de repouso encontra-se mais despolarizado; a corrente de potássio retificadora de entrada (IK1) não está alterada; a corrente de potássio transiente de saída (Ito) encontra-se reduzida; a corrente de potássio retificadora de saída (Ik) não foi alterada e a corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) foi atenuada. Além disso, os processos cinéticos da Ito e ICa,L foram, de uma forma geral, alterados. Avaliamos a liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático através da técnica de microscopia confocal e constatamos que animais B2R-/- apresentam uma liberação fracional reduzida de Ca2+. Para caracterizarmos alterações na produção de espécies reativas do oxigênio avaliamos a produção basal de superóxido pelos cardiomiócitos e constatamos que os animais B2R-/- apresentam uma produção basal aumentada, quando comparados com os animais controle. Também averiguamos a participação do óxido nítrico (NO) na modulação da Ito, ICa,L e do transiente global de Ca2+. Constatamos que o NO é, em parte, responsável pela redução da Ito e ICa,L nos cardiomiócitos de animais B2R-/-, porém o NO não é responsável pela redução observada do transiente global de Ca2+. Tomando em conjunto, nossos dados indicam que os animais B2R-/- apresentam uma redução importante na função cardíaca, sendo este fenótipo devido, em parte, às alterações na eletrofisiologia das células cardíacas, na redução da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares (retículo sarcoplasmático) e no aumento da produção de superóxido. Além disso, as alterações encontradas devem-se provavelmente, a uma produção aumentada de óxido nítrico. Em suma, o fenótipo cardíaco apresentado pelos animais B2R-/- assemelha-se àquele encontrado na insuficiência cardíaca, indicando que os camundongos B2R-/- desenvolvem naturalmente esta patologia. The Kinins are important peptides concerning control of cardiovascular function. Their action mechanism depend on the activation of two distinct receptor, type 1 and 2 bradykinin receptor (B1R and B2R). They both are coupled to G protein, which are responsible to activate different intracellular pathways, involved in different cellular process. Their role in the control of heart function is not well understood. Based on this issue, we decided to evaluate the heart physiology of mouse knockout to type 2 receptor of bradykinin (B2R-/-), in order to evaluate the B2R function in the heart physiology. Using langendorff technique we observed a reduced heart function, in terms of contraction. To evaluate the mechanism involved in the heart dysfunction, we used isolated cardiomyocyte. We evaluated the cellular contraction and both, left and right ventricular cardiomyocytes presented reduction in cell shorthening. Furthermore, time to 50% to contraction and relaxation were increased. In order to investigate the electrical properties of left ventricular cardiomyocyte in B2R-/-, we used patch-clamp technique in current and voltage-clamp mode. When comparing control and B2R-/- we observed: increased time to repolarization of action potential; increased resting potential; inward potassium rectification (IK1) is not altered; transient outward potassium current (Ito) was reduced; delay potassium current (Ik) was not altered and L-type calcium current (ICa,L) was attenuated. Besides, kinetics process concerning Ito and ICa,L, in a overall mean were altered. We evaluated calcium release from sarcoplasmatic reticulum using confocal microscope and we obtained a reduction in calcium release from sarcoplasmatic reticulum from B2R-/-. To characterize alterations in the production of reactive oxygen species we evaluate basal production of superoxide in cardiomyocyte and B2R-/- presented an increased production when comparing to control. We also investigated the participation of nitric oxide (NO) in modulate Ito, ICa,L and calcium release from sarcoplasmatic reticulum. We observed that NO is, in parts, responsible to the reduction in Ito and ICa,L in cardiomyocytes of B2R-/-. However NO is not responsible to the reduction in calcium transient. Taking together, our results indicate that B2R-/- mice present a reduction in heart function attributed to alterations in electrophysiology, calcium transient and generation of reactive oxygen species. Furthermore, the dysfunction presented is, in parts, due to excessive production of NO. In sum, the heart phenotype presented by B2R-/- mice is similar to many models of heart failure, indicating that B2R-/- mice develop spontaneous heart failure.

A avulsão de raízes motoras, na interface do sistema nervoso central e periférico, promove uma significativa perda sináptica com degeneração de até 80% dos motoneurônios afetados, não havendo, até o presente momento, estratégias eficazes que propiciem uma reversão ou amenização deste quadro. Recentes estudos atribuem um potencial neuroprotetor à produção de fatores neurotróficos por células tronco mesenquimais (CTM). Porém, pouco se sabe sobre o impacto deste tratamento na sobrevivência neuronal e plasticidade sináptica no sistema nervoso central (SNC). Com o intuito de investigar processos relacionados com esse tratamento, o presente trabalho propôs a análise da sobrevivência de motoneurônios medulares em ratos submetidos a avulsão de raízes motoras, após terapia utilizando CTM, nos períodos agudo (2 semanas) e crônico (6 semanas) após a lesão. Foi realizada uma análise da dinâmica das sinapses e da reação astroglial. A fim de identificar condições que promovessem a sobrevivência e regeneração de motoneurônios axotomizados, foram determinadas a produção de RNAm para fatores neurotróficos (BDNF e GDNF) in vitro e in vivo, bem como a detecção das proteínas in vivo. Dessa forma, foi observado que o tratamento com CTM promoveu um significativo efeito neuroprotetor sobre os motoneurônios lesados e conseqüente aumento da sobrevivência neuronal nos períodos agudo e crônico pós-lesão. Tal proteção pôde ser atribuída a produção local de BDNF e GDNF pelas CTM e por sua ação sobre células residentes do SNC. A presença das CTM no microambiente medular promoveu estabilização sináptica, redução da astrogliose reativa, o que transcendeu a necessidade de diferenciação em neurônios ou glia, uma vez que estas asseguraram uma síntese local dos fatores neurotróficos. The ventral root avulsion, in the interface of the central and peripheral nervous system, promotes a significant synaptic loss with degeneration up to 80% of the affected motoneurons. Until the present moment, there are not effective strategies that propitiate a reversion or assuage this clinical. Recent studies attribute a neuroprotective potential of mesenchymal stem cells (MSC) to the production of neurotrophic factors. However, little is known about the impact of this treatment in the neuronal survival and synaptic plasticity in the central nervous system (CNS). With the intention of investigating processes related with this treatment, the present study proposed the analysis of the survival of medullary motoneurons in rats subjected to the ventral root avulsion, after therapy using MSC, in the acute (2 weeks) and chronic (6 weeks) periods after the lesion. An analysis of the synaptic inputs dynamics and the astroglial reaction was accomplished. In order to identify conditions to promote the survival and regeneration of axotomized motoneurons, the production of RNA for neurotrophic factors (BDNF and GDNF) was determined in vitro and in vivo, as well as the detection of these proteins in vivo. Thus, it was observed that the treatment with MSC promoted a significant neuroprotective effect on the harmed motoneurons and consequent increase of the neuronal survival in the acute and chronic periods after the lesion. Such protection could be attributed to the local production of BDNF and GDNF by MSC andfor their action on resident cells of CNS. The presence of MSC in the spinal cord microenvironment promoted synaptic stabilization, reduction of the glial reaction, what transcended a need for differentiation in neurons or glia, once these assured a local synthesis of the neurotrophic factors.

Há crescentes evidências que mostram que a modificação da LDL tem um papel potencial na aterogênese. No presente estudo, o floranol (3,5,7,2-tetrahiroxi-6-methoxi-8-prenilflavanona), um flavonóide isolado das raízes de Dioclea grandiflora, inibiu, com sucesso, a oxidação da LDL na presença de íons cobre avaliada pela formação de dieno conjugado e pelas subtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Como o mecanismo antioxidante pode envolver a coordenação com metais, tentamos compreender em detalhes as interações do floranol com Cu(II) e Fe(III) pela combinção de espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis), espectrometria de massa, voltametria cíclica. As constantes de acidez do ligante, bem como, as constantes de estabilidade dos complexos metálicos foram calculadas. Os valores de pKa foram determinados 6.58, 11.97 e 13.87 e a ordem das constantes de acidez proposta foi 7-OH > 5-OH > 2-OH. O melhor ajuste entre os espectros experimentais e calculados foi obtido assumindo a formação de dois complexos de Cu(II): [CuL] log = 19.34 ± 0.05 e [CuL2]2 log = 26.4 ± 0.10 e três complexos de Fe(III): [FeL3]3 log = 44.72 ± 0.09, [FeL2] log = 35.32 ± 0.08 e [FeL]+ log = 19.51 ± 0.04. Além disso, a redução de cobre e ferro é menos favorável na presença de floranol. Esses resultados indicam que o floranol pode eficientemente ligar-se ao Cu(II) e ao Fe(III) prevenindo a oxidação da LDL por tais metais. Outro mecanismo antioxidante dos flavonóides é sua capacidade de seqüestrar radicais livres. Avaliamos, por quimioluminescência, o efeito antioxidante do floranol em macrófagos de camundongos ativados de camundongos deficientes para o gene da apoliproteína E (ApoE-/-), da óxido nítrico sintase indutível (iNOS-/-) e da linhagem selvagem C57Bl/6. Nós demonstramos o efeito atenuador do floranol no surto oxidativo de macrófagos das três linhagens experimentais estudadas, ativados com zymosan, que receberam diferentes concentrações de floranol. Em conjunto, os dados obtidos neste estudo mostram que o floranol atua com um antioxidante pela capacidade de quelar íons Cu(II) e Fe(III) e através da interação direta com radicais livres. Increasing evidences support the oxidative modification of LDL as playing a potential role in atherosclerosis. In the present study, floranol (3,5,7,2-tetrahyroxy-6-methoxy-8-prenylflavanone), a flavonoid isolated from the roots of Dioclea grandiflora, successfully inhibited the oxidation of LDL in the presence of copper ions as measured by conjugated diene formation and thiobarbituric acid-reacting substances (TBARS). As the antioxidant mechanism may involve metal coordination, we have undertaken a detailed study of floranol interactions with Cu(II) and Fe(III) by combination of UVvisible (UVVis) and mass spectrometry and cyclic voltammetry measurements. The acidity constants of the ligand, as well as the stability constants of the metal complexes, were calculated. The pKa values of 6.58, 11.97 and 13.87 were determined and the following acidity order is proposed 7-OH > 5-OH > 2-OH. The best fit between experimental and calculated spectra was obtained assuming the formation of two Cu(II) complexes: [CuL] log = 19.34 ± 0.05 and [CuL2]2 log = 26.4 ± 0.10 and three Fe(III) complexes: [FeL3]3 log = 44.72 ± 0.09, [FeL2] log = 35.32 ± 0.08 and [FeL]+ log = 19.51 ± 0.04. In addition, copper and iron reduction is less favorable in the presence of floranol. These results indicate that floranol can efficiently bind Cu(II) and Fe(III) ions thus preventing their effect on LDL oxidation. Another antioxidant mechanism of flavonoids is its ability to scavenge free radicals. We evaluated the antioxidant effect of floranol on activated murine macrophages in apolipoprotein E (ApoE-/-) and inducible nitric synthase (iNOS-/-) knockout mice comparing to the wild-type strain C57Bl/6 by chemiluminescence. It was demonstrated the attenuating effect of different concentrations of floranol on zymosan elicited murine macrophage oxidative burst from three experimental strains of mice. Altogether the data obtained in this study showed that floranol act as an antioxidant on capacity to chelate iron and copper ions and through a direct interaction with free radicals.

Angiotensina II (100 nM) levou a um aumento da freqüência de disparo dos potenciais de ação dos neurônios do gânglio nodoso de ratos adultos. Esse efeito foi mediado pelo receptor do tipo AT1 uma vez que o mesmo foi bloqueado usando-se um antagonista específico dos receptores do tipo AT1. Estudou-se a ação desse peptídeo nascorrentes de potássio e de cálcio. A angiotensina II inibiu somente a corrente de potássio do tipo IA (~50 %). Também observamos uma inibição de cerca de 50 % da corrente total de cálcio ativada por alta voltagem. Essa inibição, aparentemente, não envolve a ativação dos receptores AT1. A angiotensina II altera a dependência de voltagem para a ativação das correntes de cálcio ativadas por alta voltagem (~6 mV no sentido hiperpolarizante). A angiotensina II provavelmente não inibiu um único tipo de canal para cálcio, observamos uma inibição de 30% das correntes do tipo L e de 20% das correntes do tipo N e/ou do tipo P/Q.A angiotensina II foi capaz de gerar aumentos transientes na concentração de cálcio no citoplasma desses neurônios. Esse aumento de cálcio foi uma conseqüência da ativação dos receptores do tipo AT1. O transiente de cálcio gerado pela angiotensina II depende da presença do cálcio no meio externo. Não observamos os mesmos efeitos daangiotensina II em neurônios do gânglio nodoso provenientes de animais hipertensos (SHR). Nesses animais, angiotensina II não foi capaz de alterar a excitabilidade e não produziu variações na concentração de cálcio. Angiotensin II at 100 nM increased the spike frequency generation in the adult rat nodose neurons. Since AT1 receptor antagonist prevented this effect we could suggest that the AT1 receptor is responsible for the increase in excitability. We investigated if this peptide was able to modulate isolated potassium and calcium currents. Angiotensin IIinhibited only the IA type potassium current (~50 %). The peptide also inhibited the high-voltage activated calcium current by 50%. This inhibition was not mediated by AT1 receptor activation. Angiotensin II was able to change the high-voltage calcium current voltage dependence for activation. It caused a shift towards the hyperpolarized membranepotentials by about 6 mV. Angiotensin II probably did not inhibit one specific type of voltage-dependent calcium channel. The L-type calcium current was inhibited by 30% and the N and/or P/Q type had an inhibition of 20%. Angiotensin II generated calcium transients in these neurons. The activation of AT1 receptor was responsible for the observed changes in the intracellular calcium levels. Surprisingly, the calcium transientevoked by the application of angiotensin II depends on the presence of calcium in the extracellular millieu. None of these described effects caused by angiotensin II were reproduced in spontaneously hypertensive rats (SHR).

A aranha Phoneutria nigriventer é uma das principais responsáveis por acidentes de araneismo na região sudeste do Brasil. Os sintomas predominantes causados por sua peçonha resultam em hiperexcitabilidade geral. Duas toxinas presentes no veneno, a Pntx2-5 e a PnTx2-6 possuem 48 resíduos de aminoácidos cada, com peso molecular de 5112,3 e 5289,3 Da, respectivamente. A toxina PnTx2-6 foi considerada o componente mais tóxico do veneno da aranha, por apresentar efeitos similares aos do veneno total, modificando os canais de sódio. Por se diferirem em apenas cinco resíduos de aminoácidos, comparamos os efeitos das toxinas PnTx2-5 e PnTx2-6 em canais de sódio de células GH3, alem de comparar os efeitos da PnTx2-6 em canais de sódio de diferentes tipos celulares (neuronal e muscular esquelético). Nossos dados mostram que ambas as toxinas aumentam a constante de tempo para a inativação dos canais de sódio em todas as preparações estudadas, com o surgimento de um componente que não inativa. Além disso, em músculo esquelético de rã, a PnTx2-6 reduz a amplitude da corrente de sódio, desloca as curvas de ativação e estado estacionário da inativação para valores hiperpolarizados e aumenta o tempo necessário para a recuperação da corrente de sódio. A afinidade da PnTx2-6 em sarcolema de rã foi 25 vezes menor que em células GH3. Nessas células, a PnTx2-6 modificou os parâmetros relacionados à inativação dos canais de sódio (a curva do estado estacionário da inativação e a recuperação da inativação da corrente de sódio) e o tempo para o pico da corrente. A PnTx2-5 modificou a curva de inativação no estado estacionário, mas não modificou o tempo para o pico e a recuperação da corrente de sódio. As toxinas da aranha não alteram a amplitude da corrente de sódio em células GH3. Uma diferença que nos chamou a atenção entre a PnTx2-6 e a PnTx2-5 em células GH3 foi a diferença em suas afinidades: o K0,5 da PnTx2-6 é 3 vezes menor que da PnTx2-5. Além disso, a PnTx2-5 se liga de forma reversível, sendo lavada do seu sítio ativo. Quando a célula é fortemente despolarizada esta toxina se desliga mais rápido. A PnTx2-6 não se deslocou do seu sítio ativo em nossas condições experimentais, nem mesmo com fortes despolarizações. A análise do dicroísmo circular da Pntx2-6 sugere que ela seja formada predominantemente por folhas- e estrutura randômica, apresentando baixa proporção de -hélice. O espectro de fluorescência do triptofano mostrou que estes resíduos estão expostos na superfície da molécula. Visto que um triptofano e uma tirosina estão substituídos na PnTx2-5, estes aminoácidos podem estar envolvidos na ligação da toxina ao canal de sódio, sendo importantes para conferir o maior K0,5 desta toxina quando comparada à PnTx2-6. The spider Phoneutria nigriventer is the major responsible for the araneism accidents in the Southeast of Brazil. The predominant symptoms of the envenomation indicate a general hyperexcitability. Two toxins of the venom, PnTx2-5 and PnTx2-6 have 48 amino acids each, and molecular weight 5112.3 e 5289.3 Da, respectively. The toxin PnTx2-6 is the most toxic component of the spider venom, and produces similar effects of the whole venom, modifying the sodium channels. As PnTx2-5 and PnTx2-6 diverge in 5 amino acids, we compared their effects on the sodium channel currents of GH3 cells, and compared the effects of PnTx2-6 on sodium currents of neuronal and skeletal muscle fibers. The data show that both toxins increase the time constant of inactivation of sodium current in all preparation tested, and produce a non-inactivating component. Additionally, in frog skeletal muscle PnTx2-6 decreases the sodium channel current amplitude, shifts the activation and steady-state inactivation voltage dependences to hyperpolarized potentials, and increases the time for recovery from inactivation. The PnTx2-6 affinity in skeletal muscle is 25 times lesser than that of GH3 cells. In these cells, PnTx2-6 modified the parameters related to the inactivation of sodium channels (the voltage-dependence of steady-state inactivation curve and the recovery from the sodium current), and the time to peak of the current as well. PnTx2-5 modifies the steady state inactivation curve, but does not modify the time to peak nor the recovery from inactivation of the sodium current. The toxins do not modify the amplitude of the sodium channel in GH3 cells. The main difference PnTx2-6 and PnTx2-5 on GH3 cells was their affinities: the K0,5 of PnTx2-6 is 3 times smaller than PnTx2-5. In addition, PnTx2-5 binds reversibly and can be washed from its binding site. When the cell is strongly depolarized, this toxin unbind faster, However, PnTx2-6 is not displaced from its binding site in ours experimental condition, even after strong depolarization The circular dichroism analysis of Pntx2-6 suggests that its secondary structure is formed predominantly by -sheet and random coil, with a small proportion -helix. The tryptophan fluorescence spectra show that these residues are exposed on PnTx2-6. One tryptophan and one tyrosine are replaced in PnTx2-5 when compared to PnTx2-6, and these amino acids may be involved in the binding of the toxin to the sodium channel, and their absence may account for the difference of affinities.

Atualmente, a termodinâmica vem auxiliando as pesquisas à resolver ou mesmo elucidar com maior clareza diversas questões importantes para a bioquímica, como os processos de enovelamento e desenovelamento das proteínas. As proteínas possuem atividades biológicas dependentes das estruturas e arranjos tridimensionais das suas cadeias polipeptídicas, e esses arranjos ocorrem devido ao enovelamento direcionado da seqüência linear dos aminoácidos, fazendo dessa forma que as proteínas passem de uma estrutura desordenada e sem função para uma estrutura bem definida, compacta e muitas vezes ativa.

Muitos organismos produzem polipeptídeos com atividade tóxica sobre outros organismos. Os canais de sódio dependentes de voltagem são os principais alvos de muitas toxinas estudadas até o momento. Dois sítios de ligação específicos de toxinas polipeptídicas têm sido particularmente caracterizados sobre o canal de sódio. Toxinas que se ligam ao sítio 3 causam ativação persistente do canal de sódio por inibir sua inativação. Toxinas que se ligam ao sítio 4 deslocam a dependência de voltagem da ativação para potenciais mais negativos. A toxina Tx2-6, obtida da fração PhTx2 do veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer, é um peptídeo básico que apresenta 48 resíduos de aminoácidos, rico em cisteínas. Este peptídeo é muito tóxico para camundongos e reproduz os principais sintomas do veneno total. A proposta deste estudo é a caracterização do efeito da Tx2-6 sobre os canais de sódio de músculo esquelético de rã, utilizando a técnica modificada do loose patch clamp como método para o estudo das correntes de sódio macroscópicas. Nossos resultados mostram que a Tx2-6 modifica a cinética dos canais de sódio de maneira dose-dependente. A Tx2-6 na concentração de 1 ìM prolonga a constante de tempo da inativação e desloca a dependência de voltagem da ativação e da inativação para valores mais negativos (-7,4 e -10 mV, respectivamente). A toxina também diminui o potencial de reversão em 10 mV e reduz o pico da corrente de sódio em 48%. No entanto, a toxina não mostrou nenhum efeito sobre a recuperação da inativação ou sobre a desativação da corrente de sódio. Estas complexas alterações podem explicar o efeito tóxico da Tx2-6.Esta toxina apresentou pouca identidade na sequência primária com toxinas que atuam nos sítios 3 e 4 dos canais de sódio. Many organisms produce polypeptides with toxic activity against other organisms. The voltage-gated sodium channels are the main targets of many toxins studied so far. Two specific binding sites of polypeptide toxins have been particularly characterized on the sodium channels. Toxins which bind to the site 3 cause persistent activation of sodium channel by inhibiting the inactivation. Toxins which bind to the site 4 shift the voltage dependence of activation to more negative potentials. The toxin Tx2-6, obtained from PhTx2 fraction of the Brazilian Phoneutria nigriventer spider venom, is a basic peptide that features 48 amino acids, rich in cysteines. This peptide is very toxic to mice and reproduces the predominant symptoms produced by the whole venom. The purpose of this study is to characterize the effect of Tx2-6 on the sodium channels of frog skeletal muscle, using the modified technique of loose patch clamp as a method for the study of the macroscopic sodium currents. Our results show that the Tx2-6 modifies the kinetics of sodium channels in a dose-dependent manner. The Tx2-6 at 1 ìm prolongs the inactivation time constant and shifts the voltage dependence of both activation and steady-state inactivation to more negative values ( -7.4 and -10 mV, respectively). The toxin also decreases the potential for reversal in 10 mV and reduces the sodium current peak by 48%. However, the toxin showed no effect on recovery from inactivation or the deactivation of the sodium current. Together, these complex changes can explain the toxic effect of Tx2-6. This toxin shows little primary sequence identity with toxins that acts on site 3 and 4 of the sodium channels.