Search

Scope: Around 25% of food allergic persons in Central Europe suffer from carrot allergy caused by the major carrot allergen Dau c 1. Three different isoallergens, Dau c 1.01, Dau c 1.02 and Dau c 1.03 are identified. However, information about the qualitative and quantitative composition of natural (n)Dau c 1 is scarce. Methods and Results: The new carrot allergen Dau c 1.0401 is identified on the mRNA and protein level by RT‐PCR and mass spectrometry. It displays only around 60% sequence identity to the other known Dau c 1 isoallergens. NMR and CD‐spectra are typical for a well‐folded protein containing both α‐helices and β‐strands. It showed a poor refolding capacity after incubation at 95 °C. IgE‐binding is impaired in immunoblots, whereas in inhibition assays IgE binding to soluble Dau c 1.0401 is detected and it clearly provoked a response in mediator release assays. Conclusion: Dau c 1.0401 is a new isoallergen which contributes to the allergenicity of carrots. The absence of immunoreactivity in immobilized assays indicates that IgE binding is impaired when the protein is blotted on a solid phase. Altogether, the results point out that its allergenicity can be reduced upon carrot processing.

Pathogenesis related proteins 10 (PR-10 Proteine) in Pflanzen werden oft als Antwort auf Stressstimuli produziert und sind verantwortlich für viele Pollen- und Lebensmittelallergien. Ihre genaue physiologische Funktion ist bisher unklar. In Deutschland sind rund 92 % der Baumpollenallergiker gegen das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sensibilisiert. Es existieren zahlreiche zu Bet v 1 homologe Proteine in verschiedenen anderen Pollen und Nahrungsmitteln wie Äpfeln, Nüssen, Steinobst, Sellerie und Karotten, die aufgrund ihrer ähnlichen Struktur bei Birkenpollenallergikern Kreuzallergien auslösen können. PR-10 Allergene liegen meist als Mischung unterschiedlicher Isoallergene und Varianten vor, welche vermutlich unterschiedliche Aufgaben erfüllen. Ihre dreidimensionale Struktur ist hoch konserviert und beinhaltet einen hydrophoben Hohlraum, der kleine Liganden binden kann, und auf eine Funktion als Transport- oder Speicherprotein hinweist. Ein natürlicher Ligand von Bet v 1.0101 ist das diglykosylierte Flavonoid Quercetin-3-O-Sophorosid (Q3OS). In dieser Arbeit konnte ein natürlicher Ligand des Haselallergens Cor a 1, Quercetin-3-O-(2“-O-β-D-Glukopyranosyl)-β-D-Galaktopyranosid (Q3O-(Glc)-Gal), identifiziert werden. Dieser ist beinahe identisch zu Q3OS und unterscheidet sich nur in der Position der OH-Gruppe am ersten Zucker (Glukose vs. Galaktose). Trotzdem weisen sowohl Cor a 1.0401 als auch Bet v 1.0101 eine sehr hohe Spezifität auf und binden nur ihren eigenen Liganden. Die Struktur von Cor a 1.0401, welche durch multidimensionale NMR-Spektroskopie bestimmt wurde, ermöglichte eine genauere Charakterisierung der Bindungstasche. Dies bietet die Grundlage, um zukünftig die Ursache der Bindungsspezifität zu untersuchen. Die meisten PR-10 Allergene gelten als instabil gegen Hitze, und der Verzehr gekochter Speisen, die diese Allergene enthalten, wird daher in der Regel als ungefährlich eingestuft. Zu dem Karottenallergen Dau c 1 liegen jedoch widersprüchliche Ergebnisse bezüglich seiner Fähigkeit zur Rückfaltung nach Erhitzen vor. Deswegen wurden in dieser Arbeit erstmalig verschiedene Isoallergene und Varianten des Karottenallergens nach Hitzeeinwirkung bei verschiedenen pH-Werten strukturell und immunologisch analysiert. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Karottenmatrix bei Erhitzen berücksichtigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten Dau c 1 Isoallergene bei neutralen pH-Werten nach Erhitzen die Fähigkeit zur Rückfaltung besitzen, während sie bei pH 3 hitzeresistente Formen bilden. Erhitzen in Anwesenheit der Karottenmatrix verringert zwar die Stabilität, es scheinen jedoch lineare Epitope erhalten zu bleiben, welche weiterhin eine allergische Reaktion auslösen. Eine Peptidmassenfingerprintanalyse des gereinigten, natürlichen Karottenallergens gab Hinweise auf die Anwesenheit von mindestens acht bisher noch nicht identifizierten Isoallergenen oder Varianten. In dieser Arbeit konnte ein neues Dau c 1 Isoallergen, Dau c 1.0401, auf mRNA- und auf Proteinebene identifiziert werden. Es weist eine Sequenzidentität von 61 % oder weniger zu den bereits bekannten Isoallergenen auf. Sein allergenes Potential konnte im Mediatorenfreisetzungstest und in Inhibitionsexperimenten bestätigt werden, allerdings war die Reaktion im Immunoblot, Dot Blot und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sehr schwach. Dies weist darauf hin, dass Dau c 1.0401 nur konformationelle Epitope besitzt, welche offenbar beim Membrantransfer zerstört werden. Dau c 1.0401 scheint daher ein wichtiges Isoallergen zu sein, welches zur Allergenität von Karotten beiträgt. Aufgrund seiner geringen Fähigkeit zur Rückfaltung verliert es jedoch z.B. beim Erhitzen von Karotten während der Nahrungsmittelzubereitung vermutlich sein allergenes Potential.

Scope: The major carrot allergen Dau c 1 belongs to the group of pathogenesis related class 10 (PR‐10) proteins and is homologous to the birch pollen allergen Bet v 1. In contrast to most other PR‐10 allergens, Dau c 1 can elicit Bet v 1 independent sensitisation. Although Dau c 1 is considered heat labile, allergic reactions against cooked carrots are possible. Methods and Results: The pH and temperature stability as well as the allergenic potential before and after treatment of purified natural (n)Dau c 1 and different recombinant (r) isoallergens was investigated: rDau c 1.0104, rDau c 1.0105, rDau c 1.0201, rDau c 1.0301. All proteins except rDau c 1.0201 were able to refold at physiological pH. pH conditions around the pI (4.4 – 5.5) or the presence of the carrot matrix reduced the refolding capacity. Below the pI, most isoallergens were heat resistant and still able to cause mediator release, indicating allergenicity. Moreover, cooked carrot extract was still able to provoke mediator release due to remaining soluble Dau c 1. Conclusions: Patients allergic to carrots should avoid processed carrot containing foodstuff because heating or pH treatment do not completely abolish the allergenicity of Dau c 1.