Search

Kõrgkooliõpik Ülle Jaakma ja Mihkel Jalakase toimetatud õpik „Veise sigimine“ valiti 2018. aasta parimaks eestikeelseks kõrgkooliõpikuks. Eestis on veisekasvatusest lugu peetud juba kiviajast peale. Meil on heade tõuomadustega ja suure toodanguga piimakari ja kiiresti kasvav lihakari ning me suudame toota kvaliteetset piima ja veiseliha nii kohalikele tarbijatele kui ka ekspordiks. Veiste sigimisprobleemid on oluliseks veisekasvatuse kasumlikkust mõjutavaks teguriks. Selleks, et sigimisprobleemide olemust mõista ja nende teket ennetada või neid ravida, on vajalikud põhjalikud teadmised veise sigimise erinevatest aspektidest. Seni puudub üks terviklik veise sigimise alast teavet koondav eestikeelne õppevahend. Käesoleva õpiku abil soovime seda lünka täita. Oleme õpikusse kokku kogunud teadmised suguorganite morfoloogiast ja füsioloogiast, tiinusest ja sünnitusest ning poegimisjärgsetest haigustest. Suguorganite anatoomiat käsitletakse õpikus mitte klassikalise, vaid funktsionaalse anatoomia seisukohast. Veise tiinuse ja sünnituse patoloogia osas antakse ülevaade ka väärarendite ja abordi problemaatikast. Esmakordselt käsitletakse eestikeelses õpikus kaasaegset sigimise biotehnoloogiat, sh embrüotehnoloogiat ja transgeenset tehnoloogiat, koos võimalike rakendustega aretustöös. Õpik on mõeldud eeskätt veterinaarmeditsiini eriala üliõpilastele, aga seda saavad käsiraamatuna kasutada ka praktiseerivad loomaarstid, seemendustehnikud ja loomakasvatuse spetsialistid. Lisaks sellele saavad siit informatsiooni bioloogia eriala üliõpilased ja biotehnoloogia ning kliinilise diagnostika spetsialistid, samuti bioloogiaõpetajad. Õpiku autorid on õppejõud ja teadlased, kes on oma kitsama valdkonna tunnustatud asjatundjad ning puutuvad oma töös käsitletud teemade ringi puudutavate probleemidega kokku iga päev. Täname kõiki autoreid nende suure panuse eest õpiku valmimisse. Suur tänu Eha Järvele, kes on rahulikult ja asjatundlikult aidanud eri autorite kirjutatud osad üheks tervikuks ühendada. Oleme tänulikud kõigile kolleegidele, kes oma tähelepanekute ja soovitustega on selle raamatu valmimisel kaasa aidanud. Loodame, et õpik pakub nii õppuritele kui ka praktikutele kasulikku ja vajalikku informatsiooni. Ülle Jaakma õpiku toimetaja

Additional file 1. Data pertaining to the identified putatively transferred transcripts, specific primers used in qPCR and sequences of transferred transcripts.

Presentations Presentations of the final conference of the SEARMET "Animal reproduction, technology and welfare".

Selecting high quality preimplantation embryo for transfer has been the most difficult task when producing embryos in vitro. To date the most used non-invasive method is based on visual observation. Developing a non-invasive method for embryo assessment is essential to have a profitable in vitro embryo production (IVP) and embryo transfer system. Molecular characterization of embryo growth media has been proposed as an complementary method to visual assessment of embryo morphology. In this study we are demonstrating a novel method, allowing sample collection at different embryo development stages, without compromising embryo quality, to determine potential viability markers for bovine IVP. Single bovine embryos were cultured in 60µl SOF+0.4% BSA droplets under mineral oil. Twenty µl of culture media was removed at day 2, 5 and 8 post-fertilization. A total of 58 samples were analyzed using liquid chromatography-mass spectrometry (Q-Trap 3200), followed by principal component analysis. Our results indicate that there are significant differences (p

The viability of microblade-bisected Day-7 embryos transferred to recipients without zona pellucidae directly after splitting or after overnight storage at 4°C was investigated in two experiments. In Experiment 1, 26 demi-embryos of excellent or good quality and two of fair quality were transferred to 28 heifer recipients 1-3 h after splitting. The transfers resulted in 20 pregnancies (71.4% pregnancy rate), and 19 calves were born (one pregnant heifer was slaughtered). Another 14 demi-embryos were cultured 1 to 3 h at room temperature, transported for 3 h at 8-10°C and stored for 12 h in a refigerator at 4°C, Twelve of the 14 demi-embryos were considered transferable after storage and nine of these were transferred to nine recipients, of which five became pregnant. Four live calves were born. In Experiment 2, 21 excellent or good quality demi-embryos were transferred into 21 heifer recipients to produce 12 pregnancies (57.1%) and 10 live calves. Another 19 demi-embryos (17 excellent to good quality and two fair quality) were transferred after storage for 1-2 h at 8°C and 18 h at 4°C. Five recipients became pregnant, of which four delivered live calves. It is concluded that a high pregnancy rate can be achieved after the transfer of fresh demi-embryos produced by a simple method of embryo bisection under farm conditions. Although the transfer of demi-embryos stored overnight at 4°C results in decreased pregnancy rates, refrigeration of demiembryos may be useful in certain practical situations. However, further experiments are needed to determine the optimal conditions for overnight storage of demi-embryos., Alkionhalkaisun ja -siirron tehokkuutta selvitettiin kahdessa kokeessa siirtämällä halkaistuja alkioita tuoreina tai yön yli säilytyksen (4°C) jälkeen. Alkionhalkaisut suoritettiin yksinkertaisella mikroveitsi-tekniikalla maatilalla. Kokeessa 1 siirrettiin 28 alkion puolikasta tuoreena vastaanottajahiehoihin, joista 20 tiinehtyi (71,4 %) tuottaen 19 vasikkaa. Kylmäsäilytyksen jälkeen (kokonaissäilytysaika 17-18 tuntia) 14 alkion puolikkaasta 12 arvioitiin siirtokelpoisiksi. Näistä yhdeksän siirrettiin vastaanottajahiehoihin, joista viisi tiinehtyi tuottaen neljä vasikkaa. Kokeessa 2 siirrettiin 21 alkion puolikasta vastaanottajahiehoihin. Näistä 12 tiinehtyi (57,1 %) poikien 10 vasikkaa, Kylmäsäilytyksen (kokonaissäilytysaika 22-24 tuntia) jälkeen siirrettiin 19 alkion puolikasta hiehoihin, joista viisi tiinehtyi. Näistä neljä poiki vasikan. Tulosten perusteella voidaan todeta, että yksinkertaisella tekniikalla on mahdollista tuottaa halkaistuja alkioita, joiden elinkyky alkionsiirron jälkeen on samaa luokkaa kuin mitä yleensä saadaan käsittelemättömillä alkioilla. Kylmäsäilytyksen jälkeen halkaistujen alkioiden elinkyky heikkenee selvästi, mutta halkaistujen alkioiden kylmäsäilytys voi joissakin tilanteissa olla käytännöllistä. Toisen puolikkaan voi siirtää vastaanottajalle heti halkaisun jälkeen ja toisen seuraavana päivänä kylmäkuljetuksen jälkeen esimerkiksi toisella paikkakunnalla. Toinen menetelmän sovellutus on ottaa alkioista koepaloja, lähettää ne laboratorioon analysoitavaksi, ja valita diagnoosituloksen perusteella, mitkä kylmäsäilytetyistä alkioista siirretään seuraavana päivänä.

Loomaarstiõppe lõputöö Veterinaarmeditsiini õppekaval Viimaste aastate jooksul on alpakade pidamine Eestis muutunud populaarsemaks, mistõttu alpakade aretuse teemal on üha sagedamini pöördutud veterinaararstide poole. Alpakakarja suurendamiseks kasutatakse ainult loomulikku paaritamist, sest nii veterinaararstidel kui ka alpakakasvatajatel puuduvad teadmised alpakade biotehnoloogiliste sigimismeetodite kasutamisest. Teoreetiliselt on biotehnoloogilisi sigimismeetodeid võimalik kasutada alpakade geneetilise aretusväärtuse tõstmiseks ilma loomade transportimiseta, parandades sellega loomade heaolu ja vähendades haiguste leviku riski. Praegu on kunstliku seemendamise tehnoloogia alpakadel alles algusjärgus ja raskesti kättesaadav. Embrüosiirdamise tehnoloogiaid ei kasutata Euroopas alpakakasvatustes aktiivselt, ent mujal maailmas üksikutes farmides kasutatakse seda aretusprogrammi osana. Ülevaate saamiseks alpakade aretusest ja selle arengusuundadest Eestis viidi läbi ülevaateuuring Eesti alpakakasvatajate seas. Uuringu valimisse kaasati 9 uuringu küsimustele vastanud alpakafarmi (vastanute osakaal 60%). Uuringus koguti andmeid praegusel ajal kasutatavate sigimismeetodite kohta ja lisaks uuriti aretajate huvi biotehnoloogiliste sigimismeetodite, eelkõige embrüosiirdamise tehnoloogiate vastu. Valdav osa Eesti alpakafarmidest on väikesed farmid, milles on vähem kui 15 looma. Enamik vastanutest (77,8%) peavad alpakasid hobiloomadena, millele järgnevad loomade pidamine villa tootmiseks (33,3%) ja tõulooma aretuseks (33,3%). Paaritusmeetoditest on kasutusel võrdselt nii vabapaaritus kui ka käestpaaritus. Emase alpaka seksuaalse vastuvõtlikkuse testimine on Eestis enim kasutatav tiinuse tuvastamise meetod. Transrektaalset ultraheli meetodit, mis on levinud teistel põllumajandusliikidel, alpakadel ei kasutata. Valdav enamus alpakakasvatajatest (77,8%) olid huvitatud biotehnoloogiliste sigimismeetodite kasutamisest. Embrüote importimise ja siirdamise teenuse eest oldi nõus tasuma kuni 1200€ ning embrüote loputuse ja siirdamise teenuse eest kuni 900€. Uuringu tulemused peegeldavad suurt huvi alpakade embrüosiirdamise vastu Eestis ja vajadust veterinaararstide järele selle valdkonna teadmiste omandamiseks. Sobiva embrüosiirdamise meetodi õppimiseks ja selle kasutusele võtmiseks Eestis, osales autor praktilisel koolitusel Cas-Cad-Nac farmis (Perkinsville, Vermont, Ameerika Ühendriigid). Õpitud metoodika põhineb üksikovulatsiooni protokollil, mis on lihtsam ja odavam kui superovulatsiooni protokollide kasutamine. Nimetatud metoodika suurendab ka võimalust saada kvaliteetsemaid embrüoid. Autor usub, et uurimus on kasulik kõikidele inimestele, kes on huvitatud alpakade aretusest ja alpakade embrüosiirdamise tehnoloogiatest. Over the last few years the keeping of alpacas in Estonia has become increasingly attractive, resulting in veterinarians being consulted more frequently about alpaca breeding. Currently, only natural mating is used to increase an alpaca herd because veterinarians and alpaca breeders lack knowledge regarding use of reproductive biotechnologies in alpacas. Assisted reproductive technologies theoretically can be used to accelerate the genetic merit of an alpaca herd without the need to import live animals, thus reducing the risk of spreading diseases and improving animal welfare by minimizing animal transport over long distances. At present, however, artificial insemination technology is not well developed or readily available in alpacas. Embryo transfer techologies are not utilized routinely in European alpaca herds, but in other parts of the world they are being used as a part of breeding program. To obtain a current overview of alpaca breeding and to acquire information about the future direction it could be moving in Estonia, a surveillance survey was conducted among the alpaca breeders. With a response rate of 60%, 9 alpaca farms were included in the survey. Data were collected on present alpaca breeding approaches as well as on breeder interest in assisted reproductive technologies, especially embryo transfer techologies. The vast majority of alpaca farms in Estonia are small with fewer than 15 animals. Most respondents (77,8%) kept their alpacas as hobby animals, followed by keeping for fiber production (33,3%) and breeding (33,3%). All the farms used natural mating; 50% of the animals are bred in a group, and 50% of the animals are hand mated. The alpaca female sexual receptivity test is the most commonly used method in Estonia for detecting pregnancy, whereas transrectal ultrasound (commonly used in other species) is not used. The vast majority of alpaca farmers (77,8%) were interested in assisted reproductive techologies. For buying, importing and transferring embryos, the farmers were willing to pay up to 1200€ and for embryo collection and transferring, up to 900€. The survey results reflect a great interest in alpaca embryo transfer in Estonia and the need for veterinarians to acquire knowledge in that field. A practical training was conducted at Cas-Cad-Nac farm (Perkinsville, Vermont, United States of America) to practice a suitable method for conducting embryo transfers in Estonia. The chosen method based on the single ovulation protocol, which is easier and cheaper than using superovulation protocols, as well as enhances the possibility of recovering embryos of a higher quality grade. The author believes that this research is valuable to all persons who are interested in alpaca breeding and alpaca embryo transfer technologies.

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone, Viljatuse levimus on tänapäeval üheks suurimaks murekohaks. Maailma Terviseorganisatsiooni prognooside kohaselt on viljatus 21. sajandil suuruselt kolmas ülemaailmne terviseprobleem, mis jääb alla ainult vähi ja südame-veresoonkonna haigustele. Abistav reproduktiivtehnoloogia (Assisted Reproductive Technology - ART), sealhulgas in vitro viljastamine, on oluline terapeutiline meetod viljatuse ravis. ART edukuse määr ei ole aga endiselt piisavalt kõrgel tasemel ning on veel palju arenguruumi meetodi tõhusamaks muutmisel. Üks peamisi põhjuseid võib olla sugurakkude kvaliteedi tõstmise ebaõnnestumine ning ka ebasobiv implatatsioonieelne keskkond. Viimastel aastatel on EV-sid (membraaniga ümbritsetud nanosuuruses osakesed) üha enam tunnustatud kui alternatiivset rakkudevahelise suhtluse viisi. Mitmed uuringud on näidanud, et EV-sid on eraldatud peaaegu kõigist bioloogilistest vedelikest, sealhulgas follikulaarvedelikust (FF). FF-st pärinevad EV-d on olulised munarakkude küpsemiseks, viljastamiseks ja embrüo arenguks ning EVd on ka potentsiaalsed patofüsioloogiliste seisundite biomarkerid. Antud projektis uurisime FF EV-de rolli munajuha geeniekspressiooni reguleerimisel ning nende mõju spermatosoidide elutähtsatele funktsioonidele. Lisaks uurisime ka EV kaasas kantavate komponentide muutuseid polütsüstiliste munasarjade sündroomi (PCOS) patsientide FF EV-des võrreldes tervete inimestega. Meie esimene uuring näitas, et veiste FF ja FF EV-d muudavad veiste munajuhade epiteelirakkude geeniekspressiooni, mis võib kaasa aidata implantatsiooni eelse mikrokeskkonna, viljastamise ja embrüo varajase arengu ettevalmistamisele. Samamoodi näitas meie teine uuring, et veiste FF EV-d parendavad veiste spermatosoidide funktsionaalseid omadusi, eriti elujõulisust, kapatsitatsiooni ja akrosoomireaktsiooni. Lõpuks näitas meie kolmas uuring EV kaasas kantavate komponentide muutuseid erinevates patofüsioloogilistes seisundites (võrreldi PCOS patsiente ja viljakaid naisi) ja nende panust munasarjade signaali häiretesse. MiRNA-de analüüs näitas, et PCOS-i naistelt saadud FF EV-d kannavad tervete naistega võrreldes erinevaid miRNA-sid. Meie tulemused kinnitasid ka PCOS-i naiste puhul uudse FF EV-dest tuletatud miRNA, mida võiks kasutada PCOS-i diagnoosimise potentsiaalse biomarkerina. Kokkuvõtteks kinnitasid meie uuringute üldised leiud EV-de olemasolu FF-is ja nende mõju spermatosoididele ja munajuhade geeniekspressioonile ning erinevusi FF EV-de kaasas kantavates komponentides PCOS-i patsientide ja tervete naiste puhul., The prevalence of infertility is one of the most pressing issues in today’s society. Based on forecasts from the World Health Organization, infertility will rank third among the most serious global health problems in the twenty-first century, after cancer and cardiovascular disease. Assisted reproductive technology (ART), which includes in-vitro fertilization (IVF), is an essential therapeutic method for the treatment of infertility. However, the success rate of ART is still not up to the mark and there is abundant room for improvement in ART's. One of the main reasons hindering the success of ART’s could be the failure to enhance the quality of gametes, and undermining the factors present during preconception. Therefore, the current research identifies the bottleneck issues of infertility, methods for gametes improvement, and role of follicular fluid (FF) derived extracellular vesicles (EVs) in enhancing a suitable preconception environment that might be essential for fertilization and early embryo development. In recent years, EVs (membrane-bound nanosized particles) have become increasingly recognized as an alternative mode of intercellular communication. Many published studies have shown that EVs had been isolated from nearly every type of biological fluid, including FF. FF-derived EVs are essential for oocyte maturation, fertilization, embryo development and have potential to act as biomarkers. In this project, we investigated the role of FF EVs in regulating the gene expression of oviduct, its impact on vital functions of spermatozoa, and the cargo changes in FF derived EVs in Polycystic ovarian syndrome (PCOS) patients versus healthy people. Our first study showed that bovine FF and FF EVs alter the gene expression of bovine oviductal epithelial cells, which may contribute to the preparation of preconception microenvironment, fertilization and early embryo development. Similarly, our second study showed that bovine FF EVs enhances the functional properties of bovine spermatozoa, specifically viability, capacitation, and acrosome reaction. Finally, our third study showed EV cargo changes in different pathophysiological condition (PCOS and fertile women) and their contribution to ovarian signal disturbance. The miRNAs analysis revealed that FF EVs derived from PCOS women carry different miRNAs as compared to healthy women. Our results also confirmed novel miRNA derived from FF EVs in case of PCOS women, which could use as a potential biomarker for PCOS diagnosis. In conclusion, our studies overall findings confirmed the presence of EVs in FF and their effects on spermatozoa, and oviductal gene expression, and differences in cargo of FF EVs incase of PCOS patients versus healthy women., https://www.ester.ee/record=b5517211

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone, Viljatus on ülemaailmne probleem, mis vaevab hinnanguliselt 15% paaridest. Viljatuse raviks kasutatakse kunstliku viljastamist, mis aitab mitmetel paaridel rasestuda. Abistatud reprodiuktiivtehnoloogia metoodikate valik on mitmekesine, kuid kõige kasutatavam on in vitro viljastamine (IVF). Alates 1970-ndatest on abistatud reproduktsioonitehnoloogia märgatavalt arenenud ja aidanud ilmale tuua miljoneid lapsi. Sellest hoolimata on IVF-i edukus alla 40%. Edutu implantatsioon on ebaõnnestunud embrüo siirdamise peamine põhjus 2/3 juhtudest. Nidatsioon on inimese paljunemise üks olulisemaid etappe, kus embrüo kinnitub endomeetriumi. Selleks peab aga endomeetriumis toimuma mitmed muutused. Üheks endomeetriumi muutuste vallandajaks peetakse embrüo ja endomeetriumi vahelist suhtlust. Mitmete rakkudevaheliste suhtluste meetodite hulgas on rakuvälised ehk ekstratsellulaarsed vesiikulid (EV) üks olulisim transportmehhanism. EV on nanoosakesed, mis sisaldavad mitmeid bioloogiliselt aktiivseid molekule. Neid molekule viivad EV ühest rakust teise. Doktoritöös uuriti inimese ja veise embrüonaalse RNA, peamiselt mittekodeeriva RNA, ülekandumist endomeetriumi rakkudelt eralduvatest EV-dest. Embrüo RNA märgistamisega kinnitati, et embrüonaalne RNA kandub endomeetriumi rakkudesse. Selline rakkudevaheline suhtlus muutis endomeetriumi rakkude vastuvõtlikkust embrüo implantatsiooniks, millega tõestati et embrüo EV võivad märkimisväärselt muuta endomeetriumi rakkude talitlust nii inimesel kui ka veisel. Kunstlikus viljastamises on üha populaarsem siirata vaid üks parima kvaliteediga embrüo, kuid hindamismeetodid embrüo valimiseks on puudulikud. Antud doktoritöös leiti, et endomeetriumi rakkudes (eriti endomeetriumi transkriptoomis) toimunud muutused olid seoses embrüo kvaliteediga. Seda tulemust embrüo-emaka suhtluses saab teoreetiliselt kvantifitseerida ja kasutada mitteinvasiivse meetodina hindamaks embrüo kvaliteedi, mis parendaks viljatuse ravi edukust ja vähendaks patsientide kannatusi., Subfertility is a global condition with estimated 15% of couples worldwide have trouble conceiving. In many of these cases, the most effective remedy is assisted reproduction. Assisted reproduction can take many forms. In vitro fertilization or IVF being the one with which the most people are familiar. Since its conception in the 1970s, assisted reproduction has developed significantly producing millions of successful pregnancies. However, the rate of success of IVF remains below 40% even in ideal candidates. Failure of implantation has been identified as the main cause of failed embryo transfers in 2/3 of the cases. Implantation is one of the most critical steps in human reproduction. The embryo attaches itself to the endometrial epithelium. The endometrium changes drastically in anticipation of the incoming embryo. One trigger that brings about this change is thought to be the communication between embryo and the endometrium. Among many available methods of intercellular communication, extracellular vesicles stand out because of its remarkable utility as a cargo carrier. Extracellular vesicles or EV are nanometre sized sacs that contain biologically active molecules. They can transfer these molecules in between cells as cellular messengers. In this project, we have investigated the phenomenon of embryonic RNA, especially non-coding RNA, transfer to endometrial cells using EVs as a transport mechanism. By labelling embryo RNA, we were able to confirm that Embryonic RNA is in fact transferred to the endometrium. This intercellular communication changes the physiology of the endometrium in such a way that endometrial cells were transformed into a higher level of receptivity for the incoming embryo. We also observed that only embryo EVs can induce this remarkable change on the endometrial cells. The embryonic EV based communication was also observed in bovine embryo-maternal interactions. Interestingly, the changes induced in the endometrial cells, especially in the endometrial transcriptome, correlated with the quality of the embryo that produced the EVs leading us to theorize that this method of quantifying the embryo-maternal communication can be used as a non-invasive method of embryo grading. In the ever-popular practise of elective single embryo transfer in assisted reproduction, selecting the best embryo is hugely advantages. Quantified embryo maternal communication could therefore be an invaluable tool in the field of assisted reproduction to reduce patient suffering and to increase the rate of successful pregnancies., https://www.ester.ee/record=b5497782

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone, Viljatus on globaalne rahvatervise probleem, mis mõjutab miljoneid inimesi. Abistav reproduktiivtehnoloogia, sealhulgas in vitro viljastamine, on aidanud mitmeid viljatuid inimesi. Küll on sellel metoodikal üheks kitsaskohaks implantatsiooni ebaõnnestumine isegi morfoloogiliselt parimate embrüotega. Seetõttu toimuvad jätkuvalt uuringud tuvastamaks paremaid meetodeid, mis hindavad embrüo kvaliteeti ja ennustavad siirdamise edukust, olles peamiselt embrüokasvusöötme baasil. Rakuvälised ehk ekstratsellulaarsed vesiikulid (EV) on membraaniga ümbritsetud nanoosakesed, mida toodavad peaaegu kõik rakutüübid erinevates füsioloogilistes ja patoloogilistes konditsioonides. Nende kaudu toimub rakuvaheline suhtlus. Mitmed uuringud, eriti vähi korral, on uurinud EVde potentsiaali biomarkerina ja ravimkandursüsteemina. Antud doktoritöö uuris implantatsiooni-eelse perioodi embrüost vabanenud EVde potentsiaali embrüokvaliteedi markerina ja embrüo-emaka suhtluse vahendajana. Katsed viidi läbi kasutades veise-embrüoid ja inimrakukultuuride põhiseid eksperimentaalmudeleid. Esimene uuring tõestas, et individuaalselt kasvatatud implantatsiooni-eelse perioodi veise-embrüod eritavad EVsid kasvusöötmesse ning nende kontsentratsiooni- ja suurusprofiil sõltub embrüo kvaliteedist ja arengustaadiumist. Järgnevalt katsetati munajuharakkudel implantatsiooni-eelse perioodi embrüost pärit EVde funktsionaalsust. Katse käigus selgus, et EVd kõrge kvaliteediga embrüotest muutsid munajuharakkude geeniekspressiooni, mida aga ei teinud halva kvaliteediga embrüote EVd. Suurenenud ekspressiooniga geenide hulgas olid mitmed interferoon-τ raja interferooni stimuleerivad geenid. Interferoon-τ peetakse mäletsejaliste tiinuse tuvastusmolekuliks. See leid viitab, et munajuha tunneb ära kvaliteetse embrüo. Viimaseks uuriti embrüo EVde funktsionaalsuse spetsiifilisust. Leiti, et endomeetrium reageerib vaid embrüo päritolu EVdele. Uuringute käigus tuvastati embrüost vabanenud EVde potentsiaal ja spetsiifilisus embrüokvaliteedi biomarkerina., Infertility is a global public health problem that affects millions of people in their reproductive life. Assisted reproductive technologies (ARTs) such as in-vitro fertilization have enabled many patients to overcome this issue. However, a bottleneck in ART success is the implantation failure even after the transfer of morphologically best embryos. Hence, investigations continue to identify better or complementary methods of assessing embryo quality and predicting transfer success, mainly based on the embryo culture media. Extracellular vesicles (EVs) are membrane-bound nanoparticles released by almost all types of cells under different physiological and pathological conditions. They mediate intercellular communication. Many studies, especially related to cancer, have investigated EVs' potential as biomarkers and therapeutic drug delivery systems. This project investigated preimplantation embryo-derived extracellular vesicles as a potential embryo quality marker and a mediator of embryo-maternal communication. Experiments were performed using bovine embryos and human cell-culture based experimental models. The first study showed that individually cultured preimplantation bovine embryos release EVs to their culture media, and their concentration and size profile are dependent on the quality and development stage of embryos. Subsequently, the functionality of preimplantation embryo-derived EVs were tested in the oviduct. It was observed that EVs from good quality embryos, but not the EVs from embryos of low developmental potential quality, could alter the gene expression of the oviduct. Among the up-regulated genes, many were interferon-stimulated genes of the interferon-τ pathway. Interferon-τ is considered the pregnancy recognition molecule in ruminant pregnancy. This finding suggests that the oviduct can serve as a biosensor of embryo quality. Finally, the functional specificity of embryonic EVs were investigated. It was observed that endometrium only react to embryonic EVs but not to the non-embryonic EVs. All these studies support the potential and specificity of embryo-derived EVs as a biomarker of embryo quality., https://www.ester.ee/record=b5484099

A thesis for applying for the degree of Doctor of Philosophy in Agricultural Sciences At present, dairy farming is definitely the most profitable sector of Estonia’s cattle industry. The effectiveness of milk production is dependent not only on the availability of high-quality genetic material but also on several other factors, including the quality of frozen bull semen. The purpose of this research was to assess the effect of different factors such as age, the proportion of Holstein genes, and season of the year on the quality of semen collected from breeding bulls. The studies were also aimed at determining the methods and parameters most suitable for routine semen analysis performed at artificial insemination (AI) stations, predicting pregnancy rates, and developing a relevant mathematical prediction model. Analysis of the experimental data revealed that the above factors affect sperm motility, mitochondrial activity, and the stability and integrity of plasma membranes. A positive correlation was found between pregnancy rates and sperm quality assessed by flow cytometry and the results of conventional laboratory tests used at AI stations. A combination of conventional laboratory tests and flow cytometric analysis of membrane stability and mitochondrial activity of frozen-thawed spermatozoa allowed better prediction of the potential fertility of bull semen in comparison to the conventional laboratory tests alone. Knowledge of these relationships and implementation of the research findings into practice enables AI stations to produce top-quality semen straws the use of which ensures higher pregnancy rates in cows. Based on the findings of the study, the semen collection and processing procedures were modified at the Kehtna AI station to take into accout age-specific and other particular features of each individual bull. Furthermore, collection of ejaculates and production of semen straws were rescheduled mostly for the autumn-winter period. Thanks to the improvements made to the semen collection and processing procedures, the number of semen straws per ejaculate has increased by about 15 percent at the Kehtna AI station. Over the last seven years, an increase in pregnancy rates by about 3 percent has been achieved, as a result of which dairy farmers have saved nearly 300,000 euros on their AI costs. Tänapäeval on Eesti veisekasvatuses kõige tulusam pidada piimakarja. Piimatootmise tõhusus ei sõltu ainult väärtusliku geneetilise materjali olemasolust, vaid ka paljudest teistest teguritest, mille hulgas on tähtsal kohal sügavkülmutatud pullisperma kvaliteet. Uurimistöö eesmärk oli välja selgitada, kuidas mõjutavad sperma kvaliteeti pulli vanus, holsteini veresus ja sperma kogumise aastaaeg ning leida sperma kvaliteeti määravate meetodite seast sellised, mida saaks rakendada seemendusjaama tööprotsessis ja mis sobiksid samas ka emasloomade tiinestumise prognoosimiseks nii üksiktestina kui ka matemaatilise mudeli komponendina. Uuringust selgus, et sugupulli vanus, sperma varumise aastaaeg ja pulli holsteini veresus avaldavad mõju spermide liikuvusele, mitokondrite aktiivsusele, membraanide stabiilsusele ja terviklikkusele. Kehtna kunstliku seemendusjaama tootmisprotsessis arvestatakse pulli ealisi iseärasusi ja individuaalset omapära ning enamik seemendusdoose toodetakse sügistalvisel perioodil. Seemendusjaamas spermide hindamiseks kasutatavate testide ja voolutsütomeetriga määratud spermide kvaliteedi ja emasloomade tiinestumise vahel leiti positiivne korrelatsioon. Kõige parem mudel spermide viljastamisvõime hindamiseks moodustus kombinatsioonist, mis hõlmas nii seemendusjaamas kasutatavaid teste kui ka voolutsütomeetriga määratud spermide omadusi. Tänu selliste seoste väljaselgitamisele on võimalik garanteerida toodetud seemendusdooside tippkvaliteet, mis on vajalik emasloomade õigeaegseks tiinestumiseks. Uuringutest saadud teadmiste ja kogemuste rakendamine seemendusjaama tehnoloogilises protsessis on suurendanud ühest ejakulaadist toodetavate seemendusdooside arvu ~15% võrra. Viimase seitsme aasta jooksul on veiste kunstliku seemenduse tulemuslikkus Eestis tõusnud ~3% võrra ning seeläbi on põllumajandustootjad samal perioodil säästnud ~300 000 € seemendustele tehtavate kulutuste arvelt.

1.The gluteus medius muscle of Akhal-Teke horses consists of a relatively high percentage of MyHC I and IIa isoforms, which together compose about 50% of MyHC. These are the main isoform types in the muscle fi bres with high oxidative potential, which show muscle endurance capacity. 50% of MyHC IIx isoforms proves the standpoint that these horses can be used not only in a single discipline but in a variety of different riding sports having the capacity both for short-distance races or endurance rides. The positive correlation between MyHC I isoform and MyLC 1slow and MyLC 2slow isoforms and the negative correlation between MyHC I isoform and alkali and regulatory MyLC fast isoforms shows that MyLC 1fast isoform relative content is one indicator of muscle contraction speed. 2. The comparison of MyHC and MyLC isoforms’ pattern in human, horse and rat muscle shows that MyHC I isoform relative content in human muscle is higher than in horse and rat muscle and the horse muscle has a higher relative content of MyHC IIx/d isoforms than rat and human muscle. Quadripedals have a higher percent of MyHC IIx/d isoforms and MyLC 1fast and MyLC 2fast isoforms’ relative content in skeletal muscle than bipedal human muscle. The role of MyLC isoforms’ distribution in mammalian skeletal muscle is related to MyHC isoforms’ pattern and depends on the muscle’s oxidative capacity. 3. Older Akhal-Teke horses had a different MyHC and MyLC isoforms’ distribution in gluteus medius muscle in comparison with young horses. In over 20-year-old Akhal-Teke horses, the relative content of MyHC I and MyLC 1slow isoforms in gluteus medius muscle decreases. This is opposite to what is found in humans and laboratory animals. 4. A signifi cant difference exists in MyHC and MyLC isoforms’ composition between mares and stallions – mares had a higher proportion of MyHC IIx and MyLC 3fast isoforms than stallions. 52 5. The highest heritability was found for MyHC I isoforms (h² = 0.398), while the heritability of other fi bres was lower and not statistically signifi cant. 6. There is great variability among the content of MyHC and MyLC isoforms in Akhal-Teke horses. However, there were no statistically signifi cant differences between sire lines and dam families. Skeletilihased moodustavad 45–55% hobuse kehamassist. Lihasvalk müosiin tagab lihase töö. Müosiini molekul sisaldab kahte rasket ja nelja kerget ahelat. Müosiini erinevate isovormide sisalduse põhjal liigitatakse skeletilihased kiireteks ja aeglasteks. Müosiini raskete ahelate (MyHC) isovormid I, IIa ja IIx on hobustel aluseks viiele lihaskiutüübile – I, I/IIA, IIA, IIA/IIX ja IIX. Nende kontraktiilsed omadused ning oksüdatiivne potentsiaal määravad lihase kiirus-, jõu- ja vastupidavusomadused. Koormusele parema vastupidavusega hobustel on rohkem I ja IIA tüüpi lihaskiude, IIX tüüpi lihaskiud on aga iseloomulikud kiiretele hobustele. Müosiini kerged ahelad (MyLC) on seotud müosiini kaela piirkonnaga ning jaotuvad aluselisteks (MyLC 1fast, MyLC 1slow ja MyLC 3fast) ning regulatoorseteks (MyLC 2fast ja MyLC 2slow) isovormideks. Iga müosiini raske ahel on seotud ühe regulatoorse ja ühe aluselise kerge ahelaga. Aeglastes lihaskiududes domineerivad aeglased ja kiiretes lihaskiududes kiired müosiini kerge ahela isovormid. On leitud, et lihaskiutüüpide jaotus elu jooksul muutub. Inimestel ja närilistel suureneb vananemisel müosiini raskete ahelate I isovormi sisaldus. Vanematel (üle 20 a) hobustel on aga täheldatud hoopis IIx isovormide sisalduse suurenemist. Hobustel on palju uuritud sportlikku võimekust iseloomustavate näitajate päritavust, kuid vähe on tehtud vastavaid uuringuid lihaskiutüüpide kohta. Lihaskiutüüpide päritavust on põhjalikult uuritud veistel ja sigadel seoses liha kvaliteedi parandamisega aretuse abil. Kuna enamik hobusetõuge on juba aretatud spetsiifi lises suunas – kas veotööks, hüppevõime, kiiruse või vastupidavuse suunas, siis see on ka ilmselt põhjus, miks ei ole tehtud laialdasemaid uuringuid põlvnemise mõjust lihaskiutüüpidele ühe tõu piires. Et aga aretuse käigus parandada vastavaid lihastöö omadusi, on vaja teada lihase omaduste päritavust. 73 Ahhal-tekiini hobune on maailma vanimaid kuumaverelisi tõuge, esimesed tõendid sellest tõust pärinevad 3000 aasta tagusest ajast. Seda tõugu on kasutatud enamiku tänapäeva hobusetõugude, sh eelkõige inglise täisverelise ratsahobuse aretuses. Ahhal-tekiini hobusel on erakordne vastupidavus, ta suudab läbida sadu kilomeetreid rasketes tingimustes. Samuti võivad seda tõugu hobused arendada suurt kiirust ja sageli kasutatakse neid kiirusspordis (galopivõidusõitudes). Ahhal-tekiini hobuse skeletilihase kiulist koostist senini uuritud ei ole. Käesolevas doktoritöös uuriti ahhal-tekiini tõugu hobuste skeletilihase müosiini raskete ja kergete ahelate jaotust (artiklid II, III ja V), selgitati müosiini isovormide jaotuse muutust organismi vananemisel (artikkel III) ja isovormide jaotuse erinevusi isas- ja emasloomade vahel (artikkel V). Samuti võrreldi müosiini isovormide jaotuse erinevust inimese ning suurte (hobune) ja väikeste imetajate (rott) vahel (artikkel IV). Võttes arvesse põlvnemist, selgitati lihaskiutüüpide päritavust tõu piires (artikkel V). Lihasuuringute tegemiseks koguti lihaseproovid 26-lt ahhal-tekiini tõugu hobuselt (8 täkku ja 18 mära) vanuses 1,5–23,5 aastat. Vanuseliste iseärasuste uurimiseks jaotati 23 hobust kolme vanusegruppi: grupp 1 1,5–2,5 a (11 hobust), grupp 2 9–20 a (9 hobust) ja grupp 3 21–23,5 a (3 hobust). Erinevate imetajaliikide skeletilihase müosiini isovormide võrdlemiseks valiti 10 hobust keskmise vanusega 14 aastat, 10 meessoost isikut keskmise vanusega 40 aastat ning 12 Wistari liini rotti vanusega 22 nädalat. Eksperiment tehti Eesti Vabariigi Põllumajandusministeeriumi loomkatseprojekti loakomisjoni otsuse alusel. Lihaseproovid võeti hobustelt vasakust kesksest tuharalihasest, u 15 cm puusaköbrust kaudodorsaalselt 60 mm sügavuselt. Proovide võtmisel kasutati Ledwidthi ja McGowani poolt kirjeldatud meetodit. Enne biopsiat tehti hobustele üldanesteesia ksülasiiniga (1 mg/kg i.v.) ning lokaalanesteesia 2% lidokaiiniga (10 ml). Inimestele tehti lokaalanesteesia ja lihaseproovid koguti vasakust lateraalsest pakslihasest. Wistari liini rottidele tehti intraperitoneaalne anesteesia ning lihaseproovid võeti pindmisest varvastepainutaja, pikast varvastesirutaja ja lestlihasest ning vahelihase lihaselisest osast. Lihaskoetükid kaaluti, pulbristati vedelas lämmastikus ja homogeniseeriti jääkülmas puhvris (20 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 1 mM EGTA, 74 pH = 6,5) ning tsentrifuugiti (10 000 p/min, 10 min, temp 4 °C). Sade suspendeeriti ja müofi brillaarvalgud ekstraheeriti jääl puhvris, mis sisaldas 100 mM Na2P2O7, 5 mM EGTA, 1 mM DTT (pH = 8,5). Seejärel proovid tsentrifuugiti (10 000 p/min, 10 min, temp 4 °C). Supernatant koguti ja segati võrdse mahu glütserooliga ning säilitati temperatuuril – 80 °C edasisteks analüüsideks (d’Albis et al., 1979). Valgu kontsentratsioon uuritavates proovides määrati kolorimeetriliselt (Bio-Rad, Hercules, CA). Vahetult enne valkude elektroforeetilist lahutamist proovid lahjendati puhvriga (62,5 mM Tris pH = 6,8; 5% β -merkaptoetanool; 2,5% SDS; 20% glütserool; 0,1% broomfenoolsinine), kuumutati 3 minutit temperatuuril 100 °C, jahutati jääl ja säilitati temperatuuril – 20 °C. Müosiini raskete (MyHC) ja kergete ahelate (MyLC) isovormide lahutamiseks ja identifi tseerimiseks kasutati naatrium-dodetsüülsulfaatpolüakrüülamiid- geelelektroforeesi (SDS-PAGE). Hobuse kesksest tuharalihasest lahutati MyHC isovormid vastavalt Talmadge’i ja Roy (1993) metoodikale, mida on modifi tseerinud Kohn ja Myburgh (2006). Inimese ja roti lihasproovidest lahutati MyHC isovormid vastavalt Hämäläineni ja Pette (1996) väljatöötatud metoodikale. Geelid fi kseeriti ja värviti hõbedaga Oakley jt. (1980) järgi. MyHC isovormide (MyHC I, MyHC IIa, MyHC IIx/d, MyHC IIb) suhteline sisaldus määrati densitomeetriliselt (Image Master 1D, Version 4.0, Amersham Pharmacia Biotech, Newcastle upon Tyne, England). Nii hobuse, inimese kui ka roti lihastest lahutati MyLC isovormid SDS-PAGE geelelektroforeesiga vastavalt Laemmli (1970) metoodikale. Geelid fi kseeriti ja MyLC isovormide visualiseerimiseks geelis kasutati kolloid Coomassie värvimisprotseduuri (Neuhoff et al., 1985). MyLC isovormide (MyLC 1slow, MyLC 1fast, MyLC 2slow, MyLC 2fast, MyLC 3fast) proportsioon määrati, kasutades geelide dokumentatsiooni- ja analüüsisüsteemi G:BOX (GeneSnap, Genetools, Syngene, UK). MyLC ja MyHC isovormide proportsioone ahhal-tekiini tõugu hobuste erinevates isaliinides ning emaperekondades võrreldi dispersioonanalüüsiga, võttes arvesse ka hobuse soo mõju. Uurimaks isaliini mõju kogu MyLC isovormide struktuurile, rakendati üldist lineaarset mudelit kujul E(MyLC) = μ + Isovorm + Isovorm*Sugu + Isovorm*Isaliin ning testiti MyLC isovormi ja isaliini koosmõju statistilist olulisust. Analoogsed mudelid konstrueeriti ka emaperekondade ja MyHC isovormide analüüsimiseks. 75 MyLC ja MyHC isovormide proportsioonide päritavuse hindamiseks moodustati hobuste põlvnemisandmete tabel, mis sisaldas 26 mõõtmistulemustega hobuse ning nende 262 teadaoleva eellase andmeid. Selle tabeli baasil rakendati igale isovormile ühemõõtmelist loomamudelit, mis sisaldas fi kseeritud soo efekti ja juhuslikku aditiivgeneetilist mõju, ning leiti aditiivgeneetilise dispersiooni ja fenotüübilise dispersiooni suhtena päritavuskoefi tsiendi hinnang. Lisaks arvutati põlvnemisandmete alusel kõigi hobuste inbriidingukoefi tsiendid ning uuriti korrelatsioonanalüüsiga nende seost MyLC ja MyHC isovormide proportsioonidega. Päritavuskoefi tsiendid hinnati modelleerimistarkvara VCE 6.0 (Groeneveld et al., 2008) abil, ülejäänud statistilised analüüsid tehti statistikapaketis SAS 9.1 ning joonised konstrueeriti tabelarvutussüsteemis MS Excel 2010. Uurimistöös leiti, et ahhal-tekiini tõugu hobuste skeletilihases oli müosiini raskete ahelate isovormide keskmine sisaldus järgmine: MHC I 10,96% (varieerudes indiviiditi 3,51% kuni 22,77%), MHC IIa 38,43% (30,73–48,78%) ja MHC IIx 50,61% (36,71– 62,78%). MyHC I ja IIa isovormid paiknevad suure oksüdatiivse potentsiaaliga lihaskiududes, moodustades koos umbes poole (49,39%) kogu müosiini raskete ahelate isovormidest. Kuna neil lihaskiududel on suurem vastupidavus- ja regeneratsioonivõime kehalisest pingutusest tulenevate lihaskahjustuste suhtes, siis saadud tulemus võib olla tõestuseks, et ahhal-tekiini tõugu hobused on võimelised sooritama pikaajalist kehalist tööd. Seda, et ahhal-tekiini hobused suudavad arendada lühidistantsidel ka suurt kiirust, on võimalik seletada nende skeletilihase müosiini raskete ahelate isovormide IIx suure osakaaluga, mis moodustab samuti umbes poole kogu MyHC isovormide sisaldusest. Kuna uuringud näitasid, et ahhaltekiini tõugu hobustel varieerub skeletilihase müosiini raskete ahelate isovormide sisaldus indiviiditi ulatuslikult, siis võrreldes neid teiste hobusetõugudega ilmnes, et osal uuritud loomadest on rohkem aeglaseid lihaskiude, sarnaselt araabia täisverelisele hobusele, teistel aga on rohkem kiireid lihaskiude, sarnaselt inglise täisverelise ning veerandmiilihobusele. Kui müosiini raskete ahelate osatähtsus skeletilihase kokkutõmbekiirusel on juba hästi teada, siis müosiini kergete ahelate roll lihase kontraktiilses aparaadis pole veel täiesti selge. Tõenäoliselt on MyLC isovormide funktsionaalne osatähtsus seotud vastavate müosiini raskete ahelate isovormidega, kuna on leitud, et eksisteerib nendevaheline suur afi insus. Meie uurimistulemused näitasid hobuse skeletilihases positiivset 76 korrelatsiooni MyHC IIx isovormi suhtelise sisalduse ning MyLC 1fast ja 2fast isovormide vahel. MyLC 1fast isovormi suhtelise sisalduse vähenemine on indikaatoriks lihase kokkutõmbe aeglustumisele. On teada, et MyLC 3fast isovorm on seotud kiirete lihaste kokkutõmbekiirusega, lisaks mõjutab see isovorm ka ristsillakeste kineetika regulatsiooni. MyLC 1slow isovorm reguleerib müosiini kineetikat. MyHC I ja MyLC 1slow isovormide positiivne korrelatsioon ahhal-tekiini hobuse skeletilihaskiududes näitab, et müosiini raskete ahelate seondumiskohas võivad aluselised isovormid mõjutada müosiini kaelaosa jäikust, seega on need isovormid olulise tähtsusega müosiini pea kineetika täpsustamisel. Võrreldes inimese, hobuse ja roti skeletilihast täheldati müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide jaotuse suurt erinevust. MyHC I ja IIa isovormide sisaldus on märkimisväärselt suurem inimese skeletilihases. Vastupidiselt MyHC I ja IIa suhtelisele sisaldusele skeletilihases on MyHC IIx/d isovormide suhteline sisaldus hobuse ja roti skeletilihases üle kahe korra suurem. MyHC I ja IIa isovormide sisaldus moodustab 82% inimese, 51% hobuse ning 23% roti skeletilihase kogu MyHC isovormide sisaldusest. Kõikide kiirete isovormide (IIa + IIx/d + IIb) kogusisaldus moodustab 95% roti, 88% hobuse ning 69% inimese skeletilihases. Lihastes, kus on müosiini raskete ahelate I isovormi suhteline sisaldus suurem, on ka rohkem müosiini kergete ahelate aeglasi isovorme, ning vastupidi. Inimese skeletilihas sisaldab 48% MyLC aeglasi isovorme, hobuse ja roti skeletilihas vastavalt 17% ja 10%. MyLC kiirete isovormide kogusumma moodustab 52% inimese, 83% hobuse ning 89% roti skeletilihases. Peamine erinevus müosiini kergete ahelate isovormide vahel, võrreldes inimese, hobuse ja roti skeletilihast, on väike regulatoorse MyLC sisaldus inimese skeletilihases. Vanusegruppide 1 (1,5–2,5 a) ja 2 (9–20 a) vahel olulisi erinevusi lihase struktuuris ei leitud. Vanusegrupis 3 (21–23,5 a) aga vähenes märkimisväärselt MyHC I suhteline sisaldus võrreldes grupiga 1 ja 2, samal ajal MyHC IIx ja IIa sisaldused suurenesid. Sellised näitajad kinnitasid varasemate uuringute tulemusi. Kuna aeglased lihased sisaldavad peamiselt aeglasi müosiini kergete ahelate isovorme ning kiired lihased kiireid isovorme, siis samasugune tendents tuvastati loomade vananemisel ka müosiini kergete ahelate puhul: võrreldes nooremate vanusegruppidega vähenes 21–23,5 a hobustel MyLC 1slow ja MyLC 2slow isovormide sisaldus, kusjuures MyLC 1fast ja 2fast isovormide sisaldus suurenes. 77 Ahhal-tekiini tõugu täkkude ja märade skeletilihases on müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide sisaldus erinev. Märkimisväärne erinevus leiti MLC 3fast ja MHC IIx isovormide sisalduses – märade skeletilihases oli nende sisaldus suurem kui täkkude lihases, kuid täkkude skeletilihased sisaldasid rohkem I ja IIA tüüpi lihaskiude. Samasuguse tulemuseni on jõutud ka varasemates uuringutes teiste hobusetõugude (andaluusia hobune, inglise täisvereline hobune, traavlid ning araabia hobune) kohta. Kuigi araabia ja andaluusia hobustel on kirjeldatud ema- ja isapoolset mõju lihaskiudude isovormide sisaldusele, siis meie uurimistöös märkimisväärseid erinevusi ahhal-tekiini tõugu täkuliinide ja märaperekondade vahel ei leitud. Suurim erinevus müosiini kergete ahelate puhul oli MyLC 1fast isovormil, mis varieerus erinevate täkuliinide puhul 30,0%-st 39,9%-ni ning märaperekondade puhul 30,5%-st 39,8%- ni. Kuigi varieeruvus on üsna suur, olid piirväärtused esindatud vaid 1–3 hobusega. Müosiini raskete ahelate puhul oli suurim erinevus MyHC IIx isovormi sisalduses, varieerudes täkuliinide puhul 47,0%-st 62,8%- ni ja märaperekondade puhul 43,9%-st 62,8%-ni, kuid ka siin olid piirväärtused esindatud üksnes ühe hobusega. Analüüsides hobuste põlvnemist, leiti 26 hobusest 23 hobusel inbriiding, keskmise inbriidingukoefi tsiendiga 0,021 (miinimum 0,002, maksimum 0,102). Müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide sisalduse ning inbriidingukoefi tsiendi vahel omavahelist seotust ei leitud. Suurim päritavuskoefi tsient müosiini raskete ahelate isovormidest leiti MyHC I isovormil, kiiretel isovormidel oli see väiksem. Samasugune tulemus on varasemalt saadud ka prantsuse anglo-araabia ning andaluusia hobuste kohta. Kergete ahelate isovormidest oli suurim päritavuskoefi tsient MyLC 1fast isovormil. Kuna analüüsitud hobuste arv oli suhteliselt väike, siis kõikide MyHC ja MyLC isovormide proportsioonide päritavust ei olnud võimalik määrata. Uurimistöös saadud tulemused võimaldasid teha ahhal-tekiini tõugu hobuste skeletilihaskiudude molekulaarse struktuuri kohta mitmeid järeldusi. Kuna müosiini raskete ahelate isovormid MyHC I ja IIa moodustavad ahhal-tekiini tõugu hobuste keskses tuharalihases ligi poole (49,39%) ja IIx isovormid samuti ligi 50% kogu MyHC isovormide sisaldusest, siis saame järeldada, et ahhal78 tekiini hobused võivad näidata suurt kiirust lühidistantsidel, kuid suudavad teha ka pikaaegset vastupidavustööd. Positiivne korrelatsioon MyHC I isovormi ning MyLC 1slow ja MyLC 2slow isovormide vahel ning negatiivne korrelatsioon MyHC I isovormi ning aluseliste ja regulatoorsete MyLC kiirete isovormide vahel näitab, et MyLC 1fast isovormi suhteline sisaldus on üks lihase kontraktsioonikiiruse indikaatoreid. Võrreldes hobuse, inimese ja roti skeletilihast leiti, et MyHC I ja IIa isovormide sisaldus on märkimisväärselt suurem inimese skeletilihases ja et hobuse skeletilihases on MyHC IIx/d isovormide suhteline sisaldus suurem kui inimese ja roti skeletilihases. Loomadel oli MyHC IIx/d isovormi ja MyLC 1fast ning MyLC 2fast isovormide suhteline sisaldus suurem kui inimesel. Müosiini kergete ahelate isovormide jaotus imetajate skeletilihases on seotud müosiini raskete ahelate jaotusega. Vanematel hobustel on keskses tuharalihases müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide jaotus erinev võrreldes nooremate hobustega. Üle 20 aasta vanustel ahhal-tekiini hobustel väheneb MyHC I ja MyLC 1slow isovormide suhteline sisaldus. See on vastupidine uurimistulemustele, mis on saadud inimeste ja näriliste kohta. Kuigi inimestel ja närilistel on vananemise mõju müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide jaotusele põhjalikult uuritud, pole selle põhjused veel selged. Hobustel on muutused lihastes seoses vananemisega vastupidised inimestel ja närilistel tekkivate muutustega, kuid et hobustel on vananemisega kaasnevaid muutusi lihastes seni vähe uuritud, siis ei ole veel teada, kas erinevused on liigispetsiifi lised. Ahhal-tekiini tõugu täkkudel ja märadel on skeletilihase müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide sisaldus erinev: märadel oli MyHC IIx ja MyLC 3fast isovorme rohkem kui täkkudel. Samasugused tulemused on saadud ka mõnede teiste hobusetõugude kohta, seega tuleks edasistes uuringutes andmete võrdlemisel arvesse võtta ka soolisi erinevusi. Suurim päritavuskoefi tsient leiti MyHC I isovormil, teistel isovormidel oli see väiksem. 79 Kuigi ahhal-tekiini tõugu hobustel varieerub skeletilihase müosiini raskete ja kergete ahelate isovormide sisaldus indiviiditi ulatuslikult, erinevate täkuliinide ja märaperekondade vahel märkimisväärseid erinevusi siiski ei leitud. See on autorile teadaolevalt esimene töö, kus uuritakse müosiini kergete ahelate sisaldust hobuste skeletilihases. Edasised uuringud on vajalikud selgitamaks müosiini kergete ahelate jaotust ning funktsiooni hobuse skeletilihases ning erinevate isovormide muutuste iseloomu organismi vananemisel, sest müosiini raskete ja kergete ahelate poolt on määratud lihase kontraktiilsed ja metaboolsed omadused. Et selgitada täpsemat isa- ja emapoolset mõju järglase lihaskiudude kujunemises, on vaja analüüsida suuremat arvu hobuseid ühe täkuliini ja märaperekonna kohta. Põhjalikum pärilikkuse mõju selgitamine lihaskiutüüpide kujunemisel hobuse skeletilihases võimaldaks teha paremaid valikuid aretustöös, kuid selleks on vaja teha täiendavad uuringud suurema arvu hobustega ühe tõu piires.

Käesolevas töö eesmärgiks oli teha kindlaks embrüote poolt kasvulahusesse sekreteeritavaid metaboliite ja embrüote elutegevuse käigus kasvulahusest tarvitatavaid ühendeid kasutades vedelik-kromatograaf-mass-spektromeetrit. Töö teiseks eesmärgiks oli välja selgitada, kas muutused embrüote kasvulahuses on seotud nende kvaliteediga ja sellest tulenevalt, kas madalmolekulaarsete ühendite muutuste põhjal on võimalik ennustada moorulate blastotsüstiks arenemist. Labori ja embrüote in vitro tootmistehnoloogia puhtuse kontrollimiseks ning mikrobioloogilise saaste mõju välistamiseks embrüote arengule, viidi läbi ka kasvulahuste mikrobioloogiline analüüs. Saadud andmeid analüüsiti klaster-, dispersioon-, peakomponent- ja diskriminantanalüüsiga, et leida potentsiaalseid biomarkereid embrüote elujõulisuse hindamiseks. Labori, meetodi ja materjali puhtuse hindamiseks viidi läbi 441 mikrobioloogilist analüüsi. Käesoleva töö võib kokku võtta järgmiselt: 1. Mikrobioloogilist saastet embrüote kasvulahustes ei esinenud. Teadustöö läbiviimise tingimused ja töökeskkonna hügieen on Eesti Maaülikooli Sigimisbioloogia laboratooriumis väga head. 2. Embrüod sekreteerivad oma kasvukeskkonda erinevaid madalmolekulaarseid metaboliite sõltuvalt oma arengujärgust. 3. Blastotsüstide- ja ainult moorulateni arenenud embrüote kasvulahustes ning kontroll-lahustes on kokku 10 ühendit, mis gruppide vahel statistiliselt oluliselt erinevad. Võib eeldada, et moorulate blastotsüstiks arenemist on võimalik ennustada nende kümne ühendi molekulaarmasside põhjal. 4. Käesolevas töös suudeti ennustada moorulate blastotsüstideks grupeerumist nelja potentsiaalse biomarkeri abil kuni 81,6%-lise täpsusega. 5. Läbiviidud katsete põhjal võib soovitada moorulate blastotsüstiks arenemise hindamiseks potentsiaalsete biomarkeritena ühendeid molekulaarmassiga 104, 214, 589 ja 702 Da. 6. Blastotsüstiks arenenud ja mittearenenud moorulate eristumist kasvulahustes leiduvate madalmolekulaarsete biomarkeritega on vaja suurema katse andmestikuga kontrollida. Leitud ühendite täpseks identifitseerimiseks ja kvantiteerimiseks tuleks veel süvitsi katseid korrata ning võimalusel kasutada aparatuuri, mis võimaldab ühendite molekulaarmasse täpsemalt määrata. Samuti tuleks antud analüüs läbi viia suurema hulga proovidega. Uued katseandmed on kogutud ja käesolev uurimustöö jätkub. The aim of this Master thesis was to identify different metabolites secreted to and consumed from culture media by bovine in vitro produced embryos using highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The second goal of the Master thesis was to find out how metabolomic changes differ between embrüo developmental stages and quality and if it is possible to predict the ability of morulas to develop into blastocysts by low molecular weight metabolites in their culture media. Additionally, microbiological analysis of culture media was carried out to evaluate hygiene of laboratory and in vitro production technology of bovine embryos and also to exclude bacterial impact on embryo development. Cluster analysis, one-way analysis of variance, principal component analysis and discriminant analysis was carried out to identify potential biomarkers for evaluating bovine embryo viability. The following conclusions were made based on the results of the study: 1. No microbiological contamination in the bovine embryo culture media was found. 2. Metabolite secretion to the culture media and consumption of the nutrients differ between the embryo developmental stages and quality. 3. It can be assumed that evaluating the ability of bovine morulas to develop into blastocysts is possible by ten low molecular weight compounds. 4. Discriminant analysis with four potential biomarkers allowed the categorization of the embryos with the success rate of 81,6%. 5. Compounds with the molecular weight of 104, 214, 589 and 702 Da can be recommended as potensial biomarkers for evaluating morulas which will develop to blastocyst stage. 6. Those previously mentioned compounds can possibly be used for evaluating embryo developmental potesial as early as in morulae stage but more data is needed to verify this. Experiment has to be repeted with the greater number of samples and accurate laboratory equipment to precicely identify and quantify the biomarkers.

In recent decades technological developments have opened up new possibilities for genomic research. Mouse and bovine embryos are widely used as a tool for biomedical research. These embryos represent mammal eukaryotic cells, which have different mechanisms for gene expression control compared with prokaryotic cells. Recent research has focused on studies of pluripotency-associated genes and their expression levels in embryos. For mammal embryos, gene expression profiling might give us a better tool to evaluate developmental potential. So far, most of these studies have shown controversial results. A recent study conducted by Suzuki Jr et al. (2009) shows that pregnancy rates in day 40 differ depending on which method was used to produce embryos. Artificial insemination (AI) leads to 75 % pregnancy rate in day 40, whereas the same proportion for in vitro fertilization (IVF) is 50 % and for somatic cell nuclear transfer (SCNT) -- 30 %. Interestingly, blastocyst development rate in IVF embryos is 34 % and in SCNT embryos 28 %. During 33 days, the 6-unit difference in blastocyst formation rate increases up to a 20-unit difference in day 40 pregnancy rate between IVF and SCNT embryos. This indicates that reprogramming of SCNT embryos and in vitro conditions play a huge role in embryo survival rates. By comparing the gene expression profiles between in vivo, in vitro and SCNT we can observe how changes in in vitro conditions affect the developmental potential of embryos. In this study, we purified ribonucleic acid (RNA) from bovine embryo pools and analysed expression levels for gene insulin-like growth factor 1 (IGF1), insulin-like growth factor 2 (IGF2) and insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6). Embryos were either frozen or fresh, and produced by either IVF or SCNT. RNA was purified by using the Qiagen RNeasy Plus Micro kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). After purification the RNA was analysed using the Agilent 2100 Bioanalyzer with RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies Inc., California, USA). Complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) was synthesized from RNA by using the Quantitect Reverse Transcription kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA was used as a template for TaqMan quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis in the ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 9 The results of RNA analysis showed that the quality of RNA was acceptable in all samples. Messenger RNA (mRNA) level for IGF1 was below the detection limit. IGF2 expression level was detected in three samples. IGFBP6 mRNA level was detectable in all samples. In addition to practical skills, the author's theoretical knowledge of modern reproductive technologies improved notably during the experiments. These were the first experiments conducted in our laboratory in which RNA was purified and gene expression profiles from bovine blastocyst stage embryos were analysed. This is important, because in the future it will be easier to undertake research in this area due to applying the methods which have proven to be successful. Viimaste aastate jooksul on loomade genoomiuuringud hoogustunud peamiselt geenitehnoloogia tehniliste võimaluste kiire arengu tõttu. Hiire ja veise embrüod on biomeditsiinilistes uuringutes laialdast kasutust leidnud, aidates selgitada embrüonaalse arengu geneetilisi kontrollmehhanisme. Imetajate rakkudel on võrreldes prokarüootse rakuga mitmeid erinevaid võimalusi geeniekspressiooni kontollimiseks. Viimaste aastate uuringud on keskendunud rakkude pluripotentsusega seotud geenide uurimisele. See on vajalik, kuna nimetatud geenidel on tähtis roll imetajate varajases arengus, samuti võivad nende uuringute tulemused oluliselt mõjutada embrüonaalsete tüvirakkude alaseid uuringuid. Hiljuti avaldatud uurimustöös (Suzuki Jr et al., 2009) selgus, et sõltuvalt veise embrüo tootmise tehnoloogiast, on loomade tiinestumine erinev. Leiti, et kunstliku seemenduse (artificial insemination, AI) puhul oli 40. päeval pärast seemendust 75% veistest tiined. Samas oli tiinestumine katseklaasi viljastamise (in vitro fertilization, IVF) puhul 50% ja somaatilise raku tuuma siirdamisel (somatic cell nucleus transfer, SCNT) ainult 30%. Eelnev viitab sellele, et embrüo varajases arengus on embrüote in vitro kasvutingimustel ja kloonitud embrüote reprogrammeerimise edukusel väga oluline roll. Võrreldes geeniekspressiooni profiile in vivo, in vitro ning SCNT embrüote vahel on näha, kuidas in vitro tingimuste muutmine mõjutab embrüo arengupotentsiaali. Käesoleva uuringu käigus eraldasime blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest ribonukleiinhappe (RNA) ning uurisime insuliinilaadset kasvufaktorit 1 (IGF1), insuliinilaadset kasvufaktorit 2 (IGF2) ning insuliinilaadse kasvufaktori siduva proteiini 6 (IGFBP6) kodeerivate geenide ekspressiooni. Embrüod saadi kas IVF või SCNT teel ja analüüsiti kolmest kuni kolmeteistkümnest embrüost koosnevate rühmadena. RNA eraldati embrüotest kasutades Qiagen RNeasy Plus Micro kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). Saadud RNA kvaliteeti analüüsiti kasutades Agilent 2100 Bioanalyzer’it ja RNA 6000 Pico kiipi (Agilent Technologies Inc., California, USA). Komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti kogu RNA-st kasutades Quantitect Reverse Transcription kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA puhul kasutati geeniekspressiooni modelleerimiseks Taqman kvantitatiivse reaalaja polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) meetodil ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) abil. RNA kvaliteedi analüüsi tulemused näitasid, et kõikide proovide RNA kvaliteet oli rahuldav. IGF1 ekspressiooni tuvastada ei õnnestunud. IGF2 puhul oli ekspressiooni tase piiripealne ning seda õnnestus tuvastada neljas proovis seitsmest. IGFBP6 puhul oli mRNA tase tuvastatav kõikide proovide puhul. Tegemist oli embrüolabori esimeste katsetega, kus blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest eraldati RNA ning analüüsiti geeniekspressiooni profiile. Käesolev uurimistöö aitas kaasa vastava metoodika väljatöötamisele. Lisaks praktilisele töö osale tuleb märkida autori teoreetiliste teadmiste kasvamist kaasaegsete sigimisbioloogia tehnoloogiate osas. Peale selle oli autoril unikaalne võimalus harjutada oma käega erinevaid võtteid antud valdkonnas. Taoline teoreetiline ning praktiline kogemus on tulevikus kasulik.

Käesoleva töö eesmärgiks oli kirjeldada ja analüüsida veise in vitro viljastatud embrüote mitteinvasiivseid määramismeetodeid ning viimastel aastakümnetel avaldatud teadustööde tulemusi. Kirjanduse ülevaate põhjal saadud olulisemad tulemused olid järgmised: Tänapäeval on kõige levinum meetod veise IVF embrüote määramiseks morfoloogiline hindamine, mida teostatakse tavalise valgusmikroskoobiga. Meetodi eeliseks on vähene ajakulu, suhteliselt lihtne väljaõpe ning odavus. Puuduseks on aga hindamise subjektiivsus ning hindamistulemusi mõjutavate tegurite rohkus. IVF embrüote hapnikutarbe määramine on täpsem elujõulisuse hindamise meetod võrreldes morfoloogilise hindamisega. Kasutatakse mitmeid erinevaid aparaate nagu skaneeriv elektronmikroskoop, spektrofotomeeter, mikroelektroodid ning nanorespiromeeter. Viimane on neist kõige täpsem ning võimaldab mõõta ka individuaalsete embrüote hapnikutarvet erinevates arengujärkudes. On leitud, et kõrgema hapnikutarbega embrüod on suurema elujõulisusega. IVF embrüote elujõulisuse hindamiseks saab kasutada ka glükoositarbe ja laktaadi eritumise määramist. Suure glükoositarbega embrüod on eluvõimelised, kuid kõrge laktaadi eritumisega embrüod seevastu aga kehva eluvõimega. Laktaadi eritumine on seotud embrüo stressiga. Kasvulahusesse vabanevate ensüümide määramise abil saab hinnata degenereeruvate ja surnud embrüorakkude osakaalu. Meetodi eeliseks on selle täpsus ning kiirus. Teadlased on avastanud, et defektiga embrüod eritavad normaalsete embrüotega võrreldeskasvulahusesse rohkem L-laktaat-dehüdrogenaasi. Bioaktiivsetest ühenditest on kasvulahuses määratud interferoon-τ ja plasminogeeni aktivaatoreid. Uurimustöödest selgus, et hea kvaliteediga embrüod eritavad rohkem interferoon-τ-d kui elujõuetud embrüod ning plasminogeeni aktivaatorite tootmine on positiivses korrelatsioonis embrüorakkude arvu ja embrüo diameetriga. Implantatsioonieelse faktori PIF määramine on kõige uuem embrüote hindamise viis. Võrreldes elujõuetute embrüotega on elujõuliste embrüote PIFi tase märgatavalt kõrgem ning eluvõimetutel embrüotel puudub peptiid täielikult. Tulemused näitavad, et PIF-ELISA on usaldusväärne, kiire ning embrüoid mittekahjustav meetod IVF embrüote varajaseks valikuks. Vedelikkromatograafia kasutamine võimaldab kasvulahusest määrata embrüote poolt eritatud ja tarvitatud aminohappeid, mis korreleeruvad blastotsüstide elujõulisusega Teadlased on leidnud, et glütsiini- ja leutsiinitaseme vähenemine ning asparagiinitaseme suurenemine kasvulahuses on seotud tiinestumise ja elussündide arvuga ning et madalama aminohapete metabolismi tasemega embrüod on elujõulisemad. Teaduskirjanduse analüüs võimaldas teha embrüote kvaliteedi mitteinvasiivse hindamise võimaluste kohta järgmised järeldused: 1. Täpsemateks meetoditeks on embrüote kasvulahuses erinevate metaboliitide, eeskätt aminohapete, glükoosi ja laktaadi dünaamika, ning bioaktiivsete peptiidide määramine. 2. Bioaktiivsetest peptiididest on perspektiivne implanteerumiseelse faktori määramine 3. Uued meetodid on seni veel kallid, keerulist väljaõpet nõudvad ja pole veelstandardiseeritud, mistõttu embrüote morfoloogiline hindamine on endiselt aktuaalne. 4. Tõhus embrüote selektsioonimeetod aitab tõsta veiste tiinestumist. Samuti aitab hea arengupotentsiaaliga embrüote valik vähendada aborte ning loote arenguhäireid. The aim of this Bachelor thesis was to describe different non-invasive viability assessment methods for bovine in vitro fertilized embryos and to describe their advantages and weaknesses. As the number of bovine embryo transfers is growing worldwide and the embryo transfer business is international, it is very important to evaluate the quality of embryos for achieving the best results. However, assessment of embryo viability is also the trickiest and most challenging part in IVF technologies. Sustainable evaluation method of bovine IVF embryos must be non-invasive, fast and accurate. Nowadays, due to a lack of alternative effective non-invasive methods, embryo quality estimation based on morphological parameters is still the most commonly used method. It is the simplest method but unfortunately, also the most subjective way to judge an embryo prior to transfer. Advantages of this method are the short time needed per embryo, the ease of learning it and cheapness. Disadvantage is the abundance of factors influencing the evaluation. Embryo viability judged according to the ability to initiate pregnancy, still varies within groups of embryos with the same grade. A combination of embryo morphology and other non-invasive methods e.g. measuring oxygen consumption, glucose uptake or metabolites would result in a better discrimination between viable and non-viable embryos. Recent research in non-invasive assessment of bovine embryo metabolomics seems to be very promising. Review of the scientific publications enabled following conclusions on non-invasive embryo assessment possibilities: 1. Most precise methods for embryo assessment are measurements of different metabolites, first of all amino acids, glucose, lactate and bioactive peptides. 2. From bioactive peptides, preimplantation factor is most perspective for the assessment of embryo. 3. For now, new methods are expensive, require difficult training and also, are not yet standardized. Therefore morphological evaluation of embryos is still a current trend. 4. Effective bovine embryo selection method helps to improve pregnancy rates. Likewise it helps to reduce abortions and fetal developmental disorders.

Artiklikogumik Veterinaarmeditsiini, loomakasvatuse ja toiduteaduse valdkonna akadeemiline õpe ja teadustöö on ajast aega olnud olulised tegevused arenevas ja muutuvas Eestis. Tavatsetakse rääkida riigile prioriteetsetest erialadest ja valdkondadest. Sageli jäävad eelpoolnimetatud valdkonnad poliitilistes tõmbetuultes ja riigieelarves siiski tahaplaanile. Neid märgatakse, kui tekivad probleemid eesti elanike toidulaual olevate toodete kvaliteediga, loomade heaolu ja tervisega. Veterinaarmeditsiini ja loomakasvatuse instituudi (VL) osakondade ja töörühmade uurimistöö erinevates valdkondades katab pea kogu ahela “farmist toidulauale”. Viimaste aastate erinevad õppe ja teadustöö akrediteerimised Eesti Maaülikoolis ja välisekspertide raportid on andnud positiivse tagasisideme ja hea jätkusuutlikkust kinnitava hinnangu VL instituudi tegemistele. Instituudi näol on tegemist erinevate seotud erialade ja valdkondade omavahelise põimumisega ja inimressursi kõige otstarbekama ärakasutamisega. Hoolimata viimaste aastate kitsastest oludest on meile alati ääretult oluline, et kaasajastatud õppe- ja teadustöö paindlikult reageeriks tootja ja töötleja vajadustele. Just kõigile majanduslikult kitsastes oludes ei tohi instituut kapselduda ja muutuda asjaks iseeneses. Seega on täna vaja teadvustada oma praegustele ja tulevastele koostööpartneritele ja klientidele, millega instituudis tegeletakse ja kuidas saab VL instituudi olemasolev kompetents olla kasulik just teie tegemisi ja tulevikuplaane silmas pidades. Teaduspõhine koostöö erinevate huvipooltega, välja töötamaks lahendusi erinevatele praktilistele probleemidele, on kindlasti võimalik ka perioodil, mil Eesti tootjal napib vahendeid investeerimast teadusesse. Kui on eesmärk, siis on alati võimalik leida lahedus ja vahendid selle ellu viimiseks. Instituudi koosseisu kuuluvad kalakasvatuse, loomageneetika ja tõuaretuse, looma tervise ja keskkonna, morfoloogia, nakkushaiguste, teraapia, toiduteaduse ja toiduainete tehnoloogia, toiduhügieeni, sigimisbioloogia ning söötmise osakonnad. Teraapia osakonna koosseisus töötab EMÜ loomakliinik. Aktiivselt töötatakse erinevate projektidega EMÜ veisekasvatuse Märja katsefarmis. Mikromeierei peab lähiajal saama kõrvale lihatehnoloogia- ja tootearenduse labori. Tugev baas on loodud. Edasiste tegemiste ja arengute kiirus sõltub paljus ressurssidest inimeste ja rahaliste vahendite näol. Me ei saa lubada, et me kõiki praeguste ja tulevaste koostööpartnerite ootusi saame veterinaarmeditsiini, loomakasvatuse ning liha- ja piimatehnoloogia erialadel juba homme ellu viia. Kuid kui täna plaani ei pea, siis homme ei juhtu midagi. Käesolevas kogumikus on väike ülevaade erinevatest senistest tegevustest VL instituudis. Loodame, et see materjal annab mõtteid uuteks huvitavateks projektideks lähitulevikus. Ühine eesmärkide püstitus ja ühiselt lahenduste leidmine on meie kõigi edu alus. Toomas Tiirats, Eesti Maaülikooli Veterinaarmeditsiini ja loomakasvatuse instituudi direktor