Search

RIVM rapport:De industrie heeft een veelheid aan supplementen ontwikkeld die specifiek voor ouderen zijn. Sommige van deze supplementen bevatten hoge doseringen van bepaalde vitaminen en mineralen. Deze doseringen blijven onder de 'maximaal aanvaardbare bovengrens' (Upper Limit), en zijn meestal niet hoger dan drie keer de aanbevolen dagelijkse hoeveelheid (ADH). Uit onderzoek van het RIVM blijkt dat deze supplementen niet schadelijk zijn voor de gezondheid. Verder zijn er in supplementen voor ouderen hoge doseringen gevonden van stoffen waarvoor geen UL bestaat: B-vitamines, vitamine C en ijzer. Daardoor kunnen voor deze stoffen geen conclusies worden getrokken over de veiligheid van de doseringen. In algemene zin is daarom voorzichtigheid geboden als deze producten langere tijd worden gebruikt. Er zijn algemene supplementen op de markt, niet specifiek gericht op ouderen, die een dosering bevatten boven de Upper Limit. Ook ouderen kunnen deze producten gebruiken. Het gaat om bepaalde preparaten die hoge gehalten bevatten van de vitaminen foliumzuur, B6, D en E, en de mineralen zink en selenium. Het is niet uitgesloten dat een te hoge inname van de vitaminen B6 en E op de lange termijn schadelijk kan zijn voor de gezondheid en het welzijn van ouderen. Te hoge doseringen van vitamine B6 kan neurologische klachten veroorzaken, het gebruik van te veel vitamine E kan bloedstollingen veroorzaken. Samenvattend, supplementen die specifiek voor ouderen ontwikkeld zijn, kunnen beschouwd worden als niet gevaarlijk. Er zijn echter een aantal producten verkrijgbaar die niet specifiek op ouderen gericht zijn maar die wel door ouderen gebruikt kunnen worden, die de Upper Limit van toxiciteit overschrijden. Dagelijks gebruik van deze producten gedurende langere perioden is mogelijk schadelijk voor de gezondheid van ouderen. Voor dit onderzoek zijn alle supplementen die ouderen kunnen gebruiken geïnventariseerd., On the consumer market, supplements are available that are specifically designed and targeted for the elderly. Some of these supplements contain high doses of certain vitamins and minerals. These doses remain below the Upper Limit (UL), and do usually not rise above the Recommended Daily Allowance (RDA). RIVM research shows that these supplements can be considered as nontoxic. Some supplements specifically targeted for the elderly contain high doses of vitamins and minerals for which no UL exists, namely, B vitamins, vitamin C, and iron. As a result, for these vitamins and minerals, no conclusions can be drawn about the safety of the doses. Therefore, caution should be exercised when these products are used long time. There are supplements on the market that are targeted for the general population, that contain doses of vitamins and/or minerals above the UL. The elderly can use these products as well. Some of these supplements contain high levels of the vitamins folate , B6 , D and E , and/or the minerals zinc and selenium. It is not excluded that a high and long-term intake of vitamin B6 and E may be harmful to the elderly. High doses of vitamin B6 can cause neurological symptoms, the use of too much vitamin E increases the risk of blood clotting. In conclusion, all available supplements advised for the elderly can be considered as non-toxic. There are, however, a number of products available, that or not specifically targeted to, but may be commonly used by the elderly, that exceed the UL. A daily consumption of these products during longer periods cannot exclude a possible occurrence of detrimental effects on health and wellbeing for elderly people. For this research, an inventory was made of all supplements that can be used by the elderly.

RIVM rapport:Zoete zwak-alcoholische drankjes die in supermarkten worden verkocht bevatten veel suikers, zoals glucose, fructose en sucrose. Dit blijkt uit een onderzoek naar 65 willekeurig gekochte producten met een alcohol percentage tussen de 2,5 en 19,5 %, werd maximaal 442 g/l suiker aangetoond. In drankjes die populair zijn bij jongeren (met alcoholpercentages vaak onder de 7 %) bleek de range van de hoeveelheden suiker per liter vergelijkbaar te zijn met die van normale fruitsappen en frisdranken. Het ontwikkelen van beleidsmaatregelen voor alcoholhoudende dranken die gebaseerd zijn op alcoholpercentage in combinatie met zoetkracht (of suikergehalte) zal dus in principe invloed kunnen hebben op de verkoop en consumptie van de onderzochte producten. Alleen voor de bieren zullen additionele maatregelen op basis van zoetkracht (of suikergehalte) weinig toevoegen ten opzichte van regulering op basis van alcohol alléén. Het gebruiken van zoetkracht van dranken zal in de praktijk echter lastig kunnen zijn omdat fabrikanten ook andere toevoegingen kunnen gebruiken die de alcoholaversie verlagen. Bovendien is 'zoete smaak' soms moeilijk kwantificeerbaar in producten met meerdere smaken., Sweetened low-alcoholic drinks sold in supermarkets contain a significant amount of sugars, including glucose, fructose and sucrose. Sugars between 32 g/l and 144 g/l have been found in randomly selected products with an alcohol percentage of maximum 7%. This range of sugar concentrations is usually also found in non-alcoholic soft drinks and juices. Sweetened beers usually have the lowest amounts of sugars and alcohol, while sweetened mix-drinks have higher amounts of alcohol, the highest percentages being quantified in cans. When reference was made to fruits (lemon for example) in the name of a drink, high concentrations of limonic acids were identified. It has been reported in literature that that a sweet taste can suppress the alcohol aversion, in particular for young people. All drinks in this study were sweetened. Other flavours were also added to various products, such as acids in the lemon drinks. It is likely that producers add all these flavours to the product to achieve its total taste, and that the full taste limits the aversion to the alcohol taste. There is no relationship between alcohol percentage and sugar content, which means that taxation based on alcohol percentage is not identical to taxation based on sugar content. However, the sweetness of a drink is not identical to the amounts of sweeteners used in a drink. The sweetness of different sweeteners or combinations of different kinds of sweeteners or other flavours cannot be easily compared to the concentrations in the drinks. Sweetness is therefore a difficult unit to use in price measures. It is also possible that producers may use lower levels of sugars and sweeteners and add extra flavours when the sugar content and sweetness is used for taxation. Furthermore, consumers can easily compensate for the lowering of sugar content and sweetness by adding sugars themselves in order to circumvent price measures. This would increase the likelihood of self-mixing (already seen among consumers), althoug

RIVM rapport:It is important to be able to determine the actual supply of vitamins and minerals in the population, a procedure that can be carried out by using parameters applied to blood or urine. This is also called nutritional status assessment. At the moment, the intake of vitamins and minerals is determined in the Dutch National Food Consumption Surveys. In these food consumption surveys, dietary monitoring is done via 24-h dietary recalls. Signals of possible inadequate intake (vitamin B2, folate, vitamin B12, vitamin D, magnesium, iron, zinc) and the potential risk of an excessive intake (vitamin D, sodium, zinc) from the surveys can be evaluated through a nutritional status assessment. Information gained through such an assessment can also compensate for the lack of knowledge in the Netherlands about the nutrient supply of iodide, sodium and selenium. And finally, status assessment is recommended as being more practical than dietary monitoring for immigrant groups. Parameters for the vitamins B2, folate, B12 and D, and the minerals magnesium, sodium, iron, iodide, selenium and zinc are also discussed in the report. Although status assessment is also advisable for determination of the supply of vitamin A, calcium and chrome, appropriate parameters are not currently available., Het is van belang om de werkelijke beschikbaarheid van bepaalde vitaminen en mineralen in het lichaam (de voorziening) van de Nederlandse bevolking vast te stellen. Dit kan aan de hand van onderzoek in bloed en urine, ook wel voedingsstatusonderzoek genoemd. Momenteel wordt de inneming van vitaminen en mineralen bepaald door middel van voedselconsumptiepeilingen. Hierbij wordt gewerkt met de navraag van de voedselconsumptie. Met behulp van voedingsstatusonderzoek kunnen signalen uit de voedselconsumptiepeiling van een mogelijk te lage inneming (vitamine B2, foliumzuur, vitamine B12, vitamine D, magnesium, ijzer, zink) of te hoge inneming (vitamine D, natrium, zink) worden getoetst. Voor enkele mineralen kan de inneming niet goed worden bepaald, dit is het geval voor jodium, natrium en seleen. Met statusonderzoek kan wel de beschikbaarheid in het lichaam worden bepaald voor deze mineralen. Voor allochtone bevolkingsgroepen wordt om praktische redenen aanbevolen om statusonderzoek uit te voeren voorafgaand aan voedselconsumptieonderzoek. De te bepalen parameters voor de vitaminen B2, B12, D en foliumzuur en voor de mineralen magnesium, natrium, ijzer, jodium, seleen en zink worden in het rapport besproken. Ook voor vitamine A, calcium en chroom zou voedingsstatusonderzoek gewenst zijn; echter voor deze voedingstoffen zijn momenteel geen goede parameters beschikbaar.

RIVM rapport:Op de markt verschijnen steeds meer producten, die verrijkt zijn met plantensterolen (fytosterolen). De gecombineerde consumptie van dergelijke producten kan leiden tot overdosering, zodat er mogelijk aanvullende maatregelen nodig zijn om overdosering te voorkomen.Fytosterol-verrijkte voeding verlaagt het plasma LDL-cholesterol. Een dagelijkse inname van 1-3 g plantensterolen verlaagt de LDL-cholesterolconcentratie met 5-15%; een hogere inname geeft geen extra effect. Door hun slechte absorptie geven fytosterolen geen systemische toxiciteit. Fytosterolen verlagen echter wel de absorptie van beta-carotenoiden, die van belang zijn voor de aanmaak van vitamine A. De consumptie van (margarine verrijkt met) 3 g fytosterol per dag gedurende een jaar leidt tot een 33% afname van de beta-caroteenspiegel, die echter (alleen) zorgelijk is bij risicogroepen met een hoge vitamine A behoefte, zoals zwangeren, moeders die borstvoeding geven en jonge kinderen. Er is overigens geen indicatie voor fytosterolgebruik door deze groepen, maar het gebruik kan niet worden uitgesloten.De beschikbare data over schadelijke effecten bieden geen basis voor het stellen van een maximaal toelaatbare dagelijkse dosis voor fytosterolen. Evenals de Gezondheidsraad en SCF, wordt thans aanbevolen om niet meer (meer dan 3 g per dag) van deze plantensterolen in te nemen, omdat a. hogere doseringen niet effectiever zijn, en b. langetermijnstudies ontbreken. Op termijn zijn beleidsmaatregelen nodig ter voorkoming van overdosering in gebruikers- en risicogroepen, Phytosterol-enriched foods (sterol or stanol esters) decrease plasma LDL in healthy and hypercholesterolaemic individuals; a daily intake of 1-3 g plant sterols lowers LDL levels by about 5-15%. Higher intake of phytosterols is not more effective.Phytosterols are poorly absorbed and retain no systemic toxicological effects i.e. no endocrine, teratogenic, mutagenic or carcinogenic effects. However, plant sterols and stanols interfere with the absorption of beta-carotenoids, but virtualy not the plasma levels of other fat-soluble vitamins, such as vitamin A, D, E and tocopherols. One-year consumption of margarine enriched with phytosterol (3 g per day) decreased plasma beta-carotenoid by 33%. The consequences of such a persistent decrease of blood concentrations of beta-carotene on human health are largely unknown. No serious concern can be deduced regarding the role of beta-carotene as a vitamin A precursor, except in cases where the vitamin A requirement is larger than normal, like in pregnancy, lactation or infancy. The available data on adverse effects do not provide a basis for setting an upper level of total daily intake of phytosterols but considering the observed maximal effective dose for cholesterol lowering is 2-3 g/day and the lack of long-term studies, it is prudent to avoid plant sterol intakes exceeding this dose. Since a number of foods appear as potential candidates to be enriched with plant sterols, additional management measures may be needed to avoid excessive intakes.

RIVM rapport:The Dutch authorities consider fortifying certain foods with folic acid. Folic acid supplementation may, however, mask vitamin B12 deficiency and increase the incidence of peripheral neuropathy. This literature review outlines published studies to the potential masking of vitamin B12 deficiency related pernicious anaemia by folic acid. aggravate neurological manifestations comes from publications in the mid-1940s, when folic acid was first used to treat patients with pernicious anaemia. This resulted in an alarming incidence of relapse or progression of pre-existing neurological lesions. Indeed, treatment of vitamin B12 deficient subjects with folic acid is a false and dangerous therapy, though supplementation with folic acid at daily doses less than 5 mg has rarely been linked with a direct adverse effect on vitamin B12 deficiency associated neurological damage. After the fortification of cereals with folic aid in the U.S.A., the proportion of subjects without anaemia but with low vitamin B12 did not increase significantly, indicating that increased folic acid intake caused no major increase in masking vitamin B12 deficiency. There is no conclusive evidence that folic acid supplementation (in the absence of co-supplementation with vitamin B12) precipitates, or enhances vitamin B12-deficiency associated neuropathy. If practitioners were to properly diagnose vitamin B12 deficiency and beware of its high prevalence in certain high risk groups (elderly and vegetarians), there would be no argument for renouncing the fortification of food with folic acid by masking vitamin B12 deficiency., Het Ministerie van VWS overweegt om bepaalde voedselbestanddelen te verrijken met foliumzuur. Foliumzuurverrijking houdt echter een gezondheidsrisico in, omdat het vitamine B12 deficientie maskeert, waardoor het de incidentie van megaloblastische anemie en perifere neuropathie kan verhogen. Dit rapport geeft een overzicht van de literatuur met betrekking tot het potentieel maskerende effect door foliumzuur van pernicieuze anemie -het vroege symptoom- van vitamine B12-deficientie. Het vermoeden, dat foliumzuur neurologische complicaties kan geven en verergeren, komt mogelijk door publicaties uit de veertiger jaren, toen foliumzuur voor het eerst - en onjuist - gebruikt werd om patienten met pernicieuze anemie te behandelen. Foliumzuursuppletie (zonder co-suppletie met vitamine B12) induceert of stimuleert niet de met vitamine B12-deficientie geassocieerde neuropathie. Een belangrijke aanwijzing hiervoor werd recent verkregen in de V.S., waar na de verrijking van granen met foliumzuur, het percentage anemie onder personen met een laag serum vitamine B12 niet significant steeg ten opzichte van de periode daarvoor. Huisartsen dienen alert te zijn op een juiste diagnose van pernicieuze anemie en de hoge prevalentie van vitamine B12 deficientie in bepaalde risicogroepen (ouderen en vegetariers). Maskering van pernicieuze anemie is dan geen argument om de verrijking van voeding met foliumzuur af te wijzen.

RIVM rapport:Het huidige literatuuroverzicht vat de neurotoxische effecten van foliumzuur samen. Enkele dierexperimentele studies gaven aan dat foliumzuur, indien direct toegediend in de hersenen, neurotoxisch en epileptogeen is. In 1970 maakte een, overigens slecht gecontroleerde en niet gereproduceerde, studie melding van neurotoxische symptomen, zoals malaise, slaapverstoring en mentale stoornissen in veertien gezonde vrijwilligers, die een maand lang dagelijks 15 mg foliumzuur oraal kregen toegediend. Vijf jaar later werden convulsies gemeld na hoge intraveneuze toediening van foliumzuur aan een patient met een slecht gecontroleerde epilepsie. Overigens zijn er geen gegevens, die duiden op een direct neurotoxisch effect in de mens bij oraal foliumzuurgebruik. Klinische studies, waarbij patienten langdurig (tot 3 jaar lang) 5 tot 15 mg per dag kregen toegediend gaven geen aanwijzing voor aan foliumzuur gerelateerde neurotoxiciteit. Tenslotte wordt uiteen gezet, dat een deficientie in foliumzuur, die de synthese van S-adenosylhomocysteine remt en stapeling van homocysteine veroorzaakt, wel kan leiden tot neurotoxische schade., The present review summarises the neurotoxicological effects of folic acid. Some studies in animals have shown that folic acid is neurotoxic and epileptogenic when applied directly to the brain. One poorly controlled and not further reproduced study from 1970 reported neurotoxic symptoms like malaise, sleep disturbances, and mental changes in 14 healthy volunteers who took daily 15 mg of folic acid for one month. Five years later seizures were reported in a patient with poorly controlled epilepsy after high intravenous doses of folic acid. There are no further data that indicate that oral folic acid is directly neurotoxic in humans. Clinical studies, where daily doses of 5 to 15 for up to 3 years were applied, did not shown any evidence of folate associated neurotoxicity. It is outlined that rather a deficiency in folic acid, that induces a decrease in the synthesis of S-adenosyl-homocysteine and accumulation of homocysteine, may lead to neurotoxicological damage.

RIVM rapport:De groeiende markt van voedingssupplementen vormde de achtergrond voor deze inventarisatie van de actieve componenten die aanwezig zijn in voedingssupplementen. Van elke component is de: minimum behoefte, aanbevolen dagelijkse hoeveelheid (ADH), toxische dosis, waargenomen hoeveelheid in supplementen, bronnen en funcite van de component en symptomen die optreden bij dedicientie, weergegeven. De veel voorkomende stoffen in voedingssupplementen zijn onderverdeeld in de volgende categorieeen: water- en vet-oplosbare vitamines, mineralen, spoorelementen, hormonen, vetzuren en aanverwante voedingsfactoren. Actieve voedingscomponenten kunnen onderverdeeld worden in twee globale categorieen: componenten die veilig zijn bij een inname van minstens 50 keer de ADH en waarvan verondersteld wordt dat geen toxische effecten optreden bij normaal gebruik en in de tweede categorie vallen stoffen die een veilige marge hebben van minder dan 50 keer de ADH en waarvan redelijkerwijs mag worden aangenomen of verwacht dat ze bij overdosering of bij risico-groepen negatieve effecten op de gezondheid veroorzaken. De volgende componenten behoren tot de laatste categorie: van de wateroplosbare vitamines is een hoge vitamine C inname mogelijk schadelijk bij mensen met een verstoord ijzermetabolisme. Een hoge folaat inname kan het bestaan van een vitamine B12-deficientie maskeren. Van de vetoplosbare vitamines zijn vitamine A en D schadelijk bij een relatief lage inname. Een inname van vitamine A van ongeveer acht keer de ADH kan bij zwangere vrouwen afwijkingen aan de vrucht veroorzaken. Kinderen lijken ook erg gevoelig te zijn voor hypervitaminose D. Een hoge inname van vitamine E kan interferen met de bloedstolling en is daarom bij patienten met anti-stollingstherapie af te raden. Voor wat betreft de mineralen, zou de inname van zink beperkt moeten blijven tot twee tot vier keer de ADH. Een hoge calcium inname (>2 keer de ADH) kan gastro-intestinale stress veroorzaken. Verder heeft selenium, The growing food supplement market, where supplements are both more diverse and more easily available (e.g. through Internet) formed the backdrop to the inventory of the active components in food supplements. The safety of an increased intake of food components via supplements was also at issue here. The inventory gives the minimum requirement, recommentded daily allowance, toxic dose, observed dose in supplements, dietary source, physiological function and deficiency symptoms for each component. A distinction is made between water- and fat-soluble vitamins, major minerals, trace elements, hormones, fatty acids and associated nutritional factors. Of these components, a chronic high intake of the vitamins A, D, folate, calcium, iron, zinc and selenium in healthy persons can lead to adverse or toxic health effects. Special risk groups or risks for a high iron intake in combination with vitamin C, vitamin E, calcium and b-carotene could be identified. The safety levels of the hormones, dehydroepiandrosterone and melatonin, have yet to be determined; they have been reported to be responsible for adverse side-effects.

RIVM rapport:Nutritional iron intake in the Netherlands has been reviewed with respect to both iron deficiency and iron overload. In general, iron intake and iron status in the Netherlands are adequate and therefore no change in nutrition policy is required. The following aspects and developments, however, need to be emphasised. Iron is an essential element of nutrition required for oxygen transport, cognitive development in children and several other processes and enzyme activities in the body. The prevalence of iron deficiency is probably much lower than currently assumed. The general overestimation of iron deficiency is caused both by the incorrect comparison of the recommended daily intake with iron intake data and by the use of insufficiently specific diagnostic tests to determine real iron deficiency. Iron overload is, on the contrary, more common than generally thought. About 10% of the general population is heterozygote for the C282Y mutation, which can result in hemochromatosis, a hereditary iron overload disease. Iron overload is an established risk factor for cardiovascular disease. Recently, C282Y-heterozygotes have been suggested to be at higher risk, especially heterozygous men (> 20 years) and women (> 50 years). In addition, unabsorbed intestinal iron has been suggested to increase the risk of colon cancer. Iron supplementation or fortification in functional foods should be avoided and discouraged until the risks of iron overload have been more clearly determined, since in the general population iron overload is associated with increased risk of several chronic diseases as well., De ijzer inneming via de voeding in Nederland is geevalueerd waarbij zowel ijzertekort als ijzerstapeling in de beschouwing zijn betrokken. De gemiddelde dagelijkse ijzerinname en de ijzerstatus in Nederland lijken voldoende, zodat geen reden bestaat het voedingsbeleid t.a.v. ijzer te veranderen. De volgende aspecten en ontwikkelingen verdienen echter de aandacht. IJzer - een essentieel spoorelement - is nodig voor zuurstoftransport, cognitieve ontwikkeling van kinderen en verschillende enzymatische processen. De prevalentie van ijzerdeficientie is waarschijnlijk veel lager dan momenteel wordt aangenomen. De oorzaak van de algemene overschatting van ijzerdeficientie is enerzijds de incorrecte vergelijking van de aanbevolen dagelijkse hoeveelheden met de gemiddelde dagelijkse inname en anderzijds het gebruik van minder geschikte laboratoriumtests voor het vaststellen van echte ijzerdeficientie. De prevalentie van ijzerstapeling is groter dan momenteel wordt aangenomen. Ongeveer 10% van de bevolking is heterozygoot voor de C282Y mutatie die kan leiden tot hemochromatose, een erfelijke ijzerstapelingsziekte. IJzerstapeling is een bewezen risicofactor voor hart- en vaatziekten. Recent is aangetoond dat met name C282Y heterozygote mannen (vanaf 20 jaar) en vrouwen (vanaf 50 jaar) een sterk verhoogd risico hebben. Een hoge concentratie niet-geabsorbeerd ijzer in de darm geeft mogelijk een verhoogde kans op darmkanker. IJzersupplementatie aan voedingsmiddelen is hierdoor niet aan te raden totdat de risico's van ijzerstapeling zijn vastgesteld, aangezien ijzerstapeling ook in de algemene bevolking geassocieerd is met een verhoogd risico op verschillende chronische ziekten.

RIVM rapport:Het proces van de humane risicoschatting kan verdeeld worden in risico-identificatie, vaststellen van dosis-respons relaties, vaststellen van blootstelling en risico-karakterisering. In de humane risicoschatting worden kwantitatieve methoden en modellen toegepast. Welk model dient te worden toegepast is afhankelijk van de vraagstelling. Voor het stellen van een norm kan een eenvoudig model gebruikt worden. Indien een norm overschreden wordt, en men wil een schatting van de gevolgen voor de gezondheid van de bevolking, dan is een complex model noodzakelijk. In dit rapport wordt een overzicht gegeven van een aantal belangrijke dosis-responsmodellen en methoden. Daarnaast wordt aangegeven waarvoor de verschillende methoden gebruikt kunnen worden.Het rapport is onderverdeeld in methoden en modellen voor genotoxische stoffen en niet genotoxische stoffen. Aangenomen wordt dat niet-genotoxische stoffen een drempelwaarde hebben waaronder geen effect optreedt. Voor deze stoffen wordt een overzicht gegeven van methoden om de drempelwaarde te schatten en methoden om een toxiciteitsnorm voor mensen vast te stellen. Daarnaast worden enkele extrapolatieproblemen die ontstaan bij het vertalen van diergegevens naar de mens in het kort beschreven. Vervolgens wordt uitgelegd wat "physiologically-based pharmacokinetic" (PBPK) modellen zijn en welke extrapolatieproblemen ermee kunnen worden opgelost Voor non-genotoxische en genotoxische stoffen worden enkele dosis-responsmodellen beschreven. Zowel curve-fit procedures als biologische modellen worden gepresenteerd.Ten slotte wordt een overzicht gegeven van modellen die gebruikt en onderzocht worden binnen het RIVM en wordt aangegeven wat, met het oog op de toekomst, belangrijk is op dit gebied., The process of human risk assessment can be divided into hazard identification, dose-response assessment, exposure assessment and risk characterisation. For human risk assessment quantitative methods and models are applied. Which model should be applied depends on the nature of the question to be answered. A simple model can be applied if a standard has to be established, while a more complex model is required in the case a standard is exceeded and the health impact on a population has to be quantified. In this report an overview is given of important dose-response assessment methods and models as well as their application area. A distinction is made in methods and models for genotoxic compounds and non-genotoxic compounds. The non-genotoxic compounds are assumed to have a threshold below which no effect occurs. Methods to estimate the threshold dose and to derive a human reference dose are presented. Furthermore, extrapolation problems that arise when animal data have to be translated to human data are discussed briefly. PBPK modelling is discussed as a method to improve interspecies extrapolation. For non-genotoxic as well as genotoxic compounds curve-fitting models are described. In addition a biologically based model for genotoxic agents is briefly discussed. Finally methods that are applied and investigated at RIVM are presented and recommendations are given.

RIVM rapport:In gevallen waar humane toxiciteitsgegevens niet beschikbaar zijn wordt de "Acceptable Daily Intake" (ADI) berekend door deling van de "No Observed Adverse Effect Level" (NOAEL) in proefdieren door een veiligheidsfactor. In deze berekening wordt de NOAEL gebruikt als een puntschatting voor de drempelwaarde voor chemische toxiciteit. De manier waarop de NOAEL gebruikt wordt voor het berekenen van de ADI heeft echter enkele beperkingen. Enkele van deze beperkingen zijn de zwakte van de NOAEL als schatter voor de toxiciteitsdrempel en de onmogelijkheid om de toxiciteit van blootstellingen groter dan de ADI te kunnen beoordelen. Dit rapport evalueert drie kwantitatieve methoden, te weten Crump's "Benchmark" Dosis, Gaylor's Extrapolatie Methode en Hoekstra's "Bounded-Effect" Dosis, op hun meerwaarde ten opzichte van de NOAEL methode ter bepaling van de ADI. In tegenstelling tot de NOAEL methode betrekken de genoemde methoden de gemeten experimentele variatie bij het bepalen van de toxiciteitsdrempel. Verder betrekken deze methoden alle experimentele waarnemingen bij het vaststellen van de toxiciteitsdrempel. Bij de traditionele manier methode om de ADI vast te stellen worden daarentegen slechts de waarnemingen bij een van de toegediende doses, nl. de NOAEL, gebruikt. De toepasbaarheid van de genoemde methoden als alternatief voor de NOAEL methode wordt voor een groot deel bepaald door de kwaliteit van de te analyseren waarnemingen. In het bijzonder zijn daarbij de volgende punten van belang : 1. In hoeverre laten de waarnemingen een kwantitatieve dosis-effect analyse toe ? 2. Kan de drempelwaarde voor toxiciteit uit de waarneminegn zelf afgeleid worden of is hiervoor extrapolatie buiten het waarnemingsgebied nodig ? 3. Kunnen a priori veilige cq. niet-veilige effect niveau's aangegeven worden ? Wat betreft de toepasbaarheid van genoemde methoden kunnen de volgende conclusies getrokken worden. In gevallen waar de waarnemingen een kwantitatieve dosis-effect analyse toelate, In cases where human toxicity data are not available the Acceptable Daily Intake (ADI) is determined by division of the No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) for animal toxicity by a safety factor. In this calculation the NOAEL is used as a point estimate for the threshold of animal toxicity. The way in which the NOAEL is used in calculating the ADI has several limitations. Of these limitations the weakness of the NOAEL as an estimator of the threshold for animal toxicity and the inability of the current approach to assess toxicity beyond the NOAEL form important issues. This report reviews three quantitative methods, e.g. Crump's Benchmark Dose, Gaylor's Extrapolation Method and Hoekstra's Bounded-Effect Dose, on their merits in improving the adequacy of determining the ADI from animal toxicity data. Contrary to the NOAEL approach, the above mentioned methods take the experimental uncertainty into account in estimating the threshold for animal toxicity and make use of the entire dose-response relationship relation instead of only one of its data points in assessing chemical toxicity. The applicability of these methods, however, greatly depends on the quality of the data set to be analysed. In this context answering the following questions are of particular importance: 1. Do the data allow reasonable characterisation of the dose-response relationship? 2. Do the data allow the estimation of acceptable toxicity levels per se or is extrapolation outside the experimentally observed dose range necessary? 3. Can a priori safe vs. non-safe effect levels be defined? Reviewing the literature the following conclusions were drawn. In cases where the data allow the characterisation of a dose-response relationship, Crump's Benchmark Dose is favourable. However, toxicity data generated for regulatory purposes may not suffice for assessing a dose-response curve. Then Hoekstra's "model free" Bounded Effect Dose might be an alternative. When acceptable animal toxicity levels lie

RIVM rapport:Gehalten van 1- en 2-hydroxynaftaleen in de urine van niet-beroepsmatig blootgestelde personen worden gerapporteerd. Deze metabolieten van naftaleen zijn voorgesteld als biomarkers van blootstelling aan vluchtige PAK's. Het blijkt dat deze controleniveaus ongeveer 10 maal hoger liggen dan de detectielimiet van de GCMS methode en daarom uitstekend te bepalen zijn. De verhoogde blootstelling aan naftaleen bij rokers blijkt te resulteren in een verhoogde uitscheiding van zowel 1- als 2-hydroxynaftaleen met een factor van respectievelijk 5,9 en 14. Het groter verschil bij 2-hydroxynaftaleen geeft aan dat deze biomarker mogelijk gevoeliger is voor kleine veranderingen in de blootstelling aan naftaleen. De intra-individuele variatiecoefficienten liggen in de orde van 15-25% zowel bij rokers als niet-rokers. Geconcludeerd wordt dat de huidige methode geschikt is voor verdere studies voor inhalatoire PAK blootstelling in de algemene bevolking., Urinary levels of 1- and 2-hydroxynaphthalene of non-occupationally exposed individuals have been reported. These metabolites have been proposed as biomarkers for volatile PAH exposure. It appeared that these control levels are about 10 times higher than the limit of detection of the GCMS method and could therefore be measured very conveniently. A large difference is observed in both 1- and 2-hydroxynaphthalene concentrations in urine of smokers and non-smokers, being a factor 5.9 and 14, respectively. The larger difference in the 2-hydroxynaphthalene indicates that this biomarker is probably more sensitive for the detection of small changes in exposure of naphthalene. The intra-individual coefficients of variation were in the order of 15-25% in both smokers and non-smokers. It was concluded that the present method is suitable for further monitoring studies of inhalatory PAH exposure in the general population.

RIVM rapport:In dit rapport wordt in het kort een overzicht gegeven van de stand van zaken op het gebied van PCBs en dioxines in voedsel. Achtergrondblootstelling en de manier waarop deze achtergrondblootstelling ontstaat wordt besproken. In de risicobeoordeling wordt een overzicht gegeven van de toxicologische effecten, de wijze waarop een norm voor PCBs en dioxines is afgeleid, welke meetmethoden gebruikt worden en welke concentraties van PCBs en dioxines in verschillende voedingsmiddelen voorkomen. In het risico management deel wordt inzicht gegeven in de maatregelen die genomen zijn om de risico's ten gevolge van blootstelling aan PCBs en dioxines te verminderen., In this report a brief overview is given concerning PCBs and dioxins in food. Background levels and the way PCBs and dioxins enter the environment are described. In the risk assessment part of the report an evaluation of toxicity is given, the way standards for dioxins and PCBs have been determined, which analysis methods are used as well as which levels of PCBs and dioxins have been measured in various food items. Finally, in the risk management part of this report it is tried to make clear what measures have been taken to reduce the risks related to exposure to dioxin and PCB.

RIVM rapport:Het gebruik van N1-methylnicotinamide (NMN) als biomarker voor nitraat/nitriet blootstelling is onderzocht in drie experimenten met ratten en een humane studie met vrijwilligers. Ratten zijn blootgesteld aan 36 mmol KCl, KNO2 of KNO3 per liter water gedurende 2, 12 en 13 weken. Het algemene beeld was dat de ratten die KNO2 kregen een statistisch significante (p<0.01) tweevoudige toename in NMN vertoonden in vergelijking met de KCl-groep. Deze toename werd waargenomen na een relatief hoge blootstelling van ongeveer 800 mg/kg lichaamsgewicht/dag). De inductie van urinair NMN in mensen werd onderzocht in een experiment met 8 vrijwilligers die een eenmalige orale dosis ontvingen van natriumnitraat overeenkomend met 10 mg NaNO3/kg lichaamsgewicht/dag (2 maal de acceptable daily intake voor nitraat). Na de eenmalige dosis natriumnitraat was een snelle toename te zien van het urinaire NMN gehalte (tot 6 maal) in vier vrijwilligers. In de andere vier vrijwilligers was de urinaire NMN concentratie nauwelijks veranderd. Bij herhaling van hetzelfde experiment met dezelfde vrijwilligers was het opmerkelijk te zien dat alle vrijwilligers dezelfde respons te zien gaven voor urinair NMN als in het eerste experiment. Geconcludeerd wordt dat NMN mogelijk kan dienen als een goede biomarker voor de interne nitriet blootstelling bij mensen. Nadere studies zijn echter nodig om dit te bevestigen., The use of N-methylnicotinamide (NMN) as a biomarker for nitrate/nitrite exposure was investigated in three rat experiments and one human study with volunteers. Rats have been exposed to 36 mmol KCl, KNO2 or KNO3 per liter tap water for 2, 12 and 13 weeks. In general, the animals receiving KNO2 showed a statistically significant (p<0.01) twofold increase in NMN compared with the KCl-group. This increase was observed after a relatively high exposure (about 800 mg/kg body weight/day). The induction of urinary NMN in humans was investigated in an experiment with 8 human volunteers who received a single oral dose of sodium nitrate, corresponding with 10 mg NaNO3/kg b.w./day (2 times the acceptable daily intake for nitrate). After the single dose of sodium nitrate a rapid increase of urinary NMN (up to six-fold) was observed in four volunteers. In the other four volunteers the urinary NMN concentration did hardly react. When the same experiment was repeated with the same volunteers, it was remarkable to see that all volunteers showed the same response on urinary NMN as in the first experiment. It is concluded that NMN can possibly be a good biomarker for the internal nitrite exposure of humans but further studies are nessecary to assess its value.

RIVM rapport:In this report the conclusions of a literature study has been summarized concerning the monitoring of the general population to exposure to benzene-like solvents. Since the Dutch population is exposed to concentrations far below the ppm level, the conclusions on the suitability of biomarkers are based on the monitoring of organic solvents at low concentrations. The following compounds are considered in this study: benzene, phenol, xylenes, toluene and cresols. For exposure to benzene, the following biomarkers have been evaluated: benzene in blood, phenol, S-phenylmercapturic acid, trans,trans-muconic acid, 1,2,4-benzenetriol and catechol in urine. From these biomarkers only benzene in blood, S-phenylmercapturic acid and muconic acid are possibly interesting biomarkers of exposure. For monitoring of exposure to phenol, phenol sulphate and phenol glucuronide in urine have been evaluated as biomarkers but are not found to be suitable. For monitoring of exposure to toluene, toluene in blood, hippuric acid, para- and ortho-cresol, D-glucaric acid and retinol binding protein in urine have been evaluated. None of these parameters are found to be suitable as biomarker for toluene. For monitoring of exposure to cresols no suitable literature data have been found. For monitoring of exposure to xylenes, the biomarker methylhippuric acid in urine has been evaluated and found not to be suitable. The unsuitability of most of the biomarkers mentioned is caused by a combination of a too low sensitivity for variations in exposure in the actual concentration range, by individual variations (possibly polymorfisms) and by the disturbing influence of lifestyle and food components. Most of the mentioned biomarkers can be measured with routine like analytical methods. Therefore they can be of use in the assessment of exposures in the ppm concentration range. From the results of this literature study it is concluded that only for benzene suitable biomarkers have been found which meet the r

RIVM rapport:In the present study a method is developed for the quantitation of N-methylnicotinamide (NMN) in rat and human urine with capillary zone electrophoresis (CZE). Because NMN is considered as a possible biomarker for nitrite exposure, a quantitative method of analysis is required for further evaluation studies. In the present report CZE was evaluated as method of analysis for NMN. CZE turned out to be very suitable. No pretreatment of the human urine sample was needed before analysis and large series of samples can be handled. Although only a few human urine samples have been analysed at present, the CZE method looks very promising. In addition NMN concentrations in rat urine samples from a toxicity experiment have been determined. At this point it is questionable whether a dose-response relationship exists in the low concentration exposure range because the statistical significance disappeared after correction for the produced urine volume or creatinin content.

RIVM rapport:In a study in which male rats have been exposed to 0, 200, 600, 2000, 6000 and 20000 mg diethylphthalate (DEP)/kg diet for 2 weeks, body weight and liver weight and a number of enzyme parameters which are related with peroxisome proliferation (palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT) and lauric acid hydroxylase (LAH) have been determined in liver homogenates. No effects have been observed on the liver and body weights. PCO and LAH showed no effects up to 2000 and 600 mg DEP/kg diet, respectively. ECH was more sensitive with a dose-without-effect (DWE) of 200 mg/kg diet. Cat was the most sensitive parameter with an effect in all dose groups. Although CAT turned out the most sensitive parameter, this enzyme was not considered in the establishment of an overall no-observed-effect-level for peroxisome proliferation since it is not specific for peroxisome proliferation. The second most sensitive parameter was the ECH activity. Therefore an overall no-observed-effect-level for peroxisome proliferation of 200 mg DEP/kg diet was established corresponding to 19 mg DEP/kg b.w./day.

RIVM rapport:In a study in which male rats have been exposed to 0, 200, 600, 2000, 6000 and 20000 mg di(2-ethylhexyl)adipate (DEHA)/kg diet for 2 weeks, body weight and liver weight and a number of enzyme parameters which are related with peroxisome proliferation (palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT) and lauric acid hydroxylase (LAH) have been determined in liver homogenates. No effect has been observed on the liver weight. The highest dose group showed a significant decrease in the body weight. PCO, CAT and LAH showed no effect up to 2000 mg DEHA/kg diet. ECH, an enzyme involved in the beta-oxidation, was more sensitive with a dose-without-effect (DWE) of 200 mg DEHA/kg diet. Therefore an overall no-observed-effect-level of 200 mg DEHA/KG diet was defined equal to 20.1 mg DEHA/kg b.w.day.

RIVM rapport:In the present report a literature study has been described about the possibilities of monitoring the exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) to the general population by biochemical parameters in body fluids. The following PAH have been considered in this study: naphthalene, antracene, phenantrene, pyrene, fluorantene, benzo(a) antracene, chrysene, benzo(k)fluoranthene, benzo(a)pyrene (B[a]P), benzo(ghi)perylene and indenol[1,2,3-cd]pyrene. From the literature, five biochemical markers have been selected which are possibly suitable for monitoring of the general population (see Chapter 5). These biomarkers are: hydroxylated PAH in urine, B[a]P-protein adducts in blood, B[a]P-DNA adducts in white blood cells, B[a]P-guanine adducts in urine and oxidized nucleosides in urine. The basis of the chosen selection of parameters is formed by a number of criteria with analytical practicability as the most important one. Because PAH exposure to humans by inhalation is much more toxic than by oral exposure, a proposal has been made for the development of parameters which are able to distinguish between oral and inhalation exposure. Therefore the following parameters should be developed: 1. hydroxylated metabolites in urine as indicators for internal exposure for both oral (1-hydroxypyrene) and by inhalation (1-hydroxynaphthalene) and 2. B[a]P-guanine adducts in urine as a more effect-directed parameter

RIVM rapport:Mothers with untreated phenylketonuria (PKU) have an increased risk of bearing children with congenital malformations. PKU causes accumulation of phenylalanine (PHE) and its metabolites in urine and blood, and this condition may contribute to the developmental problems. In the present study we investigated the embryotoxicity of these compounds in the rat postimplantation embryo culture system. Whereas PHE was ineffective, phenylpyruvic acid and phenylacetic acid induced general growth retardation. Phenylacetic acid and O-hydroxyphenylacetic acid were also growth retarding and in addition affected yolk sac circulation. Phenylethylamine was the most embryotoxic compound tested, with a lowest effective concentration of 0.03 g/l. It induced various anomalies including incomplete flexion and neural tube defects. The effects of a mixture of phenylketones in culture did not reveal synergism between compounds. In the presence of maternal hepatocytes PHE was metabolized in culture without leading to embryotoxic effects. Extending culture duration from 26 to 48 hours did not increase sensitivity to phenylpyruvic acid. No changes in osmolarity or pH of media were observed that might have been responsible for the embryotoxicity observed. Analysis with HPLC of media after culture revealed no biotransformation of added compounds into other metabolites, except for phenylpyruvic acid. In addition, in the presence of maternal hepatocytes, metabolism was observed that was not accompanied with embryotoxic effects. Embryo culture in human PKU sera, either or not supplemented with 5% (v/v) rat serum, was not detrimental to development. Rather, embryo's tended to thrive better on PKU sera versus control sera. Analysis of human PKU sera revaled lower glucose levels and increased levels of PHE and PKU-related metabolites. The results suggest that the embryotoxicity of PKU-related phenylketones may contribute to teratogenicity of maternal PKU in man. However, in view of the relatively high

RIVM rapport:Two animal experiments are described in which male rates have been exposed to di(2-ethyl-hexyl)phthalate (DEHP) for 2 and 4 weeks. A number of enzyme parameters in liver homogenates have been determined which have a relation with the proliferation of peroxisomes in hepatocytes, such as palmitoyl coenenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT), catalase (cat) and lauric acid hydroxylase (LAH). In addition, the induction of ECH has been detected with Western blotting. Glutamate dehydrogenase (GlDH) was measured as a control enzyme for mitochondria. For all enzymes, except GlDH, a dose-response relationship was observed. There were not many differences between the 2 and 4 weeks exposed animals. In the 2 weeks exposure experiment, the enzyme parameters appeared to be slightly more sensitive, therefore the parameters from this experiment were taken for determination of the doses-without-effect (DWE). CAT appeared to be the most sensitive parameter. Because the lowest dose group showed a significant difference from to control group, no DWE could be established. Since CAT from mitochondria also contribute to the measured activity, CAT can not be seen as a specific parameter for perxoisome proliferation. The induction of the other enzymes, such as PCO, ECH, cat and LAH are considered to be specific for peroxisome proliferation. The most sensitive parameter was the LAH and ECH activity (DWE = 5 mg/kg b.w./day) followed by PCO (DWE 18 mg/kg b.w./day). Catalase was the least sensitive parameter (52 mg/kg b.w./day). An overal no-observed-effect level for DEHP was established as 5 mg/kg b.w./day, based on peroxisome proliferation.

RIVM rapport:In this report three independent bioassays for the determination of dioxinlike compounds have been evaluated. These assays include an immunochemical determination of 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD), an inhibition of estrogen-induced cathepsin D in MCF-7 cell line and the induction of cytochrome P-450 IA1 in isolated hepatocytes. It appeared that in our experiments only the last bioassay was successful. A limit of detection of 2 pg TCDD/assay was achieved with the cultured hepatocytes from rats. Thus far only standard solutions have been tested without the influence of matrix components of environmental or biological samples or the influence of other contaminants. The assay can be automated and performed in relatively large numbers.

RIVM rapport:In this report the preparation and characterization of a number of antibodies have been described. These antibodies have been raised in rabbits against cytochrome P-450 isoenzymes of rat liver microsomes. The antigens were isolated from liver microsomes of control rats and rats treated with beta-naftoflavon, phenobarbital and isosarole. Characterization of these antibodies was performed by detection on Western blots. It appeared that antibodies raised against the total isoenzym pattern of cytochrome P-450 showed a good immuno reactivity. A number of antibodies raised against individual cytochrome P-450 isoenzymes also showed an immunological reaction, such as isoenzym IA1 and IA2 from BNF-induced microsomes. The raised antibodies were compared with commercial antibodies against cytochrome P-450, IA1, IIB1, IIE1 and IIIA on Western blots. From this comparison it appeared that besides cytochrome P-450 IA1 also a good antibody has been obtained against cytochrome P-450 IIB1.

RIVM rapport:In this report a number of staining techniques on Western blots have been compared with respect to sensitivity, background staining, practical applicability and cost aspects. After electrophoresis of a rat microsomal liver sample followed by blotting, an incubation was performed of a primary antibody against a purified cytochrome P-450 fraction. Enzyme-labelled second antibodies with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and xanthine oxidase were used for detection. Both colorimetric and chemiluminescent methods were investigated. It appeared that chemiluminescence detection of horseradish peroxidase was the most sensitive method. followed by chemiluminescence detection of xanthine oxidase. Horseradish peroxidase with colorimetric detection was also fairly sensitive and easier to use than chemiluminescence detection. Alkaline phosphatase gave the least sensitive method with both colorimetric and chemiluminescence detection. Both horseradish peroxidase and especially alkaline phosphatase showed heavy background staining, in contrast to xanthine oxidase, where no background was observed even after overnight exposure. A number of blot experiments on nylonmembrane, for a more sensitive detection of alkaline phosphatase, did not give better results in sensitivity. Both colorimetric and chemiluminescence detection showed heavy background staining on nylonmembrane. The heavy background staining after chemiluminescence detection of horseradish peroxidase was less by using the second antibody in smaller concentration. The colorimetric detection of horseradish peroxidase gave better photographic reproduction when a substrate of diaminobenzidine and chloronaphthol was used for staining.

RIVM rapport:Based on data from literature, an evaluation was made wether it is possible to monitore the exposure of weakeners to the general Dutch population as urinary metabolites. The exposure, which mainly occurred by food, could only be estimated with data from foreign countries and by a number of assumptions. Based on existing qualitative and partially estimated data, only DEHP and DEHA are suitable for monitoring from analytical standpoint. From toxicological point of view, only DEHA is possibly interesting for monitoring, because the exposure closely approaches the tolerable daily intake.

RIVM rapport:In a study in which male rats have been exposed to 0, 20, 60, 200, 600 and 2000 mg di(isodecyl)phthalate (DIDP)kg diet for 2 weeks, body weight and liver weight and a number of enzyme parameters (palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT) and lauric acid hydroxylase (LAH) have been determined in liver homogenates which are related with peroxisome proliferation. No effects have been observed on liver and body weight. CAT appeared to be the most sensitive parameter with a dose-without-effect (DWE) of 60 mg DIDP/kg diet, corresponding with 5.6 mg DIDP/kg b.w./day. The other enzyme parameters PCO, ECH and LAH showed no effect at 200 mg DIDP/kg diet, corresponding with 18.4 mg/kg b.w/day. Since CAT is considered to be not specific for peroxisome proliferation this latter value has been established as overall no-observed-effect-level.

RIVM rapport:A practical and theoretical approach for the implementation of micro high performance liquid chromatography (HPLC) is described. A new simple and rapid test procedure was developed in wich a HPLC system can be validated for its suitability for micro-bore columns. It appeared that the detector flowcell is the most critical parameter, specially when compounds are separated with a small capacity factor. The main advantage of a miniaturized system in comparance with a conventional system is the higher mass-sensitivity and the low consumption of eluentia.

RIVM rapport:In a study in which male rats have been exposed to 0, 200, 600, 2000, 6000 and 20000 mg benzylbutylphthalate (BBP)/kg diet for 2 weeks, body weight and liver weight and a number of enzyme parameters which are related with peroxisome proliferation (palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT) and lauric acid hydroxylase (LAH)) have been determined in liver homogenates. No effect has been observed on the liver weight. The body weight showed a significant decrease as the highest dose level. PCO and CAT showed no effect up to 600 mg BBP/kg diet. LAH was more sensitive with a dose-without-effect (DWE) of 200 mg BBP/kg diet, corresponding with 19.1 mg BBP/kg b.w./day. ECH appeared to be the most sensitive parameter with an effect in all dose levels used. Therefore, no overall no-observed effect level can be defined in this experiment.

RIVM rapport:Two animal experiments are described in which male rats have been exposed to di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) for 2 and 4 weeks. Besides morphometric analysis using both light and electron microscopy, a number of enzyme parameters in liver homogenates have been determined which have a relation with the proliferation of peroxisomes in hepatocytes, such as palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT), catalase (cat) and lauric acid hydroxylase (LAH). Glutamate dehydrogenase (GIDH) was measured as a control enzyme for mitochondria. For all enzymes, except GIDH, a dose-response relationship was observed. There were not many differences between the results of the parameters examined in the 2 and 4 weeks exposed animals. In the 2 weeks exposure experiment, the enzyme parameters appeared to be slightly more sensitive. Therefore the parameters from this experiment were taken for determination of the doses-without-effect (DWE). Also the morphometric analysis has been performed on the 2 weeks-experiment. Although CAT turned out the most sensitive parameter, this enzyme activity was not considered in the establishment of an overall no-observed-effect-level since it is not specific for peroxisome proliferation. The second most sensitive parameters were the morphometric analysis and the induction of LAH and ECH activity (DWE = 5 mg/kg b.w./day) followed by PCO (DWE = 18 mg/kg b.w./day). Catalase activity was not a very sensitive parameter (52 mg/kg b.w./day). An overall no-observed-effect-level for DEHP was established as 5 mg/kg b.w./day, based on the parameters mentioned for peroxisome proliferation.

RIVM rapport:Morphometric analysis was performed on liver sections of rats at light (LM) and electron microscopical (EM) level to demonstrate proliferation of peroxisomes after administration of di (2-ethylhexyl)phthalate at dietary levels of 0, 60, 200, 600, 2000 and 6000 mg/kg diet for 2 weeks. Enzyme histochemical demonstration of catalase was carried out to demonstrate the presence of peroxisomes. The results of the LM-morphometric analysis will be compared with those of the biochemical analysis, reported elsewhere. The LM-morphometric data will be tested by EM-morphometry in a limited number of groups. With the LM- as well as the EM-method the volume density of peroxisomes and the number of peroxisomes were significantly increased after administration of 200 mg DEHP/kg diet during 2 weeks. However, LM-morphometry of peroxisomes by enzyme histochemical demonstration of catalase is suitable to compare the capacity of various phthalate esters to induce proliferation of peroxisomes, realising that the measured values of volume density at LM-level are not true values, but relative values. With the catalase reaction, enzyme histochemical morphometry of peroxisomes showed a dose-without-effect of 60 mg DEHP/kg diet.

RIVM rapport:In a study in which male rats have been exposed to 0,20, 60, 200, 600 and 2000 mg di(isononyl)phthalate (DINP)/kg diet for 2 weeks, body weight and liver weight and a number of enzyme parameters (palmitoyl coenzyme-A oxidase (PCO), enoyl coenzyme-A hydratase (ECH), carnitine acetyl transferase (CAT) and lauric acid hydroxylase (LAH)) have been determined in liver homogenates which are related with peroxisome proliferation. No effects have been observed on both liver and body weight. PCO, CAT and LAH, showed no effect at 200 mg DINP/kg diet, corresponding with 18.2 mg/kg b.w./day. ECH appeared to be the most sensitive parameter with a dose-without-effect of 60 mg DINP/kg diet, corresponding to 5.7 mg DINP/kg b.w./day. This value of 60 mg/kg diet has been defined as overall no-observed-effect-level for DINP in this experiment.

RIVM rapport:A derivatization procedure is described for the long chain fatty acid, lauric acid and metabolites using a fluorescent probe 4-(bromomethyl)-7-methoxycoumarin. The derivatives can be separated and detected in an isocratic high performance liquid chromatografic system using a fluorescence detector. The derivatization is rapid, simple and gives a good quantification by the use of an internal standard. The procedure has been applied on samples from a toxicity experiment with the plasticizer di (2-ethylhexyl)phthalate (DEHP). The activity of cytochrome P-450 IVA1 or lauric acid hydroxylase (LAH) in liver homogenates can be determined by the quantification of the 11- and 12-hydroxylated metabolites of lauric acid. The method turned out to be very sensitive and suitable to replace similar assays using radioactive compounds.

RIVM rapport:A good, rapid and simple method has been developed to determine di(2- ethylhexyl)phthalate (DEHP) in standard flour with reversed phase high performance liquid chromatography. The method consist of an extraction as sample preparation followed by an isocratic HPLC-method in which DEHP is quantitated by use of an internal standard. The recovery of the phthalate from the flour is high (>95%). This aspect, in combination with the linearity of the calibration curve, allows an accurate determination of DEHP. The determination is very fast due to the short time of analysis: the peaks of the matrix, the internal standard and DEHP appear within 5 minutes. The developed method has been applied to samples of flour used in a toxicity study with DEHP as testcompound (TOS-TOX-90-41). The measured amounts of DEHP in the flour are in good agreement with the amounts added.

RIVM rapport:Several pre-column derivatization methods have been reported for the determination of amino acids using high performance liquid chromatography (HPLC). the present report describes the derivatization procedure of amino acids with dabsylchloride and the HPLC analysis of dabsyl-amino acids for a number of applications in our Institute. The dabsyl derivatives show a number of advantages relative to other derivatives, like:- a very good stability of the dabsylderivatives ; - a good reproducibility ; - a good limit of detection of about 3 pmol ; - a complete HPLC separation for all 20 amino acids ; - specific detection at a wavelength of 436 nm. In our Institute, the here described pre-column derivatization with dabsylchloride was applied to a variety of projects in which amino acids are involved, like total amino acids analysis of protein hydrolysates for several applications, monitoring of the consumption of amino acids in animal cell cultures for the production of biologicals, determination of glycine in preparations of anti-thymocyt globulins, the ratio between tryptophan and four other hydrophobic amino acids in the study of pre-menstrual syndrome and the determination of thyronine residues in the thyroid for toxicological investigations. In conclusion, the pre-column derivatization of amino acids with dabsylchloride appears to be a good and practical method with a number of distinct advantages.

RIVM rapport:Een specifieke radioimmunoassay voor 19-nortestosteron (nandrolon) is ontwikkeld om gehalten in urine te bepalen. De antisera zijn opgewekt in konijnen tegen een nortestosteron-17alfa-carboxyethylthioether conjugaat van runder serum albumine. Tritium gelabeld nortestosteron werd als tracer gebruikt. Kruisreactiviteiten met metabolieten van nortestosteron, andere anabolica en endogene steroiden zijn erg laag. Om een extra specificiteit te verkrijgen, werd een zuiverings- en scheidingsprocedure ontwikkeld via isocratische hoge druk vloeistofchromatografie. Tot nu toe zijn er geen kwalitatieve discrepanties waargenomen tussen de resultaten van deze assay en die van het bevestigingsonderzoek via HPLC-GCMS.

RIVM rapport:In dit rapport staan een aantal uitvoeringen van de iso-elektrische focussering beschreven. Deze techniek heeft een zeer groot oplossend vermogen doordat de eiwitten gescheiden worden door verschillen in hun iso-elektrische punt (netto lading = 0). Een aantal parameters zijn gevarieerd om een zo optimaal mogelijke scheiding te verkrijgen van een monster van ratte serumeiwitten. Het effect van amfoline mengsels is onderzocht voor het verkrijgen van een optimale pH-gradient. De invloed van amfolines van verschillende firma's op de scheiding is onderzocht. De invloed van detergentia op de scheiding is uitgebreid bekeken. Verder zijn een aantal kleuringsmethoden onderzocht op hun bruikbaarheid. De optimale uitvoering van de iso-elektrische focussering voor de scheiding van ratte serumeiwitten staat gedetailleerd beschreven in de vorm van een "standard operating procedure" in de bijlage.

RIVM rapport:Een betrouwbare methode werd uitgewerkt voor de identificatie van testosteronpropionaat (T-P) en/of estradiolbenzoaat (E2-Bz) in spuitplaatsmateriaal van kalveren en runderen. De methode berust op selectieve multi-derivaat karakterisering via de combinatie hoge druk vloeistof chromatografie (HPLC) - capillaire gaschromatografie met vlamionisatie (GC-FID). De methode is zeer flexibel en kan zeker verder geoptimaliseerd worden, met name wat betreft de verlaging van de aantoonbaarheidsgrens. Deze is voorlopig praktisch geindiceerd op ongeveer 1 mg/kg (1 ppm). Vergelijkend kwalitatief onderzoek met de nieuwe HPLC/GC-FID methode enerzijds en met dunnelaagchromatografie en HPLC-totaal UV spectrum detectie of HPLC-UV detectie anderzijds leverde geen aanwijzingen op voor mogelijk fout positieve bevindingen. Toepassing van de nieuwe methode bij keuringsonderzoek van 26 monsters spuitplaatsmateriaal toonde ondubbelzinnig de aanwezigheid aan van T-P en/of E2-Bz in 25 van deze monsters.

RIVM rapport:Bijdrage tot het symposium 'Anabole steroiden en de sport- en veterinaire wereld' Groningen 14 december 1984.

RIVM rapport:Antisera tegen trenbolon (TB) en zeranol (Z) werden opgewekt in konijnen door immunisatie met het 7-carboxymethyloxime-runder serum albumine (BSA) conjugaat van Z (Z-7CMO-BSA) en het 17-hemisuccinaat-BSA conjugaat van TB (TB-17HS-BSA). De antisera zijn in de geschikte hoeveelheden geampulleerd, drooggevroren en opnieuw gekarakteriseerd. De specificiteit van alle antisera is goed. Zoals verwacht mag worden vertonen de antisera slechts met enkele aan TB of Z nauwverwante stoffen kruisreactiviteit zoals bepaald met radio immunoassay (RIA). Hierdoor zijn de in dit rapport beschreven antisera uitstekend geschikt voor metabolisme studies en voor screeningsdoeleinden. De Z-antisera zijn ook geschikt bevonden in een chemiluminescentie immunoassay (CLIA).

RIVM rapport:Een eenvoudig isocratisch hoge druk vloeistofchromatografisch systeem wordt beschreven voor de scheiding en zuivering van verschillende typen laag moleculaire anabole verbindingen en enige van hun metabolieten. Voor dit doel worden de verbindingen gechromatografeerd over een "reversed phase" C18 kolom door middel van water-methanol mengsels. Diethylstilbestrol (DES), hexestrol, alfa-R en beta-dienestrol, Zeranol R, zearalenon, zearalanon, 17-beta-Trenbolone R, 19-nortestosteron, 17-alfa-methyltestosteron en medroxyprogesteron worden van elkaar gescheiden. Behalve voor UV-detectie direct gekoppeld aan de vloeistofchromatograaf bleken de geisoleerde fracties ook geschikt voor separaat vervolgonderzoek met (radio)immunochemische detectie, dunnelaagchromatografie, en/of gaschromatografie-massaspectrometrie.

RIVM rapport:Antisera tegen 17alfa-methyltestosteron zijn opgewekt in konijnen door immunisatie met het 3-carboxymethyloxime-runder serum albumine conjugaat (MT-3CMO-BSA). De antisera zijn in geschikte hoeveelheden geampulleerd, drooggevroren en opnieuw gekarakteriseerd. De specificiteit is goed. Zoals verwacht mag worden vertonen slechts enkele nauwverwante stoffen een kruisreactiviteit in de orde van 3-15%. Hierdoor zijn de twee in dit rapport beschreven antisera uitstekend geschikt voor metabolisme studies en voor screeningsdoeleinden.

RIVM rapport:Antisera tegen 19-nortestosteron zijn opgewekt in konijnen door immunisatie met verschillende runder serum albumine (BSA)-conjugaten gekoppeld aan positie 7 of 3 van het steroid. De antisera zijn in geschikte hoeveelheden geampulleerd, drooggevroren en opnieuw gekarakteriseerd. De specificiteit van de antisera opgewekt tegen NT- 7-carboxyethylthio-BSA zijn goed. Zoals verwacht mocht worden vertonen een aantal nauwverwante stoffen en enige metabolieten van NT een aanzienlijke kruisreactiviteit met de antisera opgewekt tegen NT-3- carboxymethyloxime-BSA. Hierdoor zijn de in dit rapport beschreven antisera geschikt voor screeningsdoeleinden alsook ten dele voor metabolisme studies in het kader van de controle op het verboden gebruik van hormonale anabolica bij slachtdieren.

RIVM rapport:Een eenvoudige en snelle detectiemethode voor 17beta-trenbolon en zijn hoofdmetaboliet 17alfa-trenbolon wordt beschreven. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een HPLC-scheiding op een "normal phase" kolom met UV-detectie bij 350 nm. De absolute detectiegrens ligt in de orde van 0.3-0.4 ng, terwijl de detectielimiet in urinemonsters ligt in de orde van 1-2 mug/l.