Search

Ill., graph. Darst.

Ill., graph. Darst

Das „Na + /Taurocholate Cotransporting Polypeptide“ (NTCP, SLC10A1) ist in seiner physiologischen Rolle von wesentlicher Bedeutung für die Aufrechterhaltung der enterohepatischen Zirkulation der Gallensäuren. NTCP transportiert Gallensäuren aus dem Blut in die Leberzellen hinein. NTCP wird exklusiv nur von Leberzellen exprimiert und ist dort in der dem Blut zugewandten Membran der Hepatozyten lokalisiert. Seine gewebespezifische Expression und physiologische Bedeutung als Membrantransporter für Gallensäuren machen NTCP zu einem geeigneten Ziel an der Zelloberfläche für Substanzen und Lebensformen, die spezifisch die Leber als Ziel haben. Vermutlich genau deshalb hat es sich für das Hepatitis B Virus (HBV) und das Hepatitis Delta Virus (HDV) im Laufe der Evolution bewährt, NTCP als Rezeptor für den Viruseintritt zu kapern. Durch die Entdeckung der hochspezifischen Rezeptorfunktion von NTCP für HBV und HDV wurde die Grundlage für die Forschung an neuen Therapiemöglichkeiten für HBV gelegt. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass Gallensäuren und bekannte Inhibitoren der Transportfunktion von NTCP mit der HBV-Infektion interagieren können und es schien zunächst, dass eine Blockade der HBV Infektion stets mit der Blockade der physiologischen Transportfunktion einhergeht. Um die Mechanistik dieser Virus-Rezeptor-Bindung besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die NTCP/Ntcps verschiedener nahe verwandter Spezies kloniert, verglichen und auf ihre Funktion als Rezeptoren für HBV, HDV und WMHBV (Woolly Monkey Hepatitis B Virus) untersucht. Das WMHBV wurde in die Untersuchungen mit einbezogen, weil durch die Klonierung von Ntcps aus Alt- und Neuweltaffen naheliegend war, auch die Wirtsspezifität eines Neuwelt-Hepadnavirus zu untersuchen. In unseren Studien zeigte sich, dass die Aminosäure an der Position 158 des Ntcps der entscheidende Faktor für die Wirtsspezifität aller untersuchten Viren war und die Gruppe der Altweltaffen klar abgrenzt. Alle Altweltaffen tragen die Variante 158R und sind infektionsresistent, während die anderen Gruppen mit der Variante 158G empfänglich sind. Durch diese Entdeckung konnten wir gezielte Mutationen am humanen NTCP an der Stelle 158 untersuchen und kamen zu dem Ergebnis, dass NTCP durch Mutation von lediglich einer Aminosäure resistent gegenüber HBV-, HDV- und WMHBV-Infektion gemacht werden kann. Gleichzeitig jedoch blieb die Transportfunktion für Gallensäuren weitestgehend unberührt. Wir schließen daraus, dass es möglich ist, Arzneistoffe zu entwickeln, welche diesen Effekt nachahmen und dadurch die physiologische Transportfunktion von NTCP unberührt lassen, während sie effektiv Schutz gegenüber HBV oder HDV Infektion bieten. The "Na+/Taurocholate Cotransporting Polypeptide" (NTCP, SLC10A1) plays an essential physiological role in maintaining the enterohepatic circulation of bile acids. NTCP transports bile acids from the blood into the liver cells. NTCP is exclusively expressed by liver cells and inserted into the hepatocyte membrane facing the blood. Its tissue-specific expression and physiological importance as a membrane transporter for bile acids make NTCP a suitable target at the cell surface for substances and life forms that specifically target the liver. This is probably the reason why NTCP has proven itself as a receptor for the hepatitis B virus (HBV) and the hepatitis delta virus (HDV) in the course of evolution. The discovery of the highly specific receptor function of NTCP for HBV and HDV laid the foundation for research into new therapeutic options for HBV. Preliminary work has shown that bile acids and known inhibitors of the transport function of NTCP can interact with HBV infection; it seemed at first that a blockade of HBV infection is always accompanied by a blockade of the physiological transport function. To better understand the mechanistic of this virus-receptor-binding, the NTCP/Ntcps of various closely related species were cloned, compared and examined for their function as receptors for HBV, HDV and WMHBV (woolly monkey hepatitis B virus). The WMHBV was included in the investigations because the cloning of Ntcps from Old and New World apes made it obvious to investigate the host-specificity of a New World hepadnavirus. Our studies showed that the amino acid at position 158 in the Ntcps was a decisive factor for the host specificity of all investigated viruses and that the group of Old World monkeys clearly differs from the other groups. The Old World monkeys all carry the variant 158R and are infection resistant while the other groups with 158G are susceptible. This discovery enabled us to investigate specific mutations in human NTCP at site 158 and concluded that NTCP can be made resistant to HBV, HDV and WMHBV infections by mutating only one amino acid. At the same time, however, the transport function for bile acids remained largely unaffected. We conclude that it is possible to develop drugs that mimic this effect, leaving the physiological transport function of NTCP largely unaffected, while they effectively protect against HBV or HDV infection.

In the present study seven A. haemolyticum strains isolated from a donkey and human patients, 15 A. pluranimalium strains from ovine, bovine and giraffe origin and from a muskox and 12 strains from miscellaneous origins representing the four novel species A. canis, A. phocisimile, A. pinnipediorum and A. wilhelmae together with reference strains of the hitherto described nine species of genera Arcanobacterium and Trueperella were investigated. The four novel species of genus Arcanobacterium, namely A. canis, A. phocisimile, A. pinnipediorum and A. wilhelmae, newly described in the present study, were isolated from a dog, from harbor seals and from a rhinoceros, respectively and were characterized based on a polyphasic taxonomic approach. This included a comparative 16S rRNA gene phylogenetic tree analysis, DNA-DNA hybridization, determination of DNA-based ratio and chemotaxonomical investigations by fatty acid, menaquinone and polar lipid composition analysis. All 34 strains investigated in the present study, representing six different species of genus Arcanobacterium, were characterized phenotypically by traditional microbiological methods including morphological, physiological and biochemical properties and by MALDI-TOF MS analysis. A molecular DNA-based investigation was performed by 16S rDNA sequence analysis, by sequencing 16S-23S rDNA intergenic space region (ISR), 23S rDNA and the genes encoding the B-subunit of bacterial RNA polymerase (rpoB), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (gap) and elongation factor tu (tuf). The additionally performed PCR-mediated amplification of seven genes encoding the potential virulence factors aranolysin, phospholipase D, hemolysin A, CAMP factor family protein, collagen binding protein, neuraminidase A and neuraminidase H of the A. haemolyticum investigated in the present study allowed an individual strain characterization. Moreover, A. pluranimalium could additionally be characterized by the species-specific and newly described gene pla encoding pluranimaliumlysin. This might help to clarify the pathogenic role such putative virulence factors play in infections caused by these bacterial species. A. haemolyticum is well known for its disease-causing role in humans, rarely in animals. However, A. pluranimalium, A. canis, A. phocisimile, A. pinnipediorum and A. wilhelmae were isolated in the present study as mixed culture with several other pathogenic and non-pathogenic bacteria indicating that the pathogenic importance of these species needs to be elucidated. In der vorliegenden Studie wurden sieben A. haemolyticum-Stämme, isoliert von einem Esel und Humanpatienten, 15 A. pluranimalium-Stämme, isoliert von Schafen, Rindern, einer Giraffe sowie einem Moschusochsen, 12 weitere Stämme verschiedener Herkunft mit Vertretern der vier neu beschriebenen Arten A. canis, A. phocisimile, A. pinnipediorum und A. wilhelmae zusammen mit den Referenzstämmen der bisher beschriebenen 9 Arcanobacterium- und Trueperella-Spezies untersucht. Die vier Spezies der Gattung Arcanobacterium, nämlich A. canis, isoliert von einem Hund, A. phocisimile und A. pinnipediorum, isoliert von Seehunden sowie A. wilhelmae, isoliert von einem Nashorn, konnten in der vorliegenden Studie auf der Basis eines polyphasisch-taxonomischen Ansatzes als neue Arten beschrieben werden. Die Untersuchungen umfassten eine vergleichende phylogenetische Analyse des 16S rRNA-Gens, die DNA-DNA-Hybridisierung, die Bestimmung der DNA-basierten Basenverhältnisse und chemo-taxonomische Untersuchungen wie Fettsäure-, Menachinon- und polare Lipidanalysen. Alle 34 untersuchten Stämme der Gattung Arcanobacterium, dies beinhaltete 6 unterschiedliche Spezies, wurden phänotypisch mit traditionellen mikrobiologischen Methoden, einschließlich morphologischer, physiologischer und biochemischer Eigenschaften, untersucht und zusätzlich mittels MALDI-TOF MS-Analysen charakterisiert. Die auf DNA-Ebene basierenden Untersuchungen umfassten eine 16S-rDNA-Sequenzanalyse, die Sequenzierungen der 16S-23S rDNA intergenic spacer-Region (ISR), des 23S rDNA-Gens sowie die Gene der B-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase, der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und des Elongationsfaktors tu, rpoB, gap und tuf. Die zusätzlich durchgeführte PCR-vermittelte Amplifikation von sieben Genen der potentiellen Virulenzfaktoren Arcanolysin, Phospholipase D, Hämolysin A, CAMP-Faktor-Family-Protein, Kollagenbindungsprotein, Neuraminidase A und Neuraminidase H der A. haemolyticum-Kulturen der vorliegenden Studie ermöglichte eine individuelle Stammcharakterisierung. Darüber hinaus konnte A. pluranimalium zusätzlich durch das speziesspezifische und neu beschriebene Pluranimaliumlysin kodierende Gen pla charakterisiert werden. Dies könnte helfen, die pathogene Bedeutung dieser mutmaßlichen Virulenzfaktoren bei bakteriellen Infektionen zu klären. A. haemolyticum ist bekannt für seine krankheitsverursachende Rolle beim Menschen, seltener bei Tieren. Da die A. pluranimalium, A. canis, A. phocisimile, A. pinnipediorum und A. wilhelmae Kulturen aus Mischkulturen mit verschiedenen anderen pathogenen und nichtpathogenen Bakterien isoliert wurden blieb die pathogene Bedeutung dieser Spezies bislang allerdings noch unklar.

Pannexin-1 (Panx1) ist ein Ionenkanal und gehört neben Pannexin-2 (Panx2) und Pannexin-3 (Panx3) zu einer Gruppe von drei Membranproteinen, die im Jahr 2000 erstmals beschrieben wurden. Aufgrund ihrer Struktur und Funktion ordnete man sie zunächst den Gap Junction-Proteinen zu. Spätere Untersu-chungen haben gezeigt, dass es sich bei den Pannexinen jedoch um Trans-membranproteine handelt, die den Stoffaustausch zwischen dem Zytosol einer Zelle und dem extrazellulären Raum ermöglichen. Panx1 wird ubiquitär exprimiert. Aufgrund seiner elektrophysiologischen Eigenschaften wird ihm eine Funktion im Rahmen vieler zellulärer Prozesse zugeschrieben. So ist der Panx1-Kanal u.a. an der Steuerung der zellulären Ca2+-Homöostase und der Weiterleitung von Ca2+-Wellen über mehrere Zellen hinweg beteiligt, interagiert mit purinergen Rezeptoren und initiiert auf diese Weise inflammatorische und apoptotische Prozesse. Im Herz-Kreislauf-System konnte bisher nachgewiesen werden, dass Panx1 zur Blutdruckregulation beiträgt und durch die Aktivierung myokardialer Fibroblasten die Bildung einer kardialen Fibrose einleitet. Diese Ergebnisse sowie die Auslösung Ca2+-unabhängiger Aktionspotentiale an isolierten Kardiomyozyten deuteten darüber hinaus auf einen Einfluss des Proteins auf kardiale Arrhythmien hin. Gegenstand des vorliegenden Projektes ist die Rolle von Panx1 im Rahmen einer experimentell ausgelösten Ischämie und Reperfusion am In-vivo-Modell der Panx1-defizienten Maus. Zu diesem Zweck wurden bei acht Panx1+/+- und zehn Panx1-/--Mäusen subkutan EKG-Transmitter implantiert und vor und nach Ischämie 24h-Elektrokardiogramme aufgezeichnet. Aus diesen konnten an-schließend Arrhythmien detektiert und die einzelnen Zeiten- und Streckenab-schnitte des EKGs, die Herzratenvariabilität sowie die Herzfrequenzturbulenz berechnet werden. Des Weiteren wurden vor und nach der Ischämie echokardiographische Untersuchungen durchgeführt, um die kardialen Funktionsparameter zu bestimmen. Die Ischämie und Reperfusion wurde im Sinne eines sog. Closed-Chest-Modells durchgeführt. Eine Katheterisierung über die rechte Arteria carotis communis mit dem Millar-Katheter stellte die systolischen und diastolischen Druckverhältnisse in der Aorta und im linken Ventrikel nach Ischämie dar. Am Ende der Versuchsreihe wurden die Infarktgrößen planimetrisch bestimmt. Die Panx1-/--Mäuse zeigten postischämisch signifikant mehr AV-Blöcke als die Panx1+/+-Mäuse. Die Zeiten- und Streckenanalyse brachte eine hochsignifikant verlängerte QTc-Zeit der Panx1-/--Mäuse hervor. Keine Signifikanzen zeigten sich beim Vergleich der HRV- und der HRT-Messwerte der Panx1+/+- und Panx1-/--Mäuse. Gleiches galt für die echokardiographisch erhobenen Funktionsparameter. Diese verschlechterten sich jedoch, ebenso wie die HRV-Parameter, bei beiden Genotypen signifikant nach der Ischämie und Reperfusion. Die Untersuchung mit dem Millar-Katheter ergab keine Unterschiede zwischen beiden Versuchsgruppen. Ebenso konnten hinsichtlich der Infarktgrößen der Panx1+/+- und Panx1-/--Mäuse keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Histologisch fand sich keine veränderte Herzstruktur bei fehlender Panx1-Expression. Zusammenfassend konnten Hinweise auf eine Reizleitungsstörung und eine signifikante Repolarisationsstörung der Panx1-defizienten Tiere nachgewiesen werden. Im Rahmen eines Infarktgeschehens hat die Deletion von Panx1 keinen Einfluss auf die Klinik, Funktion und die elektrophysiologischen Parameter. Die vorliegende Arbeit trägt damit zum besseren Verständnis der kardialen Funktion von Panx1 bei. Pannexin-1 (Panx1) is an ion channel protein first described in 2000. It belongs to the same group of transmembrane proteins as Pannexin-2 (Panx2) and Pannexin-3 (Panx3). Initially they were categorized as gap junction proteins. However, later studies have shown that the pannexins form transmembrane protein channels which allow the exchange of ions, ATP and other molecules between cytosol and extracellular space. Panx1 is expressed ubiquitously and, due to its electrophysiological properties, owns several cell-specific functions. Examples are the control of the intracellular calcium-homeostasis and the propagation of calcium waves across several cells, the interaction with purinergic receptors and the initiation of inflammatory and apoptotic processes. In the cardiovascular system, experiments showed that Panx1 contributes to blood pressure regulation and initiates cardiac fibrosis. These findings together with the induction of calcium-independent action potentials in isolated cardiomyocytes indicate the proteins impact on cardiac arrhythmias. This project focusses on the central role of Panx1 in an experimentally induced in-vivo-closed-chest ischemia and reperfusion model. For this purpose, ECG-transmitters were implanted subcutaneously into eight Panx1+/+- and ten Panx1-/--mice and 24h-ECGs were recorded before and after ischemia. Based on these electrocardiograms, cardiac arrhythmias, the different periods and sections of the heartbeats, the heart rate variability and the heart rate turbulence were detected. A echocardiographic examination provided information on the cardiac function. At the end of each experiment, blood pressure data from the right arteria carotis communis and the left cardiac ventricle were collected via a Millar-catheter. Furthermore, infarct sizes were measured by infarct planimetry. In comparison with Panx1+/+-mice, Panx1-/--mice showed significantly more AV blocks and a highly significant prolonged QTc-time after ischemia. No differ-ences could be detected comparing the HRV and the HRT of both genotypes as well as the cardiac function. However, both genotypes showed significantly reduced HRV and echocardiographic parameters after ischemia and reperfusion. The catheterization of the arteria carotis communis did not yield any different results between the genotypes. Furthermore, the infarct sizes of Panx1+/+- and Panx1-/--mice showed no differences and there was no hint at any modification of heart morphology in case of Panx1-deficiency. In summary, there was no evidence of any conduction disturbance and any significant repolarization disorder in Panx1-/--mice. Obviously, Panx1-deficiency has no influence on the symptoms and on the function and electophysiology in terms of myocardial infarction. The work presented here therefore contributes to a better understanding of car-diac function of Panx1.

Liver fibrosis is a wound healing process in case of repeated liver injury characterized by activation of hepatic stellate cells (HSCs) and excessive accumulation of extracellular matrix (ECM). Depending on the duration and the nature of injury, liver fibrosis can be reversible; via elimination of activated HSCs and degradation of ECM. In contrast to chronic liver injury efficient liver regeneration occurs following acute liver injury without fibrosis development. However, little is known about the state of HSCs following acute liver injury. Here, our goal was to investigate HSCs dynamics during liver injury and regeneration and to identify the mechanisms that protect against liver fibrosis. For this purpose, mouse models of acute (single dose of acetaminophen or carbon tetrachloride, CCl4) and chronic (repeated CCl4 intoxication) liver injury were used. Induction of acute liver injury by APAP or CCl4 lead to massive killing of the pericentral hepatocytes. This was associated with massive activation and infiltration of HSCs into the dead cell area. However, these activated HSCs were efficiently eliminated within a week following liver injury without fibrosis development. In contrast, moderate cell killing and activation of HSCs following repeated liver injury lead to massive accumulation of ECM and fibrosis. Next, we investigated the mechanisms of activated HSCs elimination during liver recovery following acute and chronic damage scenarios. As already known, a fraction of activated HSCs reverts back to a quiescent phenotype during fibrosis recovery and a further fraction undergoes apoptosis. This effect was associated with massive infiltration of macrophages and NK cells. In contrast, although massive infiltration of macrophages was also observed following acute liver damage at the time when activated HSCs were eliminated, there was no reversion or apoptosis. It seems that activated HSCs are eliminated via direct engulfment by macrophages. This was supported by prolonged presence of activated HSCs after macrophage depletion. However, this prolonged preserve was transient, since activated HSCs were also eliminated within two weeks after induction of acute liver injury. Further analysis identified a backup mechanism of infiltrating immune cells (mainly B, T, NK and dendritic cells) which trigger apoptosis of activated HSCs in absence of macrophages. In conclusion, the efficient macrophage response following acute liver injury prevents liver fibrosis. When macrophages are eliminated a backup mechanism of infiltrating immune cells becomes active and triggers apoptosis of activated HSCs. Die Leberfibrose ist Folge eines Wundheilungsprozesses bei wiederholten Leberbeschädigungen. Sie ist durch die Aktivierung von Sternzellen der Leber (HSC) und die übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix charakterisiert. In Abhängigkeit von Art und Intensität kann Leberfibrose reversibel sein. Im Gegensatz zu chronischer Leberschädigung regeneriert ein akuter Leberschaden ohne Fibrose. Allerdings ist nur wenig über die Bedeutung von HSC bei akuter Leberschädigung bekannt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den zeitlichen Verlauf der Aktivierung und Entfernung von HSC nach akuter Leberschädigung zu untersuchen und zu verstehen, warum in diesem Fall im Gegensatz zur chronischen Situation keine Fibrose entsteht. Um dieses Ziel zu erreichen wurden Mausmodelle mit akuter (einzelne hepatotoxische Dosen von Paracetamol oder CCl4) und chronischer (wiederholte Applikation von CCl4) eingesetzt. Die Verursachung akuter Leberschädigung durch Paracetamol oder CCl4 führte wie erwartet zu einer massiven zentrilobulären Nekrose von Hepatozyten. Dies ging mit einer massiven Aktivierung von HSC und deren Einwanderung in das nekrotische Areal einher. Allerdings waren diese aktivierten HSC bereits eine Woche nach Induktion der Leberschädigung nicht mehr nachweisbar. Im Gegensatz zur akuten Situation führte die wiederholte Leberschädigung zu einer starken Anhäufung extrazellulärer Matrix (ECM) und Fibrose. Daher wurde als nächstes untersucht, welche Mechanismen zur Eliminierung der HSC im akuten und chronologischen Schadensszenario führen. Wie bereits bekannt wurde bei chronischer Schädigung beobachtet, dass aktivierte HSC entweder in einen ruhenden Zustand oder in Apoptose übergehen. Dies war mit einer starken Infiltration von natürlichen Killerzellen (NKC) und Makrophagen vergesellschaftet. Im Gegensatz zur chronischen Schädigung wurde nach akuter Intoxikation ebenfalls eine starke Infiltration von Makrophagen aber keine Apoptose von HSC beobachtet. Weitere Untersuchungen ergaben starke Hinweise darauf, dass aktivierte HSC in dieser Situation durch direkte Phagozytose durch Makrophagen entfernt werden. Dies konnte durch Depletion der Makrophagen bestätigt werden, wodurch es zu einer verlängerten Präsenz der HSC kam. Trotz der verlängerten Präsenz kam es jedoch zu einer späteren Entfernung der HSC innerhalb von etwa zwei Wochen nach akuter Leberschädigung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass in diesem Zusammenhang andere Immunzellen als Makrophagen, nämlich B-, T-, NK- und dendritische Zellen eine Rolle spielen. In Abwesenheit von Makrophagen scheinen diese die apoptische Antwort der HSC zu verursachen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es bei akuter Leberschädigung zu einer sehr effizienten Entfernung von aktivierten HSC durch Makrophagen kommt, wodurch Leberfibrose verhindert wird. Falls diese Makrophagenantwort eliminiert wird, kommt es zu einem Ersatzmechanismus infiltrierender Immunzellen, wodurch Apoptose von HSC verursacht wird.

Die Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs) stellen beim Menschen eine Familie von Arzneistofftransportern mit insgesamt 11 Mitgliedern dar, die in verschiedenen Organen exprimiert werden und für die Aufnahme von exogenen und endogenen Substanzen in die entsprechenden Zellen verantwortlich sind. Die humanen OATP1B1- und OATP1B3-Transporter befinden sich nahezu ausschließlich in der Leber und vermitteln an der sinusoidalen Membran der Hepatozyten die Aufnahme von z.B. Billirubin, Gallensäuren, konjungierten Steroiden und Schilddrüsenhormonen aber auch von Arzneistoffen wie Statinen, Antibiotika, Zytostatika und ACE-Hemmern. Inzwischen wurden bei OATP1B1 und OATP1B3 zahlreiche Polymorphismen identifiziert, von denen einige auch von klinischer Relevanz sind. So führen bestimmte Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) zu einer verminderten Aufnahme von Statinen in die Hepatozyten, was beim Menschen eine Statin induzierten Myopathie hervorrufen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal Leberbiopsieproben aus einem größeren Patientenkollekiv von Hunden nach Polymorphismen in dem entsprechenden Transporter des Hundes (cfOatp1b4) hin untersucht. Neben der bereits zuvor beschriebenen cfOatp1b4 cDNA-Sequenz konnte lediglich eine neue polymorphe Variante (693 A>G & 1186 A>G) des cfOatp1b4 isoliert werden. Bei einigen Tieren wurde dieser Haplotyp auch heterozygot nachgewiesen. Damit stellte sich der cfOatp1b4, anders als erwartet, nicht so polymorph dar wie die Lebertransporter OATP1B1 und OATP1B3 des Menschen. Unterschiede in der Expression des cfOatp1b4 in der Leber des Hundes wurden mit der Real-time PCR untersucht. Hierbei zeigten sich kaum Unterschiede zwischen den einzelnen Hunden, ebensowenig zwischen den beiden cfOatp1b4-Varianten, sodass die Expression des cfOatp1b4 als konstant hoch angesehen werden kann und der gefundene polymorphe Haplotyp keine Auswirkung auf die mRNA-Expression des cfOatp1b4 zu haben scheint. Die funktionelle Charakterisierung der gefundenen cfOatp1b4-Varianten stellte sich im Zellkulturmodell trotz verschiedener Versuchsansätze als problematisch dar. Durch Immunfluoreszenz und Western Blot konnte gezeigt werden, dass dies auf eine unzureichende Proteinsyntheserate zurückzuführen ist. Die Ursache hierfür ließ sich in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht klären. Aus diesem Grund wurden als weiteres Expressionsmodell Xenopus laevis Oozyten verwendet. Hierbei zeigten beide cfOatp1b4-Varianten eine Aufnahme von BSP, E1S und TC, wobei die BSP-Aufnahme der polymorphen Variante signifikant höher war, als die des Wildtyps. Für CCK8 konnte lediglich für den Oatp1b4-Wildtyp ein Transport nachgewiesen werden, nicht jedoch für Oatp1b4*. Ebenfalls zeigten beide Oatp1b4-Varianten eine Aufnahme des Herzglykosids Digoxin. Neben den ausführlichen Untersuchungen des caninen Oatp1b4 Transporters erfolgte auch die Erstklonierung der Oatp1b4-Transporter von Katze, Pferd und Schwein. Des Weiteren wurde für den bovinen Oatp1b4 Transporter das Zellkultursystem als weiteres Expressionsmodel zur Untersuchung seiner Funktionalität etabliert. Bei der vergleichenden Darstellung zu den humanen Transportern OATP1B1 und OATP1B3 konnte an ausgewählten Modellsubstraten gezeigt werden, dass der bovine Oatp1b4 Transporteigenschaften beider humaner Transporter vereinigt. The organic anion transporting polypeptides (OATPs) are a family of transporters which mediate the uptake of different kind of substrates into cells. The liver specific transporters OATP1B1 and OATP1B3 mediate the uptake of endogenous substrates like bile acids, thyroid hormones or eicosanoids as well as drugs like antibiotics, anticancer drugs or statins into hepatocytes. Many sequence variants were found in the past especially for OATP1B1. Some of these single nucleotide polymorphisms (SNPs) result in modified transport activity which can be important for medical therapies with some drugs like statins. The aim of this current study was to have a closer look on the canine Oatp1b4 transporter. Many samples of canine liver tissue were collected in cooperation with the veterinarian clinic at Justus-Liebig-University Giessen and were searched for polymorphisms in the sequence of Oatp1b4. Besides the already known variant we could find a polymorphic variant with two SNPs (693 A>G & 1186 A>G). Some of the dogs were heterozygous others were homozygous for this haplotyp. So the canine Oatp1b4 transporter wasn’t that polymorphic as it was suspected before. The expression of Oatp1b4-mRNA in liver was measured by real time PCR and showed low variation between the dogs as well as between the two Oatp1b4 variants. So we can state that the SNPs found in canine Oatp1b4 have no effect on the mRNA expression level. Funcional characterization of both canine Oatp1b4 variants was first performed in cell culture. But despite different types of experimental setups no reliable data could be archieved. Western blot analysis and immunofluorescent microscopy revealed low rates of protein synthesis only for the cfOatp1b4, but not for rat Oatp1b2 for unknown reason. So we decided to use Xenopus laevis oocytes as additional expression system. Uptake experiments showed transport of BSP, E1S and TC. The uptake of BSP of the polymorphic cfOatp1b4 variant was significantly higher compared to cfOatp1b4 wildtype. CCK8 was only transported by cfOatp1b4 wildtype but not by the polymorphic variant. Both variants also showed an uptake of digoxin. Furthermore we were the first to clone the Oatp1b4 transporters of cat, horse and pig out of liver tissues and established a cell system as expression model for bovine Oatp1b4. Experiments with bovine Oatp1b4 showed overlapping transport activity with OATP1B1 as well as OATP1B3 while using model substrates for these transporters.

Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. 40 % der Todesfälle in Deutschland lassen sich darauf zurückführen. Nicht selten liegen der Erkrankung hereditäre Ursachen, wie Fehlfunktionen von Ionenkanälen des Herzmuskels, zugrunde. Für unsere Untersuchungen liegen uns zwei Mauslinien vor, bei denen jeweils ein Gen (TASK-1 bzw. Pannexin-1) ausgeschaltet ist. TASK-1 ist einer der vier wichtigsten K2P Hintergrund-Kaliumkanäle am Herzen. Mutationen dieser Kaliumkanäle können durch Beeinflussung der kardialen Repolarisation das Risiko für Arrhythmien und den plötzlichen Herztod erhöhen. Bei der Analyse von unter Avertin®- bzw. Pentobarbitalnarkose aufgenommenen EKGs zeigt sich bei TASK-1-/- -Mäusen eine signifikante Verlängerung der QT- und frequenzkorrigierten QTc-Intervalle. Einzig unter Isoflurannarkose ist bezüglich dieser Intervalle kein Unterschied zwischen beiden Genotypen erkennbar, was möglicherweise mit der Aktivierung diverser Ionenkanäle durch Isofluran in Zusammenhang steht. Untersuchungen der Heart Rate Turbulence (HRT), die als Prädiktor für den plötzlichen Herztod gilt, machen offensichtlich, dass eine TASK-1-Defizienz die HRT beeinflusst. Weiterhin führt eine elektrophysiologische Untersuchung (EPU), bei der veränderte Überleitungs- und Refraktärzeiten und Arrhythmien nach Burststimulationen aufgezeigt werden sollen, zu keinem Unterschied zwischen TASK-1+/+ - und TASK-1-defizienten Mäusen. Es zeigt sich also, dass TASK-1 als Hintergrund-Kaliumkanal bei der ventrikulären Repolarisation eine Rolle spielt. Bei Pannexin-1, der als einziger der 3 Pannexinkanäle ubiquitär nachweisbar ist, handelt es sich um einen Hemichannel. Weder beim Vergleich anthropometrischer Daten, noch bei der histopathologischen oder echokardiographischen Untersuchung stellen sich Unterschiede zwischen Pannexin-1+/+ - und Pannexin-1-defizienten Mäusen dar. Die Analyse von EKGs wacher, sowie mit Isofluran und Avertin® narkotisierter Mäuse, ergibt jeweils verlängerte QT- sowie frequenzkorrigierte QTc-Intervalle bei Pannexin-1-/- -Mäusen. Bei letzteren treten besonders unter niedrigen Herzfrequenzen im Langzeit-EKG vermehrt AV-Blöcke auf, die bei körperlicher Betätigung verschwinden. Bei allen Pannexin-1-defizienten Mäusen war nach einer Burststimulation Vorhofflimmern induzierbar, während keine einzige Wildtypmaus dies zeigte. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass Pannexin-1 am Herzen verschiedene elektrophysiologische Parameter, wie die De- und Repolarisation und die atriale Vulnerabilität beeinflusst.

In the present study T. pyogenes isolated from milk of mastitic dairy cattle (n=57, n=1), from genital tract of metritic and apparently healthy dairy cattle (n=14) and from fatal infections of three grey slender lorises (n=3) together with 12 reference strains representing ten species of genera Trueperella and Arcanobacterium could be identified and characterized individually by using phenotypical methods, by MALDI-TOF MS fingerprinting, by FT-IR spectroscopy and by various genotypic techniques investigating the molecular targets 16S rRNA, ISR, sodA and gap. The genotypic techniques also included the amplification of the putative virulence factor encoding genes plo, cbpA, nanH, nanP, fimA, fimC, fimE and tet(W). A collection of the investigated T. pyogenes from milk of mastitic dairy cattle were subjected to epidemiological studies using MLSA and the T. pyogenes from fatal infections of three grey slender lorises using rep-PCRs RAPD-PCR and MLSA. The T. pyogenes of mastitic origin were isolated in a period of 3 years and were mainly isolated together with various other bacteria from milk of mastitic dairy cattle with varying clinical symptoms. However, T. pyogenes seemed to be the major causative agent. The phenotypic properties, also including MALDI-TOF MS analysis and the newly described FT-IR spectroscopy and the genotypic methods, allowed a reliable identification and further characterization of the bacteria of this origin. The T. pyogenes of mastitis origin possessed several putative virulence factor encoding genes in varying combinations. These results together with the genomic fingerprinting with a newly established MLSA revealed that bovine mastitis in farms caused by T. pyogenes is mainly caused by individual bacterial clones without relation to each other. The 14 T. pyogenes isolated from genital tract of metritic and apparently healthy dairy cattle and from the three grey slender lorises could also be identified phenotypically and genotypically. However, the distribution of virulence factor encoding genes of the T. pyogenes isolated from bovine genital tract revealed no significant differences between diseased and apparently healthy animals indicating that additional criteria might be responsible for onset and etiopathology of bovine metritis. In contrast to the T. pyogenes from mastitis origin and from bovine genital tract the three T. pyogenes isolated from grey slender lorises displayed identical phenotypical and genotypical properties. The latter could also be demonstrated by genomic fingerprinting using three different rep-PCRs, by RAPD-PCR and by MLSA. These results showed that the fatal infection of the three grey slender lorises were caused by a cross infection of a single T. pyogenes clone. However, the route of infection of the three grey slender lorises at Frankfurt Zoo remains unclear. In the present study T. pyogenes of bovine and grey slender lorises origin could reliably be identified by several phenotypic and genotypic methods and further characterized by determination of putative virulence factor encoding genes and by novel DNA fingerprinting procedures. All these techniques might help to improve a future identification and characterization of T. pyogenes and might help to determine epidemiological relationships of these bacteria in animal or human infections. In der vorliegenden Studie wurden 57 Trueperella (T.) pyogenes-Stämme, isoliert aus Milch von an Mastitis erkrankten Milchkühen (n=57, n=1), T. pyogenes-Stämme, isoliert aus dem Genitaltrakt von an Metritis erkrankten und offensichtlich gesunden Milchkühen (n=14) und drei T. pyogenes- Stämme, isoliert von tödlichen Infektionskrankheiten von drei Grauen Schlankloris, zusammen mit 12 Referenzstämme von zehn Arten der Gattungen Trueperella und Arcanobacterium mithilfe phänotypischer Methoden, durch MALDI-TOF MS und FT-IR-Spektroskopie und durch verschiedene genotypische Techniken durch Nachweis der molekularen Zielstrukturen 16S rRNA, ISR, sodA und gap untersucht. Die genotypischen Methoden enthielten desweiteren die Amplifizierung der mutmaßlichen Virulenzfaktor-kodierenden Gene plo, cbpA, nanH, nanP, fimA, fimC, fimE und tet(W). Eine Auswahl der untersuchten T. pyogenes-Stämme, isoliert von Milch von Kühen mit Mastitis, wurde in epidemiologischen Untersuchungen mittels MLSA und die T. pyogenes, isoliert von tödlichen Infektionen der drei Grauen Schlankloris, mittels rep-PCR, RAPD-PCR und MLSA weitergehend analysiert. Die aus Mastitis isolierten T. pyogenes-Stämme wurden überwiegend zusammen mit verschiedenen anderen Bakterienarten aus der Milch von Kühen mit Mastitis mit unterschiedlicher klinischen Symptomatik in einem Zeitraum von 3 Jahren isoliert. T. pyogenes schien bei den Mastitisfällen allerdings der Hauptinfektionserreger zu sein. Die phänotypischen Untersuchungen, darunter auch die MALDI-TOF MS-Analysen und die neu beschriebene FT-IR-Spektroskopie und die genotypischen Verfahren, erlaubten eine zuverlässige Identifizierung und weitergehende Charakterisierung der Bakterien diesen Ursprungs. Die T. pyogenes-Isolate mit Herkunft Mastitis besaßen mehrere mutmaßlich Virulenzfaktor-kodierende-Gene in unterschiedlichen Kombinationen. Diese Ergebnisse, zusammen mit dem DNA-Fingerprinting in einer neu etablierten MLSA, ergaben, dass T. pyogenes-Mastitiden in Betrieben hauptsächlich von unterschiedlichen Erregerklonen ohne Beziehung zueinander verursacht werden. Die 14 T. pyogenes-Stämme die aus dem Genitaltrakt von an Metritis-erkrankten und offensichtlich gesunden Milchkühen sowie von den drei Grauen Schlankloris isoliert wurden, konnten ebenso phänotypisch und genotypisch identifiziert werden. Das Vorkommen der Virulenzfaktor-kodierenden Gene bei T. pyogenes, isoliert aus dem Genitaltrakt von Rindern, ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen kranken und offensichtlich gesunden Tieren, sodass zusätzliche Kriterien für die Entstehung und den Krankheitsverlauf von Rindermetritiden verantwortlich zu sein scheinen. Im Gegensatz zu den T. pyogenes-Stämmen, isoliert von Kühen mit Mastitis und aus dem Genitaltrakt von Rindern, zeigten die drei T. pyogenes-Isolate, isoliert von den Grauen Schlankloris identische phänotypische und genotypische Eigenschaften. Letzteres konnte auch durch DNA-Fingerprinting unter Verwendung von drei verschiedenen rep-PCRs, durch RAPD-PCR und durch MLSA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die tödlichen Infektionen der drei Grauen Schlankloris durch eine Kreuzinfektion mit einem einzelnen T. pyogenes-Klons verursacht wurden. Der Weg der Infektion der drei Grauen Schlankloris im Frankfurter Zoo bleibt allerdings unklar. In der vorliegenden Studie wurden T. pyogenes-Isolate, isoliert von Rindern und von Grauen Schlankloris, durch unterschiedliche phänotypische und genotypische Verfahren identifiziert und durch Bestimmung mutmaßlicher Virulenzfaktor-kodierender Gene und durch neue DNA-Fingerprinting-Verfahren weitergehend charakterisiert. Diese Techniken könnten helfen in Zukunft die Identifizierung und Charakterisierung von T. pyogenes zu verbessern und epidemiologische Zusammenhänge bei tierischen oder menschlichen Infektionen mit diesen Bakterien eingehender zu analysieren.

Die Makrozyklischen Laktone (ML), zu unterscheiden in Avermectine (z.B. Ivermectin (IVM), Selamectin und Doramectin) und Milbemycine (z.B. Moxidectin (MOX), Milbemycinoxim (MIL)), stellen in der Veterinärmedizin häufig gebrauchte Antiparasitika dar. Im Parasiten führen sie durch die Öffnung von Glutamat- und GABA-gesteuerten Chloridkanälen zu einer schlaffen Paralyse. Die Anwendung ist beim Säuger dagegen durch die Barrierefunktion der Blut-Hirn-Schranke (BHS), an der P-Glycoprotein (Pgp) als Efflux-Transporter die ML unter ATP-Verbrauch aus dem ZNS zurück in das Blutkompartiment pumpt, sehr sicher. Allerdings zeigen insbesondere Hunde der Rasse Collie häufig Vergiftungssymptome nach der Gabe von IVM. Ursache dafür ist eine 4 Basenpaar-Deletion im MDR1-Gen des Hundes (nt230(del4)), welche zu einer unvollständigen Translation des Proteins führt. In gezielt durchgeführten Studien zeigte sich, dass die neurotoxische Wirkung je nach eingesetzter Substanz sehr differierte. So wurde die Gabe von 1 mg/kg MOX von MDR1-defekten Collies gut toleriert, während IVM in der gleichen Dosierung schon Vergiftungsanzeichen hervorrief. Ziel dieser Arbeit war es, die Gehirnkonzentrationen bei fehlendem Pgp für IVM, MOX und MIL zu ermitteln und deren Neurotoxizität zu messen, um eine Aussage über das unterschiedliche neurotoxische Potenzial der einzelnen ML treffen zu können. Als Tiermodell standen Mäuse der CF-1-Linie, die eine natürliche Mutation im mdr1a-Gen aufweisen, sowie mdr1a,b-Doppelknockout Mäuse zur Verfügung. Bei fehlendem Pgp penetrieren IVM und MOX nach Applikation von 0,2 mg/kg vergleichbar in das ZNS, MIL dagegen nur zu 20%. Vergleichbare Werte erreichte man für MIL erst nach Applikation der therapeutischen Dosierung von 2,5 mg/kg. Bei den Applikationsstudien an Wildtyp Mäusen mit intakter BHS stellte sich heraus, dass IVM die geringsten, MOX mittlere und MIL die höchsten Gehirnkonzentrationen aufweist. Somit hat IVM die höchste und MIL die geringste Affinität zu Pgp. Die Neurotoxizität wurde mit Hilfe eines neuen Rotarod-Setups gemessen und verglichen. Es zeigte sich, dass eine höhere Dosierung von MOX (0,7 mg/kg) und MIL (40 mg/kg) als von IVM (0,35 mg/kg) benötigt wird, um eine vergleichbare Beeinträchtigung der Laufperformance auf dem Rotarod zu erreichen. Verantwortlich dafür ist vermutlich die unterschiedliche Interaktion der einzelnen ML mit dem GABAA-Rezeptor. In weiteren Untersuchungen muss geklärt werden, ob dafür eine unterschiedliche Affinität oder die intrinsische Aktivität an dem Rezeptor verantwortlich ist. In veterinary medicine macrocyclic lactones (ML), to be differentiated in avermectines (eg ivermectin (IVM), selamectin and doramectin) and milbemycines (eg moxidectin (MOX), milbemycinoxime (MIL)), are commonly used anti-parasitic drugs. In parasites they lead to a flaccid paralysis due to the opening of glutamate- and GABA-gated chloride ion channels. In contrast, the ML have a wide margin of safety in mammals at therapeutic dosage. At the blood-brain barrier (BBB) P-glycoprotein (Pgp), an ATP-driven efflux pump, is highly expressed and therefore restricts the ML-entry into the central nervous system (CNS). However, in many dog breeds such as the Collie signs of neurotoxicosis appeared after application of IVM. Responsible for this intolerance is a 4 base pair deletion in the MDR1 gene of the dog (nt230(del4)), which results in an incomplete translation and the expression of a non-functional Pgp. Studies showed that the neurotoxic effect varied depending on the substance applied. The administration of 1 mg / kg MOX was well tolerated, whereas IVM had caused poisoning signs at the same dose. The aim of this work was to determine the brain concentrations in the absence of Pgp for IVM, MOX and MIL and to measure their neurotoxicity in order to make a conclusion about the different neurotoxic potential of each ML. Mice of the CF-1 line, which have a natural mutation in the mdr1a gene, as well as mdr1a,b-double knockout mice were used. In the absence of Pgp, IVM and MOX comparably penetrate into the CNS after administration of 0.2 mg/kg, MIL only to 20%. Comparable penetration values for MIL are reached after application of the therapeutic dose of 2.5 mg/kg. In the wildtype mice with an intact BBB, application studies showed that IVM has the lowest, MOX some more and MIL the highest brain concentrations. Thus, it seems that IVM has the highest and MIL the lowest affinity for Pgp. Neurotoxicity was measured and compared using a newly designed rotarod setup. It was found that higher doses of MOX (0.7 mg/kg) and MIL (40 mg/kg) are required as of IVM (0.35 mg/kg) to reach a similar impairment of the running performance on the rotarod. This seems to be due to the different interaction of each ML with the GABAA receptor. Further studies are needed to find out whether a different affinity or the intrinsic activity to the receptor are responsible for this difference.

SLC10A4 wurde im Jahre 2004 als ein neues Mitglied der SLC10-Familie identifiziert. NTCP und ASBT sind die Gründungsmitglieder der SLC10-Familie und verantwortlich für die Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der GS. SLC10A4 besitzt die höchste Sequenzidentität (29,7 %) zu dem Gallensäuretransporter der Leber, NTCP. Außerdem weist SLC10A4 eine zu NTCP, ASBT und SOAT identische Membrantopologie auf, mit sieben oder neun Transmembrandomänen und einem extrazellulären N-Terminus und zytoplasmatischen C-Terminus. Jedoch handelt es sich bei SLC10A4 um ein neuronales Protein, dessen höchste Expression im Gehirn vorliegt. Auf subzellulärer Ebene wird SLC10A4 in synaptischen Vesikeln cholinerger und monoaminerger Neurone des zentralen und peripheren Nervensystems und in Mastzellen exprimiert. Das Ziel dieser Arbeit war es die bisher unbekannte Funktion von SLC10A4 zu untersuchen. Die Zugehörigkeit zu einer Transporterfamilie und die beschriebene Lokalisation führten zu der Hypothese, dass es sich bei SLC10A4 um einen Transporter für Neurotransmitter oder deren Intermediate handeln könnte. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit, die plasmamembranständigen Neurotransmittertransporter DAT, CHT1 und SERT und die vesikulären Neurotransmittertransporter VAChT und VMAT2, als Positivkontrollen für ein funktionierendes Expressionssystem, kloniert. Nach transienter oder stabiler Transfektion in HEK293-Zellen und in Xenopus laevis Oozyten wurden Transportmessungen mit radioaktiv-markierten Kandidatensubstraten durchgeführt. Die Gallensäure TC und die Steroidsulfate DHEAS, PREGS und E1S gehören in das Substratspektrum von NTCP, jedoch nicht in das von SLC10A4. Die Neurotransmittertransporter DAT, CHT1 und SERT zeigten eine Na+-abhängige und Inhibitor-sensitive Aufnahme ihrer spezifischen Substrate und auch VMAT2 konnte in den nicht-neuronalen HEK293-Zellen charakterisiert werden. Jedoch konnte für SLC10A4 kein signifikant reproduzierbarer Transport für Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, Histamin, Cholin, Acetat, Acetylcholin, Glutamat, Aspartat und GABA gemessen werden. Die kürzlich publizierten Daten über eine Protease-aktivierbare Transportaktivität von SLC10A4 für die GS LC und TC konnte in den SLC10A4-HEK293-Zellen nicht bestätigt werden. Überraschenderweise wurde nach langen Inkubationszeiten eine verminderte ATP-Akkumulation in SLC10A4-HEK293-Zellen festgestellt. Dieses Ergebnis bedarf einer weiteren Aufklärung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein B6.129S5-Slc10a4tm1Lex Knockout-Mausmodell etabliert und erfolgreich auf den C57BL/6 Inzuchtstamm rückgekreuzt, um Hinweise auf die physiologische Rolle von SLC10A4 zu erhalten. Die Deletion des mSlc10a4-Gens wurde auf DNA-, RNA- und Proteinebene bestätigt und das Knockout-Mausmodell steht jetzt für phänotypische Untersuchungen zur Verfügung. SLC10A4 was identified in 2004 as a novel member of the solute carrier family SLC10. NTCP and ASBT are the founding members of this carrier family and are responsible for the maintenance of the enterohepatic circulation of bile acids. SLC10A4 has the highest sequence identity (29.7 %) with the bile acid transporter of the liver, NTCP. In addition, SLC10A4 exhibits an identical membrane topology to NTCP, ASBT and SOAT with seven or nine transmembrane domains and an extracellular N -terminus and a cytoplasmic C -terminus. However, SLC10A4 is a neuronal protein whose highest expression is present in the brain. At the subcellular level SLC10A4 is expressed in synaptic vesicles of cholinergic and monoaminergic neurons of the central and peripheral nervous system and in mast cells. The aim of the present study was to investigate the so far unknown function of SLC10A4. The affiliation to a transporter family and the localization described above led to the hypothesis that SLC10A4 might be a transporter for neurotransmitters or for their intermediates. Therefore, in the context of this work the plasma membrane-associated neurotransmitter transporter DAT, SERT and CHT1 and the vesicular neurotransmitter transporter VAChT and VMAT2 were additionally cloned and used as positive controls for an efficient expression system. After transient or stable transfection in HEK293 cells and in Xenopus laevis oocytes transport measurements were performed with radioactively labeled candidate substrates. The bile acid TC and the steroid sulfates DHEAS, PREGS and E1S belong to the substrate spectrum of NTCP, but not to that of SLC10A4. The neurotransmitter transporter DAT, SERT and CHT1 showed a Na+-dependent and inhibitor-sensitive uptake of their specific substrates and also VMAT2 was characterized in non-neuronal HEK293 cells. However, no significant reproducible transport of dopamine, serotonin, norepinephrine, histamine, choline, acetic acid, acetylcholine, glutamate, aspartate and GABA was detectable for SLC10A4. The recently published data for SLC10A4 to be a protease-activated transporter for the bile acids LC and TC was not confirmed in the SLC10A4-HEK293 cells. Surprisingly, a reduced ATP accumulation in SLC10A4-HEK293 cells was noted after long incubation times. This effect requires further investigation. In this work a B6.129S5-Slc10a4tm1Lex knockout mouse model was established and successfully backcrossed to the C57BL/6 inbred strain to obtain evidence on the physiological role of SLC10A4. The deletion of the mSlc10a4 gene was confirmed on DNA, RNA and protein level. Now, this mouse model is available for phenotypic analysis.

SLC10A5 wurde nach seiner Entdeckung aufgrund von Sequenzhomologie in die SLC10-Familie, auch Familie der Na+-abhängigen Gallensäuretransporter genannt, eingeordnet. Er wurde als potenzieller Gallensäuretransporter angesehen, da sich zusätzlich sein Expressionsprofil, das die höchsten Werte in Leber, Niere und Magen-Darm-Trakt zeigte, mit den gut charakterisierten Gründungsmitgliedern NTCP und ASBT überschnitt, welche zusammen den enterohepatischen Kreislauf der Gallensäuren aufrechterhalten. Jedoch wurde bislang keine Transportaktivität für Gallensäuren aufgezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig die Lokalisation und Funktion des SLC10A5 näher untersucht. Das SLC10A5-Protein von Mensch, Maus und Ratte wurde in transfizierten HEK293- und HepG2-Zellen intrazellulär im Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat nachgewiesen. Die Lokalisation auf subzellulärer Ebene konnte im Gewebe nicht abschließend geklärt werden, da zwei eingesetzte kommerzielle Antikörper gegen das humane SLC10A5-Protein keine spezifische Bindung aufwiesen und ein gegen den C-Terminus des SLC10A5 der Ratte generierter Antikörper in Immunhistologie- und Western-Blot-Analysen an Ratten- und Mausgewebe Mitochondrien markierte, jedoch auch mit dem Gewebe der Slc10a5-Knockoutmaus reagierte. In vitro konnte an mit humanem SLC10A5-V5-transfizierten HEK293-Zellen weder mit radioaktiv- noch mit fluoreszenzmarkierten Gallensäuren eine Transportfunktion nachgewiesen werden. Mit der Slc10a5-Knockout-Maus (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) stand jedoch ein In-vivo-Modell zur Aufklärung der physiologischen SLC10A5-Funktion zur Verfügung. Unter Standardhaltungsbedingungen zeigten die homozygot-defekten Mäuse allerdings keinen auffälligen Phänotyp, sondern waren trotz geringfügig geringeren Körpergewichts gesund und fertil. Durch einwöchige Fütterung mit 0,5 % Cholsäure-haltiger Diät konnten signifikante Unterschiede zwischen den Slc10a5-Knockout-Mäusen und den C57BL/6N-Kontroll-Mäusen induziert werden. Die Gallen- und Plasmazusammensetzung wurde mittels UHPLC-MS/MS bestimmt. Unter Kontrollfütterung glichen sich Gallemenge, Gallensäure-, Phospholipid und Cholesterinkonzentrationen und ließen sich durch die Fütterung mit Cholsäure bei beiden Genotypen erhöhen. Jedoch schieden die Knockout-Mäuse bei gleicher Gesamtgallensäurekonzentration zwanzig Mal soviel unkonjugierte Gallensäuren wie die Wildtypmäuse aus, was auf eine begrenzte Fähigkeit hindeutet, Gallensäuren zu rekonjugieren. Zusätzlich verschob sich das bei Kontrollfütterung zwischen den Genotypen gleiche Verhältnis der Gallensäuren mit Taurocholat, Tauromurocholat, Tauro-7-Deoxycholat und Taurodeoxycholat als Hauptgallensäuren durch die Fütterung mit Cholsäure. Taurocholat stellte weiterhin den größten Anteil dar, aber während bei den Wildtyp-Mäusen Taurodeoxycholat circa ein Viertel der Gallensäuren ausmachte, sank der Anteil bei den Knockout-Mäusen auf unter 1 %, welche dafür zu etwa einem Viertel Cholat und einen vermehrten (Tauro-)7-oxo-Deoxycholat-Gehalt aufwiesen. Einher gingen diese Cholsäure-induzierten Veränderungen mit einer Hyperämie und Schwellung des Dünndarms bei den Knockout-Mäusen. Bei Standardhaltung der Slc10a5-Knockout-Mäuse konnten keine Unterschiede in der Genexpression von Gallensäuretransportern oder der in Synthese und Metabolismus involvierten Enzyme in einer genomweiten Array-Analyse der Leber-RNA detektiert werden. Die Cholsäurefütterung induzierte Anpassungen der Genexpression in beiden Genotypen, jedoch nur geringe Expressionsunterschiede zwischen den Knockout- und Wildtypmäusen, welche nicht in der Lage sind, den beschriebenen Phänotyp zu erklären. Ein Einfluss des SLC10A5 auf den Prozess der Rekonjugation von Gallensäuren in der Leber ist somit wahrscheinlich, jedoch muss seine physiologische Funktion – auch in den anderen hoch-exprimierenden Geweben – weiter aufgeklärt werden. After its discovery SLC10A5 was classified as a member of the SLC10-family (family of sodium-dependent bile acid transporters) due to sequence homology. It was regarded as a potential bile acid transporter because its expression profiles, showing the highest expression in liver, kidney, and the gastro intestinal tract, greatly overlapped with NTCP and ASBT that together build up the enterohepatic circulation of bile acids. However, no transport activity for bile acids has been shown yet. In the present thesis the localization and function of SLC10A5 was examined for the first time. The SLC10A5 protein of human, mouse, and rat was sorted intracellular into the endo-plasmic reticulum and the golgi apparatus when transiently transfected in HEK293 and HepG2 cells. Subcellular localization could not be finally evaluated due to unspecific binding of two commercial antibodies. In addition, a custom made antibody raised against the C-terminus of the rat‘s SLC10A5 protein specifically marked mitochondria in immunohistology and Western Blot analysis of rat and mouse tissue but also reacted with tissue of the Slc10a5 knockout mouse. In vitro no transport function in SLC10A5-V5 transfected HEK293 cells could be observed, neither with radioactive nor fluorescent bile acids. However, the Slc10a5 knockout mouse (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) represented an in vivo model to study the physiological function of SLC10A5. Under standard conditions the homozygous knockout mice showed no phenotype though, but were instead healthy and fertile with only slightly decreased body weight. One week of 0.5 % cholic acid feeding induced significant differences between the Slc10a5 knockout mice and the C57BL/6N control strain. Bile and plasma composition was measured by UHPLC-MS/MS. Fed the control diet, the total amount of bile, bile acid, phospholipid and cholesterol concentrations were similar in both genotypes but increased with cholic acid feeding. Cholic acid fed Slc10a5 knockout mice, however, excreted 20-fold more unconjugated bile acids into the bile than the wildtype control group, although the overall bile acid concentration of the bile was identical between both strains, pointing to limited bile acid reconjugation. Furthermore, the equal ratio of bile acids between the different genotypes during control diet feeding (with taurocholate, tauromurocholate, tauro-7-oxo-cholate, and taurodeoxycholate as main bile acids) shifted after cholic acid feeding. Taurocholate still made up for the main proportion of bile acids, but while taurodeoxycholate counted for one fourth of total bile acids in the wildtype mice the amount decreased to less than 1 % in the knockout mice. Instead, the knockout mice excreted about one fourth unconjugated cholate und increased amounts of (tauro) 7-oxo-deoxycholate. These observations went together with cholic acid induced hyperaemia and swelling of the small intestinal wall of the knockout mice. Under standard conditions no differences in gene expression of bile acid transporters or enzymes involved in synthesis and metabolism of bile acids were detected using a whole genome array analysis of liver RNA. Cholic acid feeding induced changes in both genotypes with slight differences between knockout and wildtype mice, but could not explain the indicated phenotype of knockouts. This leads to the hypothesis that SLC10A5 is involved in the reconjugation of bile acids in liver. However, its physiological role – also in the other highly expressing tissues – has to be further examined.

Die vorliegende Arbeit stellt einen aktuellen, zusammenfassenden Überblick über die Polymorphismen in den Cytochrom-P450-Enzymen des Hundes dar. Es wurde dabei nicht, wie bei vorangegangenen Studien, eine einheitliche Beagle-Population untersucht. Vielmehr stellte die Testgruppe je nach spezifischer Fragestellung ein Patientengut von mindestens 20 verschiedenen Hunden unterschiedlicher Rassen dar, welche als Patienten in der Klinik für Kleintiere der JLU Gießen vorgestellt wurden. Das genetische Material dieser Hunde wurde aus Lebergewebe gewonnen und mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden (PCR, real-time PCR und Sequenzierung) auf Variationen in den Sequenzen und im Expressionsniveau der Cytochrom-P450-Enzyme 1A2, 2B11, 2C21, 2C41, 2D15 und 3A12 untersucht. Einige dabei gefundene Polymorphismen wurden bereits in der Literatur erwähnt, z.B. der Gendeletions-Polymorphismus im CYP2C41-Gen (Blaisdell et al. 1998). Es konnte festgestellt werden, dass aus einer Gruppe von 441 Hunden verschiedener Rassen nur bei 14,74 % das CYP2C41-Gen nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurden erstmals die Exon-Intron-Grenzen des CYP2C41-Gen des Hundes bestimmt, seine komplette genomische Sequenz ermittelt und diese in der GenBank-Sequenzdatenbank hinterlegt. Auffällig war die Tatsache, dass alle auf das Vorhandensein des CYP2C41-Gens getesteten Hunde der beiden Rassen Husky und Shar Pei das Gen tatsächlich aufwiesen, was sich durch den Umstand erklären könnte, dass beide Rassen genetisch gesehen recht urtümlich sind und eine nahe Verwandtschaft zum Wolf aufweisen. Das CYP2C41-Gen scheint dann im Laufe der Zeit in den meisten Rassen mehr oder weniger aus dem Genom verschwunden zu sein. Zur Evaluation der eventuellen klinischen Relevanz und um eine evolutionsbiologische Erklärung des Gendeletions-Polymorphismus zu erlangen, wären anschließende funktionelle Tests sinnvoll. In allen anderen fünf untersuchten CYPs konnten teils einzelne (CYP2C21), teils eine große Zahl (CYP2D15) an Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) entdeckt werden. Die meisten dieser SNPs stellten sich als stille Mutationen dar, bei denen mit keiner negativen Beeinflussung der CYP-Enzymfunktion zu rechnen ist. Einzelne SNPs wurden bioinformatisch mittels SIFT, einem Programm, das unterscheidet, ob ein Aminosäureaustausch (ASA) im korrespondierenden Protein für dessen Funktion tolerierbar ist oder nicht, als „nicht-tolerierbar“ bewertet. Da diese Bewertung aber nur einen vagen Anhaltspunkt für die mögliche funktionelle Relevanz gibt, müssen auch hier weitere funktionelle Untersuchungen folgen. Diese sollen klären, ob diese SNPs tatsächlich eine Auswirkung auf die Funktion dieser CYPs im Arzneistoffmetabolismus haben. Zusätzlich zu den diversen SNPs welche im CYP2D15-Gen zu finden waren, konnte in vorliegender Arbeit auch die bereits 1998 von Roussel et al. beschriebene in frame Deletion von Exon 3 (delta Exon3) dargestellt werden. In einer full-length-PCR des CYP2D15 wiesen sich 35 % der getesteten Hunde als Träger des Exons 3 Polymorphismus aus. Ebenso viele Hunde waren nicht vom Polymorphismus betroffen, wohingegen 30 % der Hunde heterozygote Träger dieses Merkmales waren. Eine klinische Relevanz ist hier anzunehmen, da bereits ein Zusammenhang zwischen dem Polymorphismus und einer verminderten Metabolisierungsrate von Celecoxib beschrieben wurde (Paulson et al. 1999). Jedoch ist es wahrscheinlich, dass das Fehlen von Exon 3 kein absolutes Ereignis ist, sondern dass es sich um einen Exon skipping Polymorphismus handelt. Auch die Expression auf mRNA-Ebene wies zwischen den unterschiedlichen Cytochromen, zwischen einzelnen Tieren und auch individuell eine große Varianz auf. So variierte z.B. das Ergebnis der real-time PCR von CYP1A2 um bis zu 12 Ct -Werte. Diese große Spannbreite könnte auf eine unterschiedliche Geninduktion der CYPs in der Leber in dem sehr heterogenen Patientengut zurückzuführen sein. Diese Resultate machen deutlich, dass veterinärmedizinische Patienten oder präklinische Versuchstiere genetisch nicht identisch sind. Aufgrund ihrer individuell sehr unterschiedlichen Ausstattung von zum Teil sehr polymorphen CYPs in der Leber, sollten sie eigentlich individuell behandelt werden. Dies ist jedoch bisher nicht etabliert. Mit den Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit ist auf diesem Hintergrund ein weiterer Schritt gelungen, um das individuelle Ansprechen und die individuell sehr unterschiedliche Verträglichkeit einer Arzneitherapie auf molekularer Ebene besser erklären zu können. The thesis presents current, summarized findings about polymorphisms of cytochrome-P450-enzymes in dogs. In comparison to previous studies, it was not tested among a homogeneous collective of Beagle dogs. Instead, the test-group was a cohort of at least 20 different dogs, of different breeds, which all were patients of the JLU Gießen, “Klinik für Kleintiere”. The genetic material was extracted out from liver tissue samples and scanned by different methods of molecular biology (e.g. PCR, real-time PCR and sequencing) for variations in sequence and level of expression in the cytochrome-P450-enzymes 1A2, 2B11, 2C21, 2C41, 2D15, and 3A12. Some detected polymorphisms have already been mentioned in former literature, as the gene deletion polymorphism in the CYP2C41 gene (Blaisdell et al. 1998). Results show, that in a group of 441 individual dogs of different breeds, only 14,75 % possessed the CYP2C41 gene. Furthermore, for the first time the exon-intron-boundaries and the genome sequence of this CYP2C41 gene of the dog were identified and the complete sequence was entered in gene bank. Noticeable was the fact, that all dogs, belonging to the breeds Husky and Shar Pei, tested for the existence of the CYP2C41 gene, possessed this gene. An explanation might be, that both breeds are ethnic and phylogenetically old, with a still near relationship to the ancestor wolf. It seems that in course of time the CYP2C41 gene has disappeared of the canine genome in most of dog breeds. Further functional tests are necessary to evaluate possible clinical relevance and to get an evolutionary and biologically explanation for the gene deletion polymorphism. In all other examined CYPs, sporadic (CYP2C21), or large numbers (CYP2D15) of single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found. Most of these SNPs represent a silent mutation, without an expected negative impact on the CYP enzyme function. Several SNPs were rated by SIFT, a program sorting by bioinformatics, if an amino acid change in the correlated protein is relevant for enzyme function or not, as not-tolerable. Because of the reason, that this rating is only an uncertain lead, there is a need for further functional testings. They should clear, if these SNPs really have an effect on the CYP metabolism of drugs. In addition to the diverse different SNPs in the CYP2C15 gene, there was also found (already described by Roussel et al. 1998) the in frame deletion of exon 3 (delta exon3). In a full-length-PCR of CYP2D15, 35 % of the tested dogs were identified as an owner of the exon 3 polymorphism. An identical percentage rate of dogs was not affected by this polymorphism and 30 % of them were heterozygous owner of this attribute. A clinical relevance is suspected, because of a correlation between the polymorphism and a reduced metabolism rate of Celecoxib (Paulson et al. 1999). However it is probable, that the missing of exon 3 is not an absolute event, but an exon skipping polymorphism. The mRNA expression also showed a huge variation between the different cytochromes and canines: E.g. the result of the real-time PCR of CYP1A2 varied up to around 12 Ct -values. This high range could indicate to a different gene induction of CYPs in liver of the very heterogeneous patient population. All these results clearly show, that both, veterinary patient or preclinical laboratory animal, are genetically not identical. Because of their unequal endowment of partly very polymorphic CYPs in the liver, they rather should be medicated individually. Until now, this is not established yet. Based on the results of the presented thesis, an additional step on that background is succeeded to better interpret the individual response and the different tolerance of drug therapie on the molecular level.

Ziel dieser Arbeit war die Aufdeckung eines möglichen Zusammenhangs zwischen dem MDR1-Genotyp und dem Auftreten von Arzneimittelunverträglichkeiten nach der Anwendung von Profender® beim Hund. Solche Arzneimittelunverträglichkeiten wurden unserem Institut in den letzten Jahren im Rahmen der MDR1-Diagnostik häufig gemeldet. Durch eine retrospektive Auswertung dieser gesammelten Fälle ist es gelungen den vermuteten Zusammenhang zum MDR1-Genotyp der betroffenen Tiere aufzudecken und durch weitere in vitro und in vivo Versuche zu bestätigen. Durch Transportversuche an spezifischen Zelllinien konnte eine Interaktion von dem in Profender® enthaltenen Emodepsid mit dem MDR1-Transporter des Hundes belegt werden. Anschließende Versuche an MDR1-defekten Mäusen zeigten deutlich eine vermehrte Gehirnpenetration von Emodepsid beim Fehlen von MDR1 in der Blut-Hirn-Schranke und eine damit verbundene Neurotoxizität in vivo. Besonders auffällig waren in diesem Zusammenhang Störungen der Muskelkoordination, welche sich beim Hund hauptsächlich als Zittern äußerten. Auch Ataxie trat häufig auf. Koordinationsstörungen konnten auch bei der Maus beobachtet und mit Hilfe des gewählten Models (Rotarod) zuverlässig quantifiziert werden. Der direkte Vergleich mit den MDR1-intakten Wildtyp-Tieren, in denen keinerlei Symptome auftraten, belegte einen Zusammenhang zwischen Emodepsid-induzierter Neurotoxizität und dem Fehlen von MDR1 in der Blut-Hirn-Schranke. Die beobachteten Symptome weisen dabei sowohl bei Hunden als auch bei Mäusen auf eine Übererregung des zentralen Nervensystems bzw. eine gestörte Balance zwischen erregenden und hemmenden Strukturen hin, wobei der Toxizitätsmechanismus zum jetzigen Zeitpunkt nicht genau bekannt ist. Wahrscheinlich ist ein komplexes Vergiftungsgeschehen mit Beteiligung mehrerer Neurotransmittersysteme. Obwohl bisher keiner der uns bekannten Fälle letal verlief und alle Symptome auch ohne Behandlung vollständig wieder abklangen, wurde dennoch oft von einem langandauernden und/oder schwerwiegenden Verlauf berichtet. In der tierärztlichen Praxis empfiehlt sich daher vor der Anwendung von Profender® beim Hund ein Test auf das Vorliegen des MDR1-Defekts, um die Applikation bei MDR1-defekten Hunden mit besonderer Sorgfalt durchzuführen. Bestehen dabei Zweifel an der korrekten Umsetzung durch den Besitzer, sollte ggf. auf ein anderes Präparat zurückgegriffen werden. The aim of the present study was to find a possible relationship between the MDR1-genotype and drug intolerances after the administration of Profender® in dogs. Drug intolerances after administration of Profender® in dogs were reported to our institute pretty often in the last few years in the context of MDR1-genotyping. In a retrospective evaluation of those cases we were able to detect the supposed relationship between the MDR1-genotype of the affected dogs, which was confirmed in further in vitro and in vivo experiments. Transport studies in MDR1-expressing cell lines proved an interaction of emodepside (contained in Profender®) and the canine MDR1-transporter. Subsequent studies in MDR1-deficient mice showed a clear increase of emodepside brain penetration and correlated neurotoxicity in the absence of MDR1 in the blood-brain barrier in vivo. This neurotoxicity mainly led to tremor and ataxia in affected dogs. Also the mice showed ataxia, which was reliably quantified with the model used in the present study (rotarod setup). As no symptoms were observed in the corresponding MDR1-intact wildtype mouse strain, an association between the absence of MDR1 in the blood-brain barrier and Emodepside-induced neurotoxicity can be drawn. The observed symptoms in dogs and mice suggest an over-excitation of the central nervous system respectively an imbalance of excitation and inhibition. However the mechanism of toxicity remains unclear. Most likely this mechanism is very complex and involves different neurotransmitter systems. Although none of the drug intolerances reported to our institute was lethal and all symptoms resolved completely without treatment, many cases showed a long lasting and/or severe course. Therefore, MDR1-genotyping is recommended before the use of Profender® in the veterinary practice to perform drug administration with particular care in MDR1-deficient (MDR1-/-) dogs. If a correct drug administration cannot be guaranteed by the owner another type of formulation might be a better choice.

Th2 lymphocytes differ from other CD4+ T lymphocytes not only by their effector tasks but also by their T cell receptor (TCR)-dependent signaling pathways. We previously showed that dihydropyridine receptors (DHPR) involved in TCR-induced calcium inflow were selectively expressed in Th2 cells. In this report, we studied whether cGMP-dependent protein kinase G (PKG) activation was implicated in the regulation of DHPR-dependent calcium response and cytokine production in Th2 lymphocytes. The contribution of cGMP in Th2 signaling was supported by the following results: 1) TCR activation elicited cGMP production, which triggered calcium increase responsible for nuclear factor of activated T cell translocation and Il4 gene expression; 2) guanylate cyclase activation by nitric oxide donors increased intracellular cGMP concentration and induced calcium inflow and IL-4 production; 3) reciprocally, guanylate cyclase inhibition reduced calcium response and Th2 cytokine production associated with TCR activation. In addition, DHPR blockade abolished cGMP-induced [Ca2+]i increase, indicating that TCR-induced DHP-sensitive calcium inflow is dependent on cGMP in Th2 cells. Th2 lymphocytes from PKG1-deficient mice displayed impaired calcium signaling and IL-4 production, as did wild-type Th2 cells treated with PKG inhibitors. Altogether, our data indicate that, in Th2 cells, cGMP is produced upon TCR engagement and activates PKG, which controls DHP-sensitive calcium inflow and Th2 cytokine production.

Das Rotwild (Cervus elaphus L.) als größtes freilebendes Wildtier in Deutschland darf sich in Hessen, gesetzlich verordnet, nur in ausgewiesenen Rotwildgebieten aufhalten. Wie sich diese Verinselung auf die Genetik auswirkt, wurde bei der Rotwildhegegemeinschaft Krofdorfer Forst untersucht. In diesem circa 16.000 ha großen Rotwildgebiet, nördlich von Gießen gelegen, leben schätzungsweise 300 Hirsche. Aus 108 Abwurfstangen und 41 Geweihen von insgesamt 56 Hirschen wurden Bohrproben gewonnen. Für die DNA-Isolierung aus den Knochenspänen wurde eine Methode etabliert. Mit 17 Mikrosatelliten in fünf Multiplex-Ansätzen wurden mit den DNA-Proben PCR-Amplifikate gewonnen. Diese so gefundenen Allele wurden mit Polyacrylamid-gelelektrophorese ihrer Länge nach getrennt und ausgewertet. Stichprobenweise wurden die gefundenen Allellängen mit Pyrosequenzierungen und Einzelsequenzierungen nach Sanger überprüft. Die phänotypische Zuordnung der Abwurfstangen durch Mitarbeiter der Hegegemeinschaft wurde anschließend genetisch überprüft. Vier von 108 Stangen waren falsch zugeordnet worden. Dies entspricht einer Genauigkeit von 96,3 %. Mit GenAlEX©, einem frei erhältlichen genetischen Auswertetool für Microsoft Excel, wurden Kennzahlen der Mikrosatelliten und der Population berechnet. Genetische Distanzen konnten damit dargestellt werden. Hirsche, die zu einem Erhalt oder einer Verbesserung der genetischen Diversität beitragen, konnten identifiziert werden. Die berechneten Kennzahlen wurden mit den Kennzahlen von insgesamt 93 Populationen aus Europa und drei Populationen aus Nordafrika verglichen. Ein direkter Vergleich der Populationskennzahlen ist kaum möglich, da bei den Untersuchungen verschiedenste Mikrosatelliten an unterschiedlichsten Stichprobenumfängen getestet wurden. Deshalb wurden auch Vergleiche mit einzelnen Mikrosatellitenergebnissen durchgeführt. Fünf von 17 Mikrosatelliten entsprechen signifikant nicht den Bedingungen des Hardy- Weinberg-Gleichgewichtes. In keiner anderen Untersuchung ist diese signifikante Abweichung so groß. Im Vergleich zu bayerischen Populationen (hohe Übereinstimmung der verwendeten Mikrosatelliten) sind die Kennzahlen aus dem Krofdorfer Forst unterdurchschnittlich, aber auf ähnlichem Niveau. Die bayerischen Populationen werden als genetisch stabil, mit moderater Drift, ohne Anzeichen einer Inzuchtdepression beschrieben. Diese Annahme der Autoren der bayerischen Untersuchung trifft auch für die Hirsche im Krofdorfer Forst annähernd zu. Die Allelanzahl ist allerdings bei den Rothirschen im Krofdorfer Forst unterdurchschnittlich. Sie beträgt 81,6% der mittleren Allelanzahl der anderen Untersuchungen. Diese wenigen Allele sind in günstigen Frequenzen verteilt. Bei den Rothirschen der Rotwildhegegemeinschaft Krofdorfer Forst handelt es sich somit um eine kleine, stark isolierte Population mit unterdurchschnittlicher Allelanzahl. Eine direkte Gefahr einer Inzuchtdepression kann aus den Ergebnissen nicht abgeleitet werden. Die Population erscheint genetisch stabil mit einer moderaten Drift. Die unterdurchschnittliche Allelanzahl sollte jedoch als drohende Gefahr für eine Inzuchtdepression gewertet werden. Um eine Aussage über das Maß der Isolation und den Grad der Differenzierung zu benachbarten Populationen treffen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig. The red deer (Cervus elaphus L.) is the biggest wild animal in Germany. The provisions of the hunting law of the federal state Hessen describe, that red deer only has to live in designated areas. The way the genetic structure changed due to “isolation by law” was analyzed by the Rotwildhegegemeinschaft Krofdorfer Forst. There are approximately 300 red deer in this area with about 16.000 hectares situated in the north of Gießen in the middle of Hessen. Drill samples from parts of 108 antlers and 41 sets of antlers shed by 56 stags were collected. A method for DNA-Isolation from the bone samples was established. PCR-amplifications were performed using 17 microsatellite loci in five multiplex polymerase chain reactions. Using polyacrylic gel electrophoreses the genotypes were analyzed. Random cross checks were made on a few samples using sanger sequencing and pyrosequencing. A phenotypic correlation of the antlers of the stags produced by members of the Hegegemeinschaft was compared to this genetic structure. Only four of the 108 antlers were mismatched, indicating an accuracy of 96,3 %. Genetic data was generated from the used microsatellites and the analyzed population using GenAlEX© (a free evaluation software). Genetic distances could be visualized. Stags that were saving or increasing the genetic diversity could be identified. The results from Krofdorfer Forst were compared with the results from 93 European deer populations and three deer populations from North Africa. A direct comparison was difficult due to the diversity and differences between the microsatellites used. Therefore comparisons would only be completed between those microsatellites that matched. Five out of 17 microsatellites showed a significant deviation from Hardy-Weinberg-equilibrium. No other study indicates such a significant divergence. When compared with the Bavarian deer populations (14 microsatellites used in both studies), the results from the Krofdorf population was below average, but in the same range. The analysts of the Bavarian study concluded, that the Bavarian deer populations were genetically stable, with a moderate drift but no indication of inbreeding. These conclusions were similar for the Krofdorf deer population. The number of alleles was below average, in the Krofdorf deer population being 81,6 % of the average of the other studies. These smaller alleles however were distributed in better frequenzes. The Rotwildhegegemeinschaft Krofdorfer Forst is a small isolated deer population with a below average number of alleles. The results to date do not shown signs of inbreeding depression, the deer population appears to be in a stabile genetic state with a moderate drift, but does not eliminate the potential risk of inbreeding. The below average number of alleles should be estimated as a high risk of inbreeding depression. In order to relate the rate of isolation or the rate of diversity to neighboring deer populations more studies are necessary.

Sulfatierte Steroide sind aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften im Gegensatz zu den unkonjugierten Steroiden nicht in der Lage, eigenständig die Zellmembran mittels Diffusion zu durchdringen. Sie sind daher auf Transportsysteme angewiesen, die sie in die Zielzelle hineinbringen. Innerhalb der Zelle können sie von der StS in freie, hormonell aktive Form überführt werden, über den spezifische Rezeptoren mit der DNA interagieren und eine hormonelle Zellantwort initieren und modulieren. Dieser sogenannte Sulfatase Pathway wird in der Literatur als alternativer Weg der Steroidhormonversorgung in intrakrinologisch aktiven Organen wie dem Hoden oder der Haut diskutiert und in den Zusammenhang mit pathologischen Befunden wie dem hormonabhängigen Mammakarzinom in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurden der Sulfatase Pathway im Hoden untersucht. Hierzu wurden vier potentielle Kandidatentransporter (OATP6A1, OATP1C1, OSCP1 und SOAT) ausgewählt und in Expressionsanalysen und Transportstudien näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass alle vier ausgewählten Transportproteine eine prädominante, oder im Fall des OATP1C1, dominante Expression im Hoden aufwiesen. Im Rahmen der funtionellen Charakterisierung stellte sich heraus, dass SOAT der vielversprechendste Kandidat für die Einbindung in den Sulfatase Pathway darstellte. Sowohl die beiden OATP-Proteine wie auch das OSCP1-Protein zeigten in den durchgeführten Transportstudien weder in stabil transfizierten HEK293-Zellen, noch im Xenopus laevis Oozyten-Expressionsmodell eine Transportaktivität für die sulfatierten Steroide DHEAS und E1S, so dass von einer weiteren Untersuchung dieser Proteine abgesehen wurde. SOAT hingegen transportiert eine Vielzahl sulfatierter Steroide. Um sein Substratspektrum zu erweitern, wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. S. Wudy, Gießen, die LC-MS/MS für die Analyse sulfatierter Steroide aus Zelllysaten etabliert. Mit Hilfe dieser neuen analytischen Möglichkeit wurde erstmals gezeigt, dass SOAT intakte Steroidsulfate in HEK293-Zellen hineintransportiert. Ferner konnten mit E2S und Androstendiol-3-sulfat zwei neue Substrate des SOAT-Proteins identifiziert werden. Beim Einsatz von Steroidmixen, die E1S, PREGS und DHEAS in wechselnden Konzentrationen enthielten zeigte sich eine, von der Konzentration der Substanz in der Messlösung abhängige Aufnahme der Substrate. Die Aufnahme von E1S kann außerdem durch freies E1 gesteigert werden, wohingegen Testosteron keinen Einfluss auf die Aufnahmemenge der einzelnen Steroidsulfate zur Folge hatte. Diese Daten zeigen, dass sowohl E1S wie auch PREGS und DHEAS ago-allosterische Modulatoren des SOAT-Proteins darstellen. Die LC-MS/MS ermöglichte somit weitere Einblicke in das Transportverhalten des SOAT-Proteins unter physiologischen Bedingungen und stellt ein neues Analyse-Tool für die Identifizierung weiterer Substrate des SOATs dar. Neben der Untersuchung des SOAT-Wildtyp-Proteins erfolgte auch die Evaluierung verschiedener natürlich vorkommender SNPs im SLC10A6-Gen. Hierbei wurde beim SOAT-L204F-Polymorphismus eine signifikant erniedrigte maximale Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zum SOAT-Wildtyp festgestellt, die vermutlich durch eine unzureichende Sortierung des polymorphen Proteins in die Zellmembran der untersuchten HEK293-Zellen hervorgerufen wird. Die Lokalisation der SOAT-Proteine erfolgte mit dem anti-SOAT311-377 Antikörper, der im Rahmen dieser Arbeit sowohl für den Western Blot als auch für die Immunfluoreszenz validiert wurde. Das membranständige SOAT-Protein wurde mit dem SOAT2-17 Antiserum detektiert und ermöglichte die Kontrolle des Sortierungsprozesses der SOAT-Varianten. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass SOAT ein breites Spektrum an intakten Steroidsulfaten Natrium-abhängig in die Zellen transportiert und auf Konzentrationsänderungen in Steroidgemischen mit einer Anpassung seines Transportverhaltens reagiert. Die Aufnahme der Steroidsulfate kann außerdem durch freie Steroide moduliert werden. In vorläufigen Experimenten konnte CS als weiteres potentielles Substrat identifiziert werden. Aufgrund der exklusiven Expression des SOATs im Hoden, die ausschließlich in den Keimzellen stattfindet, und seinem sehr selektives Substratspektrum ist von einer wichtigen physiologischen Funktion dieses Proteins im Hoden auszugehen. Hierfür spricht auch seine reduzierte Expression in verschiedenen Formen der gestörten Spermatogenese und das Auftreten funktionell veränderter SNPs. Seine deutliche Expression in der Haut deutet auch in diesem, intrakrinologisch aktivem Organ auf eine bedeutende Funktion im Rahmen der lokalen Steroidhormonversorgung hin. Um nun die physiologische und pathologische Bedeutung des SOATs final zu klären, wurde ein Slc10a6-Knockout-Maus-Modell generiert, was in weiterführenden Studien vor allem in Hinblick auf den Hoden, die Haut und den Steroidmetabolismus charakterisiert werden soll. SOAT hat das Potential zum Drug Target, was durch diese Arbeit bekräftigt werden konnte. Das Slc10a6-Knockout-Maus-Modell wird hierzu weitere Erkenntnisse liefern, die es ermöglichen SOAT als Drug Target zu nutzen. Free unbound steroids can penetrate the cell membrane by diffusion, bind to the nuclear receptor and initiate a cellular response. In contrast to that, sulfated steroid hormones rely on membrane uptake carriers, which import the sulfoconjugated steroids into the cell, where they can be (re)activated by the catalytic activity of the steroid sulfatase (StS). In the literature, the so called sulfatase pathway is discussed as an alternative way for the local supply of certain organs (testis and skin) with steroid hormones and to play a role in several diseases such as breast cancer or X-linked ichthyosis. The aim of the current study was to determine the role of the sulfatase pathway in the testis. OATP6A1, OATP1C1, OSCP1 and SOAT were selected as potential candidate carriers for steroid sulfate uptake and investigated by expression analyses and transport studies. OATP6A1, OSCP1 and SOAT were predominantly expressed in the human testis, whereas OATP1C1 showed highest expression in brain and a moderate expression in testis. Functional analyses revealed, that SOAT might be the most important steroid sulfate carrier in this study due to the fact that neither the OATPs nor the OSCP1 protein showed transport activity for sulfated steroids in the transport studies although two different expression systems (HEK293 cells and Xenopus laevis oocytes) were used for functional characterisation. In contrast to that, SOAT transported several sulfated steroids, thus further investigations concentrated on SOAT. To expand the substrate pattern of SOAT a novel LC-MS/MS procedure was established in cooperation with Prof. Dr. S. Wudy, Giessen, which is able to detect the cellular uptake of intact sulfoconjugated steroid molecules. With this new technique, E2S and androstenediol-3-sulfate were identified as novel substrates of SOAT. Furthermore steroid mixtures containing various concentrations of sulfated and free steroids were investigated using LC-MS/MS, showing that the uptake of SOAT substrates occurs in a substrate- and concentration-dependent manner. The studies ruled out that E1S, PREGS and DHEAS are all ago-alosteric modulators of SOAT. Additionally, the impact of free steroids on the uptake properties of SOAT was analysed. It was demonstrated that E1 is able to stimulate the E1S uptake whereas testosterone does not influence the transport activity of SOAT. These results confirmed that on one hand the LC-MS/MS technique is a useful tool to analyse simulated physiological conditions in the testis using various free and sulfated steroid hormones and on the other hand it enables the identification of novel substrates of SOAT without using radiolabelled compounds. In addition to the SOAT wild-type, several naturally occuring single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the SLC10A6 gene were investigated. This part of the study showed, that the SOAT L204F mutant exhibited aberrant transport kinetics with a significantly reduced maximum velocity of the DHEAS uptake in contrast to SOAT wild-type and SOAT I114V mutant. Abnormal transport kinetics of the SOAT L204F mutant seem to be caused by a disturbed sorting process of the mutated protein. For localisation studies of wild-type and mutant proteins a newly validated antibody was used. The validation of the anti-SOAT3 11-377 antibody was done by western blot analyses, peptid matching studies and immunocytochemistry using immunofluorescent microscopy of the stably transfected SOAT-HEK293 cell lines containing the wild-type or mutant genes. Due to the exclusive expression of SOAT in germ cells of the human testis and its highly selective substrate pattern it can be considered that SOAT plays an important role in the physiology of the human testis. This suggestion is reinforced by the reduced expression of SOAT in different pictures of impaired spermatogenesis and the appearance of functional abnormal SNPs in the SLC10A6 gene. In addition to the testis, SOAT might have physiological significance in the skin, where it is also highly expressed. Considering earlier studies of SOAT function and localisation, SOAT seems to be a potential drug target which was confirmed by this study. In order to clarify the physiological and pathological role of SOAT in the human organism a Slc10a6-knockout mouse model was generated and will be further investigated with special focus on intracrine active organs like testis and skin and on the steroid metabolism of the knockout mice. The Slc10a6-knockout mouse model will help to determine the physiological role of SOAT in certain organs and will elucidate the suitability of SOAT as a drug target.

Die humane Plazenta bildet hohe Mengen an Östrogenen und bezieht hierzu Vorstufen aus dem fetalen und maternalen Blut. Ort der plazentaren Östrogensynthese ist der Synzytiotrophoblast, ein Synzytium, das die Chorionzotten bedeckt und den Stoffaustausch zwischen Fetus und Mutter bestimmt. Wichtige Östrogenvorläufer sind die sulfatierten Steroide Dehydroepiandrosteron-3-sulfat (DHEAS) und 16alpha-OH-DHEAS, die für den Zelleintritt aufgrund ihrer Sulfatgruppe auf die Aufnahme durch Transporter angewiesen sind. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Steroidsulfattransporter SOAT (SLC10A6), OAT4 (SLC22A11) und OATP2B1 (SLCO2B1) für die plazentare Östrogensynthese zu untersuchen. SOAT wurde im Synzytiotrophoblasten mit einer verstärkten Lokalisation an der apikalen Membran nachgewiesen, die im direkten Kontakt zum maternalen Blut steht. Er kann somit sulfatierte Steroide, wie DHEAS, aus dem mütterlichen Blut aufnehmen, die anschließend im Synzytiotrophoblasten zu Östrogenen metabolisiert werden. Außerdem wurde SOAT im Kapillarendothel der Chorionzotten detektiert und könnte hier die Aufnahme von DHEAS und 16alpha-OH-DHEAS aus dem fetalen Blut vermitteln. Beide werden in einem nächsten Schritt von den bereits in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten bekannten Transportern OAT4 und OATP2B1 aufgenommen und im Synzytiotrophoblasten zu Östrogenen metabolisiert. 16alpha-OH-DHEAS wird fast ausschließlich vom Fetus gebildet und in der Plazenta in Estriol umgewandelt. In dieser Arbeit wurde 16alpha-OH-DHEAS als Substrat der Transporter SOAT und OAT4 identifiziert, die wie oben beschrieben den Weg dieses Steroids aus dem fetalen Blut ins Kapillarendothel der Zotten und in den Synzytiotrophoblasten ebnen könnten. Die Chorionkarzinomzelllinie JEG-3 wurde als Modell für die endokrinologischen Eigenschaften der Plazenta herangezogen und sollte Aufschluss über die Rolle der genannten Transporter für die plazentare Östrogensynthese geben. Hierzu wurden JEG-3-Zellen stabil mit den Transportern SOAT und OATP2B1 transfiziert. Die stabile Transfektion mit OAT4 war nicht erfolgreich. Es zeigte sich, dass die Estradiolsynthese in JEG-3-Zellen aufgrund des geschwindigkeitsbegrenzenden Enzyms Aromatase limitiert ist. Die einzelnen Transporter in den stabil transfizierten Zelllinien führten teilweise zwar zu einer erhöhten Aufnahme von DHEAS und E1S, diese resultierte allerdings nicht in einer erhöhten Estradiolsynthese. Unerwarteterweise zeigten die stabil transfizierten SOAT-JEG-3-Zellen sogar eine verminderte Estradiolsynthese im Vergleich zu den Kontrollzellen, was auf Beeinträchtigungen von Enzymsystemen in den stabilen Zelllinien hindeutet. Dieses Modell war daher nur bedingt geeignet, um den Einfluss verschiedener Steroidsulfattransporter auf die plazentare Östrogensynthese zu untersuchen. Die Versuche offenbarten allerdings eine 16alpha-Hydroxylasefähigkeit von JEG-3-Zellen gegenüber den Substraten DHEA und DHEAS, die zur Bildung von 16alpha-OH-DHEA und 16alpha-OH-DHEAS führte. Die Expression der entsprechenden Enzyme CYP3A4 und CYP3A7 in JEG-3-Zellen wurde in einer qRT-PCR gezeigt. Ob dieses Ergebnis auf die Plazenta übertragen werden kann, ist jedoch fraglich; eine 16alpha-Hydroxylasefähigkeit konnte dort bisher noch nicht nachgewiesen werden. The human placenta produces high amounts of estrogens and obtains precursors from fetal and maternal blood. Placental estrogen synthesis is located in the syncytiotrophoblast, a syncytium that covers the placental villi and determines the exchange of substances between fetus and mother. Important precursors are dehydroepiandrosterone-3-sulfate (DHEAS) and 16alpha-OH-DHEAS that depend on carrier-mediated uptake into cells due to their sulfate group. Aim of this project was to examine the role of the steroid sulfate carriers SOAT (SLC10A6), OAT4 (SLC22A11) and OATP2B1 (SLCO2B1) for placental estrogen synthesis. SOAT was detected in the syncytiotrophoblast with an increased localization at the apical membrane that is in direct contact to maternal blood. Therefore, SOAT can mediate uptake of steroid sulfates, like DHEAS, from maternal blood that are subsequently metabolized to estrogens by the syncytiotrophoblast. Furthermore, SOAT was localized in the vascular endothelium of placental villi suggesting uptake of DHEAS and 16alpha-OH-DHEAS from fetal blood. Both are consecutively taken up at the basal membrane of syncytiotrophoblasts by OAT4 and OATP2B1, which have already been localized at this side of the syncytiotrophoblast. 16alpha-OH-DHEAS is almost exclusively synthesized by the fetus and metabolized to estriol by the placenta. In this study 16alpha-OH-DHEAS was identified as substrate of the carriers SOAT and OAT4. Both carriers pave the way from fetal blood to vessel endothelium and syncytiotrophoblast as described above. The choriocarcinoma cell line JEG-3 was used as a model for endocrinological traits of the placenta and was supposed to elucidate the role of the different carriers for placental estrogen synthesis. For this purpose, JEG-3 cells were stably transfected with the carriers SOAT and OATP2B1. The stable transfection with OAT4 was not successful. It was shown that estradiol synthesis by JEG-3 cells was limited due to the rate-limiting enzyme aromatase. Though transporters mediated in parts increased uptake of DHEAS and E1S, estrogen synthesis was not increased. Unexpectedly, SOAT-JEG 3 cells even exhibited decreased estradiol synthesis compared to control cells, which suggests impaired enzyme systems in the stably transfected cell lines. Therefore, this model was only of limited suitability for examining the impact of each carrier on placental estrogen synthesis. Nevertheless, experiments revealed JEG-3 cells to hydroxylate DHEA and DHEAS to 16alpha-OH-DHEA and 16alpha-OH-DHEAS, respectively. Expression of the required enzymes CYP3A4 and CYP3A7 in JEG-3 cells was verified by qRT-PCR. However, if this result can be transferred to the placenta is questionable as the ability to hydroxylate carbon 16 of steroids has not yet been proven for the placenta.

Nach Lebertransplantationen kommt es bei einem Viertel der Patienten zu einer anhaltenden Cholestase, die mit einer erhöhten Mortalität einhergeht. Molekulare Mechanismen der Cholestase nach kalter Ischämie und Reperfusion sind weitgehend unbekannt und therapeutische Strategien bisher nicht etabliert. Zukünftige therapeutische Maßnahmen zur Verminderung der Cholestase nach Ischämie und Reperfusion sollten die Wiederherstellung der Lokalisation und Expression der hepatobiliären Transporter erzielen und dadurch die biliäre Ausscheidung von cholephilen Substanzen verbessern. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die zonale Expression und die Proteinexpression von Mrp2, Bsep, Ntcp und drei Isoformen der Oatp-Familie nach kalter Ischämie und Reperfusion, sowie nach Induktion der Hämoxygenase-1 untersucht. Die kanalikulären Transporter Mrp2 und Bsep zeigten nach kalter Ischämie und Reperfusion eine signifikante Herabregulation in perivenösen Hepatozyten. Die Induktion der Hämoxygenase-1 durch Hämoglobin Glutamer-200 verbesserte die Transporterexpression von Mrp2 und Bsep vor allem in den perivenösen Hepatozyten. Die Transporterexpression von Ntcp wurde nach kalter Ischämie und Reperfusion signifikant in Hepatozyten der Zone 3 reduziert. Die Induktion der Hämoxygenase-1 hatte jedoch keinen Effekt auf die Expression von Ntcp. Die zonale Transporterexpression von Oatp1a1, Oatp1a4 und Oatp1b2 in den periportalen Hepatozyten war sowohl nach Ischämie und Reperfusion als auch durch die Induktion der Hämoxygenase-1 im Vergleich zu den Kontrollen unverändert. Die Induktion der HO-1 durch HbG-200 erfolgte vornehmlich in Hepatozyten der Zone 3. Zusammenfassend kann die Herabregulation von Mrp2 und Bsep in perivenösen Hepatozyten durch die Induktion der Hämoxygenase-1 deutlich gehemmt werden. Vermutlich moduliert die HO-1 hepatozelluläre Signalwege, die eine Endozytose von kanalikulären Transporten bewirken. Somit könnte die HO-1 ein Zielmolekül für zukünftige Therapien zur Reduktion des cholestatischen Leberschadens nach Lebertransplantation sein. Following liver transplantation, 25% of patients develop persistant cholestasis, which is assoziated with a significant mortality. Molecular mechanism of cholestasis following cold ischemia and reperfusion are largely unknown and therapeutic strategies are not established. Future therapeutic measures to alleviate cholestasis following ischemia and reperfusion shall aim at reconstitute localization and expression of hepatobiliary transporters and shall improve biliary secretion of cholephilic substances. In the present work zonal expression and protein expression of Mrp2, Bsep, Ntcp and three isoforms of the Oatp family was investigated following cold ischemia and reperfusion and well as after induction of heme oxygenase-1. Canalicular transporters Mrp2 and Bsep showed significant down-regulation in perivenous hepatocytes following cold ischemia and reperfusion. Induction of HO-1 by hemoglobin glutamer-200 improved Mrp2 and Bsep expression, predominantly in perivenous hepatocytes. Expression of Ntcp was significant reduced in perivenous hepatocytes following cold ischemia and reperfusion. Induction of HO-1 had no effect on the expression of Ntcp. Zonal expression of Oatp1a1, Oatp 1a4, Oatp 1b2 following ischemia reperfusion and following HO-1 induction was unchanged. Induction of HO-1 due to HbG-200 predominantly occured in zone 3 hepatocytes. In summary, down-regulation of Mrp2 and Bsep in perivenous hepatocytes following ischemia and reperfusion can be largely inhibited by inducing HO-1. It is suggested that HO-1 modulates hepatocellular signaling pathways that may interfere with endocytosis of canalicular transporters. Thus, HO-1 could be a target molecule for future therapeutic strategies to reduce the extent of cholestatic liver injury following liver transplantation.

Lycorin gilt bei vielen Amaryllidaceae als Hauptalkaloid und die Aufnahme dieser Pflanzen ist eine häufige Vergiftungsursache bei Mensch und Tier. Als Hauptsymptome infolge dieser Pflanzenvergiftungen werden Nausea und Emesis genannt, aber systematische Untersuchungen zu diesen biologischen Effekten, zum Wirkmechanismus und zur Pharmakokinetik von Lycorin, das als auslösendes Agens angenommen wird, existieren bislang nicht. In der vorliegenden Arbeit werden die Zusammenhänge zwischen verabreichter Lycorin-dosis und Lycorin-induzierter Nausea und Emesis, die Beeinflussbarkeit dieser emetischen Effekte durch etablierte Antiemetika und die Pharmakokinetik von Lycorin in einem cross-over und vehikel-kontrollierten Design in vivo untersucht. Die Studie wurde an elf Beagle-Hunden beider Geschlechter durchgeführt. Die Lycorin-induzierten emetischen Effekte wurden quantifiziert und über Videoaufzeichnungen zeitnah dokumentiert. Nausea wird hierbei mittels eines Scoring-Systems quantifiziert, während die Parameter Latenzzeit, Dauer und Anzahl der Brechakte zur Beurteilung der Emesis herangezogen werden. Die subkutane Applikation von Lycorin induziert, beginnend ab einer Dosis von 0,5 mg/kg KGW Nausea und Vomitus. Eine statistische Signifikanz ist allerdings erst ab 1,0 mg/kg und ein maximaler emetischer Effekt bei einer Dosis von 2 mg/kg (ED100) zu verzeichnen. Die Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen applizierter Lycorin-Dosis und Nausea-Score sowie der Anzahl der Brechakte. Lycorin-induzierte Nausea und Emesis sind in den vorliegenden Untersuchungen selbstlimitierend und dauern maximal 2,5 Stunden an. Lycorin weist in den untersuchten Dosierungen von 0,25 mg/kg bis 2,0 mg/kg eine lineare Plasmakinetik auf. Nach subkutaner Gabe werden maximale Plasmakonzentrationen (Cmax) nach 0,5 h gemessen, die mittlere Plasma-Halbwertszeit beträgt 0,67 h nach subkutaner, respektive 0,51 h nach intravenöser Applikation. Die errechnete orale Bioverfügbarkeit beträgt ca. 40 %. Das Auftreten von Nausea und Emesis, sowie deren Verlauf decken sich weitestgehend mit dem Verlauf der Lycorinkonzentration im Plasma. In keiner der untersuchten Dosisstufen sind blutchemische oder hämatologische Abweichungen aufgetreten. Um Rückschlüsse auf die Zielstrukturen von Lycorin und somit auf den emetischen Wirkungsmechanismus der Lycorin-induzierten Emesis und Nausea zu gewinnen, wurden die Hunde jeweils mit Diphenhydramin, Maropitant, Metoclopramid, Ondansetron oder Scopolamin vorbehandelt. Diese therapeutisch etablierten Antiemetika besitzen eine selektive Rezeptoraffinität und entfalten ihre antiemetische Wirkung über einen Antagonismus an histaminergen H1- (Diphenhydramin), dopaminergen D2- (Metoclopramid), muskarinergen M1-3- (Scopolamin), serotoninergen 5-HT3- (Ondansetron) oder Neurokinin-1-Rezeptoren (NK1) (Maropitant). Durch die Bindung des jeweiligen Antiemetikums an die spezifischen Rezeptoren, soll die anschließende Bindung von Lycorin an den gleichen Rezeptoren verhindert oder reduziert werden, was sich in einer Reduktion oder Abwesenheit von Nausea und Emesis auswirkt. Die Vorbehandlung mit Ondansetron ist mit einer signifikanten Verminderung der Anzahl der Brechakte verbunden und durch die Vorbehandlung mit Maropitant kann Lycorin-induzierte Emesis komplett verhindert werden. Einzig Ondansetron reduziert darüber hinaus den Ausprägungsgrad der Nausea und verlängert die Latenzzeit bis zum Auftreten von Vomitus, was eine Beteiligung von 5-HT3 Rezeptoren bei lycorin-induzierter Nausea nahe legt. Histaminerge (H1), dopaminerge (D2) und muskarinerge (M1-3) Rezeptoren sind vermutlich nicht an Lycorin-induzierter Nausea und Emesis beteiligt. Die Befunde der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass Lycorin bei Vergiftungen mit Pflanzen oder Pflanzenteilen, die zu den Amaryllidaceae gehören, eine entscheidende Bedeutung für die klinische Symptomatik und den Verlauf von Intoxikationen hat. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit sind eine prädominierende Beteiligung von NK1- und eine etwas geringer ausgeprägte Beteiligung von 5-HT3-Rezeptoren im emetischen Wirkmechanismus wahrscheinlich. Somit erscheint die therapeutische Anwendung von Maropitant beim Hund (und evtl. Apreptitant beim Menschen) und/oder Ondansetron zur symptomatischen Behandlung anhaltender Nausea und Emesis bei Pflanzenvergiftungen mit Amaryllidacaen bei denen die Wirkung von Lycorin dominiert, wissenschaftlich begründet und klinisch von Vorteil gegenüber anderen antiemetischen Prinzipien zu sein.

Die Leber spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung des metabolischen Gleichgewichts. Akutes Leberversagen ist daher lebensbedrohlich. Relativ wenig ist bekannt, wie metabolische Funktionen während und nach Leberschädigung aufrechterhalten werden. Die Ziele dieser Arbeit waren daher 1) metabolische Veränderungen der Leber der Maus während Leberschädigung- und Regeneration zu untersuchen, 2) die Ammoniak-Entgiftung zu modellieren, 3) die Veränderungen der metabolischen Zonierung des Leberläppchens während Leberschädigung und Regeneration zu berücksichtigen, 4) mögliche Kompensationsmechanismen während der Schädigungs- und Regenerationsphase zu identifizieren. Für diese Untersuchungen wurden Mäuse eingesetzt, denen Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) zur Verursachung eines akuten Leberschadens injiziert wurde. Für den Ammoniakstoffwechsel relevante Parameter wurden Zeit- und Dosisabhängig nach Injektion von CCl4 erfasst: Ammoniak, Harnstoff, Glutamin, Glutamat, Glucose, Laktat, Pyruvat, Alanin, und alpha-Ketoglutarat. Diese Analysen wurden durchgeführt in Blut aus a) der Portalvene, welche den „Lebereingang“ repräsentiert, b) der Lebervene als „Leberausfluss“ und c) der rechten Herzkammer, um auch gemischt venöses Blut zu erfassen. Um die komplexen Vorgänge des Ammoniakstoffwechsels quantitativ erfassen zu können, wurde ein metabolisches Modell eingesetzt. Vorhersagen dieses metabolischen Modells (welches alle zur Zeit wesentlichen Prozesse des Ammoniakstoffwechsels einschließt) wurden mit den experimentellen Daten verglichen. Nach mehreren Zyklen von Experimenten und Modellierung wurde hierbei gezeigt, dass die bisher bekannten Mechanismen nicht ausreichen, den Ammoniakstoffwechsel während Leberschädigung quantitativ zu beschreiben. Vielmehr wurde der folgende Mechanismus identifiziert, welcher für das Verständnis der gesamten Situation wesentlich ist: nach Leberschädigung setzen geschädigte Hepatozyten neben zahlreichen weiteren Proteinen Glutamatdehydrogenase (GDH) in dem systemischen Blutkreislauf frei. Sobald die Ammoniakkonzentrationen im Blut ansteigen, findet eine GDH-Reaktion in umgekehrter Richtung statt. Bei dieser Reaktion wird der toxische Ammoniak dadurch entgiftet, dass er mit Ammoniak zum relativ untoxischen Glutamat verbunden wird. Ein neuer Aspekt ist hierbei, dass Ammoniakentgiftung in Folge der GDH-Freisetzung nicht nur in der Leber, sondern auch systemisch im Blut stattfindet. Allerdings kann diese entgiftende Reaktion im Blut nur so lange stattfinden, bis das dort vorhandene alpha-Ketoglutarat durch die GDH-Reaktion verbraucht wurde. Diese Beobachtung ist möglicherweise von klinischer Relevanz. Denn sobald die alpha-Ketoglutarat Konzentration in der Leber als Folge der GDH-Reaktion absinkt, könnte es therapeutisch substituiert werden. Dieser Mechanismus der reversen GDH-Reaktion wurde bei Experimenten mit Plasma von Mäuse und mit kultivierten Hepatozyten der Maus beobachtet. Nach Verabreichung von CCl4 an Mäusen wurde eine transiente Zunahme von GDH im Plasma beobachtet. Dies ging einher mit einer sehr starken Abnahme des alpha-Ketoglutarat. Falls Plasma in diesem Zustand Mäusen entnommen wurde, konnte Ammoniak-Entgiftung zu Glutatmat nur dann beobachtet werden, nachdem alpha-Ketoglutarat zugesetzt worden war. Weiterhin konnten im Plasma sowohl die Ammoniakentgiftung, als auch die Bildung von Glutamat durch den GDH-Inhibitor 2,6 Pyridine dicarboxylsäure (PDAC) gehemmt werden. In kultivierten Hepatozyten steigerte PDAC die Toxizität des Ammoniaks. Bemerkenswert ist, dass kultivierte Hepatozyten nur bei hohen Ammoniakkonzentrationen im Kulturmedium Ammoniak zu Glutamat entgifteten. Bei niedrigen Konzentrationen gaben Hepatozyten sogar noch Ammoniak in das Kulturmedium ab. Auch diese Beobachtung passt zur Hypothese des „GDH switch“, wobei GDH bei niedrigen Ammoniakkonzentrationen Ammoniak produziert, hingegen bei hohen Konzentrationen konsumiert. Leberschädigung mit CCl4 verursachte eine transiente Störung der metabolischen Zonierung des Läppchens. Zum Beispiel wurde eine verzögerte Erholung des perizentralen Markers Glutaminsynthetase beobachtet. Im Gegensatz hierzu dehnte das normalerweise auf die periportale Region begrenzte Enzym Carbamoylphosphat-Synthetase sein Territorium auf das gesamte Leberläppchen aus. Dies wurde zwischen Tag 4 und 6 nach Intoxikation mit CCl4 beobachtet. Nachdem sämtliche neue Mechanismen im Modell berücksichtigt wurden, ergab sich eine gute Übereinstimmung zwischen der Modellsimulation und den experimentellen Daten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Leber nach akuter Schädigung einen systemischen Schutz gegen Hyperammonämie durch Freisetzung von GDH vermittelt. Eine mögliche klinische Relevanz dieser Beobachtung besteht darin, dass alpha-Ketoglutarat im Plasma therapeutisch substituiert werden könnte, sobald es durch die GDH Reaktion verbraucht worden ist. The liver is responsible for maintaining the metabolic homeostasis throughout the body. Therefore, acute liver failure is life threatening. Only little is known about how the complex metabolic function of the liver is restored after liver injury. The goals of this thesis were to 1) study the metabolic alterations during liver damage and regeneration, 2) model ammonia detoxification during liver damage and regeneration, 3) study the alterations of metabolic zonation and to 4) identify possible compensatory mechanisms for ammonia detoxification during liver damage and regeneration. For this purpose I used a mouse system where the hepatotoxic agent CCl4 was injected to induce acute liver damage. Metabolic parameters relevant for ammonia and carbohydrate metabolism were quantified in a time and in a dose-dependent manner after CCl4 intoxication including ammonia, urea, glutamine, glutamate, glucose, lactate, pyruvate, alanine, arginine and alpha-ketoglutarate. The measurement was done in blood collected from the portal vein “representing the liver inflow”, the hepatic vein “representing the liver outflow” and from the heart “representing the mixed venous blood”. For deeper understanding of ammonia metabolism during liver damage and regeneration, a model of ammonia detoxification was established. Model predictions and experimental data were compared. After iterative cycles of modeling and experiments the following so far unknown mechanism was identified. Upon acute liver damage hepatocytes release glutamate dehydrogenase (GDH) (together with further liver enzymes) into the systemic circulation. As soon as blood ammonia concentrations increase, the GDH reaction takes place in a reversed manner. This means that GDH uses ammonia and alpha-ketoglutarate (A-KG) as substrates to form glutamate. By this reaction the toxic ammonia is detoxified to form the non-toxic glutamate. Interestingly, this reaction is not limited to the liver itself but upon release of GDH from damaged hepatocytes protection against ammonia is provided systemically in blood. However, this protection lasts only as long as A-KG is present in the blood. It can not continue when A-KG has been consumed by the GDH reaction. This observation is of clinical relevance since it might be possible to therapeutically substitute α-KG after induction of acute liver damage. This mechanism was discovered in experiments with plasma of mice and in vitro with cultivated hepatocytes. After administration of CCl4 a transient increase of plasma GDH was observed which was accompanied by a decrease in A-KG. When plasma was taken from such mice detoxification of ammonia to glutamate was only observed when A-KG was added. Ammonia detoxification as well as glutamate production were both blocked by addition of the GDH inhibitor 2,6-pyridinedicarboxylic acid (PDAC). In cultivated hepatocytes PDAC increased ammonia cytotoxicity. Interestingly, hepatocytes decreased the ammonia concentrations in the culture medium at high ammonia concentrations. In contrast, hepatocytes released ammonia if its concentrations in the culture medium were relatively low. This fits to the mechanism that GDH switches from ammonia production to ammonia detoxification if the concentrations of ammonia increase. Studying the metabolic zonation after CCl4 intoxication showed a transient disturbance of metabolic zonation during liver regeneration. This included the delayed recovery of the pericentral marker glutamine synthetase. In contrast, the territory of the periportal marker carbamoyl phosphate synthetase1 is extended to cover the whole liver parenchyma on days four and six after CCl4 intoxication. When these findings were included into the model, the predictions of both ammonia and glutamine were in a good accordance with the experimentally obtained data. In conclusion, the acutely damaged liver provides systemic protection against hyperammonemia by the release of GDH into the blood. As soon as plasma A-KG is consumed by the GDH reaction it should be therapeutically substituted.

In this thesis, I showed that liver cell apoptosis by the mycotoxin ochratoxin A in vitro is not mediated by cytokine TNF-alpha nor by direct binding to the receptor TNFR1, but by oxygen radical formation that causes lipid peroxidation and was, thus, different from in vivo conditions in the intact rat liver. TNF-alpha produces apoptosis in liver cells via the extrinsic apoptosis pathway by using TNFR1 and causes oxidative damage. However, OTA seems to cause apoptosis not by activating the extrinsic pathway, but, rather the intrinsic pathway. The herbal flavanolignan silibinin counteracted the cytotoxicity and induction of apoptosis by OTA, TNF-alpha, H2O2, and UVC on primary rat hepatocytes cultures and thus was a potent cytoprotective and anti-apoptotic agent. This distinguishes silibinin as a prophylactic hepatoprotective remedy. Primäre Hepatozyten aus Ratten wurden nach zwei verschiedenen Methoden isoliert: der klassischen enzymatischen Methode nach künstlicher Verdauung durch Kollagenase-Perfusion und einer neuen EDTA-Perfusionsmethode. Die EDTA-Perfusionsmethode ergab Hepatozyten, die in Zellkulturen bis zu 96 h stabil ohne DNA-Fragmentierung kultiviert wurden, während die Kollagenase präparierten Hepatozyten Apoptoseereignisse bereits von Beginn ihres Kultivierung auch in Abwesenheit von OTA zeigten. Experimentell wurde Apoptose durch 20 ng/ml Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) nur in Gegenwart von 200 ng/ml des transkriptionellen Inhibitors Actinomycin D (ActD) ausgelöst. Diese Apoptosewirkung wurde vollständig in Gegenwart von 25 µg/ml löslichem TNF-alpha-Rezeptor 1 (sTNFR1) verhindert. Der transkriptionelle Inhibitor Actinomycin D (ActD) verursachte alleine keine Apoptose. Die durch ActD/TNF-alpha ausgelöste Apoptose wurde dagegen nicht in Gegenwart von 25-375 µg/ml löslichem TNF-alpha Rezeptor 2 (sTNFR2) im Überstand von Zellkulturen verhindert. Dies zeigt, dass die TNF-alpha-erzeugte Apoptose in kultivierten Hepatocyten nur durch TNFR1 vermittelt wird. Apoptose trat auch nach Anwendung von 12,5 müM Ochratoxin A (OTA) sowhol in kultivierten Hepatozyten als auch in HepG2-Zellen auf. Allerdings wurde diese weder von sTNFR1 bis 500 µg/ml noch von sTNFR2 bis zu 375 µg/ml verhindert. Dies zeigt, dass TNFR1 und 2 an der OTA vermittelten Apoptose in kultivierten Hepatozyten nicht beteiligt sind. Eine Inkubation von kultivierten Hepatozyten und HepG2 Zellen mit dem klassischen TNF-alpha Induktor Lipopolysaccharid (LPS) (von 0,1 bis 12,5 µg/ml) hatte keine cytotoxische oder apoptotische Wirkung unter diesen Bedingungen. Das antioxidative Flavanolignan Silibinin in Dosen von 130 bis 260 müM verhinderte an den Zellkulturen eine Chromatin-Kondensation, Caspase-3-Aktivierung und apoptotische DNA-Fragmentierung, die durch OTA sowie durch 10 mM Wasserstoffperoxid (H2O2), durch ultraviolettes (UVC) Licht (50 mJ/cm2) und durch ActD/TNF-alpha induziert wurden. Um eine Schutzwirkung durch Silibinin zu erreichen, wurde das Medikament zu den Hepatozyten für 2 h im voraus gegeben. Als Verursacher der OTA stimulierten Apoptose wird keine TNF-alpha vermittelte Apoptose, sondern eine durch Lipidperoxidation ausgelöste Apoptose angenommen. Unter OTA trat an den kultivierten menschlichen Lebertumorzellen HepG2 sowie an immortalisierten Rattenleber HPCT-Tumorzellen eine Sauerstoffradikal- und Malondialdehyd (MDA)-Bildung auf. Dieser Indikator für die Lipidperoxidation trat auch durch H2O2 und ActD/TNF-alpha Inkubation auf. Sämtliche oxidativen Reaktionen, nämlich ROS (reactive oxygen species) und MDA wurden durch Silibinin Vorbehandlung unterdrückt. Wir folgern, dass die anti-apoptotische Aktivität von Silibinin gegen OTA, H2O2 und ActD/TNF-alpha durch die antioxidativen Wirkungen des Flavanolignans verursacht wird. Neben der Apoptose-Schutzwirkung vermittelte Silibinin auch einen Schutz vor Zytotoxizität. Dieser wurde gegenüber allen pro-apoptotischen Stoffen durch den MTT-Test-und Live/Dead Kit offenbart. Wenn einzeln angewandt, zeigte ActD und TNF-alpha keine zytotoxische Wirkung nach 24 h, die aber in Kombination auftrat. Die verwendeten Konzentrationen von OTA, H2O2 und die Dosis von UVC verursachte einen deutlichen Rückgang der Zellvitalität innerhalb von 36 h, der von Silibinin verhindert wurde. Zusammengenommen läßt sich feststellen, dass die durch OTA vermittelte Apoptose in kultivierten primären Rattenhepatozyten entgegen früherer Annahmen nicht durch TNF-alpha/ TNFR1, sondern durch Sauerstoffradikale und Lipidperoxidation verursacht wird. Silibinin ist eine sehr wirksame anti-apoptotisch wirkende Verbindung, die auch vor einer Zytotoxizität durch OTA und die anderen untersuchten Stoffe schützt.

Die physiologische Rolle des humanen SOAT (SLC10A6), welcher sulfatierte Steroidhormone wie DHEAS, E1S und PREGS transportiert und im Hoden stark exprimiert wird, ist derzeit noch unklar. Zur Aufklärung ist daher die Generierung einer Knockout-Maus angedacht, weshalb der Soat der Maus (mSoat) kloniert und funktionell charakterisiert wurde, um eine Übertragbarkeit der erhaltenen Ergebnisse auf den Mensch zu gewährleisten. Die Resultate der quantitativen RT-PCR zeigten eine sehr hohe mSoat-Expression in der Lunge und eine hohe Expression in Hoden und Haut. Immunhistochemische Untersuchungen führten zu einer spezifischen Anfärbung der Bronchialepithelzellen in der Lunge, der pachytänen primären Spermatozyten im Hoden, der Epidermis der Haut und dem Urothel der Blase. Aufnahmeversuche an stabil transfizierten mSoat-HEK293-Zellen zeigten dasselbe Substratspekt-rum des humanen SOAT; die Bestimmung der Michaelis-Menten Kinetiken ließ jedoch eine deutliche Präferenz des mSoat zum PREGS als Substrat erkennen. Zusammengefasst kann der Soat der Maus, trotz Unterschieden in der Genexpression und den Transportaffinitäten, als homologer Transporter des humanen SOAT angesehen werden. Durch eine RACE-PCR wurde die Soat-Sequenz vom Schwein bestimmt (susSoat). Ein Aminosäurevergleich weist eine höhere Sequenzidentität des humanen SOAT zum susSoat (82,2 %) als zum mSoat (71 %) auf. Durch quantitative RT-PCR konnte eine 465-fache Erhöhung der susSoat-Expression im Hoden eines 250 Tage alten geschlechtsreifen Schweins gegenüber dem Hoden eines präpubertären 50 Tage alten Schweins festgestellt werden. In Verbindung mit der dargestellten Proteinexpression in pachytänen primären Spermatozyten bei der Maus spricht dies für eine Rolle von SOAT im Hoden ab der Pubertät. Zwei weitere wichtige Mitglieder der SLC10-Famile, zu der auch SOAT zählt, weisen eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislauf der Gallensäuren zwischen Leber und Dünndarm auf, der ASBT und der NTCP. Trotz der hohen phylogenetischen Verwandtschaft zum SOAT zeigen sich deutliche Unterschiede in der Substratspezifität. Während NTCP sowohl sulfatierte Steroidhormone als auch Gallensäuren und glukuronidiertes Estron transportiert, erkennt ASBT nur Gallensäuren als Substrat, SOAT dagegen nur sulfatierte Steroidhormone. Erstmals konnte jedoch ein Substrat für alle drei Transporter entdeckt werden, das Taurolithocholat (TLC); demnach müssen bei der Substraterkennung die Bindungsstellen Gemeinsamkeiten aufweisen. Sowohl DHEAS als auch TLC wurden vom SOAT als Substrat erkannt; eine Erklärung hierfür wäre, dass bei einer Überlagerung der beiden Substrate die räumlichen Strukturen der Sulfat- bzw. Sulfongruppe annähernd passend übereinander gelegt werden können. Lithocholat, unkonjugierte Steroide und glukuronidiertes Estradiol wurden von keinem der drei Transporter aufgenommen. Zur Generierung eines SOAT-Pharmakophormodells wurden mehr als 100 Substanzen auf ihre Inhibition der DHEAS-Aufnahme in SOAT-HEK293-Zellen überprüft. Die 3D-QSAR SO-AT-Pharmakophore, berechnet durch den Catalyst Algorithmus, besteht aus fünf charakteristischen Bereichen. Taurolithocholat-3-sulfat, ein potenter Inhibitor des SOAT-Transports, erfüllt alle fünf dieser Kriterien: a) drei hydrophobe Bereiche, eine am A-Ring und zwei an den Methylgruppen an Position 18 und 21 des Gallensäuregerüsts; b) die Sulfatgruppe an Position 3 und die Sulfongruppe des Taurins fungieren als Wasserstoffbrückenakzeptoren. Zu den bereits existierenden Pharmakophormodellen des ASBT und NTCP konnten so Gemeinsamkeiten, aber auch spezifische Unterschiede festgestellt werden. Ingesamt achtzehn Substanzen, darunter Testosteron und Progesteron, führten zu einer konzentrationsabhängigen Stimulierung des SOAT-Transports von DHEAS. Eine physiologische Rolle der Stimulation ist möglich, da z.B. reichlich Testosteron im Hoden produziert wird und eine hohe Expression von SOAT im Hoden demonstriert wurde. So könnte mit Beginn der Pubertät eine Stimulation der DHEAS-Aufnahme durch Testosteron zu einer erhöhten Bereitstellung von DHEAS in der Zelle führen. Durch eine erhöhte Synthese von Testosteron aus DHEAS könnte auf diese Weise ein stimulierender Kreislauf entstehen. The physiological role of the human SOAT (SLC10A6), which is highly expressed in testis and transports sulfoconjugated steroid hormones is not well understood yet. Therefore, a knockout mouse model was considered that may elucidate the biological significance of this process for reproduction and other hormone dependent processes. However, a prerequisite for this purpose is the cloning of Soat from the mouse (mSoat) and its thorough expression analysis and functional characterization in order to assess the transferability of the results to the situation in humans. Quantitative mRNA expression analysis for mSoat revealed very high expression in lung and further high expression in testis and skin. Immunohistochemical studies showed expression of the mSoat protein in bronchial epithelial cells of the lung, in pachytene primary spermatocytes within the seminiferous tubules of the testis, in the epi-dermis of the skin as well as in the urinary epithelium of the bladder. Stably transfected mSoat-HEK293 cells revealed sodium-dependent transport for the same substrates as the human SOAT, but determination of Michaelis-Menten kinetics demonstrated a preference to PREGS as substrate for mSoat. In conclusion, some differences between SOAT and mSoat exist in the quantitative gene expression in endocrine and non-endocrine tissues as well as in the transport kinetics for steroid sulfates, but in general mSoat can be regarded as homo-logous carrier for SOAT. Additionally, the Soat mRNA sequence of the pig (susSoat) was determined via RACE-PCR. A comparison of the amino acid sequences showed a higher identity of human SOAT to susSoat (82.2%) than to mSoat (71%). Quantitative mRNA expression analysis revealed a 465-fold increase of susSoat in the testis of a 250 days old sexually mature boar compared to a 50 days old preadolescent male pig. Associated with the demonstrated mSoat protein expression in pachytene primary spermatocytes a physiological role after puberty can be assumed. Two further members of the SLC10 family, the NTCP and the ASBT, are important factors for the maintenance of the enterohepatic circulation between the liver and the gut. In spite of a high phylogenetic relationship to SOAT, distinct differences exist in the substrate specifity. While NTCP transports sulfoconjugated steroid hormones, bile acids and Estron-3beta-D-glucuronide, ASBT shows uptake only for bile acids, and SOAT only for sulfated steroids. For the first time, a substrate was discovered for all three transporters: the Taurolithocholic acid (TLC). Therefore, similarities in the substrate recognition of the binding sites between all three transporters have to exist. For SOAT, a nearly identical steric overlay of the sulfate group of DHEAS and the sulfone group of TLC could explain the substrate recognition of both. Lithocholic acid, unconjugated steroids and Estradiol-17betaD-glucuronide were not trans-ported by any of these three carriers. For the generation of a pharmacophore model more than 100 compounds were screened for inhibition of DHEAS transport by SOAT-HEK293 cells. The 3D-QSAR SOAT pharmacophore calculated by the CATALYST algorithm consists of five characteristic features. The potent SOAT inhibitor taurolithocholic acid 3-sulfate (TLCS) mapped all of them: a) three hydropho-bic sites, one matches the A-Ring and two the methyl groups at positions 18 and 21 of TLCS; b) the sulfate group at position 3 and the sulfonyl group of the taurine residue act as hydro-gen bond acceptors. Comparison with the hitherto existing human ASBT, rabbit Asbt (cAsbt), and NTCP pharmacophore models revealed similarities, but also specific differences. Alltogether 18 compounds, including testosterone and progesterone, caused a concentration dependent stimulation of DHEAS uptake. A physiological role of an enhanced uptake may be possible. For example, production of testosterone is abundant in testis, where SOAT is highly expressed. So at the beginning of the puberty a stimulation of the DHEAS uptake by testos-terone could lead to an elevated supply of DHEAS into the cells. The resulting increase of testosterone synthesis out of DHEAS may lead to a stimulating loop.

In der heutigen Zeit wird die Diagnose Krebs in der Kleintiermedizin immer häufiger auf-grund der zunehmenden Lebenserwartung der Patienten gestellt. Im Zuge dieser Entwick-lungen in der Veterinärmedizin rückt die klinische Onkologie mit dem Wunsch nach einer individualisierten und zielgerichteten Therapie in den Fokus der Wissenschaft. Als Modell für die Untersuchungen diente der vorliegenden Arbeit das maligne Lymphom des Hundes. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, einen entscheidenden Schritt zur weiteren Aufklärung zu liefern, inwieweit eine individualisierte Therapie beim Hund möglich ist und auch realisiert werden kann. Hinsichtlich dieses Vorhabens beschäftigt sie sich einerseits mit der Korrelation von Neben-wirkungen nach einer Zytostatika-Applikation mit SNPs in den Efflux-Transportern MDR1 und MRP1 sowie einer veränderten MDR1-Expression. Andererseits fanden Untersuchungen statt, welche die Resistenzentwicklung während der Chemotherapie mittels Blutproben ver-folgten und die Identifizierung eines CutOff-Wertes in der Hochregulation der MDR1-Expression bezüglich einer Resistenz anstrebten. Die Dissertation berichtet von der Existenz weiterer SNPs im MDR1- und MRP1-Gen, die jedoch noch funktionell zu charakterisieren sind. Bei Hunden mit gravierenden Nebenwirkungen konnten signifikant niedrigere MDR1-Expressionslevel ermittelt werden als bei Patienten mit guter Verträglichkeit der Chemothe-rapie. Aufgrund der Ergebnisse der Resistenzstudie lässt sich der genetische CutOff für die MDR1-Expression bei 2,0 definieren. Alle Hunde mit Werten über 2,0 entwickelten eine The-rapieresistenz während diejenigen mit Werten unter 2,0 in partieller oder kompletter Re-mission waren. Weiterhin widmet sich die Studie der „Targeted Therapy“ mit TKIs, die das Risiko für die Entstehung von Nebenwirkungen minimieren und als alternative Therapieopti-on für verschiedene Patienten zur Verfügung stehen. Im Hinblick auf die Identifizierung von SNPs und der Therapieerfolge aus klinischen Studien wird deutlich, dass TKIs in der Veteri-närmedizin möglicherweise für ein breiteres Spektrum der Tumorbehandlung eingesetzt werden können. Die Verwirklichung einer individualisierten und auch zielgerichteten Therapie für zum Teil sehr kleine Subpopulationen bleibt zwar mit einem hohen wissenschaftlichen und finanziel-len Aufwand verbunden, kann aber eine wirksame und gut verträgliche Therapie für den einzelnen Patienten ermöglichen. Today, cancer is frequently diagnosed in small animal medicine because of the patient’s growing life span. Considering these developments in veterinary medicine, an individualized and targeted therapy in clinical oncology becomes more and more important. The work at hand uses the malignant lymphoma in dogs as a model for all experiments. It tries to report an important step towards an individualized therapy for dogs. On the one hand, this study wants to correlate chemotherapeutic adverse effects with SNPs in ATP-dependent transporter genes, MDR1 and MRP1, as well as an aberrant MDR1-expression. On the other hand, we performed experiments to analyze the development of resistence during chemotherapy by using blood samples and tried to define a CutOff value for MDR1 upregulation determining resistence. The present work identified various SNPs in the MDR1 and MRP1 genes which still need to be functionally characterized. Moreover, this study showed that dogs with severe adverse effects had significantly lower MDR1 expression levels than dogs with which well-tolerated chemotherapy. Considering the results of the re-sistancy study, a genetic CutOff value of 2.0 for the upregulation of MDR1 could be defined. Dogs with values above 2.0 showed resistance to chemotherapy and dogs showing values lower 2.0 were in partial or complete remission. Furthermore, this thesis dealed with tar-geted therapy with TKIs by identifying SNPs in the cKIT gene. These drugs are supposed to minimize the risk of developing adverse effects which would serve as an alternative therapy for several patients. The identified SNPs in the cKIT gene as well as effective results from clinical studies point out that the TKI’s potential could be useful in veterinary medicine to treat not only mast cell tumors but other tumors as well. Realizing an individualized and targeted therapy for subpopulations is associated with high scientific and financial effort; but this type of therapy could initiate a more efficient and compatible treatment for individual patients.

In der vorgelegten Studie wurde Modafinil hinsichtlich seiner möglichen antidepressiven und kognitionsverbessernden Wirkung in einem akuten prädiktiven tierexperimentellen Test mit Ratten, dem Forced Swim Test (FST), sowie in einem kognitiven Test zur gerichteten Aufmerksamkeit in der sozialen Diskriminierung (SND), sowie in einem Depressionsmodell der Ratte getestet. Bei der akuten Gabe von Modafinil zeigte sich im FST bei naiven Ratten eine vergleichbare Wirkung mit typischen Antidepressiva, die sich in einer verkürzten immobilen Zeit im Wasserbassin ausdrückte, während durch die akute Administration von Modafinil sich das Diskriminierungsverhalten gesunder Ratten nicht änderte. Zur Induktion depressionsartigen Verhaltens wurde ein 14-tägiges Restrained Stress-Protokoll verwendet. Der FST diente zum Nachweis der depressionsartigen Verhaltensmuster. Gestresste und ungestresste Tiere wurden akut und subchronisch mit Modafinil bzw. Placebo behandelt, um damit die Reversibilität depressionsähnlicher Verhaltensänderungen durch Modafinil zu untersuchen. Das Medikament verbesserte signifikant die depressionsartigen Verhaltensveränderungen und die Aufmerksamkeitsleistung im FST und SND. Mittels Mikrodialyse wurde gezeigt, dass Modafinil die Dopamin-Konzentration im kortikolimbischen System erhöht, so dass dies zu den beobachteten Effekten beitragen könnte. Die vorliegenden Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass Modafinil antidepressiv-ähnliche und kognitionsverbessernde Wirkungen besitzt und damit eine mögliche Alternative bei der adjuvanten Behandlung menschlicher Depression sein könnte. In weiteren Studien gilt es zu klären, in wie weit die hier gewonnenen Ergebnisse auf die klinische Situation übertragbar sind.

In der vorliegenden Arbeit wurden 51 A. (T.) pyogenes, isoliert von verschiedenen Tierarten, 23 A. (T.) abortisuis, isoliert von Schweinen und Kühen, 3 A. haemolyticum, isoliert von Pferden und 3 Stämme einer neuen Spezies der Gattung Actinomyces, für die der Name Actinomyces weissii gegeben wurde, zusammen mit 13 Referenzstämmen, von 9 Spezies der Gattungen Arcanobacterium und Trueperella sowie von zwei Spezies der Gattung Actinomyces mittels phänotypischer Methoden, durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisations Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) Fingerprinting und durch genotypische Methoden identifiziert. Die Stämme wurden aufgrund ihrer kulturellen Eigenschaften, ihrer Hämolyse, ihrer synergistischen und antagonistischen Hämolysereaktionen, verschiedener biochemischer Eigenschaften sowie durch Nachweis unterschiedlicher Peptidspektren durch MALDI-TOF MS identifiziert. Letzteres stellt eine neue Methode dar, die eine schnelle und zuverlässige Identifizierung und Charakterisierung aller in dieser Arbeit untersuchten Bakterienstämme erlaubte. Eine molekulare Untersuchung wurde durch 16S rDNA-Analysen, durch Sequenzierung der 16S-23S rDNA Intergenic spacer region (ISR), der 23S rDNA und des Hitzeschockprotein- oder Chaperonin (CPN60)-kodierenden Gens cpn60 durchgeführt. Aufgrund der Sequenzierungsdaten ließen sich speziesspezifische Oligonukleotidprimer erstellen die eine molekulare Identifizierung sämtlicher Stämme der Gattungen Arcanobacterium und Trueperella unterschiedlicher Herkunft ermöglichten. Eine zusätzliche PCR-vermittelte Amplifizierung der 7 bereits bekannten bzw. mutmaßlichen Virulenzfaktor-kodierenden Gene plo, cbpA, nanH, nanP, fimA, fimC und fimE von A. (T.) pyogenes erlaubte eine individuelle Charakterisierung der jeweiligen Stämme. Dies könnte dazu beitragen die Rolle dieser mutmaßlichen Virulenzfaktoren bei einer Infektion mit diesem Krankheitserreger zu verstehen. Die 23 A. (T.) abortisuis Stämme wurden überwiegend zusammen mit verschiedenen anderen Bakterienarten aus dem Urogenitaltrakt von Schweinen und Kühen mit unterschiedlichen Symptomen in einem Zeitraum von 12 Jahren isoliert. Unter diesen Stämmen wiesen lediglich 3 A. (T.) abortisuis einen Zusammenhang mit Aborten auf, wobei die Beteiligung von A. (T.) abortisuis als Aborterreger bei Schweinen noch eingehender untersucht werden muss. Die drei untersuchten A. haemolyticum Stämme der vorliegenden Arbeit wurden zusammen mit verschiedenen anderen Bakterienarten von Infektionen von Pferden isoliert. Dies wies darauf hin, dass diese überwiegend humanpathogene Bakterienspezies auch bei Infektionen von Pferden isoliert werden kann. Möglicherweise deutet dieses Vorkommen auf eine Kreuzinfektion zwischen Pferdebesitzer und Pferd hin. Die drei zusätzlich untersuchten A. weissii Stämme, die aus der Maulhöhle von drei Hunden isoliert wurden, zeigten synergistische CAMP-ähnliche Aktivitäten mit verschiedenen Indikatorstämmen und eine reverse CAMP-Reaktion der Staphylokokken-β-Hämolysinzone. Diese drei Stämme konnten anhand konventioneller Tests, durch MALDI-TOF-Fingerprinting sowie durch Sequenzierungen der 16S rDNA, 23S rDNA und des Gens cpn60 als eine neue Spezies der Gattung Actinomyces identifiziert und charakterisiert werden, wobei für sie der Name A. weissii mit dem Typstamm A. weissii 2298T (CIP 110333T) vorgeschlagen wurde. In the present study 51 A. (T.) pyogenes isolated from various animal origins, 23 A. (T.) abortisuis isolated from pigs and cows, three A. haemolyticum isolated from horses and three strains representing a novel species of genus Actinomyces, for which the name Actinomyces weissii was proposed, together with 13 reference strains representing nine species of genera Arcanobacterium and Trueperella and two species of genus Actinomyces could be identified phenotypically, by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) fingerprinting and by genotypic techniques. The strains were characterized by determination of cultural properties, their hemolysis, by detection of synergistic and antagonistic hemolytic reactions, by determination of various biochemical properties and by investigating their peptidic profiles by MALDI-TOF MS. The latter appeared to be a novel technique which allowed a rapid and reliable identification and characterization of all strains investigated in the present study. A molecular approach was performed by 16S rDNA analyses, by sequencing of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region (ISR), the 23S rDNA and gene cpn60 encoding heat shock protein or chaperonin CPN60. The sequencing results allowed the design of species specific oligonucleotide primers which could be used for molecular identification of all investigated strains of genera Arcanobacterium and Trueperella isolated from various origins. The additionally performed PCR-mediated amplification of the seven known and putative virulence factor encoding genes plo, cbpA, nanH, nanP, fimA, fimC and fimE of the A. (T.) pyogenes investigated in the present study allowed an individual strain characterization. This might help to clarify the role such putative virulence factors play in infections caused by this bacterial pathogen. The 23 A. (T.) abortisuis strains isolated from samples of pigs and cows in a period of 12 years were mainly isolated together with various other bacteria from the urogenital tract of pigs and cows with varying clinical symptoms. Among these strains only three A. (T.) abortisuis were isolated from cases of abortion, indicating that the role this species plays as causative agent for abortion remains to be elucidated. The three A. haemolyticum strains investigated in the present study were isolated together with various other bacterial species from infections of three horses, indicating that this well-known human pathogenic bacterium could also be isolated from infections of horses possibly caused by a cross infection between the horse owner and the horse. The three additionally investigated A. weissii strains of the present study were isolated from the oral cavity of three dogs. These strains, displaying synergistic CAMP-like activities with various indicator strains and a reverse CAMP-reaction in the zone of staphylococcal ß-hemolysin, could be characterized by conventional tests, by MALDI-TOF MS fingerprinting and by 16S rDNA, 23S rDNA and cpn60 gene sequencing as novel species of genus Actinomyces, for which the name A. weissii with the type strain A. weissii 2298T (CIP 110333T) was proposed.

The liver contains two networks: 1) the microvessels network also named liver sinusoids and 2) the bile canalicular network. The disruption of the bile canalicular network leads to improper bile flow, cholestasis and toxicity of the liver cells. Relatively little is known about the organization of the bile canalicular network in healthy livers and it is not completely described after liver intoxication, regeneration and fibrosis processes. Therefore, the goals of the present study are to: i) establish a mouse model of acute hepatoxicity by carbon tetrachloride injection; ii) determine the maintenance and establishment of hepatocellular polarity during the intoxication and regeneration processes; and iii) reconstruct the bile canalicular network of the normal, intoxicated and regenerated as well as fibrotic mouse livers. In the present study, I used carbon tetrachloride as a well accepted model for liver cell destruction, intoxication and fibrosis induction. The obtained results describing the liver intoxication and regeneration process were in agreement with published data. Therefore, the liver tissue after acute and chronic administration of carbon tetrachloride could be used to analyze the bile canalicular network under conditions of acute liver damage and fibrosis. The steps of the normal hepatic micro-architecture restoration after liver intoxication could be summarized as follows: i) the proliferating hepatocytes maintained their polarity; ii) the daughter hepatocytes are aligned in the direction of the closest microvessels; and iii) the existing bile canaliculus is invaginated between the daughter hepatocytes to establish a novel branch. Currently, there is no technique available to quantify the bile canalicular network. Therefore, to understand the architecture of the bile canalicular network and to bridge this gap, a method for analyzing three dimensional organization of the bile canaliculi and hepatic sinusoids was established using confocal microscopy and image analysis. Based on the reconstructed data sets of the healthy mice, I could detect some basic structures of the bile canalicular network including: 1) the bile canaliculi form three half-hexagonal belts around the hepatocytes. Two halves are connected to form a belt and third half sometimes is connected to the belt or formed an unconnected branch; 2) two classes of bile canaliculi could be differentiated. Whereby canaliculi of first class are oriented in parallel to the closest sinusoid and the second class of bile canaliculi are perpendicular to the sinusoid; 3) three hepatocytes surrounding one sinusoid form a frequently observed basic building block; 4) hepatic sinusoids are surrounded by a hexagonal belt of bile canaliculi; 5) unconnected branches of the bile canalicular network ‘dead ends’ were observed; and 6) bile canaliculi are located mainly at the center of the lateral surface or very rarely at the edges of the hepatocyte surface. The disruption of the bile canalicular network was recorded in injured livers. This disruption includes disappearance of the network in damaged areas (necrotic and fibrotic) and an increase in the number of the unconnected branches in the surviving tissue. A ‘fish bone’ appearance was also frequently recorded in the tissue with the surviving hepatocytes. The current study demonstrates that the architecture of the bile canalicular network clearly differs from the way it is presented in textbooks. It represents a low order network but some basic features and building principles are maintained all over the tissue. Liver damage induces a tightly controlled sequence of events by which the bile canalicular network is reconstructed. Die Leber besteht aus zwei unabhängigen Netzwerken: 1) dem Mikrogefäßnetzwerk, Sinusiodalnetzwerk genannt und 2) einem Netzwerk von Gallengängchen. Beeinträchtigungen am Gallengangnetzwerk führen zu Cholestase und zur Schädigung von Leberzellen. Über die Organisation des Gallengangnetzwerks in der Leber ist bisher wenig bekannt und ist nur zu Teilen für Vergiftung, Regeneration und Fibrose beschrieben. Das Ziel dieser Arbeit ist es i) ein Modell der akuten Tetrachlorkohlenstoffvergiftung zu erstellen, ii) die Erhaltung bzw. den Neuaufbau der Leberzellenpolarität während der Lebervergiftung und der Regeneration zu untersuchen und iii) eine Rekonstruktion des Gallengangnetzwerks der gesunden, vergifteten und regenerierenden Mausleber zu erstellen. In dieser Arbeit verwendete ich Tetrachlorkohlenstoff als Lebertoxin. Dieses Modell ist gut verstanden und akzeptiert zur Untersuchung von Leberzelltod, Vergiftung und Leberfibrose. Die erhaltenen Daten bestätigen die bereits publizierten Ergebnisse, so dass die gewonnenen Gewebeproben von akuter und langzeitbehandelter Leber zur Analyse des Gallengangnetzwerks in geschädigter und fibrotischer Leber gebraucht werden konnten. Die Schritte der Wiederherstellung der normalen Lebermikroarchitektur können wie folgt zusammengefasst werden: i) die proliferierenden Zellen behalten die Zellpolarität bei, ii) Tochterzellen richten sich an den anliegenden Sinusoidzellen aus und iii) aus bereits bestehenden Gallengängen werden neue zwischen die Tochterhepatozyten getrieben, um weitere Zweige auszubilden. Bis heute gibt es noch keine Möglichkeit zur Quantifizierung des Gallengangnetzwerk. Zum besseren Verständnis des Netzwerks wurde eine Methode zur Analyse der dreidimensionalen Organisation des Gallengang- und des sinusoidalen Netzwerks mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie und Bildverarbeitung entwickelt. Basierend auf den gemessenen Datensätzen von gesunden Mäusen konnte ich einige grundlegende Strukturen des Netzwerks finden: 1) die Gallengängchen bilden drei halbhexagonale Gürtel um die Hepatozyte. Zwei Halbe sind miteinander verbunden und bilden einen Gürtel und der dritte Halbe kann ebenfalls verbunden sein oder aber auch ein Sackgassenende ausbilden; 2) es können zwei Klassen von Gallengängen unterschieden werden. Wobei Gallengänge der ersten Klasse sich parallel am angrenzenden Sinusoid ausrichten, im Gegensatz dazu aber die Gallengänge der zweiten Klasse sich senkrecht dazu erstrecken; 3) drei Hepatozyten, die einen Sinusoid umgeben bildet eine oft vorgefunden Grundstruktur; 4) Sinusoide sind von einem hexagonalen Gürtel aus Gallengängchen umgeben; 5) es existieren freie Enden im Gallengangnetzwerk - ‚dead ends’; und 6) Gallengängchen befinden sich hauptsächlich in der Mitte der flachen Seite der Hepatozyte, nur sehr selten sind sie entlang der Kante der Hepatozyte zu finden. Die Zerstörung des Gallengangnetzwerks wurde in Tetrachlorkohlenstoff geschädigter Leber untersucht. Diese Zerstörung zeigt sowohl ein Verschwinden des Netzwerks in den geschädigten Arealen (nekrotisch und fibrotisch), als auch eine vermehrte Anzahl an freien Enden der Gängchen in den gesunden Arealen. Das Gallengangnetzwerk im angrenzenden gesundeten Gewebe zeichnete sich häufig durch ein fischgrätenartiges Muster aus. Diese Studie zeigt, dass die Architektur der Gallengänge sich von den gängigen Beschreibungen in Lehrbüchern unterscheidet. Es handelt sich um ein Netzwerk von geringer Ordnung, aber mit einigen grundlegenden Mustern und Aufbauprinzipien des Gewebes. Leberschädigung löst einen streng regulierten Regenerationsmechanismus aus, der zur Wiederherstellung des Gallengangsystems führt.

Terahertz electromagnetic fields are non-ionizing electromagnetic fields in the frequency range from 0.1 to 10 THz. Potential applications of these electromagnetic fields include the whole body scanners, which currently apply millimeter waves just below the terahertz range, but future scanners will use higher frequencies in the terahertz range. These and other applications will bring along human exposure to these fields. Up to now, only a limited number of investigations on biological effects of terahertz electromagnetic fields have been performed. Therefore, research is strongly needed to enable reliable risk assessment.Cells were exposed for 2 h, 8 h, and 24 h with different power intensities ranging from 0.04 mW/cm(2) to 2 mW/cm(2), representing levels below, at, and above current safety limits. Genomic damage on the chromosomal level was measured as micronucleus formation. DNA strand breaks and alkali-labile sites were quantified with the comet assay. No DNA strand breaks or alkali-labile sites were observed as a consequence of exposure to terahertz electromagnetic fields in the comet assay. The fields did not cause chromosomal damage in the form of micronucleus induction.

Cytochrom P450-Enzyme (CYPs) sind an der Metabolisierung körpereigener und körperfremder Substanzen beteiligt. Hierbei spielen Polymorphismen in einzelnen CYPs, welche zu einem Ausfall der Enzymfunktion führen, eine wichtige Rolle bei bekannten interindividuellen Unterschieden im pharmakokinetischen Profil bestimmter Arznei- und Fremdstoffe. In präklinischen Studien, in denen Hunde als Versuchstiere eingesetzt werden, aber auch in der tierärztlichen Praxis kann dadurch sowohl die Wirksamkeit als auch die Verträglichkeit der Arzneitherapie beeinflusst sein. Das humane CYP1A2 ist an der Metabolisierung von Methylxanthinen wie Coffein und Theobromin beteiligt, jedoch lässt dies nicht auf eine identische Substratspezifität bei Hunden schließen. Theobrominvergiftungen bei Hunden, insbesondere als Folge von Schokoladenverzehr werden häufig in der tierärztlichen Praxis vorgestellt und sind in der Literatur vielfach beschrieben. Der Hund stellt im Vergleich zu anderen Tierarten und dem Menschen eine Spezies mit besonderer Empfindlichkeit gegenüber Theobromin dar. Dies ergibt sich aus speziesspezifischen Unterschieden in der Präferenz der Demethylierungsposition bei der Metabolisierung von Theobromin. Allerdings wurde darüber hinaus von einer interindividuell sehr unterschiedlichen Verträglichkeit von Theobromin beim Hund berichtet. Es wurde vermutet, dass hierfür ein CYP1A2 1117C>T Polymorphismus verantwortlich sein könnten, welcher in homozygoter Ausprägung zu einem Totalausfall der CYP1A2 Enzymaktivität führt. Das Ziel dieser Studie war es, mögliche Unterschiede im Metabolismus und der Pharmakokinetik von Theobromin bei CYP1A2 1117C/C (Wildtyp) und 1117T/T (CYP1A2 defizient) Beagle Hunden zu ermitteln. Sowohl die intravenöse als auch die per orale Applikation von Theobromin führte zu signifikanten Unterschieden im metabolischen Profil der getesteten Hunde und legt die Beteiligung des caninen CYP1A2 bei der Metabolisierung von Theobromin beim Hund nahe. CYP1A2 defiziente Hunde wiesen signifikant höhere Plasma-AUC-Werte und eine längere Halbwertzeit für Theobromin auf. Sowohl im Plasma als auch im Urin konnten niedrigere Konzentrationen der Metaboliten 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure nachgewiesen werden. Die signifikant verminderte Körperclearance von Theobromin bei den CYP1A2 defizienten Hunden weist auf einen längeren Verbleib der Substanz im Körper hin und lässt die Schlussfolgerung zu, dass CYP1A2 1117T/T-Hunde bei Aufnahme höherer Dosen empfindlicher auf Theobromin reagieren als CYP1A2 1117C/C-Hunde. Daher könnte der CYP1A2 1117 Genotyp an der interindividuell unterschiedlichen Empfindlichkeit von Hunden gegenüber Schokolade beteiligt sein. Cytochrome P450 enzymes (CYPs) are involved in the metabolism of endogenous and exogenous substances. CYP polymorphisms are known to cause inter-individual differences in pharmacokinetic profiles of certain drugs and xenobiotics. In preclinical studies with dogs, these polymorphisms influence the efficacy and safety of new chemical entities, and confound the efforts to study these chemicals under controlled conditions. Human CYP1A2 is involved in the metabolism of caffeine and theobromine, however it does not predict substrate specificity in dogs. Dogs are uniquely sensitive to theobromine, and theobromine toxicity in dogs due to consumption of chocolate is frequently reported in the literature. Furthermore, individual dogs are differently sensitive against chocolate consumption and this observation has made it difficult for researchers to fully understand chocolate toxicity in dogs. In the present study we hypothesized that the CYP1A2 1117 C>T polymorphism, which leads to a complete loss of enzyme function, may be involved in the individual theobromine tolerance in dogs. Therefore, we aimed to analyse potential differences in the metabolism and pharmacokinetics of theobromine in CYP1A2 1117C/C (wild-type) and 1117T/T (CYP1A2 deficient) Beagle dogs. Both, intravenous and oral administrations of theobromine indicated significant differences in the metabolic profiles of theobromine and confirmed that canine CYP1A2 is involved in theobromine metabolism. CYP1A2 deficient dogs showed higher plasma AUC values and longer half-lifes of theobromine compared with CYP1A2 wild-type dogs. In plasma and urine lower concentrations of the metabolites 3-methylxanthine, 7-methylxanthine and 3,7-dimethyluricacid were detected in the 1117T/T dogs. Furthermore, the body clearance of theobromine was significantly reduced in the group of CYP1A2 deficient dogs, leading to longer retention times in the body. Based on this data we assume that consumption of higher doses of theobromine may result in more pronounced accumulation and more severe toxicosis of theobromine in the 1117T/T dogs. In conclusion, these results support the hypothesis that polymorphisms in the canine CYP1A2 are at least in part responsible for the well-known inter-individual differences in the sensitivity against theobromine and even chocolate in dogs.

In nahezu allen Organen und Geweben des Organismus kommt Transportsystemen eine wichtige physiologische Bedeutung zu. Aufgrund der Kompartimentierung ist es für den Stoffwechsel essentiell, dass es schlecht oder nicht permeablen Substanzen ermöglicht werden kann, Biomembranen zu überwinden. Die humanen organischen Kationentransporter hOCT1, hOCT2 und hOCT3 aus der SLC22-Genfamilie transportieren sowohl endogene als auch pharmakologisch relevante exogene Substanzen. Diese Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert, u. a. im Gehirn, wo sie in Neuronen, Gliazellen und im Plexus choroideus zu finden sind. Defekte der hOCTs werden mit bei Patienten differierenden Plasmamedikamentenspiegeln und starken Nebenwirkungen bei der Einnahme von Medikamenten assoziiert. Seit der Entdeckung und Erstbeschreibung der hOCT sind bereits sehr viele Substrate auf ihre Wechselwirkungen mit diesen Transportern untersucht worden. Zu den Substraten gehören endogene Substanzen wie Cholin oder Monoamin-Neurotransmitter, Xenobiotika wie MPP oder TEA, so wie kationische Pharmaka wie Metformin oder Cisplatin. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Stoffe, die zwar nicht transportiert werden, aber die Aktivität der hOCTs hemmen. Dieses ist auch pharmakokinetisch relevant, da beispielsweise die Gabe eines hOCT-hemmenden Medikamentes (z. B. Glukokortikoide) die Ausscheidung eines anderen Pharmakons hemmen kann und damit zu erhöhten Plasmaspiegel führt, was für etwaige Nebenwirkungen mitverantwortlich sein kann. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Psychopharmaka (Desipramin, Doxepin, Imipramin, Citalopram, Mirtazapin, Amisulprid, Quetiapin) Substrate der hOCTs darstellen, was aufgrund ihrer Struktur (kationisch bei physiologischem pH, Molekulargewicht < 500) möglich wäre oder ob sie als Inhibitoren dieser Transporter wirken können. Dies ist zum einen zum genaueren Verständnis der Pharmakokinetik von Bedeutung, zum anderen könnte eine Hemmung der hOCTs möglicherweise auch für die Wirkung dieser Pharmaka mitverantwortlich sein. So wird beispielsweise vermutet, dass hOCTs an der Elimination extrazellulärer Neurotransmitter im Gehirn beteiligt sind, ihre Hemmung könnte also einen erhöhten Neurotransmitterspiegel hervorrufen. Zur Durchführung dieser Untersuchungen wurden die hOCTs in transfizierten CHO- und HEK293 Zellen heterolog exprimiert und die Aktivität der Transporter durch die szintigraphische Messung der Aufnahme radioaktiv markierter Substrate bestimmt. Bei den getesteten Psychopharmaka ließ sich -ausser bei Doxepin über hOCT1- kein hOCT-vermittelter Transport nachweisen. Es ist jedoch nicht auszuschliessen, dass dieser durch die hohe endogene Transportaktivität überdeckt wird und dadurch mit der hier angewandten Messmethode nicht nachweisbar ist. Alle Psychopharmaka hemmten jedoch die Aktivität aller drei hOCT-Subtypen. Die ermittelten IC50-Werte lagen hierbei im mikromolaren Bereich. Die höchsten Affinitäten wurden für die Interaktion von Doxepin und Imipramin mit hOCT2 bestimmt (1,3µM bzw. 1,4µM). Alle ermittelten Werte liegen jedoch über den therapeutischen Werten im Serum des Menschen. Diese Arbeit soll einen kleinen Beitrag zum näheren Verständnis von Struktur, Funktionsmechanismen, Regulation und Arbeitsweisen von Transportproteinen, insbesondere der OCT-Familie leisten. Bis zur definitiven Aufklärung muss noch sehr viel Forschung betrieben werden, die weiteren Ergebnisse und daraus erwachsenden Fragestellungen bleiben spannend. In almost all organs and tissues of the organism transport systems play a vital physiological role. Due to compartmentation it is essential for metabolism that poorly permeable or impermeable substances are enabled to overcome biomembranes. The human organic cation transporters hOCT1, hOCT2 and hOCT3 belonging to the SLC22 gene family transport endogenous as well as exogenous pharmacologically relevant substances. These proteins are expressed in various tissues, among others in the brain where they can be found in neurons, glia cells as well as in the plexus choroideus. Defects of the hOCTs are associated with differing plasma drug levels of patients and severe side effects when on medication. Since the discovery and first description of hOCTs a lot of substrates have already been examined with regard to their interactions with these transporters. The substrates comprise endogenous substances such as choline or monoamine neurotransmitters, xenobiotics such as MPP or TEA as well as cationic pharmaceuticals such as metformin or cisplatin. In addition to these there are numerous substances not being transported but inhibiting the activity of hOCTs. This is also of pharmacokinetic relevance as for example the administration of a hOCT inhibiting drug (e. g. glucocorticoids) can inhibit the elimination of another pharmaceutical thus leading to an elevated plasma level, which may be partly responsible for possible side effects. The aim of this thesis was to examine whether psychotropic drugs (Desipramin, Doxepin, Imipramin, Citalopram, Mirtazapin, Amisulprid, Quetiapan) represent substrates of the hOCTs, which would be possible due to their structure (cationic at physiological pH, molecular weight < 500), or whether they can act as inhibitors of these transporters. On the one hand this is of importance for a more precise understanding of pharmacokinetics, on the other hand an inhibition of the hOCTs could possibly also be partly responsible for the effect of these pharmaceuticals. For example it is supposed that hOCTs play a role in the elimination of extracellular neurotransmitters in the brain. Thus their inhibition could evoke an elevated neurotransmitter level. For the carrying out of these examinations the hOCTs were heterologously expressed in transfected CHO- and HEK293 cells and the transporters´ activity was determined by scintigraphic measurement of the uptake of radiolabeled substrates. With none of the tested psychotropic drugs -except in the case of Doxepin via hOCT1- a hOCT-mediated transport could be established. However, it cannot be excluded that such transport might be masked by the high endogenous transport activity and therefore cannot be established with the measuring method applied in this study. All the psychotropic drugs however inhibited the activity of all three hOCT subtypes. The IC50 values obtained were within the micromolar range. The highest affinities were determined for the interaction of Doxepin and Imipramin with hOCT2 (1.3µM, 1.4µM respectively). However, all the values obtained are above human therapeutic serum values. This thesis shall make a small contribution to a closer understanding of the structure, functional mechanisms, regulation and mode of operation of transport proteins, especially those belonging to the OCT-family. For a complete and definitive understanding a lot of research work has yet to be undertaken. Further findings and arising questions remain exciting.

Die inverse Regulation des Multidrug Resistance Protein 2 (Mrp2) und 3 (Mrp3) stellt einen wichtigen Mechanismus zur Reduktion des cholestatischen Leberschadens dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die zonale Expression der Gallensalztransportpumpe (Bsep), des "Natrium-Taurocholat-Cotransporting- Polypeptid" (Ntcp) und 3 Isoformen der Familie organischer Anionentransporter (Oatp1a1, Oatp1a4 und Oatp1b2) bei obstruktiver Cholestase und nach LPSGabe in der Rattenleber untersucht. In der normalen Rattenleber waren Bsep, Ntcp und Oatp1a1 zonal homogen verteilt. Die Expression von Oatp1a4 und Oatp1b2 waren in Hepatozyten der Zone 3 stark exprimiert. Die Expression nahm zur Zone 1 hin kontinuierlich ab. Glutaminsynthetase-positive Hepatozyten wiesen eine deutlich geringere Expression von Oatp1a4 auf als die umliegenden Hepatozyten der Zone 3. Bei obstruktiver Cholestase kam es zu einer signifikanten Herabregulation von Bsep und Ntcp in periportalen Hepatozyten, während die Expression in perivenösen Hepatozyten unverändert blieb. Periportale Hepatozyten zeigten zunehmend Bsep- und Ntcp-positive intrazelluläre Vesikel. Oatp1a4 wurde in Glutaminsynthetase-positiven perizentralen und in periportalen Hepatozyten induziert. Oatp1b2 wurde ebenfalls in periportalen Hepatozyten induziert. Nach Hemmung von TNF-α und IL-1ß war die periportale Herabregulation von Bsep reversibel. Die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Expression von IL-1ß war periportal deutlich stärker ausgeprägt als perizentral. Die übrigen untersuchten Transporter wurden in ihrer Expression und Zonierung nach Hemmung von TNF-α und IL- 1ß nicht beeinflusst. Nach Gabe von LPS trat keine signifikante Zonierung der untersuchten Transporter auf. Die zonale Herabregulation von Bsep bei obstruktiver Cholestase wird somit durch eine portale Entzündung ausgelöst und durch TNF-α und IL-1ß vermittelt. Die periportale Induktion von Oatp1a4 und Oatp1b2, sowie die periportale Herabregulation von Ntcp könnten eine Rolle bei dem vermehrten basolateralen Export und der verminderten Aufnahme von cholephilen Substanzen in Hepatozyten mit deutlicher Herabregulation von Bsep und Mrp2 spielen. Inverse acinar regulation of multidrug resistance protein 2 (Mrp2) and 3 (Mrp3) represents an important adaptive response to reduce hepatocellular cholestatic injury. This study investigated zonal expression of bile salt export pump (Bsep), natrium cotransporting polypeptid (Ntcp), organic anion transporting polypeptid 1a1 (Oatp1a1), organic anion transporting polypeptid 1a4 (oatp1a4) and organic anion transporting polypeptid 1b2 (Oatp1b2) in rat liver following bile duct ligation (BDL) and LPS treatment. In normal rat liver Bsep, Ntcp, Oatp1a1 were homogeneously zonated, whereas Oatp1a4 and Oatp1b2 expression gradually decreased from zone 3 to 1. Glutamine synthetase-positive pericentral hepatocytes had a marker lower Oatp1a4 peak immunofluorescence than the remaining zone 3 hepatocytes. In cholestatic rat liver Bsep and Ntcp peak immunofluorescence in periportal hepatocytes significantly decreased, whereas peak immunofluorescence in pericentral hepatocytes was not significantly altered. Periportal hepatocytes further showed a fuzzy Bsep and Ntcp membrane staining and increasing Bsepand Ntcp-positive vesicles. Oatp1a4 was induced in periportal hepatocytes and in glutamine synthetase-positive pericentral hepatocytes. Likewise Oatp1b2 was induced in periportal hepatocytes. Inactivation of IL-1ß and TNF-α largely inhibited periportal down-regulation of Bsep. Recruiting of neutrophile granulocytes and expression of IL-1ß were more pronounced in periportal hepatocytes regulation and zonation. The other investigated transporters were not influenced by inactivation of TNF-α or IL-1ß. No significant transporter zonation was seen following LPS treatment. Zonal down-regulation of Bsep in obstructive cholestasis thus is triggered by portal inflammation and mediated by TNF-α and IL-1ß. Induction of periportal Oatp1a4 and Oatp1b2 as well as periportal downregulation of Ntcp may play a role in compensatory basolateral export and decreased uptake of cholephilic substances in hepatocytes with profound downregulation of Bsep and Mrp2. The mechanism described could contribute to reduce liver injury in obstructive cholestasis.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen konnten 11 Referenzkulturen von neun Spezies der Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella, 43 A. phocae-Kulturen, isoliert von Seehunden und einer Kegelrobbe, sieben A. haemolyticum-Kulturen, isoliert von Pferden, eine A. pluranimalium-Kultur, isoliert von einem Hund, drei A. (T.) bialowiezense-Kulturen und sieben A. (T.) bonasi-Kulturen, isoliert vom Europäischen Bison, zwei A. (T.) pyogenes- Kulturen, isoliert von einer Bartagame und einem Gecko, und 26 A. (T.) pyogenes-Kulturen, isoliert von Rindermastitiden, phänotypisch und genotypisch identifiziert und weitergehend charakterisiert werden. Die Identifizierung der Arcanobacterium- bzw. Trueperella-Kulturen war aufgrund von kulturellen Eigenschaften, durch Nachweis der Hämolyse bzw. synergistischer oder antagonistischer Hämolysereaktionen und durch Nachweis biochemischer Eigenschaften möglich. Eine molekulare Charakterisierung der Arcanobacterium- bzw. Trueperella- Kulturen erfolgte durch 16S rDNA-Analysen und, als bislang für diese Gattungen noch nicht beschriebene Gen- bzw. Genomabschnitte, durch Sequenzierung der 16S-23S rDNA intergenic spacer-Region (ISR), der 23S rDNA, des Superoxid Dismutase A-kodierenden Gens sodA und durch Sequenzierung des die Beta-Untereinheit der RNA-Polymerasekodierenden Gens rpoB. Die Ergebnisse der ISR- bzw. der 16S rDNA und 23S rDNASequenzierungen führten zur Erstellung von spezifischen Oligonukleotidprimern für drei ISRGenospezies von A. phocae (ISR-Gruppe I bis III) und für sechs weitere Spezies der Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella. Dies ermöglichte eine PCR-vermittelte Identifizierung der jeweiligen ISR-Genospezies bzw. Spezies. A. phocae-ISR-Gruppe I konnte im weiteren durch ein A. phocae-sodA-spezifisches Oligonukleotidprimerpaar und durch das Phocaelysinkodierende Gen phl, die A. haemolyticum-Kulturen durch das Phospholipase D-kodierende Gen pld und die A. (T.) pyogenes-Kulturen durch das Pyolysin-kodierende Gen plo weitergehend charakterisiert werden. Das Phocaelysin-kodierende-Gen phl von A. phocae stellt, vergleichbar mit dem Pyolysin-kodierenden-Gen plo von A. (T.) pyogenes, das Gen eines bisher noch nicht beschriebenen porenbildenden Toxins von A. phocae dar. Die Charakterisierung von drei ISR-Genospezies von A. phocae korrelierte mit dem Nachweis des Phocaelysin-kodierenden Gens phl (ISR-Gruppe-I) und mit einigen kulturellen und biochemischen Merkmalen der Kulturen. Die Bedeutung dieser Unterschiede für die taxonomische Einordnung von A. phocae ist bislang allerdings noch unklar. Die phänotypische und genotypische Identifizierung der bisher nur als humanpathogen bekannten Spezies A. haemolyticum, isoliert von Pferden, einer A. pluranimalium-Kultur, isoliert von einem Hund, und auch der A. (T.) pyogenes-Kulturen, isoliert von einer Bartagame und einem Gecko, gelang erstmalig bei den jeweiligen Tierarten. Die Isolierung der unterschiedlichen Spezies der Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella der vorliegenden Untersuchungen erfolgte in der Regel mit zahlreichen weiteren Mikroorganismen unterschiedlicher Spezies, sodass, mit Ausnahme für die A. (T.) pyogenes- Kulturen, isoliert von Rindermastitiden, über die Bedeutung der Arcanobacterium- bzw. Trueperella-Kulturen für das jeweilige Krankheitsbild keine abschließende Aussage getroffen werden kann. Die in den vorliegenden Untersuchungen aufgeführten konventionellen und molekularen Verfahren könnten die diagnostische Erkennung von Bakterien der Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella in klinischem Untersuchungsmaterial verbessern helfen und darüber hinaus, zur Klärung der Bedeutung dieser Bakterien bei Infektionen von Tier und Mensch beitragen. In the present study 11 reference cultures of nine species of genera Arcanobacterium or Trueperella, 43 A. phocae cultures, isolated from harbour seals and one grey seal, seven A. haemolyticum-cultures, isolated from horses, one A. pluranimalium culture, isolated from a dog, three A. (T.) bialowiezense and seven A. (T.) bonasi cultures, isolated from the European bison, two A. (T.) pyogenes cultures, isolated from a bearded dragon and a gecko, and 26 A. (T.) pyogenes cultures, isolated from mastitic cows, could be phenotypically and genotypically identified and further characterized. All Arcanobacterium or Trueperella cultures of the present study could be identified by cultural properties, their hemolysis, by detection of synergistic and antagonistic hemolytic reactions and by determination of biochemical properties. A molecular characterization of the Arcanobacterium or Trueperella cultures was realized by 16S rDNA-analyses and, with gene or genome parts which had not been investigated for these genera, by sequencing of the 16S- 23S rDNA intergenic spacer region (ISR), the 23S rDNA, the superoxide dismutase A encoding gene sodA and the beta subunit of RNA polymerase encoding gene rpoB. The results of ISR, 16S rDNA and 23S rDNA sequencing allowed the design of specific oligonucleotide primers for three ISR-genospecies of A. phocae (ISR group I toIII) and for six additional species of genera Arcanobacterium or Trueperella. This allowed a PCR-mediated identification of the respective ISR-genospecies or species. The A. phocae ISR group I could be further characterized by using an A. phocae sodA specific oligonucleotide primerpair and by amplification of the phocaelysin encoding gene phl, the A. haemolyticum cultures by amplification of phospholipase D encoding gene pld and the A. (T.) pyogenes cultures by amplification of pyolysin encoding gene plo. The phocaelysin encoding gene phl of A. phocae represents, comparable to the pyolysin encoding gene plo of A. (T.) pyogenes, a gene of a pore forming toxin of A. phocae which has not yet been described. The occurrence of three genospecies of A. phocae correlated with the detection of phocaelysin encoding gene phl (ISR group I) and some cultural and biochemical characteristics of the cultures, although their significance for the taxonomic position of A. phocae remains unclear. The phenotypic and genotypic identification of the species A. haemolyticum from horses, a species which has been regarded so far as a human pathogen, the A. pluranimalium culture, isolated from a dog, and the A. (T.) pyogenes species, isolated from a bearded dragon and a gecko, could for the first time be approved for the respective animal species. The isolation of 150 the different species of genera Arcanobacterium or Trueperella of the present study usually occurred with a number of various other microorganisms of different bacterial species. Consequently, with the exception of the A. (T.) pyogenes cultures, isolated from bovine mastitis, no final statement about the importance of the Arcanobacterium or Trueperella cultures for the respective disease could be made. However, the conventional and molecular techniques which are described in the present study could contribute to improve the diagnostic detection of bacteria of genera Arcanobacterium or Trueperella and to clarify the significance of these bacteria in animal and human infections.

Die SLC10-Familie ist bekannt als die Familie der Na+-abhängigen Gallensäuretransporter. NTCP und ASBT sind die Gründungsmitglieder dieser Familie und verantwortlich für die Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren. Die Identifizierung weiterer Mitglieder führte zu einer Neubetrachtung dieser Familie. In der vorgelegten Arbeit wurde zum ersten Mal das sechste Familienmitglied, der humane Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT (SLC10A6), molekular und funktionell charakterisiert. Der humane SOAT ist ein Protein mit 377 Aminosäuren und besitzt das SLC10-Signaturmotiv „ALGMMPL“. Seine höchste Verwandtschaft hat SOAT zum ASBT, mit welchem er eine Subfamilie bildet. SOAT ist ein transmembranäres Glykoprotein mit wahrscheinlich sieben TMD und einer Nex/Cin-Topologie. In stabil transfizierten Zellen wurde SOAT auf seine Transporteigenschaften untersucht. Im Gegensatz zu NTCP und ASBT zeigt SOAT keinen Transport der Gallensäuren Taurocholat, Cholat, Lithocholat, Deoxycholat und Chenodeoxycholat. Stattdessen transportiert er die sulfatierten Steroidhormone DHEAS, E1S und PREGS, welche auch Substrate des NTCP, aber nicht des ASBT sind. Weiterhin stellen die sulfatierte Gallensäure TLCS und die Xenobiotika 2-SMP und 4-SMP Substrate des SOAT dar. In Hemmstudien zeigten insbesondere Substanzen mit mindestens zwei Hydrocarbonringen und einer negativ geladenen Sulfatgruppe eine starke Interaktion mit dem SOAT-Transport. Der Transport über den SOAT ist Na+-abhängig und erreicht erst bei physiologischen Na+- Konzentrationen sein Transportmaximum. Weiterhin weist dieser bei pH-Werten

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen konnten S. aureus-, S. intermedius- und S. hyicus-Kulturen unterschiedlicher Herkunft zunächst durch phänotypische und genotypische Eigenschaften identifiziert und anschließend weitergehend, unter besonderer Berücksichtigung der Exfoliativen Toxingene, charakterisiert werden. Aufgrund der unklaren taxonomischen Stellung und einer fehlenden Abgrenzung gegenüber S. pseudintermedius wurden die S. intermedius-Kulturen der vorliegenden Untersuchungen als S. intermedius-Gruppe (SIG) bezeichnet. Eine Differenzierung der Staphylokokkenkulturen war aufgrund von kulturellen Eigenschaften, durch Nachweis der Hämolyseformen, der Koagulasereaktion und verschiedener anderer biochemischer Kriterien möglich. Eine molekulare Identifizierung der S. aureus-Kulturen erfolgte durch PCR-vermittelten Nachweis des Thermonuklease-kodierenden Gens nuc, des S. aureus-spezifischen Abschnitts Sa442 innerhalb der chromosomalen DNA und des Protein A-kodierenden Gens spa, der SIG-Kulturen durch Nachweis des Thermonuklease-kodierenden Gens nuc und eines speziesspezifischen Abschnitts des Co-Chaperon-DnaJ-kodierenden Gens dnaJ und der S. hyicus-Kulturen durch Nachweis des Superoxid Dismutase A-kodierenden Gens sodA und eines S. hyicus-spezifischen Abschnitts der 16S-23S rDNA „intergenic spacer“ Region. Die Etablierung eines PCR-vermittelten Nachweissystems für Exfoliative Toxingene ergab für S. aureus, isoliert vom Menschen, nicht aber vom Tier, den vereinzelten Nachweis der ETA- und ETB-kodierenden Gene eta und etb, für SIG bei nahezu allen untersuchten Kulturen den Nachweis des SIET-kodierenden Gens siet und für S. hyicus den Nachweis der Exfoliativen Toxine ExhC-, ExhD- und SHETA-kodierenden Gene exhC, exhD und sheta. Der Nachweis der Exfoliativen Toxingene bei S. hyicus schien mit dem Krankheitsbild der Exsudativen Epidermitis korreliert zu sein. Die Bedeutung des bei nahezu allen SIG-Kulturen vorkommenden Toxingens siet ist bislang noch unklar. Für S. aureus-Isolate vom Menschen und erstmalig bei S. aureus-Isolaten vom Tier konnte im weiteren das Chemotaxis inhibiting Protein-kodierende Gen chp nachgewiesen werden. Eine weitergehende Charakterisierung der SIG war durch Nachweis der Enterotoxin-, Leukotoxin-, Adenylsuccinatlyase- und Chemotaxis inhibiting Protein-kodierenden Gene se-int, lukS, lukF, purB und chp möglich. Bei ausgewählten SIG-Kulturen waren ferner die gemeinsam auftretenden Resistenzgene gegenüber Penicillin und Methicillin blaZ und mecA feststellbar. Diese ausgewählten SIG-Kulturen zeigten einen identischen DNA-Fingerprint, was auf die Verbreitung eines einheitlichen Methicillin-resistenten Bakterienklons in der Hunde und Katzenpopulation hindeutet. Die in den vorliegenden Untersuchungen vorgestellten PCR-vermittelten Nachweissysteme ermöglichten eine eindeutige Identifizierung und, insbesondere für SIG und S. hyicus, eine weitergehende Charakterisierung hinsichtlich des Vorkommens mutmaßlicher Toxin- und Resistenzgene. Der Nachweis unterschiedlicher Genausstattungen bei S. aureus, SIG und S. hyicus durch die teilweise erstmals vorgestellten molekularen Nachweisverfahren könnte zu einer Abschätzung des krankmachenden Potentials einzelner Staphylokokkenstämme beitragen und letztlich eine Erklärung für das jeweilige Krankheitsbild bei Tier und Mensch geben. Within the framework of the present study, S. aureus-, S. intermedius- und S. hyicus-cultures of different origins could be firstly identified through phenotypic and genotypic properties and further characterized with the exfoliative toxingenes been taken under consideration. As a result of the unclear taxonomic situation and a missing border opposite to S. pseudintermedius, the S. intermedius-cultures of the present study, were characterized as S. intermedius-Group (SIG). A differentiation of the staphylococcal cultures was based on cultural properties, through proving hemolysis forms, the coagulase reaction and other biochemical criteria. A molecular identification of S. aureus-cultures was carried out through PCR-mediated detection of the thermonuclease-encoding gene nuc, of the S. aureus-specific section Sa442 within the chromosomal DNA and the protein A-encoding gen spa, the SIG-cultures by detection of the thermonuclease encoding gene nuc and a specific part of the Co-Chaperon-DnaJ-encoding gene dnaJ and the S. hyicus-cultures by detection of the superoxide Dimutase A-encoding gene sodA and a S. hyicus-specific section of the 16S-23S rDNA „intergenic spacer“ region. Establishment of PCR-mediated detection-systems for exfoliative toxingenes has shown for S. aureus, isolated from man, not from animal, the separate proof of the ETA-and ETB-encoding gens eta and etb for SIG for almost all tested cultures the evidence of SIET-encoding gene siet and for S.hyicus the evidence of the exfoliative toxins ExhC-, ExhD- und SHETA-encoding genes exhC, exhD and sheta. Evidence of the exfoliative toxingenes in S. hyicus seemed to be correlated with clinical picture of the disease exudative epidermitis. The significance of the occurring toxingenes siet in almost all SIG-cultures is so far vague. For S. aureus-isolates from man and for the first time for S. aureus-isolates from animal, the chemotaxis inhibiting protein- encoding gene chp could be furthermore identified. A further characterization of the SIG was possible through identifying the enterotoxin-, leucotoxin-adenylsuccinatlyase- and chemotaxis-inhibiting protein-encoding genes se-int, lukS, lukF, purB and chp. In selected SIG-cultures the commonly occurring resistence-genes against penicillin und methicillin blaZ und mecA were detectable. These selected SIG-cultures showed an identical DNA-fingerprint, pointing to the spread of a unique methicillin-resistant bacterial clone in dog and cat population. The PCR-mediated detection systems presented in this study have enabled a definite identification and, particularly for SIG and S. hyicus, a further characterization regarding the appearance of supposable toxin- und resistence gene. The recognition of differient gene configurations, in S. aureus, SIG and S. hyicus through the partially for the first time presented molecular evidence process could help an estimation of the pathogenic potentials of single staphylococcus strains and finally an explanation for the particular disease symptoms in animal and man.

Herzinsuffizienz ist ein progressives klinisches Syndrom, charakterisiert durch das Unvermögen des Herzens den Kreislauf mit genügend Blut zu versorgen. Ein Rezeptor, der an den Herzinsuffizienz begleitenden Remodelling Prozessen, beteiligt zu sein scheint, ist der „peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa). In der Tat, scheint der PPARa bei Patienten mit Herzinsuffizienz herunter reguliert zu sein und soll außerdem antihypertrophe und antifibrotische Wirkungen auf das Myokard haben. Ziel dieser Studie war es daher, die Rolle von PPARa bei den mit Herzinsuffizienz assoziierten Remodelling Prozessen mit Hilfe einer durch Ischämie- (chronischer Myokardinfarkt Modell) und Hypertonie- (deoxycorticosterone Acetate / DOCA Salz Modell) induzierten Herzinsuffizienz, zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die Effekte der Aufhebung der PPARa Aktivität bei knock-out (KO) Mäusen mit der normalen Aktivität in Wildtyp (WT) Mäusen und Aktivierung von PPARa durch den PPARa Agonisten, Fenofibrate (80 mg/kg/d), in den zwei oben erwähnten Modellen, verglichen. Zusätzlich wurde die Fenofibratebehandlung mit einer Standardtherapie mit einem ACE Hemmer, Ramipril (10 mg/kg/d), verglichen. Die linksventrikuläre Funktion wurde 9 Wochen nach Ligation der Koronararterie oder 6 Wochen nach Anfang der DOCA Behandlung mittels invasiver hämodynamischer Messungen bewertet. Genexpression für Hypertrophie und Fibrose wurde mittels real-time PCR Analyse gemessen. Schließlich wurden Plasma Lipidprofile ermittelt. Zusätzlich wurde die Nierenfunktion mittels Diurese in dem DOCA Modell bestimmt. PPARa KO Mäuse mit durch Ischämie induzierter Herzinsuffizienz zeigten signifikant reduzierte Überlebensraten nach der Operation im Vergleich zu den WT Mäusen (60 % im Gegensatz zu 80%). Beide Modelle resultierten in einer Hypertrophie des linken Ventrikels, was durch eine Gewichtsermittlung und Biomarkeranalyse gezeigt werden konnte. In beiden Modellen, sowohl bei WT als auch bei KO herzinsuffizienten Mäusen verglichen zu deren respektiven scheinoperierten Tieren, konnte eine zwei- bis zehnmal erhöhte Genexpression für Hypertrophie und Fibrose nachgewiesen werden. Zusätzlich, zeigten KO Mäuse eine höhere Genexpression für myosin heavy chain b (MyHCb), collagen und tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) als WT Mäuse (fast 3fache Erhöhung). Die Behandlung mit dem ACE Hemmer Ramipril konnte die Erhöhung der Biomarker sowohl in der Gruppe der WT, als auch in der Gruppe der KO Mäuse verhindern, während Behandlung mit dem PPARa Agonist Fenofibrate, wie erwartert, nur einen Effekt bei den WT, nicht aber bei den KO Mäusen, zeigte. In beiden Modellen, wurde die Verschlechterung der Morphologie ebenso in einer Verschlechterung der Herzfunktion wiedergespiegelt. Obwohl die Basalwerte der Hämodynamikmessungen vergleichbar zwischen scheinoperierten WT und KO Tieren waren, wurden große Unterschiede in den anderen Gruppen festgestellt. Kontraktilität (LVdp/dtmax) und Relaxation (LVdp/dtmin und Relaxationskonstante tau) waren verschlechtert in der Gruppe der KO Mäuse verglichen zu der der WT Mäuse (etwa 20%). Ähnlich zu der Morphologie, zeigten KO Mäuse eine verschlechterte Herzfunktion verglichen mit der der WT Mäuse. Wiederum konnte die Behandlung mit Ramipril die Herzfunktion der WT und KO Mäuse teilweise wiederherstellten, während eine Behandlung mit Fenofibrate lediglich bei den WT Mäusen, nicht aber bei den KO Mäusen eine Verbesserung ermöglichte. Schließlich zeigt diese Studie, dass die Expressions- und Aktivitätshöhe von PPARa die Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber Herzinsuffizienzentwicklung bedingt. Der Mangel an PPARa Aktivität verursacht eine höhere Empfindlichkeit der KO Mäuse gegenüber einer Herzinsuffizienz und eine Verschlechterung der damit assoziierten Remodellingsprozesse und der Herzfunktion. Im Gegensatz dazu führt eine Behandlung mit Fenofibrate zur Wiederherstellung der mit einer Herzinsuffizienz einhergehenden herabgesetzten PPARa Aktivität. Im Zuge dessen verbessert Fenofibrate eine durch Ischämie und Hypertonie induzierte Herzinsuffizienz. Seine Wirkung erzielt es bei Mechanismen involviert in Energie Homöostase und / oder Matrix Remodelling, antifibrotische- und antihypertrophe Prozesse. Zusammenfassend kann man sagen, dass eine Normalisierung der PPARa Aktivität bei PPARa Agonisten sehr nützlich bei Patienten mit Herzinsuffizienz ist und unbedingt Inhalt weiterer klinischer Untersuchungen sein sollte. Heart failure is a progressive clinical syndrome which is characterized by the inability of the heart to pump or fill with a sufficient amount of blood through the systemic circulation. One receptor, which seems to be involved in the remodelling processes accompanying the progression of heart failure, is the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa). Indeed, it seems that PPARa is downregulated in patients with heart failure and has antihypertrophic and antifibrotic effects on the myocardium. Thus, the aim of this study was to investigate the role of PPARa in the remodelling processes related to heart failure, in models of ischemia (chronic myocardial infarction model) and hypertension (deoxycorticosterone acetate / DOCA salt model) induced heart failure, the two most important causes of heart failure development in patients. To this end, the effects of abrogation of PPARa activity in knock-out (KO) mice were compared to normal activity in wild-type (WT) mice and activation of PPARa by the PPARa agonist fenofibrate (80 mg/kg/d) in the two aforementioned models. Furthermore the treatment with fenofibrate was compared to a standard therapy with the ACE inhibitor ramipril (10 mg/kg/d). Left ventricular function was evaluated via invasive haemodynamic measurements 9 weeks after coronary ligation and 6 weeks after beginning of DOCA treatment. Left ventricular expression profiles of hypertrophy and fibrosis genes were analyzed by real-time PCR. At last, lipid profiles in the plasma were measured. In the DOCA model, kidney function was additionally measurement by diuresis. PPARa KO mice with ischemia induced heart failure showed a significantly reduced survival compared to WT mice after surgery (60 % compared to 80%). Both models resulted in hypertrophy of the left ventricle which was also reflected in the biomarker analysis. For both models markers of hypertrophy and fibrosis were enhanced compared to Sham mice. Furthermore KO mice showed higher levels of myosin heavy chain b (MyHCb), collagen and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) than WT mice (almost 3 fold increase). On the contrary, treatment with fenofibrate or ramipril could prevent increases of the biomarkers in WT mice but not in KO mice. In both models, worsening of morphology was also reflected in the cardiac function. Although baseline haemodynamics were similar in sham WT and Sham KO mice, they were significantly differing between the treated WT and KO mice. Indeed, contractility (LVdp/dtmax) and relaxation (LVdp/dtmin and relaxation constant tau) were more impaired in KO compared to WT mice. Similarly to the morphology, KO mice showed more impaired cardiac function than WT mice and treatment with fenofibrate and ramipril partially restored ventricular function in WT but not KO mice. In conclusion, this study shows that the level of PPARa expression and activity determines the susceptibility of mice towards heart failure development. The absence of PPARa activity renders KO mice tremendously more sensitive for heart failure development and worsens remodelling processes and heart function. On the contrary, treatment with fenofibrate to normalize PPARa activity, which is reduced in heart failure, ameliorates heart failure development in ischemia and pressure overload induced heart failure by mechanisms involved in energy homeostasis and/or anti matrix remodelling, antifibrotic and antihypertrophic processes. The normalization of PPARa activity by PPARa agonists should, therefore, be beneficial in patients and is of value for further clinical investigations.

Im Jahre 2004 wurde am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Justus-Liebig-Universität in Giessen ein neues Transportprotein kloniert, das aufgrund seiner Substrate als Sodium-dependent Organic Anion Transporter, (SOAT) bezeichnet wurde. Wegen seiner Sequenzhomologie wurde der SOAT als SLC10A6 der SLC10-Familie zugeordnet, die bis dahin als Natrium/Gallensäuretransporter-Familie bezeichnet wurde. Im Gegensatz zu den bis dahin bekannten Mitgliedern der SLC10 -Familie NTCP und ASBT transportiert SOAT keine Gallensäuren. Zu seinen Substraten zählen die sulfatierten Steroide Estron-3-sulfat (E1S), Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) und Pregnenolonsulfat. Sulfatierte Steroide spielen eine herausragende Bedeutung im Zusammenhang mit Estrogen-abhängigen Mammatumoren beim Menschen. Zwei Drittel des Brustkrebses treten in der postmenopausalen Phase auf. Der wesentliche Teil dieser Tumore ist Estrogen-abhängig, obwohl in dieser Lebensphase die Plasmaspiegel aktiver Estrogene unter dem biologisch wirksamen Niveau liegen. Es finden sich aber auch in der Postmenopause micromolare Konzentrationen der sulfatierten Steroide E1S und DHEAS im Plasma. Diese können im Mammatumorgewebe nach Aufnahme in die Zellen in einer intrakrinen Synthese in die aktiven Estrogene Estron (E1) und Estradiol (E2) umgewandelt werden. Aufgrund seines Substratspektrums und seiner nachgewiesenen Expression in Mammatumorgewebe ist SOAT möglicherweise an der intrakrinen Synthese von Estrogenen in Brustkrebsgewebe beteiligt. Um die Bedeutung des SOAT für die Steroidsulfat-abhängige Proliferation von Mammatumoren zu untersuchen, wurde die Estrogen-abhängige Mammatumor-Zelllinie T47D mit einem Expressionsvektor des SOAT transfiziert. Funktionelle Expression des Proteins wurde überprüft durch RT-PCR und Aufnahmemessungen mit [3H]E1S. Die Sensitivität der Zellen für E1S wurde in einem Proliferationsassay in Form des EC50 der E1S-Konzentration im Medium bestimmt. Es zeigte sich, dass SOAT-transfizierte T47D-Zellen mit einem EC50 von 2,2 ± 0,3 nM eine 10fach höhere Sensitivität für E1S aufweisen als die Kontrollen mit 21,7 ± 2,1 nM. Dieser Effekt war durch den Estrogenrezeptor-Antagonisten Tamoxifen und den Steroidsulfatase-Inhibitor STX64 hemmbar, wodurch gezeigt werden konnte, dass der SOAT-Effekt Estrogenrezeptor-abhängig und an die intrakrine Synthese von Estrogenen aus E1S gekoppelt ist. Darüber hinaus war die SOAT-vermittelte Proliferation hemmbar durch die SOATInhibitoren 2-und 4-Sulfooxymethylpyren. Es konnte somit gezeigt werden, dass SOAT an der E1S-vermittelten Proliferation von Mammatumoren beteiligt sein kann und dass der Einfluss des SOAT durch spezifische Hemmstoffe aufgehoben werden kann. SOAT ist demnach als Target für die antiendokrine Therapie von Estrogen-abhängigen Mammatumoren vorstellbar. At the Institute of Pharmacology and Toxicology of the Justus-Liebig-University in Giessen in 2004 a new Transporter was cloned, that because of its substrates was called Sodium dependent Organic Anion Transporter (SOAT). Due to its sequence homology it was classified as SLC10A6 in the SLC10-family, hitherto called sodium bile salt cotransport family.In contrast to the other members of the SLC10-family, NTCP and ASBT, SOAT does not transport bile acids. To its substrates belong the sulfated steroids estrone-3-sulfate (E1S), dehydroepiandrosterone sulfate and pregnenolone sulfate. Sulfated steroids play an importante role in the context of estrogen dependent breast cancer in women. Two third of the mamma tumors occur in the postmenopausal period of life, despite the fact, that the plasma levels of active estrogens in this period is below biological effective concentrations. In contrast sulfated steroids are still present in the plasma in micro molar concentrations. These are precursors for the intrakrine synthesis of the active estrogens estrone (E1) and estradiol (E2) in breast cancer tissue after uptake in the cells. Because of its substrate spectrum and proved expression in mamma tumor tissue SOAT may be involved in intrakrine estrogen synthesis in breast cancer. To clear the significance of SOAT in this context, the estrogen dependent breast cancer cell line T47D was transfected with an expression vector for SOAT. Functional expression of SOAT in the transfected cell line was proved by RT-PCR and uptake measurements with [3H]E1S. E1S sensivity was determined as EC50 of E1S concentration in a proliferation assay. In this assay SOAT transfected T47D cells showed with an EC50 of 2,2 ± 0,3 nM a 10fold enhanced sensitivity to E1S compared to control (EC50 21,7 ± 2,1 nM). This effect was reversible by the estrogen receptor antagonist tamoxifen and the steroid sulfatase inhibitor STX64. Thereby the estrogen receptor dependence of the SOAT effect could be shown as well as the coupling to the intrakrine synthesis of free estrogens. Furthermore the SOAT mediated proliferation was inhibited by the SOAT inhibitors 2- and 4-sulfooxymethylpyrene. In summary the study shows, that SOAT may be involved in E1S mediated proliferation of breast cancer and that its impact can be inhibited by specific inhibitors. Thereby SOAT is conceivable as target in the pharmacological therapy of breast cancer.

Die Ursache der renalen Anämie bei chronischem Nierenversagen beruht in den meisten Fällen auf einem Mangel an Erythropoietin. Zurzeit werden weltweit etwa 300.000 Dialysepatienten, die infolge eines chronischen Nierenversagens an einem absoluten Erythropoietinmangel leiden, mit rekombinantem humanem Erythropoietin (EPO) behandelt. Bei dem heute üblichen Therapieregime wird EPO dreimal wöchentlich subkutan oder intravenös verabreicht. In der Literatur wird immer wieder von Patienten mit einer EPO-resistenten Anämie aufgrund der Antikörperbildung gegen EPO berichtet. Ziel der vorliegenden Studie war es, verschiedene neue erythropoietische Wirkstoffe (Ro 50 und MIX) im Vergleich zu dem herkömmlichen EPO im Hinblick auf die Erythropoiese im chronischen Nierenversagen an der Ratte zu untersuchen. Zudem wurde die Antikörperproduktion gegen diese neue Wirkstoffe und EPO gesondert untersucht. Die Studie wurde in drei Abschnitte unterteilt. Im ersten Experiment wurde die Effektivität der beiden neuen erythropoietischen Wirkstoffe (Ro 50 und MIX) im Vergleich zu EPO und einer Kontrollgruppe bezüglich der Stimulierung der Erythropoiese untersucht. Im zweiten Experiment wurde die Wirkung des im Experiment 1 besseren Wirkstoffes im Vergleich zu EPO und einer Kontrollgruppe bei unterschiedlicher Applikationsfrequenz beobachtet. Im dritten Experiment wurde dann eine Dosis-Wirkungskurve für den neuen erythropoietischen Wirkstoff Ro 50 aufgestellt und die Entwicklung einer immunologischen Antwort auf die Medikation untersucht. Das Auftreten eventueller Nebenwirkungen wurde in allen 3 Experimenten geprüft. Zur Erzeugung eines chronischen Nierenversagens wurde bei allen Ratten zu Beginn des Versuches eine fünfsechstel-Nephrektomie durchgeführt. Während der Versuchszeit wurden Messungen von relevanten Nieren- und Leberfunktionsparametern, des Blutdrucks und der Körpermasse vorgenommen. Die Tiere wurden nach Versuchsende seziert und ein Organspektrum wurde histologisch aufgearbeitet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der Wirkstoff Ro 50 eine deutlich bessere Stimulierung der Erythropoiese im Vergleich zu der Mischung (MIX) bewirkt. Ro 50 zeigte dabei bei einer einmaligen wöchentlichen subkutanen Applikation eine vergleichbare gesteigerte Effektivität wie bei der dreimaligen wöchentlichen Behandlung, die gewöhnlich bei der EPO-Therapie benötigt wird, um eine ausreichende Stimulierung der Erythropoiese zu erreichen. Darüber hinaus konnte keine Antikörperproduktion und somit eine Reduzierung der Immunogenität bei Ro 50, im Gegensatz zu EPO, aufgrund der Polymeranknüpfung festgestellt werden. Für die Anwendung des Wirkstoffes Ro 50 statt EPO beim Menschen bedeuten diese Ergebnisse, dass die Applikation wesentlich vereinfacht würde und dass die Probleme, die durch die Immunogenität von EPO auftreten (Therapieresistenz duch Antikörper gegen EPO), bei einer Therapie mit Ro 50 nicht erwartet werden müssen. Die Resultate der histologischen Untersuchung der Nieren zeigen, dass im chronischen Nierenversagen die längerfristige Behandlung sowohl mit EPO als auch mit Ro 50 nicht zu einer beschleunigten Verschlechterung des Nierenversagens führt. Die patho-histologische Untersuchung der übrigen Organe, wie Knochenmark, Milz, Leber und Lunge zeigte keine substanzabhängigen bzw. toxisch bedingten Veränderungen, die mit der Medikation in Verbindung gebracht werden könnten. Die Überdosierung der Medikation (10-fache Dosierung) kann jedoch, so zeigt diese Studie, zur Verschlechterung des Allgemeinbefindens mit gesteigertem Gewichtsverlust, Entstehung von Bluthochdruck, Krämpfen und Lähmungen führen. Die Auswertungen der hier vorliegenden Studie zeigen, dass Ro 50 erheblich verbesserte Eigenschaften gegenüber EPO besitzt und eine vielversprechende Neuentwicklung eines erythropoietischen Wirkstoffes ist, mit dem Ziel, die Anämie des chronischen Nierenversagens des Menschen zu therapieren. Renal anemia with chronic renal failure is in most cases based on erythropoietin deficiency. At the moment 300.000 dialysis patients who suffer from an absolute erythropoietin deficiency as a result from chronic renal failure are treated world-wide with a recombinant human erythropoietin. With today´s usual method of treatment EPO is given subcutaneously or intravenously three times a week. In literature it is reported again and again about patients with an EPO resistant anemia caused by the development of antibody against EPO. The aim of the present study was to examine the effect of new erythropoietic agents (Ro 50 and MIX) compared to the conventional EPO with regard to the erythropoiesis with chronic renal failure of the rat. Moreover the production of antibody against these agents and EPO has been investigated separately. The study has been divided into three sections. In the first experiment the effectiveness of the new erythropoietic agents (Ro 50 and MIX) that had to be tested were examined and compared to EPO and a control group in respect of the stimulation of erythropoiesis. In the second section of the experiment, the effects of these new agents of the first section were observed and compared to EPO and a control group with different application-frequencies. In the third experiment a dosis-effect graph has been established for the new erythropoietic agent Ro 50 and the development of an immune response to the medication has been examined. The occuring of possible side effects has been examined in all three sections. To create a renal failure a five-sixth nephrectomy was carried out with all rats at the beginning of the experiment. During the time of the study the parameters for relevant kidney and liver functions were taken, blood pressure was taken and the body weight was controlled. At the end of the experiment the animals were dissected and an organ spectrum was histologically reconditioned. The results of this study show that the agent Ro 50 had an obviously better stimulation of the erythropoiesis compared to the other agent (MIX). Ro 50 thereby showed that a subcutaneous application once a week had a comparable higher effectiveness than a treatment three times a week, which is usually needed at an EPO therapy, in order to obtain a sufficient stimulation of the erythropoiesis. Furthermore no production of antibody could be found and therefore a reduction of the immunogenicity against Ro 50 in contrary to EPO could be discovered. For the application of the modification Ro 50 instead EPO with human beings these results mean that the application can be simplified considerably and that the problems, which occur by the immunogenicity of EPO (resistance to treatment through antibodies against EPO) are not to be expected by a therapy with Ro 50. The results of the histological examination of the kidneys show that in case of chronic renal failure the long-term treatment with EPO as well as with Ro 50 does not cause an accelerated worsening of renal failure. The patho-histological examination of the other organs like bone marrow, spleen, liver and lungs did not show any alteration caused by a substance or toxicity which could be connected to the medication. An overdose of the medication (10 times doses) can however, as the study shows, cause a worsening of the general condition with an increased loss of weight, high blood pressure, spasms and paralysis. To summarize, the analysis of the present study shows that the new erythropoietic agent Ro 50 has far better characteristics compared to EPO in order to treat anemia with chronic renal failure of the human being.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues pharmakokinetisches Modell zur Untersuchung der hepatobiliären Ausscheidung von Xenobiotika bei Mäusen mit Transportdefekten etabliert. Das Modell erlaubt die Zuordnung eines Arzneistoffs als neues Substrat zu einem bestimmten Arzneistofftransporter sowie Untersuchung der möglichen unerwünschten Wirkungen von Substanzen bei Tieren mit entsprechenden Transportdefekten. Untersucht wurde die Elimination der Modellsubstanzen Selamectin, Ivermectin und Digoxin als Substrate für MDR1-Transporter sowie Phalloidin und Ouabain als Substrate für MRP2 Carrier. Die Antiparasitika Ivermectin und Selamectin weisen in dieser Studie keine Unterschiede in der Pharmakokinetik und in der Gehirnkonzentration zwischen bcrp1 (-/-), mrp1 (-/-) Knockout und FVB Wildtyp-Mäuse sowie zwischen Wistar- und mrp2-defizient TR(-) Ratten auf. Auch in der hier präsentierten Studie wurde die therapeutische Sicherheit bei der Anwendung von Selamectin beim MDR1-/- Genotyp nachgewiesen. Die Ergebnisse der in situ Galleausscheidung von Digoxin bei der Maus zeigen erhebliche Unterschiede in der Organverteilung zwischen der mdr1a,b(-/-) Knockout- und Wildtyp-Maus bei einer reduzierten Gallenausscheidung. Ebenfalls eine reduzierte Gallenausscheidung zeigen TR(-) Ratten im Vergleich zu Wistar-Ratten. Die Ergebnisse an TR(-) Ratten und Knockout-Mäusen zeigten, dass das Mrp2 Efflux-Transportsystem für einen Hauptteil wenn nicht sogar für die gesamte Ausscheidung des Phallotoxins über die Galle verantwortlich ist. Im Vergleich zu Mrp2 wurde kein signifikanter Transport über die Mdr1- und Bcrp-Transporter bei der in situ Galleausscheidung gemessen. Im Unterschied zur Galle enthielt der Urin von Wistar-Ratten nur Spuren der applizierten [³H]-DMP Dosis, und dies ist auch deutlich weniger im Vergleich zu den TR(-) Ratten. Dies zeigt, dass die reduzierte hepatobiliäre Ausscheidung durch eine gesteigerte Elimination durch die Niere kompensiert wurde. Die Ergebnisse zur Untersuchung der Pharmakokinetik von Ouabain weisen auf ein erheblichen biliären Ausscheidungsdefizit bei den TR(-) Ratten im Vergleich zur Wildtyp-Ratte hin, was durch einen gesteigerte Harnexkretion kompensiert wird. In der Maus-Versuchen wurde festgestellt, dass Ouabain über Bcrp transportiert wird, da bei den bcrp1 (-/-) Knockout-Mäusen eine reduzierte Ausscheidung im Vergleich zum Wildtyp gemessen wurde. Der Mdr1 Transporter spielt bei der Ausscheidung von Ouabain offenbar keine Rolle. The present thesis serves to introduce a pharmacokinetic model for investigating the hepatobiliary excretion of xenobiotics in mice with defects in transport systems. The model allows the classification of drug transported by certain system as well as the relation to side effects due to transport failure in animals. Examined were the elimination of selamectin, ivermectin und digoxin, all substrates of the MDR1 carrier, and of phalloidin und ouabain, transported by MRP2 carrier. The antiparasitics Ivermectin and Selamectin did not exhibit any differences in pharmacokinetics and the brain concentrations between bcrp1 (-/-), mrp1 (-/-) knockout and FVB wild-type-mices. These results were also found in Wistar and mrp2-deficient TR(-) rats. The investigation further demonstrated a therapeutical safety of selamectin applied to animals with a the MDR1-/- genotype. The results of in situ bile excretion in the mice exhibit a strong difference in organ distribution as well as a reduced excretion of digoxin between mdr1a,b(-/-) knockout- und wild-type. The same could be observed in TR(-) rat compared to Wistar. The data obtained in TR(-) rat and knockout mice reveal that the Mrp2 efflux system is responsible for main excretion of phalloidin into the bile. In contrast to Mrp2 the Mdr1 and Bcrp- transport systems are not significantly involved in the phalloidin bile excretion. In the urine of Wistar rats only traces of administered [³H]-DMP whereas elevated levels were measured in TR(-) rat. These results show that the reduced hepatobiliary elimination was compensated by an increased kidney excretion. The pharmacokinetic data of ouabain point to a strong defect in bile excretion in TR(-) rats compared to Wistar which was compensated by enhanced urine elimination. Ouabain is transported by Bcrp as demonstrated by investigations in mice, since bcrp1 (-/-) knockout-mice exhibit a reduced excretion compared to wildtype. Mdr1 efflux carrier seems not to be involved in the ouabain transport.

In den vorliegenden Untersuchungen wurden insgesamt 325 präsumtiv identifizierte bovine S. aureus-Kulturen aus Viertelgemelksproben der Routinediagnostik des LHL, Gießen verwendet. Die Isolate stammten aus unterschiedlichen Regionen in Hessen aus Betrieben mit zum Teil hochgradigen Eutergesundheitsstörungen. 310 Stämme zeigten phänotypisch eine Hämolyse, 15 waren anhämolysierend. Unter Verwendung verschiedener Genotypisierungsverfahren (Makrorestriktionsanalyse, coa-/spa-Gen-Polymorphismus) erfolgte unter den hämolysierenden Stämmen eine Auswahl von 61 genetisch differenten S. aureus-Isolaten für die weitergehenden Untersuchungen. Ergänzt wurden diese durch die 15 anhämolysierenden S. aureus-Kulturen. Traten genotypisch identische S. aureus-Feldisolate in einem Betrieb mehrfach (≤ 6 Kulturen) bei verschiedenen Kühen auf, wurde das betreffende Isolat als „epidemisch“ gewertet. Nur vereinzelt auftretende Genotypen galten als „sporadisch“. Alle 76 ausgewählten Feldstämme wurden nach eingehender kultureller, biochemischer und molekularbiologischer Speziesidentifizierung hinsichtlich mutmaßlicher Virulenzfaktorgene, wie z.B. Anheftungsfaktor-, Mikrokapsel-, Hämolysin- und weiterer Toxingene untersucht. Zur Beurteilung des krankmachenden Potentials erfolgte eine Zuordnung der Zellzahl der Ursprungsviertelgemelksprobe zu Eigenschaften von jedem dieser ausgewählten S. aureus-Feldisolate (Viertel-Zellzahl), ebenso wie eine Zuordnung der durchschnittlichen Zellzahl der Viertelgemelksproben der untersuchten Viertel eines Betriebes, die positiv für die genotypisch identischen S. aureus-Isolate waren (Betriebs-Zellzahl). Die anschließend durchgeführte explorativ-statistische Auswertung ergab signifikante Zusammenhänge zwischen dem epidemiologischen Verhalten und dem Auftreten der im egc-Gencluster zusammengefassten Enterotoxingene seg, sei, sem, sen und seo. Ebenso war das phänotypische Hämolyseverhalten statistisch signifikant mit dem Auftreten des egc-Genclusters verbunden. Bezüglich der genetischen Marker coa- und spa-Gen war die Repeat-Anzahl ebenfalls statistisch signifikant mit dem Auftreten des egc-Genclusters korreliert. Und schließlich ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Zellzahl der Ursprungsviertelgemelksprobe und dem egc-Gencluster. Zusätzlich erwies sich der Zusammenhang zwischen Zellzahl und der Anzahl der spa-Gen-Repeats als statistisch signifikant. Das Auftreten des sbi-Gens innerhalb der Gruppe der „sporadischen“ S. aureus-Kulturen erwies sich als hochsignifikant. Weitere Signifikanzen ergaben sich bei den „sporadische“ S. aureus gegenüber der Summe der Enterotoxin-, der Anheftungsfaktorgene und der Anzahl der spa-Repeats. Die Summe aller Virulenzfaktoren erwies sich ebenfalls als statistisch hochsignifikant. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das egc-Gencluster und die Anzahl der spa-Gen-Repeats in der Pathogenese der durch S. aureus hervorgerufenen Mastitis offensichtlich eine Rolle spielen. Dabei scheint allgemein den phänotypisch beta-hämolysierenden Stämmen eine größere Bedeutung zuzukommen, da die betreffenden Feldstämme ein statistisch signifikant höheres Virulenzpotential aufwiesen. Auch die Anzahl an spa-Gen-Repeats könnte als genetischer Marker eingesetzt werden, da diese mit dem Auftreten verschiedener Virulenzgene positiv assoziiert sind. Die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Verfahren könnten die Auswahl des für das Eutergesundheitsproblem des Betriebes entscheidenden S. aureus-Stammes erleichtern und die Herstellung einer stallspezifischen Vakzine unterstützen. In the present study 325 presumptively identified S. aureus-strains from routine diagnostic of bovine quarter-milk samples of LHL, Giessen were used. The isolates were obtained from farms all over Hessia, Germany, with partly severe mastitic problems. 310 strains were phenotypically hemolytic, 15 were non-hemolytic. Using different methods of genotyping (PFGE analysis, coa/spa-gene polymorphism) among the hemolytic strains 61 genetically different S. aureus isolates were selected for further investigations. Additionally, the 15 non-hemolytic S. aureus-strains were used. If genotypically identical S. aureus field-strains were found several times in different cows of one farm (≤ 6 cultures) these isolates were classified as “epidemic”. Single genotypes were called “sporadic”. The species identity of the 76 field-strains was confirmed by cultural, biochemical and molecular methods. The 76 strains were additionally investigated for the presence of genes encoding potential virulence factors such as bindingproteins, microcapsule, hemolysins, and other toxins. To evaluate the potential of causing sickness the properties of each of the selected S. aureus field-isolates was related to the number of somatic cells of the original quater-milk-sample as well as to the average cell count of all investigated quater-milk-samples of the same farm with genotypically identical S. aureus isolates. In an additionally performed explorative-statistical evaluation significant correlations were found between epidemiological behaviour and the egc-gencluster (this is the gencluster with the combined enterotoxin genes seg, sei, sem, sen and seo). Furthermore there was a statistically significant correlation between the phenotypic property beta-hemolysis and the egc-gencluster. The number of repeats of the genetic marker “coa”- and “spa”-gene was statistically significant correlated with the egc-gencluster. In addition there was a significant correlation between cell count of the original quarter-milk sample and the egc-gencluster. Additionally the number of spa-repeats was statistically significant and the presence of sbi-gene was highly significant in the group of sporadic S. aureus. Further significant correlations were found in the total of the genes encoding enterotoxins, bindingproteins and the number of spa-repeats. The total of all virulence factors was statistically highly significant. In summary it can be concluded that the presence of the egc-gencluster and the number of spa-gene-repeats has obviously an importance in the pathogenesis of mastitis caused by S. aureus. It appears that the presence of phenotypically β-hemolytic strains seems to be more important, as these field-strains had a significant higher virulence potential. The spa-gene-repeats can also be used as genetic markers as their number was positively associated with different virulence genes. The results of the present study can help to select a S. aureus strain mainly involved in mastitic problems of a single farm. This strain could subsequently be used for production of a farm specific vaccine.

Die SBF-Proteindomäne (Sodium Bile acid symporter Family domain) kommt in zwei bereits charakterisierten Proteinfamilien vor, SLC10 und ACR3. Die ersten charakterisierten Mitglieder der SLC10-Familie sind die natriumabhängigen Gallensäuretransporter NTCP (SLC10A1) und ASBT (SLC10A2). Beide Transporter sind essentiell an der Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren beteiligt. In den letzten zwei Jahren wurden am Institut für Pharmakologie und Toxikologie vier neue Mitglieder (SLC10A3 bis 6) dieser Proteinfamilie identifiziert. Eines dieser Mitglieder, der SOAT (SLC10A6), transportiert keine Gallensäuren, sondern sulfatierte Steroide. Damit wurde offensichtlich, dass nicht alle Mitglieder der SLC10- Familie Gallensäurentransporter sind, was das bisherige Verständnis von der „Familie der Gallensäuretransporter“ grundlegend veränderte. Mitglieder der ACR3-Familie wurden ausschließlich in Hefen und Bakterien identifiziert und vermitteln einen Arsenit-resistenten Phänotyp. In der vorliegenden Arbeit wird ein neues Protein, genannt P7, von Mensch, Ratte, Maus und Frosch beschrieben. Diese Proteine wurden kloniert und charakterisiert. P7-Gene sind in 12 Exonen organisiert und bilden zahlreiche Transkriptionsvarianten. Drei dieser Varianten wurden in dieser Arbeit bei Mensch und Maus nachgewiesen und kloniert (P7 Variante 1 bis 3 bei Mensch und Maus). Die Variante 1 und 3 von Maus und 1 von Mensch verändern nicht das Leseraster, während Variante 2 und 3 von Mensch und 2 von Maus dies tun und zur Bildung vorzeitiger Stop-Codons und dadurch C-Terminal-trunkierter Proteine führen. P7-Gen wird im Körper sehr breit exprimiert, besonders stark in Herz, Gehirn, Leber, Milz, Dickdarm, Dünndarm und Nebenniere. P7-Proteine bestehen aus 340-343 Aminosäuren und zeigen über 85 % Sequenzidentität untereinander. Durch heterologe Expression in X. laevis-Oozyten wurden radioaktiv markierte Gallensäuren (Taurocholat, Cholat und Chenodeoxycholat), Steroidsulfate (Estron-3-sulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Pregnenolonsulfat), Eicosanoide (Prostaglandin E2 und Leukotriene C4), Digoxin und Estron-17ß-Glucuronid getestet. Allerdings konnte keine Transportaktivität für die getesteten Substanzen nachgewiesen werden. Durch strategisch eingebaute HA- und FLAG-Epitope und anschließende Immunfluoreszenz wurde für P7 eine Membrantopologie von 10 Transmembrandomänen mit einem intrazellulär lokalisierten N- und CTerminus bewiesen. P7 ist ein Protein von 27 kDa bei Mensch und Ratte und ist in der Plasmamembran lokalisiert. Der N-Terminus von P7 wird proteolytisch nicht gespalten. Weil P7 das 7. Säugetierprotein ist, welches die SBF-Domäne enthält, wurde es als SBFDCP7 „Sodium Bile acid Family Domain Containing Protein 7“ bezeichnet. Neben den Vertebraten- Proteinen wurden zahlreiche SBFDCP7-verwandte Sequenzen von Bakterien, Pflanzen und Hefen, die noch nicht charakterisiert worden sind, identifiziert. Die phylogenetische Verwandtschaft der SBF-Familie wurde analysiert. Unter der SBF-Familie existieren drei gut definierte Unterfamilien: ACR3, SBFDCP7 und SLC10. Zu den Mitgliedern der SLC10- und ACR3-Familie haben SBFDCP7 weniger als 15 % Sequenzidentität. Im Gegensatz dazu zeigen Vertebraten- und Bakterien-SBFDCP7 eine höhere Sequenzidentität (> 20 %). Damit hat die SBFDCP7-Familie die Besonderheit, im Gegensatz zu der SLC10- und ACR3-Familie, in allen drei Zweigen der belebten Natur vorzukommen, nämlich in Pflanzen, Bakterien und tierischen Lebewesen. SBFDCP7- Proteine zeigen eine vergleichbare Länge und Membrantopologie sowie zahlreiche konservierte Proteindomänen von E. coli bis Mensch, was auf eine konservierte physiologische Funktion hindeutet. Mit dieser Arbeit sind die grundlegenden genomischen und biochemischen Erkenntnissen zu dieser Proteinfamilie sowie die Expression von vier neuen Proteinen aufgeklärt worden. Ebenso liegen in dieser Arbeit die ersten phylogenetischen Daten dieser neuen Proteinfamilie SBFDCP7 vor. There are two well-characterized protein families, which contain the SBF protein domain (Sodium Bile acid symporter Family domain): SLC10 and ACR3. NTCP (SLC10A1) and ASBT (SLC10A2) are well-known sodium-dependent bile acid transporters. These carriers are essentially involved in the maintenance of the enterohepatic circulation of bile acids. In addition to NTCP and ASBT, we recently identified further members of the SLC10 family: SLC10A3 to A6. After the cloning of SOAT (SLC10A6), which specifically transports steroid sulfates but not bile acids it became evident that not all SLC10 members are bile acid transporters. The second SBF-family is referred to as ACR3 and is comprised of genes from bacteria and yeasts, which confer an arsenic-resistant phenotype. In this Ph.D. thesis a new protein, named P7, from man, rat, mouse, and frog, was cloned and characterized. P7 genes are organized in 12 exons and code numerous alternatively spliced transcription variants. Three variants from man and mouse were here identified and cloned. Variant 1 and 3 from mouse and variant 1 from man do not alter the open reading frame, whereas variant 2 and 3 from man and 2 from mouse conduct to premature stop codons and thus to C-terminal truncated protein isoforms. P7 genes are broadly expressed, among others, in heart, brain, liver, spleen, colon, small intestine, and adrenal glands. P7 proteins consist of 340-343 amino acids and have an overall sequence identity of > 85 %. P7 proteins were expressed heterologous in X. laevis oocytes and uptake studies with radioactive labelled bile acids (taurocholate, cholate, and chenodeoxycholate), steroid sulfates (estrone-3sulfate, dehydroepiandrosterone sulfate, and pregnenolone sulfate), eicosanoids (prostaglandine E2 and leucotriene C4), digoxine, and estrone- 17ß-glucuronide, were conducted. However, no transport activity could be detected for these compounds. With strategically inserted HA- and FLAG-epitopes and immunofluorescence microscopy a membrane topology of 10 transmembrane domains was demonstrated strengthening that both N- and C-terminus are intracellularly localized. P7 are membrane proteins of 27 kDa in man and rat. The N-terminus is not splitted off by proteolysis. Because P7 represents the 7th mammalian protein, which contains the SBF-domain, it was named SBFDCP7 Sodium Bile acid Family Domain Containing Protein 7. Phylogenetic relationships of the SBF-Family were analyzed. There are three well-defined SBF subfamilies among the SBF-family, e.i. ACR3, SBFDCP7, and SLC10. Compared with SLC10 and ACR3 family members SBFDCP7 show < 15 % sequence identity. By contrast, vertebrates and bacteria SBFDCP7 are more identical (> 20 % sequence identity). In contrast to SLC10 and ACR3 families, members of the SBFDCP7 family exist within the three branches of living organisms, namely in bacteria, plants, and animals. P7 proteins from E. coli to man show a similar length and membrane topology as well as many conserved protein domains. Therefore, a conserved physiological function of P7 is assumed. In this Ph.D. thesis the underlying genomic and biochemical knowledge of four new SBF proteins were clarified. Also, the first phylogenetical relationships of the new protein family SBFDCP7 are presented in this study.

Kurz nach der Geburt verlieren Kardiomyozyten ihre Proliferationsfähigkeit, das weitere Wachstum des Herzen erfolgt durch Hypertrophie. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die Proliferationsfähigkeit der Kardiomyozyten von embryonalen Stammzellen (ES Zellen) mit der neonataler Kardiomyozyten der Maus verglichen und der Effekt reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf die Proliferationsfähigkeit und die Kardiomyogenese untersucht. Geringe Konzentrationen H2O2 stimulierten die Kardiomyogenese von ES Zellen und induzierten die Zellproliferation der Kardiomyozyten, die aus ES Zellen und neonatalen Kardiomyozyten gewonnen wurden. Dies wurde anhand der Inkorporation von BrdU, der Steigerung der Ki-67-Expression, der Kerntranslokation von Zyklin D1, der Phosphorylierung des Retinoblastoms (Rb) und der verminderten Expression des p27KIP1 untersucht. Die beobachteten Effekte wurden in Anwesenheit der freien Radikalfänger Trolox und NMPG aufgehoben. In ES Zellen führte die Zugabe von ROS zu einer Expressionssteigerung der kardialen Gene a-CA, ANP, β-MHC, MLC 2a und MLC 2v, der herzspezifischen Transkriptionsfaktoren MEF 2C, DTEF 1, GATA 4 und Nkx 2.5 und des bei der Kardiomyogenese involvierten Wachstumsfaktors BMP-10. Die Behandlung der Kardiomyozyten mit ROS führte sowohl zu einer Steigerung der Proteinexpression der NADPH-Oxidase-Untereinheiten MOX 1, NOX 4, p22phox, p47phox und p67phox als auch zu einer Steigerung der NOX 1 und NOX 4 mRNA, was für eine vorwärtsgerichtete Regulation der ROS-Generierung spricht. Dem entsprechend verhinderte eine Inhibierung der NADPH-Oxidase durch DPI und Apocynin die ROS-induzierte Kardiomyogenese der ES Zellen. Die Daten sprechen dafür, dass bei der Proliferation der neonatalen und ES-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten ROS-vermittelte Signalkaskaden involviert sind und dass die NADPH-Oxidase die kardiovaskuläre Differenzierung der ES Zellen beeinflusst. Shortly after birth the proliferation of cardiac cells declines by so far unknown reasons, and further growth of the heart occurs by hypertrophic cell growth. In the present study the cell proliferation capacity of mouse embryonic stem cells versus mouse neonatal cardiomyocytes and the effects of reactive oxygen species on cardiomyogenesis and cardiac cell proliferation of ES cells was investigated. Low levels of ROS stimulated cardiomyogenesis and induced cell proliferation of ES-cell-derived and mouse neonatal cardiomyocytes as investigated by nuclear translocation of cyclin D1, downregulation of p27KIP1, phosphorylation of retinoblastoma, increase of Ki-67 expression and incorporation of BrdU. The observed effects were blunted in the presence of the free radical scavengers trolox and NMPG. In ES cells exogenous ROS induced the expression of the cardiac-specific genes α-CA, ANP, β-MHC, MLC 2a and MLC 2v as well as the cardiac-specific transcription factors MEF 2C, DTEF 1, GATA 4 and Nkx 2.5 and the cardiomyogenesis-assocciated growth factor BMP-10. Treatment of cardiac cells with ROS increased MOX 1, NOX 4, p22phox, p47phox and p67phox protein as well as NOX 1 and NOX 4 mRNA, indicating feed-forward regulation of ROS generation. Consequently, inhibition of NADPH oxidase with DPI and apocynin totally abolished ROS-induced cardiomyogenesis of ES cells. In summary, the data suggest that proliferation of neonatal and ES cell-derived cardiac cells involves ROS-mediated signalling cascades and point toward an involvement of NADPH oxidase in cardiovascular differentiation of ES cells.