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Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A silicose é causada pela inalação de partículas de sílica resultando em doença inflamatória crônica, com formação de granulomas e fibrose pulmonar. Neste trabalho avaliamos a quimiotaxia , a fagocitose via CRI e CRJ e, a produção de ânion superóxido por monócitos de vinte e um indivíduos expostos cronicamente à sílica, e de quinze indivíduos normais. Observamos que a mediana da migração espontânea de monócitos foi de 27,90_; a migração de monócios estimulada com soro humano normal e soro de paciente incubados com LPS, , foi de 66,90µ e de 62,85µ respectivamente, no grupo de indivíduos expostos à sílica; no grupo controle, a migração espontânea de monócitos foi de 28,77µ (p=0,91), e a migração de monócitos estimulada com soro controle, incubados com LPS, foi de 61,20µ (p=0,77;p=0,57).O índice fagocitário para partículas de zimosan incubadas com meio, soro humano normal e soro de pacientes ou soro controle apresentaram medianas de 13,98,69,57 e 71,09 respectivamente, nos indivíduos expostos à sílica, e de 17,54, 68,49 e 68,49 no grupo controle. (p=0,34;p=0,40 e p=0,40). A mediana da capacidade fagocitária destes pacientes foi de 134,25; 385,25 e 390,0 para partículas de zimosan incubadas com meio, soro humano normal e soro de paciente, e no grupo controle foi de 128,25; 365,25 e 362,25 respectivamente.(p=0,83; p=0,52 e p=0,87).A produção espontânea de ânions superoxidos por monócitos apresentou mediana de 4,03 nos indivíduos expostos à sílica e de 3,30 no grupo controle (p=0,69) e de 9,24 nos pacientes e de 9,52 no grupo controle (p=0,71), quando estimulados com zimosan.Portanto não encontramos diferença significativa nas funções fagocitárias destes indivíduos em relação aos indivíduos normais. Também não observamos correlação entre estas funções estudadas e a classificação radiológica, tempo de exposição ou antecedente para tuberculose. Estes resultados sugerem que a sílica desencadeia uma resposta imune que é modulada e controlada no pulmão, resultando em discreta manifestação sistêmica Abstract: The inhalation of silica partic1es leads to silicosis and the development of a chronic inflammatory disease involving granuloma formation and pulmonary fibrosis. In this work, we have evalueted the chemotaxis, CRI and CRJ mediated phagocytosis, and superoxide anion production of monocytes from 21 individuaIs who had experienced chronic exposure to silica and have compared the results with those from 15 unexposed individuals.In the former group, the median spontaneous monocyte migration distance was 27.9µ while that following stimulation by normal and patient's serum was 66.9 and 62.9µ in the presence of LPS, respectively. The corresponding values for monocytes from normal individuaIs were 28.8, 61.2 and 61.2µ. The monocyte phagocytic index in the presence of culture medium, normal serum and patient's serum was 14.0, 69.6 and 71.1, respectively, for the silica exposed individuaIs and 17.5, 68.5 and 68.5 for cells from unexposed persons. The median zymosan partic1e phagocytic capacity of patients monocyte in culture medium, normal serum and patient's serum was 134.3, 385.3 and 390.0, respectively, while the corresponding values for normal cells were 128.3, 365.3 and 362.3. The spontaneous production of superoxide anions was 4.0 and 3.3 nM/1O6cels/h in silica exposed and unexposed monocytes while in presence of zymosan these values were 9.2 and 9.5 nM/I06cels/h, respectively. ln none ofthe above monocyte function tests was there any significant difference between the cells fron silica-exposed and unexposed individuaIs. There was also no correlation between any of the tests results and the radilogical c1assification, length of exposure, or antecedents of tuberculosis. These results therefore suggest that silica initiates an immune response that is modulated and controlled within the lung although there may be subsequent discrete systemic manifestations Mestrado Imunologia Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Paulo Cesar Giraldo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Com a finalidade de investigar e comparar as células de defesa presentes na mucosa vaginal de mulheres com (vaginose bacteriana e candidíase vaginal) e sem vulvovaginites, foram avaliados esfregaços de 128 mulheres atendidas no Ambulatório de Infecções Genitais (AIG) do Departamento de Tocoginecologia (DTG) do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e Centro de saúde comunitário (CECOM), no período de junho à dezembro de 2001. Os esfregaços foram preparados com raspado de parede vaginal lateral à direita colhidos com cotonete estéril. A lâmina era rapidamente colocada em frasco de vidro contendo álcool 95% para fixação e posterior coloração com hematoxilina-eosina. Estudou-se sistematicamente a presença de células do tipo neutrófilos, linfócitos, macrófagos, eosinófilos, e plasmócitos em 32 mulheres com diagnóstico de candidíase vaginal, 32 com vaginose bacteriana e 64 sem infecção. Foram analisados dez campos microscópicos por lâmina em ocular de 10X e objetiva de 40X. Além do esfregaço citado, foram realizados exame bacterioscópico a fresco e corado pelo gram, pH vaginal e o teste das aminas. O diagnóstico final foi resultante da associação destes procedimentos. A análise estatística foi feita utilizando-se o teste Exato de Fisher e testes não paramétricos de Kruskal-Wallis, Mann-Whitney e teste de Dunn para comparações múltiplas. No grupo de mulheres com candidíase vaginal houve uma predominância de células do tipo neutrófilos (mediana: 67,5) e linfócitos (mediana: 2,5), sendo esse achado significante em relação ao grupo de mulheres com vaginose bacteriana (mediana 3,0 e 0 respectivamente - p

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcos Tadeu Nolasco da Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Este estudo teve como objetivo analisar se há associação entre a viremia plasmática do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e a resposta imunológica adaptativa de crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV-1 em uso de terapia antirretroviral combinada (TARVc). Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas e no Centro de Orientação e Apoio Sorológico (COAS), em Jundiaí, ambos no estado de São Paulo, Brasil. Constituíram-se dois grupos de pacientes: a) com controle virológico sustentado por mais de um ano (Carga viral - CV < limite de detecção de 50 cópias de RNA viral/mL, pelo método de Branched-DNA); e b) com CV > 1000 cópias/mL. Crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Foram realizadas, por citometria de fluxo, imunofenotipagens de linfócitos T CD4+, T CD8+, B total e de memória e a proliferação de linfócitos T em culturas de células mononucleadas do sangue periférico estimuladas com HIV-1 inativado por aldritiol-2. A concentração de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? e TGF-?1 no sobrenadante destas culturas foi analisada com Cytometric Bead Array e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Também foram dosados imunoglobulinas por nefelometria; anticorpos anti-hepatite B e anti-rubéola por Chemiluminescent Microparticle Immunoassay e anti-tétano e anti-difteria por Toxin Binding Inhibiton test. Empregaram-se os testes estatísticos de Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, exato de Fisher, Comparações Múltiplas Não Paramétricas e Correlação de Spearman, sendo o nível de significância de p < 0,05. Não houve diferença na contagem de linfócitos T CD8+, B total e de memória entre os grupos de pacientes. O número de linfócitos T CD4+ estava reduzido no grupo virêmico no momento da avaliação da resposta vacinal. Observaram-se maiores valores absolutos de linfócitos B de memória nos pacientes com CV indetectável (CVI) de menor idade à introdução de TARVc. A concentração de IgM e IgG foi superior nos pacientes virêmicos em relação aos com CVI e controles. Pacientes com CVI tiveram maior nível de IgA que os controles. Os pacientes com CVI apresentaram maior proliferação de linfócitos T e produção de IL-2 e IFN-? HIV-1 específicas em relação aos virêmicos. A proliferação e produção de IFN-? e IL-2 se correlacionaram com a duração da TARVc bem-sucedida no controle da viremia. Em pacientes virêmicos, a concentração de IFN-? correlacionou-se inversamente à CV e a proliferação foi menor nos que iniciaram TARV após um ano de idade. A proporção de respondedores para as vacinas de tétano, difteria, rubéola e hepatite B foi similar entre os grupos de pacientes, e aqueles com CVI apresentaram maiores títulos de anti-hepatite B e anti-rubéola. Os controles apresentaram maior número de respondedores para rubéola, hepatite B e difteria e maiores títulos de anti-hepatite B, anti-rubéola e anti-tétano que os pacientes. Concluímos que o controle virológico sustentado em crianças e adolescentes com infecção crônica pelo HIV trouxe benefícios diretos na manutenção das respostas anti-HIV e vacinais e que a administração de TARV precoce contribuiu para melhor resposta celular ao HIV e maior número de linfócitos B de memória Abstract: The aim of this study was to evaluate if there was an association of Human Immunodeficiency Virus (HIV) plasma viremia and the development of adaptative immune responses from vertically-HIV-1 infected children and adolescents under combination Antirretroviral Therapy (cART). The individuals were recruited at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the University of Campinas Clinical Hospital (UNICAMP, Campinas) and at the Center for Orientation and Serologic Support (COAS, Jundiaí), in São Paulo State, Brazil. They were separated in two groups, according to HIV RNA plasma viral load (VL): one had sustained undetectable VL (UVL, with VL < 50 copies of RNA/mL) for at least one year before blood collection; the other had VL > 1,000 copies/mL. Healthy children and adolescents participated in the study as controls. Aldrithiol-2-inactivated HIV-1-stimulated peripheral blood mononuclear cells were cultured to evaluate HIV-specific lymphoproliferation by flow cytometry and IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? and TGF-?1 concentration by Cytometric Bead Array and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Adaptative immunity was also evaluated with T CD4+, T CD8+, total and memory B cell counts by flow cytometry, immunoglobulin dosage by nephelometry, Chemiluminescent Microparticle Immunoassay to antibodies anti-hepatitis B and anti-rubella and Toxin Binding Inhibiton test to anti-tetanus and anti-diphtheria were carried out to humoral response evaluation. Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, Fisher's exact, Nonparametric Multiple Comparisons and Spearman Correlation tests were used, with a p value < 0.05. There was no difference in T CD8, total and memory B cell counts between the groups of patients. T CD4 cell numbers were decreased in the viremic group at the time humoral immunity was performed. Greater memory B cell counts were observed among patients with UVL who were younger at cART beginning. IgM and IgG levels were higher in viremic patients in comparison to control and patients with UVL, which had increased levels of IgA in comparison to controls. There was no difference in the proportion of responders for tetanus, diphtheria, rubella and hepatitis B vaccines between the two groups of patients; nevertheless, the group with UVL showed higher titers of anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus than the viremic group. Controls showed higher frequency of responders to diphtheria, rubella and hepatitis B and titers to anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus in comparison to patients. Patients with UVL showed higher HIV-1-specific T lymphocyte proliferation and IL-2 and IFN-? production in comparison to viremic patients. Greater time since the start of successful cART in patients with UVL was associated with higher proliferation and IFN-? and IL-2 levels in cultures with HIV. Among viremic patients, HIV-specific proliferation was lower in individuals who started ART after one year of age, and IFN-? concentration was inversely correlated with VL. We concluded that sustained HIV-1 virologic control was valuable on mounting responses to HIV and vaccines and the early initiation of ART contributed to improved HIV cellular immunity and greater memory B cell counts Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências

Butaphosphan, an organic source of phosphorus, potentiates humoral and cellular immune responses, however, it is still not clear how this occurs. We evaluate the effect of subcutaneous administration of injectable butaphosphan on pro-inflammatory markers and neutrophil activity index of mice challenged with bacterial lipopolysaccharide. Forty-two mice were randomly divided into three groups: Butaphosphan 50 (BUT50, n=14), that received injections of 50 mg/kg of butaphosphan; Butaphosphan 200 (BUT200, n=14), that received injections of 200 mg/kg of butaphosphan and Control (CTL, n=15), that received placebo. Subcutaneous injections were performed twice daily, for eight consecutive days. At the 8th day, half of animals per group were randomly selected to be challenged with bacterial lipopolysaccharide. Two hours after the challenge animals were euthanized, blood and spleen collected to analyze hematological parameters, circulating levels of interleukin 6 (IL-6), 1β (IL-1B) and myeloperoxidase (MPO) tissue activity. Red blood cell count was higher in butaphosphan treated groups. White blood cell count was lower in BUT200/LPS, as consequence of the decreased neutrophil count. Defense cells and IL-6 were elevated in BUT200 group. The use of butaphosphan ameliorate inflammatory markers, both in challenged and not challenged animals. El butafosfano, una fuente orgánica de fósforo, potencia las respuestas inmunes humorales y celulares, sin embargo, aún no está claro cómo ocurre esto. Evaluamos el efecto de la administración subcutánea de butafosfano inyectable sobre los marcadores proinflamatorios y el índice de actividad de neutrófilos de ratones desafiados con lipopolisacárido bacteriano. Cuarenta y dos ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos: Butafosfano 50 (BUT50, n=14), que recibieron inyecciones de 50 mg/kg de butafosfano; Butafosfano 200 (BUT200, n=14), que recibió inyecciones de 200 mg/kg de butafosfano y Control (CTL, n=15), que recibió placebo. Las inyecciones subcutáneas se realizaron dos veces al día, durante ocho días consecutivos. En el día 8, la mitad de los animales por grupo fueron seleccionados al azar para ser desafiados con lipopolisacárido bacteriano. Dos horas después de la exposición, los animales fueron sacrificados, se recolectó sangre y bazo para analizar parámetros hematológicos, niveles circulantes de interleucina 6 (IL-6), 1β (IL-1B) y actividad tisular mieloperoxidasa (MPO). El recuento de glóbulos rojos fue mayor en los grupos tratados con butafosfano. El recuento de glóbulos blancos fue menor en BUT200/LPS, como consecuencia de la disminución del recuento de neutrófilos. Las células de defensa y la IL-6 estaban elevadas en el grupo BUT200. El uso de butafosfano mejora los marcadores inflamatorios, tanto en animales expuestos como no expuestos. O butafosfano, fonte orgânica de fósforo, potencializa as respostas imunes humoral e celular, porém ainda não está claro como isso ocorre. Avaliamos o efeito da administração subcutânea de butafosfano injetável sobre marcadores pró-inflamatórios e índice de atividade de neutrófilos de camundongos desafiados com lipopolissacarídeo bacteriano. Quarenta e dois camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos: Butaphosphan 50 (BUT50, n=14), que recebeu injeções de 50 mg/kg de butaphosphan; Butaphosphan 200 (BUT200, n=14), que recebeu injeções de 200 mg/kg de butaphosphan e Controle (CTL, n=15), que recebeu placebo. As injeções subcutâneas foram realizadas duas vezes ao dia, por oito dias consecutivos. No 8º dia, metade dos animais por grupo foram selecionados aleatoriamente para serem desafiados com lipopolissacarídeo bacteriano. Duas horas após o desafio os animais foram eutanasiados, sangue e baço coletados para análise de parâmetros hematológicos, níveis circulantes de interleucina 6 (IL-6), 1β (IL-1B) e atividade tecidual de mieloperoxidase (MPO). A contagem de glóbulos vermelhos foi maior nos grupos tratados com butafosfan. A contagem de leucócitos foi menor em BUT200/LPS, como consequência da diminuição da contagem de neutrófilos. As células de defesa e IL-6 estavam elevadas no grupo BUT200. O uso de butafosfano melhora marcadores inflamatórios, tanto em animais desafiados como não desafiados.

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A resistência à quimioterápicos é um dos principais obstáculos para a terapia do câncer. Na leucemia mielóide crônica (CML) o tratamento é frequentemente ineficiente devido à aquisição de resistência aos quimioterápicos utilizados. Dessa forma, o estudo comparativo de linhagens celulares de CML resistentes e susceptíveis a drogas é de extrema importância para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência e para a evolução de novos protocolos terapêuticos. Um número cada vez maior de evidências indica que os microRNAs apresentam importante papel no processo de carcinogênese e na agressividade tumoral. Nesse trabalho o principal objetivo é melhor esclarecer o papel da maquinaria de processamento de microRNAs no fénotipo MDR (multi-drug resistance), utilizando principalmente as linhagens de CML K562 (susceptível) e Lucena (fenótipo MDR). Nossos resultados revelaram que as células Lucena apresentam altos níveis da endonuclease Dicer e que os microRNAs let-7a e miR-145 são intensamente regulados em relação à K562. Além disso, a linhagem Lucena se tornou mais sensível ao quimioterápico vincristina após o silenciamento de Dicer. Experimentos com outras linhagens celulares mostraram que a resistência frente à cisplatina e doxorrubicina possui correlação significativa com os níveis de Dicer. A identificação de ligantes dessa endonuclease nas linhagens de CML ressalta a possibilidade desta enzima estar cumprindo novos papéis no fenótipo MDR. Entre os ligantes exclusivos da linhagem resistente, estão proteínas envolvidas na promoção de defesa anti-oxidante, proliferação celular e metabolismo de lipídios e hormônios esteróides. De acordo, dados de proteoma das duas linhagens enfatizam a importância do metabolismo lipídico para aquisição da resistência, bem como de um intenso remodelamento do citoesqueleto. Nossos dados reforçam o caráter complexo e multifatorial da resistência à múltiplas drogas, contribuindo para o entendimento do ação de miRNAs e de Dicer nesse processo Abstract: Drug resistance is one of the main obstacles in cancer therapy. Frequently, the treatment of chronic myelogenous leukemia (CML) becomes inefficient due to the emergence of a resistant population of cancer cells. Therefore, comparative studies of resistant and non-resistant CML cell lines is extremely important to the understanding of molecular mechanisms involved in the acquisition of resistance and also to the evolution of new therapeutic protocols. A growing number of evidence supports an important role for microRNAs in carcinogenesis and tumoral aggressiveness. This study aims to better understand the role of microRNAs and their biosynthetic pathway in the phenotype of multi-drug resistance (MDR) of CML cells. To this purpose we worked with the leukemic cell lines K562 (non-resistant) and Lucena (MDR phenotype). The results obtained revealed that Lucena expresses high levels of Dicer endonuclease and intensely regulates microRNAs let-7a and miR-145 when compared to K562. Also, Dicer silencing in MDR cells enhanced sensitivity to the chemotherapic drug vincristine. Experiments with different cells lines showed that resistance to cisplatin and doxorubicin are correlated to Dicer expression levels. In CML cell lines, the identification of Dicer ligands points to the possibility of alternative roles for this endonuclease in the MDR phenotype. Among the newly found interactors in the resistant cell line are proteins involved in antioxidant defense, proliferation and metabolism of fatty acids and steroids. Accordingly, proteome data from K562 and Lucena cells emphasizes the importance of lipid metabolism and structural remodeling to the resistant phenotype. Overall, our data contributes to the understanding of the role played by microRNAs and Dicer in the complex and multifactorial MDR phenotype Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A epidemia de HIV/aids sofreu modificações em seu perfil, dentre os quais o fenômeno de envelhecimento. São referidos como idosos os indivíduos infectados com idade igual ou superior a 50 anos em razão de características clínicas e epidemiológicas que incluem um processo mais rápido de progressão para aids. Com o objetivo de caracterizar os perfis clínico epidemiológico e de adesão de pacientes diagnosticados com infecção pelo HIV com idade igual ou superior a 50 anos, foi desenvolvido um estudo de coorte retrospectiva em um Serviço de Atendimento Especializado público, utilizando dados de prontuários médicos nos anos de 2014 a 2018. Os dados referentes a questões sociodemográficas, de condições de saúde e estilo de vida, clínicos e relacionados ao tratamento foram organizados em um banco de dados. As variáveis quantitativas foram expressas como média (ou mediana) ± desvio padrão (ou distância interquartil) e as variáveis categóricas expressas como número e percentual de pacientes. As análises de associação foram realizadas através do teste do qui-quadrado. Foi determinada letalidade e mortalidade específica por aids e sobrevida global em 24 meses. Nível de significância adotado de 5%. 149 pacientes foram incluídos, com predomínio do sexo masculino (62,4%), faixa etária de 50 a 59 anos (65,8%), auto referidos como brancos (57,7%). Em 53,7% destes não houve finalização da educação fundamental ou eram analfabetos 29,5% dos pacientes foram considerados imunodeficientes graves e 23,5% portadores de grau moderado de imunodeficiência na admissão. Valores menores ou iguais a 200 células /mm3 na contagem de linfócitos T CD4 foram registrados em 46,3% da amostra. Configuraramse como aderentes 80 pacientes (56,7%) que realizaram 6 ou mais retiradas mensais nos primeiros 6 meses de tratamento e 81 (60%) dos usuários que tiveram mais de 11 retiradas aos 12 meses de seguimento. Destaca-se que a adesão foi significativamente maior entre os pacientes acima de 60 anos nos primeiros 12 meses. A recuperação imune, observada pelo incremento na contagem de células TCD4 ao longo do tempo, aumentou em média 139,63 nos primeiros 6 meses e 50,51 dos primeiros 6 meses a 12 meses de seguimento, com aumento médio nos primeiros 12 meses de 157,63 células, notando-se também diferença na contagem de células T CD4 segundo faixa etária, sendo encontrado em apenas 9,1% dos pacientes acima de 60 anos contagem superior a 500 células/mm3 após 6 meses de tratamento. Um total de 19 pacientes evoluíram a óbito no período analisado, resultando em letalidade por aids de 8%, mortalidade proporcional (considerando causas confirmadas) de 68% e sobrevida global em 24 meses de 84,1%. O atraso no diagnóstico implica em pacientes com doença avançada e impacto negativo no prognóstico. Os profissionais de saúde devem estar atentos às medidas de prevenção das infecções relacionadas à transmissão sexual em faixas etárias mais avançadas, e às necessidades específicas de cuidado com a saúde desse grupo, que requer a interseção da equipe multidisciplinar no fortalecimento de vínculo e manutenção do tratamento. Averiguar potenciais fatores de risco para a não adesão à terapia é essencial para o manejo satisfatório da doença nesta população. The HIV/aids epidemic has undergone several changes in its profile over time, among which the phenomenon of aging and a significant increase in the number of cases among older adults has been reported worldwide. Infected individuals aged 50 years or older are referred to as elderly due to clinical and epidemiological characteristics that include a faster progression to Aids. In order to characterize the epidemiological clinical profile of patients diagnosed with HIV infection aged 50 or over in a specialized public answering service, a descriptive study was developed using secondary data from medical records in the years 2014 to 2018 and those patients who had doctor’s appointments in other institutions of medical or private assistance and with a diagnosis prior to the age of 50 years who were inadvertently classified in this age group in the medical record were excluded. The compiled, sociodemographic, health and lifestyle, clinical and treatment-related data were organized into a database using the Statistical Package of the Social Sciencies program, version 21. Quantitative variables were expressed as mean (or median) ± standard deviation (or interquartile distance) and categorical variables expressed as number and percentage of patients. Association analyzes were performed using the chi-square test. AIDS-specific mortality and mortality and overall 24-month survival were determined. Significance level adopted at 5%. 149 patients were included, with a predominance of males (62.4%), aged between 50 and 59 years (65.8%), self-reported as white (57.7%). In 53.7% of them, there was no completion of basic education or they were illiterate 29.5% of the patients were considered severe immunodeficient and 23.5% had a moderate degree of immunodeficiency on admission. Values less than or equal to 200 cells / mm3 in the T CD4 lymphocyte count were recorded in 46.3% of the sample. 80 patients (56.7%) who performed 6 or more monthly withdrawals in the first 6 months of treatment and 81 (60%) of users who had more than 11 withdrawals at 12 months of follow-up were adherent. It is noteworthy that adherence was significantly higher among patients over 60 years of age in the first 12 months. Immune recovery, observed by the increase in T CD4 cell count over time, increased on average 139.63 in the first 6 months and 50.51 from the first 6 months to 12 months of follow-up, with an average increase in the first 12 months of 157 , 63 cells, noting also a difference in the count of TCD4 cells according to age group, being found in only 9.1% of the patients over 60 years old counting above 500 cells / mm3 after 6 months of treatment. A total of 19 patients died in the analyzed period, resulting in AIDS lethality of 8%, proportional mortality (considering confirmed causes) of 68% and overall survival in 24 months of 84.1%. The delay in diagnosis implies patients with advanced disease and a negative impact on the prognosis. Health professionals must be aware of measures to prevent infections related to sexual transmission in more advanced age groups, and the specific health care needs of this group, which requires the intersection of the multidisciplinary team in strengthening the bond and maintaining treatment. Investigating potential risk factors for non-adherence to therapy is essential for satisfactory management of the disease in this population.

Sepsis is characterized by an amplified systemic immunoinflammatory response produced by a microorganism. Its pathophysiological mechanism is complex and involves the activation of inflammatory cytokine signaling pathways and oxidative stress. Due to the high mortality in ICU patients, the scientific community has been constantly looking for safe and effective therapies for the treatment of sepsis. And in this context, hydralazine (HDZ) is a strong candidate. Although HDZ is best known as a potent vasodilating substance and has been used frequently in the past five decades as an antihypertensive, due to its safety and low risk of causing toxicity, studies have shown that it also has potent antioxidant properties, especially in inhibition of ROS and RNS formation and sequestration in vivo and in vitro. Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of hydralazine (HDZ) to mitigate mortality, the inflammatory response and oxidative stress induced by sepsis, and to investigate its possible mechanisms of action. Sepsis was induced by the ligation and cecal perforation (CLP) method in male Wistar rats. After surgery, the animals were randomly divided into three groups: sham, sepsis and sepsis + HDZ (1 mg/kg, s.c; 4 h after sepsis induction and after 12-12 hours until 48 h). All groups were monitored for 48 h to assess survival rate, clinical, biochemical and cellular parameters. After euthanasia, blood, spleen, liver and kidneys were collected for analysis of markers of lipid and protein damage, serum blood cytokines, myeloperoxidase activity (MPO) and oxidative stress parameters, through the activity of catalase and superoxide dismutase enzymes. The involvement of the PI3K/Akt pathway was also investigated by western blot in the tissues of the spleen, liver and kidney. Sepsis was successfully induced by the CLP technique. HDZ administration has increased: the survival rate (from 50 to 90%); the temperature (from 33.3 ± 0.2 to 34.5 ± 0.3ºC); blood glucose concentration (from 87.6 ± 2.8 to 106.5 ± 2.1 mg/dL). HDZ treatment reduced: the clinical sepsis severity score (from 10.6 ± 0.51 to 6.5 ± 0.40 u.a.); the lactate concentration (from 36.2 ± 1.5 to 18.03 ± 1.1 mg/dL); the concentrations of cytokines TNF-α, IL-1β and IL-10 (from 10.2 ± 0.3; 99.1 ± 10.7; 1252 ± 325.3, respectively to 4.1 ± 0.4; 19 , 66 ± 4.5; 267 ± 138.1 pg/mL); MPO activity in the spleen, liver and kidney (from 26.02 ± 2.74; 0.11 ± 0.01; 0.20 ± 0.02, respectively to 13.37 ± 0.95; 0.066 ± 0.007; 0.141 ± 0.006 U / g, respectively); TBARS concentrations (from 2.33 ± 0.15; 0.92 ± 0.15; 9.14 ± 0.97 to 1.47 ± 0.07; 0.48 ± 0.06; 4.34 ± 0.36 nmol/mg protein, respectively). In addition, HDZ significantly prevented increased Akt activation in the liver and kidneys, but had no effect on the spleen. HDZ administration largely mitigated the effects of sepsis by improving inflammatory and antioxidant responses through the PI3K/Akt pathway. These findings provide strong evidence that HDZ may be a new therapeutic alternative for the treatment of sepsis. A sepse é caracterizada por uma resposta imunoinflamatória sistêmica amplificada produzida por um microrganismo. Seu mecanismo fisiopatológico é complexo e envolve a ativação de vias de sinalização de citocinas inflamatórias e estresse oxidativo. Devido à alta mortalidade em pacientes internados em UTI, a comunidade científica tem buscado constantemente terapias seguras e eficazes para o tratamento da sepse. E, nesse contexto, a hidralazina (HDZ) é um forte candidato. Embora a HDZ seja mais conhecida como uma potente substância vasodilatadora e tenha sido frequentemente usado nas últimas cinco décadas como anti-hipertensivo, devido a sua segurança e ao baixo risco de causar toxicidade, estudos têm mostrado que ela também possui potentes propriedades antioxidantes, principalmente em relação à inibição da formação e sequestro de ERO e ERN in vivo e in vitro. Assim, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade da hidralazina (HDZ) em mitigar a mortalidade, a resposta inflamatória e o estresse oxidativo induzida pela sepse, e investigar seus possíveis mecanismos de ações. A sepse foi induzida pelo método de ligadura e perfuração cecal (CLP) em ratos Wistar machos. Após a cirurgia, os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos: sham, sepse e sepse + HDZ (1 mg/kg, s.c; 4 h após a indução da sepse e depois de 12-12 horas até tempo de 48 h). Todos os grupos foram monitorados por 48 h para avaliar a taxa de sobrevivência, parâmetros clínicos, bioquímicos e celulares. Após a eutanásia, o sangue, baço, fígado e rins foram coletados para análise dos marcadores de danos lipídicos e proteicos, citocinas séricas do sangue, atividade de mieloperoxidase (MPO) e parâmetros de estresse oxidativo, através da atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase. O envolvimento da via PI3K/Akt também foi investigado por western Blot nos tecidos do baço, fígado e rim. A sepse foi induzida com sucesso pela técnica CLP. A administração com HDZ aumentou: a taxa de sobrevivência (de 50 para 90%); a temperatura (de 33,3 ± 0,2 para 34,5 ± 0,3ºC); a concentração da glicemia (de 87,6 ± 2,8 para 106.5 ± 2.1 mg/dL). O tratamento com HDZ reduziu: o escore de gravidade clínica de sepse (de 10,6 ± 0,51 para 6,5 ± 0,40 u.a.); a concentração do lactato (de 36,2 ± 1,5 para 18,03 ± 1,1 mg/dL); as concentrações das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 (de 10,2 ± 0,3; 99,1 ± 10,7; 1252 ± 325,3, respectivamente para 4,1 ± 0,4; 19,66 ± 4,5; 267 ± 138,1 pg/mL); a atividade da MPO no baço, fígado e rim (de 26,02 ± 2,74; 0,11 ± 0,01; 0,20 ± 0,02, respectivamente para 13,37 ± 0,95; 0,066 ± 0,007; 0,141 ± 0,006 U/g, respectivamente); as concentrações de TBARS (de 2,33 ± 0,15; 0,92 ± 0,15; 9,14 ± 0,97 para 1,47 ± 0,07; 0,48 ± 0,06; 4,34 ± 0,36 nmol/mg de proteína, respectivamente). Além disso, a HDZ preveniu significativamente o aumento da ativação da Akt no fígado e rins, mas não teve efeito no baço. A administração com HDZ mitigou amplamente os efeitos da sepse ao melhorar as respostas inflamatórias e antioxidantes por meio da via PI3K/Akt. Esses achados fornecem fortes evidências de que o HDZ pode ser uma nova alternativa terapêutica para o tratamento da sepse. Aracaju

The tick Rhipicephalus microplus is a harmful parasite of cattle that causes considerable economic losses to the cattle breeding industry. Although R. microplus saliva (Rm-saliva) contains several immunosuppressants, any association between Rm-saliva and the expression of immunoinhibitory molecules, such as programmed death (PD)-1 and PD-ligand 1 (PD-L1), has not been described. In this study, flow cytometric analyses revealed that Rm-saliva upregulated PD-1 expression in T cells and PD-L1 expression in CD14+ and CD11c+ cells in cattle. Additionally, Rm-saliva decreased CD69 expression in T cells and Th1 cytokine production from peripheral blood mononuclear cells. Furthermore, PD-L1 blockade increased IFN-γ production in the presence of Rm-saliva, suggesting that Rm-saliva suppresses Th1 responses via the PD-1/PD-L1 pathway. To reveal the upregulation mechanism of PD-1/PD-L1 by Rm-saliva, we analyzed the function of prostaglandin E2 (PGE2), which is known as an inducer of PD-L1 expression, in Rm-saliva. We found that Rm-saliva contained a high concentration of PGE2, and PGE2 treatment induced PD-L1 expression in CD14+ cells in vitro. Immunohistochemical analyses revealed that PGE2 and PD-L1 expression was upregulated in tick-attached skin in cattle. These data suggest that PGE2 in Rm-saliva has the potential to induce the expression of immunoinhibitory molecules in host immune cells.

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Objective : to evaluate the action of Transfer Factor on the immune response of patients with malignant neoplasm submitted to surgery, chemotherapy and radiotherapy. Method: we analyzed the variations of leukocytes, total lymphocytes, T-lymphocytes and CD4 counts in 60 patients submitted to immunostimulation with a single, daily dose of 0.5mg sublingual Transfer Factor, started simultaneously with chemotherapy and/or radiotherapy. Results: there were statistically significant increases in the counts of all cell lines studied, more pronounced after 12 months of use of the medication. Conclusion: the Transfer Factor restored immune response and showed no side effects. RESUMO Objetivo: avaliar a ação do Fator de Transferência na resposta imunológica de pacientes portadores de neoplasia maligna submetidos à cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Método: análise das variações dos valores dos leucócitos, linfócitos totais, linfócitos T e CD4 em 60 pacientes submetidos à imunoestimulação com Fator de Transferência administrado em dose única de 0,5mg por via sublingual, diariamente e iniciada simultaneamente à quimioterapia e/ou radioterapia. Resultados: houve um aumento no número de todas as linhagens celulares estudadas que foi mais acentuada após 12 meses de uso da medicação. A análise estatística realizada com o software Graph Pad Instat, testadas pelo método Kolmogorov and Smirnov, mostrou que os resultados foram significativos. Conclusão: o Fator de Transferência restabeleceu a resposta imune e não apresentou efeitos colaterais.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2019. Introduçāo: A vacina antiamarílica 17DD promove uma resposta imunológica de longa duração, com indução de células de memória tanto da linhagem humoral quanto celular. O tratamento da artrite reumatoide (AR) com medicamentos modificadores docurso da doença (MMCD) pode impactar a resposta vacinal protetora da vacina 17DD em indivíduos previamente vacinados, e, dessa maneira, aumentar o risco de infecção nesta população. O objetivo do trabalho foi determinar se o uso de terapias imunomoduladoras poderia afetar a duração da imunidade protetora contra a febre amarela em pacientes com AR. Métodos: Cento e vinte e dois indivíduos com AR, previamente imunizados com a vacina 17DD ( nos períodos de [1-5) anos, [5-10) anos e ≥ 10 anos), foram selecionados para participar do estudo. Os participantes foram divididos de acordo com a terapia imunomoduladora em uso: MMCD sintéticos convencionais (MMCDsc) ou associação de MMCD sintéticos e biológicos (MMCDsc+b). O grupo controle (CONT) compôs–se de 226 indivíduos saudáveis. Realizaram– se dosagem de anticorpos neutralizantes pelo teste de redução de plaques (PRNT) e análise da imunidade celular por meio de citometria de fluxo. Resultados: Os resultados obtidos mostram que a terapia com MMCD sintéticos nāo afetou a duração da imunidade protetora induzida pela vacina 17DD, quando comparado ao grupo controle. Entretanto, a associação de MMCD sintéticos e biológicos levou a uma depleção prematura dos principais biomarcadores de memória imunológica associada à vacina antiamarílica, com redução da soropositividade mensurada pelo PRNT entre [5-9) anos pós- vacinaçāo e com baixos níveis de células de memória efetora TCD8+ até 5 anos pós-vacinaçāo. Conclusāo: Infere-se, a partir destes resultados, que esta população está vulnerável à infecção amarílica e poderia beneficiar-se de uma estratégia de reforço vacinal planejada. Background: The 17DD-Yellow Fever (YF) vaccine induces a long-lasting protective immunity, resulting from humoral and cellular immunological memory. The treatment of rheumatoid arthritis (RA) patients with disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARD) may affect pre-existing 17DD-vaccine protective immunity and increase the risk of acquiring YF infection. Our goal was to determine whether DMARD would affect the duration of YF-specific protective immunity in RA patients. Methods: A total of 122 RA patients, previously immunized with the 17DD-YF vaccine (1- 5, 5-9 and ≥10 years) and currently under DMARD therapy, were enrolled in the present investigation. Immunomodulatory therapy encompasses the use of conventional synthetic DMARD alone (csDMARD) or combines with biological DMARD (cs+bDMARD). A total of 226 healthy subjects were recruited as a control group (CONT). Neutralizing antibody responses were measured by a plaque-reduction neutralizing test (PRNT), and cellular immunity was evaluated by an in vitro 17DD-YF-specific peripheral blood lymphoproliferative assay. Results: The data demonstrated that csDMARD therapy did not affect the duration of protective immunity induced by the 17DD-YF vaccine compared to that of CONT, as both presented a significant time-dependent decline at 10 years after vaccination. Conversely, cs+bDMARD therapy induced a premature depletion in the main determinants of the vaccine protective response, with diminished PRNT seropositivity levels between 5-9 years and impaired Effector Memory in CD8+ T-cells as early as 1-5 years after 17DD-YF vaccination. Conclusions: These findingscouldsupport changing the vaccination schedule of this population, with the possibility of a planned booster dose upon the suspension of bDMARD in cases where this is allowed, even before ten years following 17DD-YF vaccination. The benefit of a planned booster dose should be evaluated in further studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2015. As leishmanioses representam um complexo de doenças com uma importante diversidade clínica e epidemiológica. A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose endêmica no Brasil, anteriormente restrita a áreas rurais, mas, recentemente tem ocorrido expansão no processo de urbanização da Leishmaniose Visceral. A imunidade inata participa dos mecanismos de defesa contra a leishmânia e ainda está pouco compreendida na leishmaniose canina. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta imunitária inata dos fagócitos de cães naturalmente infectados por Leishmania spp. em comparação com cães normais, pela avaliação da fagocitose e capacidade de produzir moléculas microbicidas. Foram utilizados 30 cães, sem raça definida, maiores que um ano de idade, sendo 22 cães machos e 8 fêmeas, que foram distribuídos em dois grupos: 15 cães não infectados utilizados como controle normal e 15 cães naturalmente infectados pela Leishmania spp. Foram feitos o exame clínico, o hemograma e os testes bioquímicos. Foram avaliadas a fagocitose de Saccharomyces cerevisiae pelos neutrófilos e monócitos do sangue periférico, pelos receptores para padrões moleculares de patógenos e pelos receptores para opsoninas. A produção de ânions superóxido foi avaliada pelo teste do NBT, a produção de peróxido de hidrogênio pela oxidação do vermelho neutro na presença de peroxidase e a produção de óxido nítrico foi quantificada pela presença de nitrito no sobrenadante das culturas utilizando reagente de Griess, estimuladas ou não com LPS. Os cães com leishmaniose apresentaram os seguintes sinais clínicos característicos da doença: alopecia (33%), descamação (46%), úlcera na pele (20%), onicogrifose (26%), caquexia (46%), linfoadenomegalia (40%), ceratoconjuntivite (53%). Os cães com leishmaniose apresentaram anemia normocrômica e normocítica, plaquetopenia e leucopenia, com neutrofilia relativa e desvio à esquerda. Os cães com leishmaniose apresentaram diminuição da atividade sérica da alanina aminotransferase (ALT) em relação a cães normais. Não foram observadas diferenças na concentração sérica da creatinina. As proteínas totais (PT) mostraram-se aumentadas em cães com leishmaniose as custas do aumento das globulinas, sendo que não houve diferença na concentração sérica de albumina entre cães com leishmaniose e cães normais. Cães com leishmaniose apresentaram menor capacidade fagocitária pelos neutrófilos do que cães normais quando avaliados pelos r eceptores para padrões moleculares de patógenos. A fagocitose facilitada por opsoninas mostrou que o número de leveduras ingeridas por neutrófilo foi maior em cães com leishmaniose em relação aos controles normais. Não houve diferença entre a capacidade fagocitária pelos monócitos de cães com leishmaniose e cães controle normal quando avaliados pelos receptores para padrões moleculares de patógenos, nas proporções de 5 ou 20 leveduras não sensibilizadas por monócito. Monócitos de cães com leishmaniose apresentaram maior capacidade fagocitária em comparação aos de cães normais, quando avaliados pelos receptores para opsoninas, tanto na proporção de 5 quanto na proporção de 20 leveduras sensibilizadas por monócito. A porcentagem de redução do NBT basal pelos fagócitos de cães com leishmaniose foi menor do que a dos cães controle. Quando utilizamos a concentração de 5 μg/mL de LPS, observamos que cães controles normais apresentaram um aumento da produção de óxido nítrico em relação aos cães controles normais. Entretanto, nos cães com leishmaniose houve diminuição na produção de óxido nítrico quando estimulados com 5 μg/mL de LPS em relação a sua produção basal. Observamos maior produção basal de peróxido de hidrogênio pelos cães com leishmaniose. Nossos resultados mostraram que há uma deficiência dos neutrófilos de cães com leishmaniose tanto na fagocitose quanto na produção de moléculas microbicidas, como os ânions superóxido. Entretanto, os monócitos desses cães embora apresentem uma maior capacidade fagocitária do que os cães normais, mostram uma menor capacidade de produzir óxido nítrico, que é uma das principais moléculas microbicidas para as leishmânias. Estas alterações do sistema imunitário inato podem favorecer o escape do parasito do sistema imunitário do hospedeiro, assim perpetuando sua sobrevivência. Ademais, o aumento da produção de peróxido de hidrogênio pelos monócitos, pode estar contribuindo para restringir em parte a multiplicação do parasito, mas o seu excesso pode também estar contribuindo nos mecanismos de imunopatogenia. Nossos dados contribuem para uma maior compreensão dos mecanismos de defesa da imunidade inata e da imunopatogenia da leishmaniose em cães e podem contribuir para a busca de novos alvos para drogas imunomoduladoras que possam auxiliar no tratamento contra a leishmaniose. Leishmaniasis represent a complex disease with a significant clinical and epidemiological diversity. The Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a zoonosis endemic in Brazil, previously restricted to rural areas, but recently there has been expansion in the urbanization process of Visceral Leishmaniasis. Innate immunity participates in the defense mechanisms against Leishmania and is still poorly understood in canine leishmaniasis. The objective of this study was to evaluate the innate immune response of phagocytes of naturally infected dogs to Leishmania spp. compared to healthy dogs, and to evaluate phagocytosis and microbicide molecule production by phagocytes. Thirty dogs, mixed breed, higher than one year old, 22 males and 8 females, were separated into two groups: 15 uninfected dogs used as healthy control, 15 dogs naturally infected by Leishmania spp. The clinical examination, the blood cell count and biochemical tests were assessed. Phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae by neutrophils and monocytes were assessed through pathogen-associated molecular pattern and opsonin receptors. The production of superoxide anions was assessed by the NBT test. Hydrogen peroxide production was evaluated by neutral red oxidation and nitric oxide production by the Griess reagent, with or without LPS. Leishmania infected-dogs showed the following clinical characteristics: alopecia (33%), peeling (46%), skin ulcers (20%), onychogryphosis (26%), cachexia (46%), lymphadenopathy (40%), keratoconjunctivitis (53%). Leishmania infected-dogs showed normochromic and normocytic anemia, thrombocytopenia and leukopenia with neutrophil relative increment and a left shift. Leishmania infected- dogs showed decreased serum activities of alanine aminotransferase (ALT) compared to healthy control. No differences were observed in serum creatinine. The total protein (TP) was increased in Leishmania infected-dogs due to an increase in globulins, and there was no difference in serum albumin concentration between dogs with leishmaniasis and healthy controls. Leishmania infected-dogs showed lower phagocytic capacity by neutrophils than healthy dogs when evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors. Phagocytosis facilitated by opsonins showed that the number of ingested yeast per neutrophil was higher in Leishmania infected-dogs when compared to healthy controls. There was no difference between the phagocytic capacity of monocytes by Leishmania infected-dogs and healthy control when evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors. Monocytes from leishmaniasis animals showed higher phagocytic capacity when compared with healthy dogs, as assessed by the opsonin receptors. NBT percent reduction was lower in leishmaniasis than control dogs. When the concentration of 5 mg / mL of LPS was use, it was observed that healthy control dogs showed an increase in nitric oxide production when compared to control dogs. However, in dogs with leishmaniasis decreased nitric oxide production was observed when monocytes were stimulated with 5 / ml LPS. Higher baseline production of hydrogen peroxide by dogs with leishmaniasis was observed. Our results showed that there is a deficiency in neutrophils of Leishmania infected-dogs, both to phagocytosis as production of microbicidal molecules, such as superoxide anions. However, monocytes from leishmaniasis animals showed a higher phagocytic capacity than healthy dogs, showed a decreased capability to produce nitric oxide, which is a major microbicides molecule to Leishmania. These changes in innate immune system may favor the parasite scape from host immune system, thus maintaining their survival. In addition, the increased production of hydrogen peroxide by monocytes may contribute to impair the growth of parasites, but its excessive production may contribute to the immunopathogenesis of the disease. Our data contribute to enhance the understanding of the defense mechanisms of innate immunity and the immunopathogenesis of the disease in dogs. This knowledge may contribute as new targets for immunomodulatory drugs improving treatment against leishmaniasis.

Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), BioManguinhos/FIOCRUZ, PROEP/IRR/FIOCRUZ, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico-CNPq Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Fisiologia e Biof?sica. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil Secretaria Municipal de Sa?de de Belo Horizonte. Belo Horizonte, MG, Brasil. Secretaria do Estado de Sa?de de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Sa?de P?blica Sergio Arouca. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiol?gicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Universidade de Bras?lia. Faculdade de Medicina. Bras?lia, DF, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Departamento de Imuniza??o e Doen?as Transmiss?veis. Bras?lia, DF, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Programa Nacional de Imuniza??es. Bras?lia, DF, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. Funda??o Oswaldo Cruz. Instituto Ren? Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. The Yellow Fever (YF) vaccination is recommended for people living in endemic areas and represents the most effective strategy to reduce the risk of infection. Previous studies have warned that booster regimens should be considered to guarantee the long-term persistence of 17DD-YF-specific memory components in adults living in areas with YF-virus circulation. Considering the lower seroconversion rates observed in children (9-12 months of age) as compared to adults, this study was designed in order to access the duration of immunity in single-dose vaccinated children in a 10-years cross-sectional time-span. The levels of neutralizing antibodies (PRNT) and the phenotypic/functional memory status of T and B-cells were measured at a baseline, 30-45 days, 1, 2, 4, 7, and 10 years following primary vaccination. The results revealed that a single dose induced 85% of seropositivity at 30-45 days and a progressive time-dependent decrease was observed as early as 2 years and declines toward critical values (below 60%) at time-spans of ?4-years. Moreover, short-lived YF-specific cellular immunity, mediated by memory T and B-cells was also observed after 4-years. Predicted probability and resultant memory analysis emphasize that correlates of protection (PRNT; effector memory CD8+ T-cells; non-classical memory B-cells) wane to critical values within ?4-years after primary vaccination. Together, these results clearly demonstrate the decline of 17DD-YF-specific memory response along time in children primarily vaccinated at 9-12 months of age and support the need of booster regimen to guarantee the long-term persistence of memory components for children living in areas with high risk of YF transmission.

A malária é uma doença infecciosa transmitida por mosquitos que continua a ser uma das doenças infecciosas mais impactantes do mundo, matando milhares de pessoas todos os anos. Apesar de todos os esforços para controlar esta doença, como quimioprofilaxia e medidas de controlo de vetores, a falta de conhecimento sobre as respostas imunes desencadeadas pelo parasita Plasmodium dificulta o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a malária, que é necessária com urgência. A natureza assintomática e altamente imunogénica do estadio hepático da infecção por Plasmodium torna-o num alvo ideal para o desenvolvimento da vacina contra a malária. Prudêncio lab do Instituto de Medicina Molecular (IMM) desenvolveu um novo candidato a vacina contra a malária de esporozoito inteiro que tem como alvo o estágio hepático, a PbVAC. Na qual o parasita roedor P. berghei expressa a proteína circunsporozoítica de superfície do P. falciparum (PfCSP), altamente imunogénica, de modo a promover respostas imunitárias específicas para PfCSP, assim como respostas cruzadas entre espécies, que podem proteger contra uma infecção subsequente por P. falciparum. Estudos pré-clínicos em modelos de infecção em murganhos e coelhos mostraram que PbVac é capaz de infectar e desenvolver-se em hepatócitos sem estabelecer uma infecção no estadio sanguíneo. Para imitar o que acontece no fígado humano, os macacos rhesus (Macaca mulatta) foram usados para um teste pré-clínico de P. berghei wild-type (WT) e esporozoítos PbVac geneticamente modificados, como estratégia para induzir imunidade contra P. falciparum. Este estudo tem como objetivo investigar e comparar as respostas imunes humorais e celulares entre animais imunizados e não imunizados. Primeiro, confirmamos que os esporozoítos do PbWT são capazes de infectar hepatócitos do macaco rhesus in vivo. Posteriormente, os macacos rhesus foram imunizados por picada de mosquito com PbVac ou PbWT e seguidos por 21 semanas, em paralelo com animais não imunizados. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e plama foram coletadas periodicamente e células do fígado e esplenócitos foram coletados na eutanásia. Foi realizada uma comparação do plasma pré e pós 3 imunizações para analisar as respostas humorais quantificando IgGs específicas para esporozoítos. As composições dos compartimentos imunes do sangue periférico, fígado e baço foram analisadas por imunofenotipagem e respostas imunes celulares específicas contra esporozoítos PbVAC, PbWT e Pf foram avaliadas em PBMCs e células hepáticas utilizando um ensaio intracelular de citocinas. As imunizações foram seguras, sem alterações relevantes nos parâmetros de segurança avaliados, e nenhuma infecção relevante foi encontrada. Mostramos que as imunizações contra PbWT e PbVac são capazes de provocar uma resposta humoral contra o antigénio em macacos. É importante ressaltar que a geração de anticorpos anti-esporozoítos Pf observados em animais imunizados com PbVac- mas não com PbWT indica que a PfCS pode desempenhar um papel significativo nas respostas humorais à vacina. Quanto ao papel da imunidade celular desencadeada por essas imunizações, nem o perfil fenotípico geral, nem a magnitude e especificidade das respostas celulares aos agentes de imunização ou a Pf foram significativamente alteradas após a imunização. Em contraste com o que alguns ensaios em humanos relataram, não encontramos expansão da população de células T γδ após a imunização. No entanto, encontramos alterações fenotípicas nas células linfóides inatas (ILCs), que diminuíram significativamente, e um aumento nas células T CD4+ nos PBMCs. No geral, os nossos resultados indicam que a imunização com PbVac representa uma plataforma de vacinação segura que gera respostas imunes humorais a Pf. Manipulação adicional da estratégia de imunização com PbVac, como dose ou modo de administração, pode melhorar significativamente as suas respostas imunológicas humorais e celulares, contribuindo assim para o desenvolvimento de uma vacina eficiente contra a malária. Malaria is a mosquito-borne infectious disease that remains one of the most impactful infectious diseases globally, killing thousands of people every year. Despite all efforts to control this disease, such as chemoprophylaxis and vector control measures, the lack of knowledge about the immune responses triggered by the Plasmodium parasite hinders the development of an urgently needed efective malaria vaccine. The asymptomatic and highly immunogenic nature of the liver stage of Plasmodium infection makes it an ideal target for malaria vaccine development. The Instituto de Medicina Molecular (IMM)’s Prudêncio lab has developed a new pre-erythrocytic whole-sporozoite malaria vaccine candidate, PbVac, in which the rodent P. berghei parasite expresses the highly immunogenic P. falciparum surface circumsporozoite protein (PfCS in order to promote PfCS-specific and cross-species immune responses that may protect against a subsequent P. falciparum infection. Pre-clinical studies in mouse and rabbit models of infection have shown that PbVac is able to infect and develop in hepatocytes without establishing a blood stage infection. In order to mimic what happens in the human liver, rhesus macaques (Macaca mulatta) were used for a pre-clinical analysis of P. berghei wild-type (WT) and genetically modified PbVac sporozoites, as a strategy to induce immunity to P. falciparum. This study aims to investigate and compare the humoral and cellular-associated immune responses between immunized and non-immunized animals. First, the ability of PbWT sporozoites to infect rhesus macaque hepatocytes in vivo was confirmed. Subsequently, rhesus macaques were immunized by mosquito bite with PbVAC or PbWT and followed for 21 weeks, in parallel with non-immunized animals. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and plasma were collected periodically, and liver cells and splenocytes were collected at euthanasia. A comparison between plasma pre- and post- 3 immunizations was performed to analyze humoral responses through quantification of specific IgGs for sporozoites. The compositions of the peripheral blood, liver and spleen immune compartments were analyzed by immunophenotyping, and specific cellular immune responses against PbVAC, PbWT and Pf sporozoites were assessed in PBMCs and liver cells by an intracellular cytokine assay.Immunizations were safe, with no relevant changes in the safety parameters evaluated, and no breakthrough infections were found. We show that both PbWT and PbVac immunizations are capable of eliciting a humoral response against the immunogen in monkeys. Importantly, the generation of anti-Pf sporozoites antibodies observed in PbVac- but not PbWT-immunized animals indicates that PfCS may play a significant role in humoral responses to the vaccine. As for the role of cellular immunity elicited by these immunizations, neither the overall phenotypic profile nor the magnitude and specificity of cellular responses to the immunization agents or to Pf were significanty altered upon immunization. In contrast to what some human trials have reported, we found no expansion of the γδ T cell population upon immunization. However we found phenotypic changes in innate lymphoid cells ILCs, which decreased significantly, and an increase in CD4+ T cells in PBMCs. Overall, our results indicate that PbVac immunization represents a safe vaccination platform that generates humoral immune responses to Pf. Additional manipulation of the PbVac immunization strategy, such as dose or mode of administration, may significantly enhance its humoral as well as cellular immune responses, thus contributing to the development of an efficient malaria vaccine

O glioblastoma (GBM) é o mais maligno e com a menor taxa de sobrevida dos tumores gliais. O tecido tumoral é composto por muitas células neoplásicas em proliferação, fibroblastos e células do sistema imune. A proliferação tumoral depende de uma rede complexa de fatores, como citocinas, adenosina e vesículas extracelulares (VEs). O papel das VEs ainda é um assunto controverso e sua atividade pró-tumoral ou antitumoral não é totalmente compreendida. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi compreender o papel das vesículas extracelulares derivadas de tumores (VETs), derivadas da linhagem celular C6, na modulação do sistema imune e na progressão do GBM. VETs foram isolados por centrifugação diferencial do sobrenadante da linhagem celular C6. O tamanho e a polidispersão foram analisados por equipamentos Nanosight, ZetaSizer e Microscopia Eletrônica de Transmissão. A estabilidade das VETs foi analisada pelo equipamento ZetaSizer nos dias 1, 4 e 18. Estas vesículas foram caracterizadas pela presença de marcador clássico, como CD9, e também pela presença das enzimas CD39 e CD73. Além disso, as células de GBM C6 foram tratadas com diferentes concentrações de VETs durante 96 h (n = 3) e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio MTS. Em seguida, as VETs foram incubadas (8 μg) com linfócitos mesentéricos isolados de ratos Wistar adultos. Após 48 h de incubação, a expressão das enzimas CD39 e CD73 nos linfócitos foi avaliada por citometria de fluxo. Os modelos GBM in vivo foram realizados com três grupos de ratos Wistar machos adultos: Controle, coinjeção e imunização. No grupo de coinjeção, as VETs foram coinjetadas com células C6 GBM no estriado por cirurgia estereotáxica. No grupo de imunização, os ratos foram tratados com 20 μg de VETs 10 e 5 dias antes da cirurgia. Após 14 dias de crescimento tumoral, os ratos foram decapitados e o cérebro foi removido para quantificação do volume do tumor e análise do microambiente tumoral. As VETs apresentaram tamanho uniforme (175,2 ± 6,14nm) e a estabilidade, a 4 ° C, durante os 18 dias testados. Os inibidores das enzimas CD39 e CD73 reduziram (52,1% e 57,8%, respectivamente) a formação de ADO, enquanto o efeito do bloqueio do receptor ADO não alterou a concentração deste nucleosídeo. A porcentagem de células viáveis foi significativamente reduzida após o tratamento com 16 e 32 μg / mL de VETs (de 120 ± 2,12% para 82,52 ± 5% e 92,1 ± 7,9%, respectivamente). A incubação de linfócitos T com VETs não alterou a expressão da proteína CD39 e CD73 em nenhum dos subtipos testado de linfócitos T. Além disso, a coinjeção de VETs reduziu o tamanho do GBM de 221 ± 65,1 mm³ para 121 ± 40,6 mm³ em comparação ao controle. O grupo imunização apresentou um menor volume de GBM em comparação ao grupo controle (de 173 ± 91,8 mm³ para 69 ± 20,2 mm³). Buscando entender o mecanismo por trás dessa redução, analisamos a presença de células CD4+FOXP3- e CD4+FOXP3+ no microambiente tumoral. O grupo coinjeção mostrou uma redução significativa de células CD4+FOXP3- e CD4+FOXP3+, no entanto, não observamos o mesmo no grupo de imunização, que não mostrou diferença entre os grupos. Juntos, nossos resultados sugerem que os VETs desempenham um papel antitumoral na progressão do GBM, reduzindo a proliferação tumoral e a presença de linfócitos T regulatórios no microambiente tumoral. Glioblastoma (GBM) is the most malignant with the poorest survival rate of the glial tumors. The tumoral tissue is composed by many proliferating neoplastic cells, fibroblasts and cells of immune system. Tumor proliferation depends on complex network factors, such as cytokines, adenosine and extracellular vesicles (EVs). The role of EVs remains controversial and their pro-tumoral or antitumoral activity is not fully understand. In this context, the aim of this study was understand the role of tumor-derived extracellular vesicles (TEVs) in the immune system modulation and GBM progression. TEVs were isolated by differential centrifugation of C6 cell line supernatant. Size and polydispersity were analyzed by Nanosight, Zetasizer equipments and Transmission Electron Microscopy. TEVs stability was analyzed by Zetasizer equipment on days 1, 4 and 18. These vesicles were characterized by the presence of EVs classical marker, CD9, also CD39 and CD73 enzymes. Further, C6 GBM cells were treated with different concentrations of TEVs during 96 h (n=3) and cell viability was assessed by MTS assay. Then, GEVs were incubated (8 μg) with mesenteric lymphocytes isolated from adult Wistar rats. After 48 h of incubation, the expression of CD39 and CD73 enzymes was evaluated by flow cytometry. The in vivo GBM model was performed with three adult male Wistar rats groups: Control, coinjection and immunization. In the coinjection group, TEVs were coinjecting with C6 GBM cells into the striatum by stereotactic surgery of adult Wistar rats. In the immunization group, rats were treated with 20 μg of TEVs 10 and 5 days before surgery. After 14 days of tumor growth, the rats were decapitated and the entire brain was removed for tumor size quantification and tumor microenvironment analysis. TEVs presented uniform size (175,2±6,14nm) and the stability, at 4°C, during the 18 days tested (186,8±6,64nm). Inhibitors of CD39 and CD73 enzymes reduces (52,1% and 57,8%, respectively) formation of ADO while the effect of ADO receptor blockade did not alter the concentration of this nucleoside. The percentage of viable cells was significantly reduced after treatment with 16 and 32 μg/mL of TEVs (from 120±2,12% to 82,52±5% and 92,1±7,9%, respectively). The incubation of T-lymphocytes with TEVs did not alter the expression of CD39 and CD73 protein in any tested subset of T-lymphocytes. Moreover, the co-injection of TEVs reduces the GBM size from 221 ± 65,1 mm³ to 121± 40,6 mm in comparison to GBM group. Immunization group reduces the GBM size from 173 ± 91,8 mm³ to 69 ± 20,2 mm³. Seeking to understand the mechanism behind this reduction, we analyzed the presence of CD4+FOXP3- and CD4+FOXP3+ cells in tumor microenvironment. The coinjection group showed a significant reduction of CD4+FOXP3- and CD4+ FOXP3+ cells, however we didn’t observe the same in immunization group, which has shown no difference between groups. Together, our results suggest GEVs plays an anti-tumoral role in GBM progression by reducing tumor proliferation and presence of T regulatory lymphocytes in tumor microenvironment.

A malária é uma doença infecciosa transmitida por mosquitos que continua a ser uma das doenças infecciosas mais impactantes do mundo, matando milhares de pessoas todos os anos. Apesar de todos os esforços para controlar esta doença, como quimioprofilaxia e medidas de controlo de vetores, a falta de conhecimento sobre as respostas imunes desencadeadas pelo parasita Plasmodium dificulta o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a malária, que é necessária com urgência. A natureza assintomática e altamente imunogénica do estadio hepático da infecção por Plasmodium torna-o num alvo ideal para o desenvolvimento da vacina contra a malária. Prudêncio lab do Instituto de Medicina Molecular (IMM) desenvolveu um novo candidato a vacina contra a malária de esporozoito inteiro que tem como alvo o estágio hepático, a PbVAC. Na qual o parasita roedor P. berghei expressa a proteína circunsporozoítica de superfície do P. falciparum (PfCSP), altamente imunogénica, de modo a promover respostas imunitárias específicas para PfCSP, assim como respostas cruzadas entre espécies, que podem proteger contra uma infecção subsequente por P. falciparum. Estudos pré-clínicos em modelos de infecção em murganhos e coelhos mostraram que PbVac é capaz de infectar e desenvolver-se em hepatócitos sem estabelecer uma infecção no estadio sanguíneo. Para imitar o que acontece no fígado humano, os macacos rhesus (Macaca mulatta) foram usados para um teste pré-clínico de P. berghei wild-type (WT) e esporozoítos PbVac geneticamente modificados, como estratégia para induzir imunidade contra P. falciparum. Este estudo tem como objetivo investigar e comparar as respostas imunes humorais e celulares entre animais imunizados e não imunizados. Primeiro, confirmamos que os esporozoítos do PbWT são capazes de infectar hepatócitos do macaco rhesus in vivo. Posteriormente, os macacos rhesus foram imunizados por picada de mosquito com PbVac ou PbWT e seguidos por 21 semanas, em paralelo com animais não imunizados. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e plama foram coletadas periodicamente e células do fígado e esplenócitos foram coletados na eutanásia. Foi realizada uma comparação do plasma pré e pós 3 imunizações para analisar as respostas humorais quantificando IgGs específicas para esporozoítos. As composições dos compartimentos imunes do sangue periférico, fígado e baço foram analisadas por imunofenotipagem e respostas imunes celulares específicas contra esporozoítos PbVAC, PbWT e Pf foram avaliadas em PBMCs e células hepáticas utilizando um ensaio intracelular de citocinas. As imunizações foram seguras, sem alterações relevantes nos parâmetros de segurança avaliados, e nenhuma infecção relevante foi encontrada. Mostramos que as imunizações contra PbWT e PbVac são capazes de provocar uma resposta humoral contra o antigénio em macacos. É importante ressaltar que a geração de anticorpos anti-esporozoítos Pf observados em animais imunizados com PbVac- mas não com PbWT indica que a PfCS pode desempenhar um papel significativo nas respostas humorais à vacina. Quanto ao papel da imunidade celular desencadeada por essas imunizações, nem o perfil fenotípico geral, nem a magnitude e especificidade das respostas celulares aos agentes de imunização ou a Pf foram significativamente alteradas após a imunização. Em contraste com o que alguns ensaios em humanos relataram, não encontramos expansão da população de células T γδ após a imunização. No entanto, encontramos alterações fenotípicas nas células linfóides inatas (ILCs), que diminuíram significativamente, e um aumento nas células T CD4+ nos PBMCs. No geral, os nossos resultados indicam que a imunização com PbVac representa uma plataforma de vacinação segura que gera respostas imunes humorais a Pf. Manipulação adicional da estratégia de imunização com PbVac, como dose ou modo de administração, pode melhorar significativamente as suas respostas imunológicas humorais e celulares, contribuindo assim para o desenvolvimento de uma vacina eficiente contra a malária. Malaria is a mosquito-borne infectious disease that remains one of the most impactful infectious diseases globally, killing thousands of people every year. Despite all efforts to control this disease, such as chemoprophylaxis and vector control measures, the lack of knowledge about the immune responses triggered by the Plasmodium parasite hinders the development of an urgently needed efective malaria vaccine. The asymptomatic and highly immunogenic nature of the liver stage of Plasmodium infection makes it an ideal target for malaria vaccine development. The Instituto de Medicina Molecular (IMM)’s Prudêncio lab has developed a new pre-erythrocytic whole-sporozoite malaria vaccine candidate, PbVac, in which the rodent P. berghei parasite expresses the highly immunogenic P. falciparum surface circumsporozoite protein (PfCS in order to promote PfCS-specific and cross-species immune responses that may protect against a subsequent P. falciparum infection. Pre-clinical studies in mouse and rabbit models of infection have shown that PbVac is able to infect and develop in hepatocytes without establishing a blood stage infection. In order to mimic what happens in the human liver, rhesus macaques (Macaca mulatta) were used for a pre-clinical analysis of P. berghei wild-type (WT) and genetically modified PbVac sporozoites, as a strategy to induce immunity to P. falciparum. This study aims to investigate and compare the humoral and cellular-associated immune responses between immunized and non-immunized animals. First, the ability of PbWT sporozoites to infect rhesus macaque hepatocytes in vivo was confirmed. Subsequently, rhesus macaques were immunized by mosquito bite with PbVAC or PbWT and followed for 21 weeks, in parallel with non-immunized animals. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and plasma were collected periodically, and liver cells and splenocytes were collected at euthanasia. A comparison between plasma pre- and post- 3 immunizations was performed to analyze humoral responses through quantification of specific IgGs for sporozoites. The compositions of the peripheral blood, liver and spleen immune compartments were analyzed by immunophenotyping, and specific cellular immune responses against PbVAC, PbWT and Pf sporozoites were assessed in PBMCs and liver cells by an intracellular cytokine assay.Immunizations were safe, with no relevant changes in the safety parameters evaluated, and no breakthrough infections were found. We show that both PbWT and PbVac immunizations are capable of eliciting a humoral response against the immunogen in monkeys. Importantly, the generation of anti-Pf sporozoites antibodies observed in PbVac- but not PbWT-immunized animals indicates that PfCS may play a significant role in humoral responses to the vaccine. As for the role of cellular immunity elicited by these immunizations, neither the overall phenotypic profile nor the magnitude and specificity of cellular responses to the immunization agents or to Pf were significanty altered upon immunization. In contrast to what some human trials have reported, we found no expansion of the γδ T cell population upon immunization. However we found phenotypic changes in innate lymphoid cells ILCs, which decreased significantly, and an increase in CD4+ T cells in PBMCs. Overall, our results indicate that PbVac immunization represents a safe vaccination platform that generates humoral immune responses to Pf. Additional manipulation of the PbVac immunization strategy, such as dose or mode of administration, may significantly enhance its humoral as well as cellular immune responses, thus contributing to the development of an efficient malaria vaccine.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos. O potencial destes vírus como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado na década de 70. Hoje, os baculovírus são utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal, diagnóstico e como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sabendo que a forma BV (Budded virus) de AcMNPV (Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus) induz alterações fenotípicas e funcionais em células da resposta imune inata e adaptativa, despertou-se o interesse do nosso grupo em saber se a forma OB (Occlusion Body) de AcMNPV, também conhecido como poliedros, apresenta a capacidade de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa. Genes de interesse podem ser fusionadas ao gene da poliedrina, a proteína mais abundante do poliedro, o que permite assim sua produção de proteínas recombinantes em alta concentração. Neste presente trabalho foi avaliado a capacidade do poliedro de AcMNPV em estimular a resposta imune do hospedeiro saudável, apresentando uma ação imunomoduladora. Os resultados in vitro mostraram que o poliedro é capaz de induzir a maturação das células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) observado pelo aumento da produção de citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-12), quimiocina (CCL2), aumento da expressão de moléculas coestimulatória (CD80, CD86) e MHC-II. O poliedro foi capaz de ativar vias de sinalização intracelular semelhante ao obsevado por vírus com o aumento da transcrição dos genes. Além disso, observou-se a ativação de células da reposta imune adaptativa com aumento da proliferação celular com indução de um perfil mixto. Estes dados nos permite concluir que a fusão de proteínas de interesse fusionadas à poliedrina é uma estratégia interessante, não sendo necessária a utilização de adjuvantes nas estratégias de vacinas terapêuticas ou profiláticas. Baculoviruses are circular double-stranded DNA viruses that infect insects. The potential as an implement for heterologous proteins expression began to be explored in the 70´. Today, baculoviruses are widely used to express vaccine antigens, to diagnosis and as potential gene therapy vectors and DNA vaccines. It is already reported in the literature that the BV form of AcMNPV induces phenotypic and functional changes in cells of the innate and adaptive immune response. In this way, our group's interest in knowing whether the OBs form of AcMNPV, also known as polyhedra, has been shown to have the ability to stimulate the innate and adaptive immune responses. Proteins of interest can be fused to the polyhedrin gene, the most abundant protein of the polyhedron, which allows its production in high concentration. This study evaluated if the polyhedron of AcMNPV is able to exert immunomodulatory action. The in vitro results showed that the polyhedron is capable of inducing maturation of the BMDCs cells, which is observed by increased production of inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-12), chemokine (CCL2), increased expression of co-stimulatory molecules (CD80, CD86) and MHC-II. The polyhedron was able to activate intracellular signaling pathways, like those observed by viruses with increased transcription of TLR3, TLR9, IRF3 and IFN-α. In addition, it was through the activation of the BMDCs that it provided the activation of adaptive immune response cells with increased cell proliferation with induction of a mixed profile. These data allow us to conclude that the fusion of proteins of interest fused to polyhedrin is an interesting strategy and there is no need for the use of adjuvants in the strategies of therapeutic or prophylactic vaccines.

Hemocytes are insect immune cells which are responsible for processes of phagocytosis, encapsulation, and coagulation. This study aim to characterize the hemocyte cells in two species amazon blackflies: Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) and Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adler). Black fly larvae and pupae were collected from streams in Presidente Figueiredo Municipality, Amazonas State, Brazil. Hemolymph of 36 individuals of E. rorotaense (12 larvae, 12 pupae and 12 adults) and 38 of E. trombetense (12 larvae, 12 pupae and 14 adults) were collected and the cells were characterized by light microscopy; 200 adults of each species were used to transmission electron microscopy study. In this work were showed, by the first time, the hemocyte cells of black flies amazon. Four cell types were identified: prohemocytes, granulocytes, oenocytoids, and plasmatocytes. Prohemocytes were the smallest cells and they exhibited a high nuclear-cytoplasmic ratio. Granulocytes possessed large, eccentric nuclei, and they were characterized by the presence of granules that differed in size and shape. Oenocytoids presented poorly developed nucleus with localization in central region. Plasmatocytes showed more morphological variations and large projections in the cytoplasmic membrane. The prohemocytes were the most frequent in E. rorotaense , with nearby 45% of total cells, whereas plasmatocytes and granulocytes, each one with 38%, were the most abundant in E. trombetense . This study showed that prohemocytes, granulocytes, oenocytoids, and plasmatocytes were present in the hemolymph of E. rorotaense and E. trombetense during all stages. Caracterizacao Morfologica de Hemocitos em Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adler) (Diptera: Simuliidae) Resumo. Os hemocitos sao celulas do sistema imune dos insetos responsaveis pelos processos de fagocitose, encapsulacao e coagulacao. O objetivo desse trabalho foi caracterizar os hemocitos nos simulideos amazonicos, Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc)e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adler). Larvas e pupas de simulideos foram coletadas em igarapes no municipio de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil. Para caracterizacao celular atraves da microscopia optica, foi coletada a hemolinfa de 36 especimes (12 larvas, 12 pupas e 12 adultos) de E. rorotaense e 38 especimes (12 larvas, 12 pupas e 14 adultos) de E. trombetense . Para o estudo com microscopia eletronica de transmissao, 200 adultos de cada especie foram utilizados. Neste trabalho foram descritos, pela primeira vez, os hemocitos de simulideos amazonicos. Foram identificados quatro tipos celulares em larvas, pupas e adultos: prohemocitos, plasmatocitos, granulocitos e oenocitoides. Os prohemocitos, com um nucleo volumoso em relacao ao citoplasma, se mostraram as menores celulas. Os granulocitos foram caracterizados pela presenca de grânulos de diferentes tamanhos e formas e um nucleo grande e excentrico. Os oenocitoides revelaram nucleo pouco desenvolvido, geralmente localizado na regiao central. Os plasmatocitos apresentaram grandes projecoes da membrana citoplasmatica e maior variacao morfologica. Os prohemocitos foram as celulas mais frequentes em E. rorotaense com 45% do total das celulas , enquanto os plasmatocitos e granulocitos, ambas com 38% cada, foram as mais abundantes em E. trombetense. Esse estudo mostrou que prohemocitos, granulocitos, oenocitoides e plasmatocitos sao presentes na hemolinfa de E. rorotaense and E. trombetense durante todos os estagios.

O objetivo da pesquisa foi avaliar o comportamento das células do sistema imune após a aplicação da vacina SG9R (Salmonella Gallinarum), correlacionando a intoxicação de aflatoxinas (AFLA) em poedeiras comerciais com e sem adsorvente (AAM) na dieta. Foram utilizadas poedeiras comerciais de linhagem Brown com um dia de idade. A vacina foi utilizada de forma subcutânea na região dorsal do pescoço, aplicando 0,2 ml por ave. As coletas de sangue foram realizadas 3, 14 e 21 dias após a vacinação. Durante o experimento foram utilizadas duas doses de Aflatoxinas (1 e 2,5 ppm) e duas concentrações de adsorvente (1 e 2,5 kg/ton), de acordo com os seguintes tratamentos: T1 (controle); T2: 9R + 2,5 ppm AFLA + 2,5 kg/ton AAM; T3: 9R; T4: 9R +2,5 ppm AFLA; T5: 2,5 ppm AFLA; T6: 2,5 ppm AFLA + 2,5kg/ ton AAM; T7: 9R + 1 ppm AFLA; T8: 9R + 1 ppm AFLA + 1 kg/ton AAM. As aves começaram a consumir AFLA/AAM desde o primeiro dia. As células avaliadas foram: linfócitos T citotóxicos de mucosa (CD4-TCRvβ1+), linfócitos T citotóxicos ativados (CD8+ CD28-), linfócitos T auxiliares de mucosa (CD4+TCRvβ1+), linfócitos B (Bu-1a +), monócitos (Kul+MHCII+), monócitos fagocíticos (%) e heterófilos fagocíticos (%). Os marcadores celulares foram interpretados por citometria de fluxo. A vacina SG9R reduziu de forma significativa (p˂0,05) a concentração de linfócitos T citotóxicos ativados (CD8+CD28-), tornando esse marcador um bom parâmetro para ser analisado antes e após a imunização com SG9R. Os monócitos (Kul+MHCII+), apresentaram aumento estatisticamente significante (p˂0,05) de concentração após a vacinação. As aflatoxinas demonstraram um efeito supressivo sobre os linfócitos T auxiliares de mucosa (CD4+TCRVβ1+), linfócitos T auxiliares periféricos (CD4+TCRVβ1-) e linfócitos T citotóxicos de mucosa (CD4-TCRVβ1+) em aves vacinadas, apresentando diferença significativa (p˂0,05) nas coletas com 3 e 14 dias após a vacinação. A inclusão de 2,5 kg/ton de adsorvente na ração na presença da vacina, neutralizou os efeitos da aflatoxicose relatados acima, especialmente nas concentrações de linfócitos T auxiliares de mucosa (CD4+TCRVβ1+), linfócitos T auxiliares periféricos (CD4+TCRVβ1-) e linfócitos T citotóxicos de mucosa (CD4-TCRVβ1+). As concentrações dessas células aumentaram significativamente (p˂0,05) 21 dias após a vacinação. Portanto, a concentração de células do sistema imune pode apresentar diferenças após a vacina SG9R. Os efeitos supressivos das aflatoxinas junto a população de linfócitos T ficaram evidentes após a vacinação. No entanto, esses efeitos foram neutralizados quando utilizado 2,5 kg/ton de adsorvente na ração. The objective of this research was to evaluate the behavior of some specific immune cells after applying SG9R (Salmonella Gallinarum) live vaccine. The effect of adding Aflatoxin (AFLA) and an anti-mycotoxin absorbent to the rations was also evaluated. One-day-old commercial layers were used in this experiment. Each bird was vaccinated subcutaneously in the neck with 0.2 ml of the vaccine.Blood samples were collected at 3, 14 and 21 days post vaccination. The concentrations of the Aflatoxins mixed in the feed in the trial were 1 and 2.5 ppm (1 and 2.5 kg/ton). The concentrations of the anti-mycotoxins absorbent used were 1-2.5 kg / ton. The following treatments were used: T1: control; T2: 9R + 2.5 ppm AFLA + 2.5 kg/ton AAM; T3: 9R; T4: 9R +2.5 ppm AFLA; T5: 2.5 ppm AFLA; T6: 2.5 ppm AFLA + 2.5 kg/ton AAM; T7: 9R + 1 ppm AFLA; T8: 9R + 1 ppm AFLA + 1 kg/ton AAM. Birds started consuming Aflatoxin and the anti-mycotoxin absorbent at one day of age. The following cells were evaluated: peripheral helper T lymphocytes (CD4+TCRvβ1-), helper T lymphocytes of mucosa (CD4+TCRvβ1+), cytotoxic T lymphocytes of mucosa (CD4-TCRvβ1+), Activated cytotoxic T lymphocytes (CD8+CD28-), B lymphocytes (Bu-1a+), monocytes (Kul+MHCII+), phagocytic monocytes (%) and phagocytic heterophils (%). Cells markers were measured by flow cytometry. SG9R vaccination significantly decreased (p˂0.05) the concentration of activated cytotoxic T lymphocytes (CD8+CD28-). Making this marker a good parameter to be analyzed before and after immunization with SG9R. The monocytes (Kul+MHCII+) presented a statistically significant increase (p˂0.05) in concentration after vaccination. In the treatments where aflatoxins were present we detected a large suppressive effect on the mucosal helper T lymphocytes (CD4+TCRVβ1+), peripheral helper T lymphocytes (CD4+TCRVβ1-) and cytotoxic T lymphocytes of mucosa (CD4-TCRVβ1+) in vaccinated birds. With significant difference (p˂0.05) in the collections with 3 and 14 days after vaccination. The inclusion of 2.5 kg of the adsorbent in the diet per tonne of feed neutralized the effects of aflatoxicoses reported above, especially in the concentrations of helper T lymphocytes of mucosa (CD4+TCRVβ1+), peripheral (CD4+TCRVβ1-) and cytotoxic of mucosa (CD4-TCRVβ1+). Increasing the concentration of these cells in the significant difference (p˂0.05) 21 days after vaccination. Therefore, the concentration of immune system cells may show differences after the SG9R vaccine. The suppressive effects of aflatoxins on the T lymphocyte population were evident after vaccination. However, these effects were neutralized with 2.5 kg / ton of adsorbent.

Orientadores: Marcos Tadeu Nolasco da Silva, Carlos Emilio Levy Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: INTRODUCAO E OBJETIVO: Estimativas recentes avaliam que um terco da populacao mundial sao portadores do bacilo e que cerca de 10,4 milhoes de novos casos de tuberculose ocorrem anualmente em todo o mundo, dos quais 86 mil no Brasil. A infeccao pelo HIV prejudica os mecanismos adaptativos da imunidade celular. O controle virologico de longa duracao por terapia anti-retroviral combinada (TARC) reduz o risco de infeccao por micobacterianos. Os linfocitos T Gama-Delta ('gama' ð) podem adquirir a capacidade de processar e apresentar antigenos. Na tuberculose, podem desempenhar diversos papeis na resposta imunologicas, como produzir citocinas inflamatorias e acao citolitica. Com base nesse cenario, nosso estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de producao de granulos citotoxicos, expressao de fenotipo de apresentacao de antigeno e ativacao celular, em resposta a antigenos micobacterianos, por linfocitos T CD8+ e 'gama' ð, em jovens infectados pelo HIV por transmissao vertical, vacinados por BCG. METODO: Foi realizado um estudo analitico, prospectivo, observacional, do tipo corte transversal. Foram recrutados 20 individuos, entre 16 e 23 anos, no ambulatorio de Imunodeficiencia secundaria do HC/Unicamp e 20 voluntarios saudaveis com idade comparavel. Foram realizadas culturas celulares nao estimuladas, estimuladas por fitohemaglutinina e antigenos micobacterianos (BCG e Mycobacterium tuberculosis . Mtb). Essas culturas foram marcadas com anticorpo CD107a (marcador de degranulacao), HLA-DR+CD80+CD86 (fenotipo de celulas apresentadoras de antigenos). RESULTADOS: A expressao de CD107a de celulas T 'gama' ð em resposta a antigenos micobacterianos foi semelhante entre grupos e menor no grupo HIV em resposta a fitohemaglutinina. No grupo HIV, a expressao basal de HLA-DR foi maior e a expressao estimulada por antigeno Mtb foi maior nos linfocitos T CD8+. Especificamente no grupo de pacientes infectados pelo HIV, observou-se maior expressao de CD107a em resposta a fitohemaglutinina no grupo com imunossupressao grave. CONCLUSAO: A producao de granulos citotoxicos semelhante em celulas T CD8+ e celulas T 'gama' ð, quando comparada a controles saudaveis, pode representar a preservacao imunologica de longo prazo com reconstituicao imune sob a TARC bem-sucedida. No entanto, as diferencas na expressao de HLA-DR podem representar inflamacao em curso e respostas mais baixas especificas em jovens infectados pelo HIV. Essas caracteristicas podem ser relevantes no contexto da precocidade e gravidade da infeccao pelo HIV adquirida verticalmente Abstract: BACKGROUND: Recent estimates evaluate that one-third of the world's population are carriers of the bacillus, and that around 10.4 million new cases of tuberculosis occur annually around the world, of which 86,000 in Brazil. HIV infection harms the adaptive mechanisms of cellular immunity. Long-term virological control by combination anti-retroviral therapy (TARc) reduces the risk of mycobacterial infection. Gamma-Delta T lymphocytes ('gamma' ð) may acquire the ability to process and present antigens. In tuberculosis, they may play several roles in the immune response, such as producing inflammatory cytokines and cytolytic action. Based on this scenario, our study aimed to evaluate the capacity of production cytotoxic granules, expression of antigen presenting phenotype and cellular activation in response to mycobacterial antigens by CD8+ and 'gamma' ð T lymphocytes in young infected by HIV by vertical transmission, vaccinated by BCG. METHODS: A prospective cross-sectional study was conducted. Twenty individuals, aged 16-23, were recruited at the Pedriatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the State of University of Campinas (Unicamp) Hospital (Campinas, Brazil) and 20 healthy volunteers of comparable age. Cell cultures stimulated by phytohemagglutinin and mycobacterial antigens (BCG and Mycobacterium tuberculosis ¿ Mtb)or negative control were performed. These cultures were marked with CD107a antibody (degranulation marker), HLA-DR+CD80+CD86 (antigen presenting cell phenotype). RESULTS: CD107a expression of 'gamma' ð T cells in response to mycobacterial antigens was similar between groups and lower in the HIV group in response to phytohemagglutinin. In the HIV group, the baseline expression of HLA-DR was higher and Mtb antigen-stimulated expression was higher, too. Specifically in the group of HIV-infected patients, greater expression of CD107a was observed in response to phytohemagglutinin in the group with severe immunosuppression. CONCLUSION: Similar cytotoxic granule production in CD8+ T cells and 'gamma' ð T cells, when compared to healthy controls, may represent long-term immune preservation with immune reconstitution under successful CART. However, differences in HLA-DR expression may represent ongoing inflammation and specific lower responses in HIV-infected youngsters. These characteristics may be relevant in the context of the precocity and severity of vertically acquired HIV infection Mestrado Saúde da Criança e do Adolescente Mestre em Ciências CAPES FAPESP 2013/26862-9

O presente trabalho objetivou avaliar, em vacas e em búfalas submetidas à mastite induzida por inoculação de Staphylococcus aureus, a concentração da citocina pró-inflamatória interleucina-1β (IL-1β), a contagem de células somáticas (CCS) e a correlação destas com alguns parâmetros da resposta local e sistêmica à inflamação. Os animais tiveram uma glândula mamária inoculada e o processo inflamatório foi monitorado pela cultura bacteriológica do leite, CCS, quantificação da IL-1β na secreção láctea, avaliação da aparência/consistência da glândula, aparência da secreção láctea (resposta localizada à inflamação) e aferição da temperatura retal (resposta sistêmica à inflamação). Houve elevação nos níveis de IL-1β, na CCS e resposta localizada e sistêmica à inflamação, tanto na espécie bovina como na bubalina. A cinética da produção da citocina foi diferente nas duas espécies (P0,05) de CS/mL de leite, com concentrações diferentes (P0.05) of SC/milk mL, with different concentrations (P

Esta tese aborda dois temas imunológicos importantes para o controle da hanseníase: diagnóstico laboratorial da hanseníase paucibacilar/ PB e valor prognóstico da sorologia específica para Mycobacterium leprae para reações hansênicas. O diagnóstico laboratorial da hanseníase PB se baseia em testes que avaliam a imunidade celular e este estudo avaliou um protótipo de ensaio de sangue total/EST com combinações antigênicas do M. leprae em pacientes multibacilares-MB e PB e controles de duas regiões endêmicas (Goiânia/GO e Fortaleza/CE). A avaliação da imunidade celular específica se baseou em EST em tubos heparinizados contendo diferentes combinações de antígenos do M. leprae: 46f+LID-1 e ML0276+LID-1; controles: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. Após 24 horas de cultura (37ºC, 5% CO₂), o plasma foi coletado e ELISA utilizado para mensurar IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) e CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Pacientes com hanseníase, recém diagnosticados, não tratados (30 MB, 38 PB) e controles (27 contatos domiciliares/CD, 61 controles saudáveis/CS) foram avaliados. A nova plataforma de tubos foi validada demonstrando produção de IFNγ similar a obtida em placas de cultura. A produção específica de IFNγ para a combinação 46f+LID-1 foi: 84% pacientes PB, 55% CD; para ML0276+LID-1: 71% PB, 55% CD. Para ambas as combinações antigênicas a resposta de IFNγ em pacientes PB diferiu da obtida para os CS (p0,05). Estudos em tuberculose/TB mostraram que a produção de CXCL10 discrimina indivíduos com TB ativa daqueles com infecção latente pelo Mycobacterium tuberculosis. Avaliamos na hanseníase se a produção de CXCL10 é capaz de diferenciar pacientes PB/infecção ativa de CD com infecção “latente”, assintomática. Nossos resultados mostraram produção de CXCL10 induzida por combinações antigênicas do M. leprae, entretanto sem diferenciar resposta de infecção ativa em PB de infecção assintomática em CD. Apesar desta limitação, nossos resultados mostram que o EST em tubo poderia ser uma ferramenta para avaliar as taxas de infecção PB pelo M. leprae e o impacto das medidas de controle. A aplicabilidade da sorologia específica para hanseníase como ferramenta preditora de reações hansênicas foi avaliada por ELISA para detectar anticorpos para específicos do M. leprae, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 e IgM e IgG anti ND-O-LID Utilizamos amostras de soro de 452 pacientes que participaram do Ensaio Clínico para Avaliação da Eficácia de um Esquema Único de Multidrogaterapia em pacientes com hanseníase no Brasil (U-MDT/ CT-BR) que foram monitorados por mais de 6 anos após o tratamento quanto ao desenvolvimento de reações. Resultados da sorologia realizada em amostras coletadas ao diagnóstico, antes do início da terapia (baseline) foram analisados segundo os desfechos clínicos (ocorrência ou não de reações hansênicas). Independente do tipo de reação (reação reversa/RR ou eritema nodoso hansênico/ENH), pacientes reacionais apresentaram maior soropositividade e medianas de D.O para PGL-I, LID-1 e ND-O-LID comparados com pacientes não reacionais (p03, 66% de pacientes reacionais. Os resultados da sorologia, estratificados de acordo com o IB mostrou no grupo com IB negativo que pacientes que desenvolveram RR apresentaram maiores níveis de anticorpos anti PGL-I comparados com pacientes não reacionais (p=0,014); Grupo com IB>03: pacientes que desenvolveram ENH apresentaram maiores níveis de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes não reacionais (p=0,028). De acordo com resultados da curva ROC para avaliar a acurácia de um teste sorológico para prever o desenvolvimento de reações durante o monitoramento, a sorologia anti PGL-I apresentou limitado valor para prever o desenvolvimento futuro de RR (área sob a curva/AUC=0,702). A sorologia para LID-1 mostrou capacidade de prever o desenvolvimento de ENH (AUC= 0,85). A sorologia anti-PGL-I apresentou baixa sensibilidade para prognóstico da RR, indicando a necessidade da identificação outros biomarcadores plasmáticos para predição da RR. Já em pacientes que desenvolveram ENH durante o seguimento apresentaram alta positividade na sorologia anti LID-1 ao diagnóstico, indicando a potencial aplicação da sorologia na identificação de pacientes com maior risco de desenvolver ENH. This thesis concerns two immunologic issues which are relevant for leprosy control activities: laboratory diagnosis of paucibacillary leprosy/PB and evaluation of the prognostic value of Mycobacterium leprae specific serology for leprosy reactions. Immunodiagnostic laboratory tests for PB leprosy (PB) depend on cellular immunity and these tests and this study evaluated a whole blood assay/WBA prototype using antigen combinations in PB and multibacillary leprosy patients (MB) and controls from two Brazilian endemic regions (Goiânia/GO and Fortaleza/CE). The M. leprae specific cellular immunity was evaluated by WBA using heparinized tubes containing different antigen combinations: 46f+LID-1 and ML0276+LID-1; controls: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. After 24 hours incubation (37°C, 5% CO₂) plasma was collected and ELISA used to detect IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) and CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Newly diagnosed, untreated leprosy patients (MB, n=30, PB, n=38) and controls (27 household contacts/HHC, 61 endemic controls/EC) were tested. The new platform in tube validated previous IFNγ results obtained in culture plates. Production of IFNγ to 46f+LID-1 was detected in 84% PB patients, 55% HHC; for ML0276+LID-1: 71% PB, 55% HHC. For both antigen combinations, the IFNγ response of PB leprosy patients differed from the EC (p0.05). Studies in tuberculosis/TB have shown that the CXCL10 response differentiate individuals with active TB from those with latent Mycobacterium tuberculosis infection. In leprosy, CXCL10 levels did not differentiate PB leprosy from HHC. Despite this limitation, our results show that WBA in tube could be a supplementary tool in assessing M. leprae infection rates and evaluating the impact of control measures. The application of leprosy serology as a predictor for the occurrence of leprosy reactions observed during clinical monitoring post treatment was evaluated by ELISA tests to detect M. leprae-specific antibodies, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 and IgM and IgG anti ND-O-LID. Serum samples from 452 patients were tested and these patients participated of Clinical Trial for Uniform Multidrug Therapy Regimen for Leprosy Patients in Brazil/U-MDT/CT-B who were clinically monitored for more than six years post treatment for the development of leprosy reactions. Serological tests were performed in samples collected in untreated patients at diagnosis (baseline) and the results were analyzed taking into account the clinical outcome post treatment (reaction and reaction-free). Reactional patients (RR and ENL) had higher seropositivity rates and optical density/OD medians for PGL-I, LID-1 and ND-O-LID compared to reaction-free patients (p0=3): 66% reactional patients. The serological results stratified according to the BI showed: in BI negative patients higher anti-PGL-I levels in RR patients compared to reaction-free ones (p=0.014); group IB> 0 3: patients who developed ENL showed higher levels of anti-LID-1 antibodies (p=0.028) when compared with reaction-free ones. The accuracy of a serological test to predict the occurrence of leprosy reactions as determined by ROC curve showed that only anti-PGL-I serology provided limited value to predict RR (area-under-the-curve/AUC=0.702). The anti-PGL-I serology showed low sensitivity for RR prognosis, indicating the need to identify other plasma biomarkers for prediction of RR. In patients who developed ENL during follow-up was observed high positivity in the anti-LID-1 serology at diagnosis indicating the potential application of serology in the identification of patients at higher risk of developing ENL. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

Submitted by CLEBER COSTA DE MARTINI null (cleber.martini@hotmail.com) on 2016-06-23T14:59:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Boneco - Cleber1.pdf: 832298 bytes, checksum: a667b4a380fe8c12b4d8a0bb46ef5790 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-27T19:09:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martini_cc_me_araca_par.pdf: 609394 bytes, checksum: 27e09ea8b1ea0328753dcb01c5ac21da (MD5) Made available in DSpace on 2016-06-27T19:09:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martini_cc_me_araca_par.pdf: 609394 bytes, checksum: 27e09ea8b1ea0328753dcb01c5ac21da (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Os cães são o principal hospedeiro-reservatório para a leishmaniose visceral (LV) zoonótica, uma doença vetorial causada por Leishmania infantum. O óxido nítrico (NO) é a principal molécula envolvida na morte do parasita Leishmania, porém não foi quantificada intracelularmente nos macrófagos, e o seu papel na indução da apoptose celular desencadeada na resposta imune contra Leishmania não está esclarecido. Nós quantificamos a frequência de células produtoras de NO e sua concentração no sangue periférico, e em macrófagos do baço de cães sintomáticos com LV. Também avaliamos se o óxido nítrico tem correlação com a carga parasitária e a apoptose no baço. Nos cães com LV foi observado maior porcentagem de células produzindo óxido nítrico no sangue e baço do que a observada nos cães do grupo controle. A porcentagem de células CD14+ e CD14/NO do sangue e baço foi maior nos cães infectados que nos controles saudáveis. As taxas de apoptose tardia também se encontraram aumentadas no sangue e baço dos cães infectados em relação aos controles saudáveis. A porcentagem de células produtoras de NO do baço apresentou uma correlação positiva com a carga parasitária. Não foi observada uma correlação com a produção de NO e a apoptose no sangue e baço dos cães infectados, sugerindo que outros mecanismos efetores devem estar atuando na apoptose. As taxas de apoptose elevadas das células produtoras de NO do sangue periférico e no baço estão afetando a sua produção, favorecendo o aumento da carga parasitária e a evolução da infecção. Dogs are the main reservoir host for visceral leishmaniasis (VL) Zoonotic, a vector disease caused by Leishmania infantum. Nitric oxide (NO) is the main molecule involved in the death of the parasite Leishmania, however it was not quantified intracellularly in macrophages and their role in induction of apoptosis triggered the immune response against Leishmania is unclear. We quantified the frequency of cells producing NO and its levels in the peripheral blood, spleen and macrophages in symptomatic dogs with VL evaluate whether nitric oxide is correlated with the parasite load in spleen and apoptosis. In dogs with LV was higher percentage of cells observed producing nitric oxide in the blood and spleen than that observed in the control group dogs. The percentage of CD14 + and CD14/NO blood and spleen was higher in infected dogs than in healthy controls. The late apoptosis rates are also increased in the blood and spleens of infected dogs compared to healthy controls. The percentage of cells producing NO spleen showed a positive correlation with the parasite load. There is a correlation with the production of NO and apoptosis in the blood and spleens of infected dogs was observed, suggesting that other mechanisms may be acting effectors of apoptosis. The high rates of apoptosis in cells producing NO peripheral blood and spleen are affecting their production, favoring increased parasite load and development of infection. FAPESP: 2013/06684-9

The thymus is a lymphoid organ and usually evaluated for the degree of lymphocyte loss with subjective histological techniques. This study aimed to adapt and to apply of the digital analysis of the lymphoid depletion system (ADDL) in the thymus in order to obtain a more accurate analysis. Glucocorticoid was used to induce immunosuppression in 55 broilers at 21 days of age; other 15 broilers were the control group. After euthanasia of the broilers, postmortem examination was made. Both thymic chains were collected and six lobes were selected for histological examination of the degree of lymphocyte depletion (scores 1 to 5) and for submission to all stages of processing by the ADDL system. The artificial constructed neural networks (ANN) obtained 94.03% of correct classifications. In conclusion, it was possible to adopt objective criteria to evaluate thymic lymphoid depletion with the ADDL system. Resumo: O timo é um órgão linfóide, que é normalmente avaliado para o grau de perda de linfócitos a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como objetivo a adaptação e aplicação do sistema de análise digital de depleção linfóide (ADDL) para o timo, a fim de tornar sua análise mais acurada. Glicocorticóides foram utilizados a fim de induzir imunossupressão em 55 aves de 21 dias de idade. Outras 15 aves formaram o grupo controle. Posteriormente, para cada um dos aves, realizou-se a eutanásia e necropsia. Ambas as cadeias do timo foram coletadas e foram selecionadas seis lóbulos para processamento histológico, análise quanto ao grau de depleção linfocitária (escores de 1-5) e submissão a todas as fases do processamento pelo sistema ADDL. Observou-se que a rede neural artificial (RNA) construída obteve 94,03% de classificações corretas. Em conclusão, foi possível adotar critérios objetivos para avaliar a depleção linfóide tímica utilizando o sistema ADDL.

O treino competitivo envolve exercício intenso e prolongado, capaz de modular o número e actividade das células imunitárias. Quando demasiado exigente poderá induzir fadiga e aumentar a susceptibilidade a doenças. Esta dissertação apresenta três estudos desenvolvidos no âmbito da Imunologia do Exercício, considerando a análise da resposta celular imunitária sistémica aguda e crónica ao exercício aplicada em situações reais do treino competitivo de natação, controlando factores passíveis de influenciar esta resposta. Pretendeu-se avaliar a resposta imunitária a uma sessão de treino prolongada e intensa, durante as 24h de recuperação (Estudo 1) e a uma época de treino com sete meses (Estudo 2), e estudar a influência de um macrociclo de treino de quatro meses sobre a resposta imunitária à mesma sessão de treino e período de recuperação (Estudo 3), controlando sexo, fases do ciclo menstrual, maturidade, escalão, especialidade, performance, cargas de treino e sintomas respiratórios superiores (URS). A sessão de treino induziu a diminuição da vigilância imunitária adquirida imediatamente e, pelo menos nas 2h seguintes. Juvenis e seniores recuperaram totalmente 24h depois, mas não os juniores, reforçando a ideia da existência de uma janela aberta para a infecção após exercícios prolongados e intensos e sugerindo uma recuperação menos eficiente para os juniores. No período de treino mais intenso da época observou-se uma imunodepressão e maior prevalência de URS. No final da época, a imunidade inata diminuiu aparentando maior sensibilidade aos efeitos cumulativos da carga de treino, enquanto a imunidade adquirida parece ter recuperado após o taper. O macrociclo de treino atenuou a resposta imunitária à sessão de treino e aumentou o período de janela aberta às infecções (efeitos mais acentuados nos adolescentes). Os resultados evidenciam a importância de controlar alterações imunitárias durante a época competitiva, especialmente em períodos de treino intenso e quando se realizam sessões de treino intensas consecutivas com recuperações inferiores a 24h. Competitive training demands strenuous prolonged exercise that may modulate the number and activity of circulating immune cells. Over demanding programs can lead to fatigue and increased risk of infection and susceptibility to diseases. This dissertation presents three studies developed within the Exercise Immunology scope, considering the analysis of acute and chronic systemic immune cell responses to exercise applied in real situations of competitive training, controlling for factors that may affect immune responses. We aimed to evaluate the immune response to a high intensity prolonged swimming training session (Study 1) and to a 7-month swimming training season (Study 2), and the influence of a 4-month training macrocycle on the immune response to a swimming session (Study 3). Subjects characteristics, namely sex, menstrual cycle phase, maturity, swimming age group, and distance specialty were controlled, and training load, performance improvements and Upper Respiratory Symptoms (URS) were monitored. The swimming session induced an impaired acquired immune surveillance immediately and at least throughout 2h post-exercise, however, 24h after, senior and youth swimmers had totally recovered but not juniors. This supports the idea of an open window to infection after prolonged intense exercise, suggesting also a more difficult recovery of juniors. During the season’s high intensity training periods immune depression and higher URS prevalence were observed. When the season ended, innate immunity was decreased, appearing to have been more affected by cumulative training loads, while acquired immunity seemed to have adapted and recovered efficiently after the taper period. The training season induced an overall attenuation of the immune system’s ability to respond to the swimming session, and a subsequent longer open window period of susceptibility to infection (more accentuated in adolescents). These findings enhance the importance of controlling immune alterations throughout the season, especially in heavy training periods and when performing consecutive intense training sessions without 24h of recovery.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. As parasitoses intestinais apresentam uma alta prevalência no mundo. Estudos revelam o aumento das doenças alérgicas e da asma e concomitantemente redução das doenças infectoparasitárias em crianças. A existência de uma correlação é estudada demonstrando a ação imunossupressora dos parasitos intestinais sobre a resposta imunitária sistêmica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o estado de ativação dos eosinófilos e as funções dos fagócitos comparativamente em crianças com asma, com parasitoses intestinais e na associação de ambas. Foi realizado estudo transversal com 68 crianças residentes no Riacho Fundo II e na Cidade Estrutural, em Brasília/Distrito Federal. Os pacientes foram separados nos grupos: A) crianças com parasitoses intestinais; B) crianças asmáticas sem parasitoses intestinais; C) crianças com parasitoses intestinais e asma e D) grupo controle. Após técnica de aderência em lâmina, foram avaliados: o estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico por parâmetros morfológicos; a fagocitose pelos monócitos (MON) e neutrófilos (NEU) por receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e para opsoninas (rOps), como também a produção de ânions superóxido (O-) pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT). As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis. Observamos, além da baixa renda familiar e reduzidas condições de escolaridade, a prática de evacuações no peridomicílio pelas crianças e a ausência de tratamento domiciliar da água de beber. Os parasitos intestinais mais prevalentes foram Ascaris lumbricoides e Giardia lamblia, seguida por Hymenolepis nana e houve associação de parasitos intestinais em 38% dos pacientes parasitados. A ativação dos eosinófilos foi menor nas crianças com enteroparasitoses, quando analisados o percentual de eosinófilos normais, espraiamento, liberação de pequenas quantidades de grânulos e emissão de pseudópode único, comparativamente às crianças asmáticas. A capacidade fagocitária pelos rPMP dos NEU das crianças parasitadas exclusivamente por protozoários foi menor do que a das crianças asmáticas. Quando a fagocitose foi avaliada pelos rOps, a capacidade fagocitária dos MON das crianças asmáticas e também parasitadas foi maior do que a das crianças controle, pela maior ingestão de leveduras pelos MON. A produção de O- pelos fagócitos foi menor nas crianças parasitadas por protozoários do que nas crianças asmáticas e parasitadas por protozoários. Contudo, a produção dos O- foi maior nas crianças parasitadas por helmintos do que nas crianças asmáticas. Em conclusão, a infecção parasitária e o quadro de asma tiveram efeitos opostos sobre as diversas funções da imunidade inata estudada. O tipo de resposta dependeu do tipo de parasito e helmintos e protozoários determinaram repostas opostas: enquanto os protozoários, particularmente a Giardia intestinalis, diminuíram a capacidade fagocitária dos NEU pelos rPMP, os helmintos estimularam a fagocitose pelos MON pelos rOps. Em adição, enquanto no quadro de asma observamos certo grau de ativação dos eosinófilos, nas crianças parasitadas, essa ativação dos eosinófilos no sangue periférico não ocorreu, possivelmente por fatores supressores produzidos pelos parasitos. Tais achados podem contribuir para o esclarecimento sobre a resposta imune inata aos parasitos e suas repercussões no indivíduo, auxiliando na abordagem das parasitoses e no desenvolvimento de novas terapêuticas para a asma e atopias. Intestinal parasites have a high prevalence worldwide, mainly in developing countries in places showing poor sanitary and socio-economic conditions. Several studies point to an increase in allergic diseases and asthma over the years, and show a concomitant reduction in infectious and parasitic diseases in children. The existence of such a correlation or causal factor has been investigated in experimental models with animal and human beings, leading to findings that demonstrate the immunosuppressive action of the parasites on the systemic immune response. Factors depending on the host, such as genotype, immune competence and nutritional status; and factors depending on the parasite, as the parasite load and the pathogenicity and virulence of helminths or protozoans, will determine the type of immune response triggered in infected individuals. In this context, this work aimed to evaluate eosinophil activation status and phagocytes' functions comparatively in children with asthma, intestinal parasites and in combination of both. A cross-sectional study was done in 68 children living in Riacho Fundo II and Chácara Santa Luzia in Cidade Estrutural, in Brasilia/Federal District, Brazil. The socio-economic-cultural evaluation of the families, and clinical, laboratory and stool testing of each child were made. Four groups were studied: A) Helminths or/and protozooan parasitized children; B) asthmatic children; C) asthmatic and parasitized children; and D) control group. The blood eosinophil activation status was assessed by morphologic parameters after adherence to glass. The phagocytic capacity of monocytes and neutrophils was evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) and the opsonin receptors, as well as superoxide anions production by nitroblue tetrazolium test (NBT). Statistic analyses were performed by ANOVA or Kruskal-Wallis test. Eosinophils were lower activated in children with intestinal parasites than in asmathic children, by percentage of normal eosinophils, spreading, releasing of small quantities of granules and emission of a single pseudopod. The phagocytic capacity of neutrophils of children exclusively parasitized by protozoan was lower than that of asthmatic children, by pathogen-associated molecular pattern receptors. When the phagocytosis was evaluated by opsonin receptors, phagocytic capacity of monocytes in asthmatic children concomitantly parasitized was higher than that of controls. Superoxide anions production was lower in children parasitized by protozoan than in children with asthma plus protozoan. However, superoxide anions production was higher in children who were parasitized by helminths than in asthmatic children. In conclusion, our data showed that parasitic infection and asthma had opposite effects on several immune innate functions. Furthermore, immune response depended on the type of parasite, and helminths and protozoa determined opposite responses: whereas protozoan, mainly Giardia intestinalis, decreased phagocytic capacity by neutrophils by PAMPr, helminths stimulated phagocytosis by monocytes by opsonin receptors. In addition, whereas in asthmatic children there were some eosinophil activation, in parasitized children there was no blood eosinophil activation possibly determined by suppressive factors produced by parasites. These findings may contribute to make clear the innate immune response to parasites and their impact on individual, assisting to understand parasites and in development of new therapies for treatment of asthma and atopies.

Adjuvants play an important role in vaccine formulations by increasing their immunogenicity. In this study, the phenolic compound-rich J fraction (JFR) of a Brazilian green propolis methanolic extract stimulated cellular and humoral immune responses when co-administered with an inactivated vaccine against swine herpesvirus type 1 (SuHV-1). When compared to control vaccines that used aluminium hydroxide as an adjuvant, the use of 10 mg/dose of JFR significantly increased (p < 0.05) neutralizing antibody titres against SuHV-1, as well as the percentage of protected animals following SuHV-1 challenge (p < 0.01). Furthermore, addition of phenolic compounds potentiated the performance of the control vaccine, leading to increased cellular and humoral immune responses and enhanced protection of animals after SuHV-1 challenge (p < 0.05). Prenylated compounds such as Artepillin C that are found in large quantities in JFR are likely to be the substances that are responsible for the adjuvant activity.

A infecção pelo HIV não altera a história natural da hanseníase. Observa-se maior incidência de estados reacionais nos pacientes co-infectados, além de casos mais graves de neurite. Paciente soropositiva com hanseníase dimorfa tuberculóide manifestou reação reversa exuberante. Lesões cutâneas atípicas e raras surgiram após a introdução da terapia anti-retroviral que promoveu o início da recuperação imunológica com aumento de linfócitos T CD4+ e queda da carga viral. A restauração da imunidade celular nos pacientes soropositivos pode precipitar reações reversas, descritas recentemente como uma das manifestações da síndrome inflamatória de reconstituição imunológica associada à hanseníase. HIV infection does not modify the natural course of leprosy. However, HIV co-infection seems to be associated with an increased rate of reactional states and more severe cases of neuritis. The authors describe a case of borderline tuberculoid leprosy in a HIV-positive patient who developed a marked reversal reaction. Atypical and rare skin manifestations, such as verrucous lesions and ulcers, appeared after highly active antiretroviral therapy, which resulted in increased CD4+ T-lymphocyte count and drop in viral load. The restoration of the cellular immunity in HIV-seropositive patients can trigger reversal reactions that are one of the manifestations of the immune reconstitution inflammatory syndrome. Only recently the syndrome has been associated with leprosy.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) As esponjas marinhas se apresentam como uma rica fonte de novos compostos bioativos de grande interesse biotecnológico, vimos, neste trabalho, relatar a purificação e caracterização de uma lectina da espécie Aplysina fulva, denominada AFL com atividade imunomoduladora, bem como avaliar se a mesma possue efeito citotóxico sobre células em cultura (normais, tumorais e leishmanias). As proteínas totais foram extraídas da esponja com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, e fracionadas por precipitação com acetona. A fração obtida com 1 volume de acetona possuía maior atividade hemaglutinante e foi submetida a uma cromatografia em matriz de goma guar com tampão tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5. Em seguida foi aplicada em uma coluna de Superdex 75 (FPLC-AKTA) contendo tampão Tris- HCl 20 mM, pH 7,5. A pureza da lectina foi atestada em uma coluna HILIC (HPLC). A sequência de 15 resíduos de aminoácidos do N-terminal da lectina foi determinada por degradação de Edman e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína dos bancos de dados mais conhecidos. A massa foi estabelecida em 62 kDa, por gel filtração em Superdex 75. Análise após tratamento com agentes redutores permitiu deduzir que AFL é uma proteína homotetramérica. Sua atividade hemaglutinante foi reduzida quando a lectina foi exposta em meio ácido (pH < 4) ou quando submetida a temperaturas acima de 60 ºC. AFL apresentou especificidade para lactose e parcial para D-glicose e D-galactose. A lectina purificada AFL não apresentou efeito citotóxico para as linhagens de células cancerígenas (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) e de fibroblastos (MRC5). AFL foi capaz de aglutinar formas promastigotas vivas de Leishmania amazonensis e Leishmania. braziliensis,e teve sua atividade revertida pela adição de lactose ao ensaio. AFL não diminuiu de forma significante a viabilidade de Leishmania amazonensis. A lectina AFL apresentou atividade mitogênica em concentrações a partir de 40 μg/mL para célula mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos). A lectina AFL foi capaz de induzir na linhagem de macrófagos (RAW264.7) de murinos a liberação de TNF- α, mas não de IL-6, na concentração de 10,0 μg/mL. Quando AFL foi incubada com células esplênicas de camundongos BALB/c, foi capaz de estimular a produção de IFN-γ e promover a diferenciação de células T para uma resposta imune celular do tipo Th1. A capacidade de modular a resposta imune do tipo Th1 jamais foi relatada em lectinas de esponjas marinhas. Todos os resultados corroboram com o alto potencial que a lectina AFL apresenta como uma nova molécula capaz de modular o sistema imune, podendo ser utilizada como adjuvante de vacinas contra microrganismos, dentre eles, os do gênero leishmania. Marine sponges are presented as a rich source of new bioactive compounds of great biotechnological interest. Here in this research we report the purification and characterization of a lectin from Aplysina fulva species, called AFL, that presents immunomodulatory activity, and it was also evaluated whether it possesses cytotoxic effects on cultured cells (normal, tumor and Leishmania). Total proteins were extracted from the sponge with Tris-HCl buffer 20 mM, pH 7.5, and fractionated by precipitation with acetone. The fraction obtained with 1 volume of acetone had greater hemagglutinating activity and was subjected to a column chromatography on guar gum matrix with 20 mM sodium tetraborate buffer, pH 7.5. It was then applied to a Superdex 75 column (AKTA-FPLC) containing 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5. The purity of the lectin was attested in a HILIC (HPLC) column. The sequence of 15 residues of N-terminal amino acid of the lectin was determined by Edman degradation and showed no similarity to any other protein of the known databases. The molecular mass was set at 62 kDa by gel filtration on Superdex 75. Analysis after treatment with reducing agents enabled to deduce that the AFL is a homotetrameryc protein. Their hemagglutinating activity was reduced when the lectin was exposed in an acidic medium (pH

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-15. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:42Z : No. of bitstreams: 1 000863861.pdf: 1356360 bytes, checksum: 18b85330b53418de931a17e7f535d1fb (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Considering the complexity of the immune response against Leishmania spp. infection in different species and the lack of clinical signs in the majority of cats with visceral leishmaniasis, this study aimed to evaluate the gene expression of some cytokines involved in cellular (IFN-, TNF α, IL-2) and humoral (IL-5) immune response by real-time PCR, on spleen samples from 12 cats naturally infected by Leishmania spp., comparing to the immune response of four healthy cats; and to verify the correlation between the parasite load in the bone marrow and the gene expression of cytokines in the spleen of infected animals. An increase of 1.53 times in IFN- gene expression was observed in infected cats when compared to healthy cats (p=0.0005). Statistically significant differences were not observed in gene expression of the cytokines evaluated between infected and healthy cats (TNF-α p=0.4203, IL-2 p=0.1968, IL-5 p=0.6390). Correlation was not observed between the parasite load in the bone marrow and the gene expression of cytokines in the spleen of cats infected by Leishmania spp. (IFN- p = 0.1570; TNF- p = 0.5702; IL-2 p = 0.6081; IL-5 p = 0.2329). These results suggest that IFN- may play an important role in the protective mechanisms against feline leishmaniasis FAPESP: 2013/02394-6 FAPESP: 2012/10365-3

CAPEs A alta prevalência de esquistossomose crônica em gestantes, bem como em mulheres em idade fértil, tem sido amplamente relatada. Esta condição materna é capaz de alterar a resposta imune do descendente em longo prazo. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito in vitro do leite materno de mães infectadas pelo Schistosoma mansoni em esplenócitos e caracterizar os peptídeos encontrados nesse leite. Para isso, camundongos fêmeas infectadas ou não, tiveram seu leite coletado no 12º dia após o parto. Os esplenócitos jovens (15 dias) e maduros (6 semanas) foram cultivados com o Leite de Mães Infectadas (LMI) e com Leite de Mães Não Infectadas (LMNI) na presença de estimulador policlonal. Além disso, foram utilizados controles experimentais: Células pulsadas na ausência (BASAL) e apenas com estimulador policlonal (MITÓGENO) e células cultivadas com LMNI adicionado de antígenos solúveis dos ovos do S.mansoni (LMNI+SEA). Posteriormente, os ensaios de citometria de fluxo foram realizados para dupla marcação: Linfócitos T (CD3+ ou CD4+) marcados com CD28, CD154, CTLA4, IL-10 ou FoxP3. Além disso, foram analisadas a expressão de CD80, CD86 e CD40 na superfície de Macrófagos (CD14) e Linfócitos B (CD45R), e ainda a expressão de IL-10 por esse último. Para a análise dos peptídeos presentes no leite materno, um gel unidimensional foi confeccionado e as bandas obtidas no LMI, LMNI+SEA e LMNI foram processados para análise por espectometria de massa. Além disso, foram realizadas análises de antígenos parasitários: SEA e SWAP (antígeno solúvel do verme adulto). Esplenócitos jovens pulsados apenas com o mitógeno apresentaram maior frequência de células CD3+CD28+ e CD45R+IL10+. A adição de LMNI manteve aumento CD3+CD28+ e levou a menor frequência de Tregs, com aumento na expressão de células CD45R+CD40+. Ao ser introduzido o SEA (LMNI+SEA) foi identificada uma menor frequência de células CD3+CD28+ e aumento na expressão de IL-10. O LMI proporcionou menor frequência de linfócitos CTLA4+ e FoxP3+, porém com produção de IL-10 e maior frequência de CD45R+/CD80+. Para os esplenócitos maduros, o LMNI e LMI levaram à menor frequência de células CD3+/CD28+ e maior CD3+/CTLA4+, respectivamente, com aumento sustentado de Treg. Contudo, o LMI diminui a presença de células B IL-10+. A adição do SEA ao LMNI manteve a diminuição de células CD3+CD28+, mas aumentou a frequência de células CD3+/CD154+. O leite de mães esquistossomóticas apresentou peptídeos relacionados à presença do S. mansoni e com variabilidade de função. Destacamos a natureza imunomodulatória dos peptídios aqui identificados (Interleucina 17F, Glutationa s Transferase) que podem atuar na imunidade, seja para antígenos do parasita ou heterólogos, no descendente previamente amamentado. Estes achados enfatizam o caráter dicotômico do leite materno: estimulador em células jovens e tolerogênico em células maduras. Esses achados são relevantes em áreas endêmicas para esquistossomose e reiteram a importância da identificação e caracterização de antígenos parasitários, bem como, uma avaliação do seu papel na interação parasito-hospedeiro no incio da vida. The high prevalence of chronic schistosomiasis in pregnant women and women of childbearing age has been widely reported. Breastfeeding by mothers with schistosomiasis is capable of altering the long term immune response of offspring. The aim of this study was to undertake an in vitro analysis of the effect of breast milk of mothers with schistosomiasis on young and mature splenocytes and characterize the proteomics in this milk. The milk of female mice infected with Schistosoma mansoni and non-infected female mice was collected on the 12th day postpartum. Young (15 days) and mature (6 weeks) splenocytes were cultivated (24hs) with mitogen (CONTROL), added to the Milk of Infected Mothers (MIM), Milk of Non-Infected Mothers (MNIM) or Milk of Non-Infected Mothers with the addition of soluble egg antigens of parasites (MNIM+SEA), as well as those without in vitro stimulus (BASAL). Double cell labeling was performed for flow cytometry: T Lymphocytes (CD3+ or CD4+) marked with CD28, CD154, CTLA4, IL-10 or FoxP3; Macrophages (CD14) and B Lymphocytes (CD45R) marked with CD80, CD86 or CD40 on the surface and the expression of IL-10 by CD45R+ cells. For analysis of proteomics a one-dimensional gel was made and the bands obtained from MIM, MNIM, MNIM + SEA, were processed for analysis by mass spectrometry. Additionally, the parasite antigens SEA and SWAP (soluble adult worm antigen preparation) were included in the analysis. Young splenocytes pulsed only with mitogen had the greatest CD3+CD28+ and CD45R+IL10+ cell frequency. The addition of MNIM maintained an increase of CD3+CD28+ and produced the lowest frequency of Tregs, with an increase in the expression of CD45R+CD40+ cells. The introduction of SEA (MNIM+SEA) resulted in reduced CD3+CD28+ cell frequency and increased IL-10 expression. MIM resulted in reduced CTLA4+ and FoxP3+ lymphocyte frequency, although there was some IL-10 production and greater CD45R+/CD80+ frequency. MNIM and MIM resulted in the lowest frequency of CD3+/CD28+ and CD3+/CTLA4+ cell frequency, respectively, for mature splenocytes, with a sustained increase of Treg. However, MIM reduced the presence of B IL-10+ cells. The addition of SEA to MNIM maintained a reduction in CD3+CD28+ cells, but increased the frequency of CD3+/CD154+ cells. The breast milk of mothers with schistosomiasis presented peptides related to the presence of S. mansoni and variability of function. The immunomodulatory nature of the peptides identified in the present study (Interleukin 17F, Glutathione-S-Transferase) should be noted, as these can act in the immune process of breastfed offspring, whether for parasite antigens or heterologous antigens. These findings emphasized the dichotomous character of breast milk, which functions as a stimulator in young cells and is tolerogenic in mature cells, yet is capable of improving LB activation. These findings are relevant for areas in which schistosomiasis is endemic and emphasize the importance of the identification and characterization of parasite antigens and the evaluation of their role in parasite-host interaction in the early stages of life, in order to obtain a better understanding of immunoregulatory events.

Made available in DSpace on 2016-01-13T13:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-13T13:33:40Z : No. of bitstreams: 1 000855035.pdf: 1172777 bytes, checksum: c5e74631a660ffb4086f52ada1a405ab (MD5) o presente estudo analisou a ação do cloridrato de levamisol (CL) no estresse e imunidade inata de pacu (Piaractus mesopotamicus). Os peixes (180 ± 0,27g; 16 ± 0,4cm) foram alimentados com ração contendo CL durante quinze dias. Um grupo controle e quatro tratamentos (T) foram testados: T1 (100), T2 (150), T3 (300) e T4 (500) mg kg-1 de CL, 15 peixes/repetição, em quadruplicata. Após isso, os peixes (n=40) foram submetidos à exposição aérea e inoculados com bactéria Aeromonas hydrophila e amostrados uma, 3, 6 e 24h após a inoculação. Foram determinados os indicadores de estresse (concentração plasmática de cortisol, de glicose e número de eritrócitos) e os indicadores imunológicos (atividade respiratória de leucócitos, do sistema complemento - ACH50 - e concentração sérica de lisozima). O CL diminuiu significativamente a concentração plasmática de cortisol em uma (500 mg kg-1) e 3 h (300 mg kg-1) após a inoculação bacteriana, em relação aos peixes do grupo controle. O CL não influenciou a glicemia, o número de eritrócitos e a concentração sérica da lisozima. O CL (100 mg kg-1) aumentou a ARL em 1h e também a ACH50 em 3 h e em todos os tratamentos de CL, 24 h após a inoculação. Os resultados deste estudo demonstram que a exposição aérea e a infecção bacteriana foram estressores para o pacu, causando aumento da glicemia e prejuízo da resposta imune da lisozima e que o CL foi eficiente para reduzir o cortisol e aumentar a atividade fagocítica dos macrófagos e a ACH50 nos peixes. Durante a amostragem inicial, para analisar a eficácia do cloridrato de levamisol como antiparasitário, quatro peixes do grupo controle e de cada tratamento (n=20) foram eutanasiados por secção medular e encaminhados para análise parasitológica. Para analisar as lesões histológicas, dez peixes do grupo controle e de cada tratamento (n=50) foram eutanasiados em benzocaína (100 mg L-1). O fígado foi fixado em... The present study analyzed the levamisole hydrochloride (CL) action in the stress and innate immunity pacu (Piaractus mesopotamicus). Fish (180 ± 0.27 g; 16 ± 0.4 cm) were fed a diet containing CL for fifteen days. A control group and four treatments (T) were tested: T1 (100), T2 (150), T3 (300) and T4 (500) mg kg-1 CL, 15 fish/repeat, in quadruplicate. After that, fish (n = 40) were submitted to air exposure for three minutes, inoculated with the bacteria Aeromonas hydrophila and sampled one, 3, 6 and 24 h after inoculation. Were determined stress indicators (plasma cortisol, glucose and red blood cell count) and immunological indicators (leukocytes respiratory activity, complement system - ACH50 - and serum lysozyme). CL significantly reduced the plasma concentration of cortisol in one (500 mg kg-1) and 3 h (300 mg kg-1) after bacterial inoculation, compared with control fish. CL did not influence blood glucose, the number of erythrocytes and the serum concentration of lysozyme. CL (100 mg kg-1) increased the ARL in 1h and also the ACH50 in 3 h and all treatments 24 h after inoculation. The results of this study indicate that air exposure and bacterial infection were stressful for pacu, causing increased blood glucose and prejudice of lysozyme immune response and the CL was efficient to reduce cortisol and increased the phagocytic activity of macrophages and ACH50 in fish. During the initial sampling to analyze the effectiveness of levamisole hydrochloride as antiparasitic, four fish from control group and each treatment (n = 20) were euthanized by medullary section and sent for parasitological analysis. To analyze the histological lesions ten fish from control group and each treatment (n = 50) were euthanized in benzocaine (100 mg L-1). The liver was fixed in Bouin for identification and quantification of the lesions. In gills, was identified Anacanthorus penilabiatus (Monogenoidea, Dactylogyridae) and in intestines Rondonia ...