Search

Tese de doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas, As infeções fúngicas afetam milhões de pessoas, representando uma problemática para a saúde pública global. Apesar dos progressos nas estratégias de diagnóstico e terapia, o controlo da progressão de infeções fúngicas graves permanece um desafio, sendo necessário elucidar os mecanismos moleculares que influenciam o risco e a progressão da infeção fúngica. Recentemente, a reprogramação do metabolismo celular foi identificada como um mecanismo central para suportar a ativação das funções efectoras das células do sistema imunitário no decorrer da resposta à infeção. Portanto, identificar e caraterizar os mecanismos metabólicos e moleculares que sustentam o sucesso do controlo da infeção por Aspergillus fumigatus é imperativo. Nesta tese de doutoramento, é demonstrado um novo papel do metabolismo da glutamina na ativação de funções efetoras de macrófagos em resposta à infeção por A. fumigatus. A depleção de glutamina ou a inibição farmacológica de enzimas envolvidas no seu metabolismo influencia significativamente a sua capacidade fagocítica e a produção de citocinas pró inflamatórias e derivadas de células T. Este papel foi confirmado através de um modelo de aspergilose in vivo, onde a inibição da glutaminase aumentou a suscetibilidade à infeção. Mais importante, identificámos variantes em genes do metabolismo da glutamina que regulam a produção de citocinas em resposta a A. fumigatus. Além disso, nesta tese de doutoramento, decidimos também dissecar a regulação do metabolismo celular por moléculas do sistema imunitário. A pentraxina longa PTX3 tem um papel essencial na resposta imunitária contra A. fumigatus. De facto, não só ratinhos deficientes em PTX3 mostram uma maior suscetibilidade à aspergilose, mas também variantes genéticas humanas que afetam a expressão de PTX3 foram já associadas a um risco aumentado de aspergilose pulmonar invasiva. Os nossos dados revelam que a PTX3 é necessária para uma adequada capacidade fungicida dos macrófagos ao permitir a ativação do metabolismo da glucose em detrimento da ativação da via das pentoses fosfato. Além disso, a enzima sedoheptulose cinase, bem como do seu produto, a sedoheptulose-7-fosfato, foram identificados como reguladores essenciais do fluxo glicolítico, sendo que a inibição desta enzima restaura o anormal fluxo glicolítico, bem como a capacidade fungicida de macrófagos na ausência de PTX3. Em suma, os nossos resultados demonstram a importância da interligação entre os mecanismos imunológicos e metabólicos para a resposta de macrófagos na resposta a A. fumigatus., Fungal infections affect millions of people, representing a problem for global public health. Despite advances in diagnostic and therapeutic strategies to control the progression of serious fungal infections, their management remains challenging. It is thus necessary to elucidate the precise mechanisms that influence the risk, progression, and outcome of fungal infection. Recently, the reprogramming of cellular metabolism has emerged as a central mechanism to support the activation and effector functions of immune cells during immune responses to fungal infection. Therefore, understanding the crosstalk between metabolic and molecular determinants that underpin the successful control of Aspergillus fumigatus is imperative. This doctoral thesis demonstrates a novel role for glutamine metabolism in the activation of macrophage effector functions in response to A. fumigatus infection. Glutamine depletion or pharmacological inhibition of enzymes involved in its metabolism significantly impacted its phagocytic capacity and the production of pro-inflammatory and T cell-derived cytokines. This was confirmed in an in vivo model of aspergillosis, in which inhibition of glutaminase increased the susceptibility to infection. Most importantly, we identified genetic variations in glutamine metabolism genes to regulate cytokine production in response to A. fumigatus stimulation. Furthermore, in this doctoral thesis, we also decided to understand whether cellular metabolism could also be regulated by selected molecules of the immune system. The long pentraxin PTX3 has a non-redundant role in the immune response against A. fumigatus. Indeed, PTX3 knock-out mice display increased susceptibility to aspergillosis, but also in humans, genetic variants that compromise PTX3 expression have been consistently found to increase the risk of invasive pulmonary aspergillosis. Our data reveal that PTX3 is critically required for an adequate fungicidal capacity of macrophages by balancing the metabolic flux between glycolysis and the pentose phosphate pathway. In addition, we identified the sedoheptulose kinase enzyme and the product of its reaction, sedoheptulose 7-phosphate, as critical regulators of this balance. In this regard, the blockade of this enzyme rescues both the metabolic dysregulation as well as the functional defects observed in conditions of PTX3 deficiency. In summary, our results demonstrate the importance of the crosstalk between immunological and metabolic mechanisms for macrophage responses to A. fumigatus infection., The work presented in this thesis was developed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), University of Minho. Financial support was provided by grants from the Foundation for Science and Technology (FCT) PD/BD/137680/2018, PTDC/SAU-SER/29635/2017, 2022.06674.PTDC, UIDB/50026/2020, and UIDP/50026/2020; the Northern Portugal Regional Operational Program (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF) (NORTE-01-0145-FEDER-000039); the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreement no. 847507; the “la Caixa” Foundation (ID 100010434) and FCT under the agreement LCF/PR/HR17/52190003.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz A observação das comunidades fúngicas em estados de saúde e doença, juntamente com os avanços nos métodos de análise dos fungos, possibilitaram que novas descobertas fossem feitas nessa área e muitas pesquisas tem sido propostas com o intuito de esclarecer o porquê das alterações das diversidades fúngicas em diferentes doenças. Faz-se então a seguinte pergunta: é a disbiose que leva a doença ou a mesma é quem acarreta na quebra da homeostase. Sabe-se que diferentes fatores podem levar à disbiose, como por exemplo, o uso de dentaduras, os hábitos tabágicos, o uso de antibióticos, a baixa da imunidade e o stress. Infecções fúngicas locais podem ser indícios de infecções sistêmicas. Uma simples candidíase pode ser sinal de um problema maior a nível sistêmico e, o conhecimento das principais infecções fúngicas orais possibilitam que o Médico Dentista não apenas trate uma infecção localizada como também atue na prevenção de outras a nível sistémico. O diagnóstico precoce pode evidenciar a necessidade de um tratamento multidisciplinar e, consequentemente, mudar o rumo de uma doença. O conhecimento do micobioma juntamente com suas interações entre si (fungo-fungo), e entre outros reinos (fungobactéria), é imprescindível para a atuação dos profissionais da saúde, pois estas interações afetam a resposta imune do hospedeiro e tornam os tratamentos muito mais complexos do que seriam se fossem direcionados para apenas um tipo de microorganismo. A nossa boca, por apresentar vários nichos que acomodam ecossistemas únicos para vários micróbios e facilidade na coleta de amostras, favoreceu as descobertas que mudaram o rumo da ciência, principalmente com relação a comunidade fúngica, pois foram os maiores beneficiados com os avanços tecnológicos. The observation of fungal communities in states of health and disease, together with advances in methods of fungal analysis, have made it possible for new discoveries made in this area and a lot of research has been proposed in order to clarify why the changes in fungal diversity in different diseases. Then the following question is asked: is it dysbiosis that leads to the disease, or is it the same that causes the breakdown of homeostasis? It is known that different factors can lead to dysbiosis, such as the use of dental prothesis, smoking habits, the use of antibiotics, low immunity and stress. Local fungal infections can be indications of systemic infections. A simple candidiasis can be a sign of a major problem at the systemic level, and the knowledge of the main oral fungal infections allows the Dentist not only to treat a localized infection but also to prevent others at the systemic level. Early diagnosis can highlight the need for multidisciplinary treatment and, consequently, change the course of a disease. The knowledge of the mycobioma together with its interactions with each other (fungus-fungus), and among other kingdoms (fungusbacteria), is essential for the performance of health professionals, as these interactions affect the host's immune response and make treatments very complex than they would be if they were directed to just one type of microorganism. Our mouth, for presenting several niches that accommodate unique ecosystems for various microbes and ease in collecting samples, this favored the discoveries that changed the course of science, especially with regard to the fungal community, as they were the biggest beneficiaries of technological advances.

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-12-17T19:16:04Z No. of bitstreams: 1 ulfc125192_tm_Sara_Brito.pdf: 1048516 bytes, checksum: fd09b53cc2b9a3fc3d054603146a682f (MD5) Made available in DSpace on 2019-12-17T19:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125192_tm_Sara_Brito.pdf: 1048516 bytes, checksum: fd09b53cc2b9a3fc3d054603146a682f (MD5) Previous issue date: 2019

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019 O trabalho apresentado nesta Dissertação de Mestrado foi realizado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge sob a orientação direta da Doutora Elisabete Valério e contou com a coorientação do João Brandão. Os fungos filamentosos e as leveduras são omnipresentes na natureza, incluindo nas zonas balneares. A areia frequentada por pessoas e por animais tem uma população crescente de fungos específicos de humanos e específicos de animais, em comparação com a areia não frequentada por pessoas e animais. Contudo, certas espécies de fungos podem causar infeções ou alergias em humanos. Estudos anteriores mostraram que existem microrganismos patogénicos ou patogénicos oportunistas que sobrevivem e crescem na areia. O conjunto de doenças resulta da inalação e da ingestão de esporos fúngicos e de células vegetativas, ou do contato direto com células fúngicas. Uma vez que as zonas balneares são locais frequentados por um elevado número de pessoas, especialmente no verão, a qualidade microbiológica das areias e das águas balneares é particularmente importante. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a recolha de dados sobre as espécies de fungos existentes nas três zonas balneares em estudo – Carcavelos, Alburrica e Praia Verde. A identificação dos isolados foi realizada através da observação de caracteres morfológicos e através de ferramentas moleculares. Para isto, foram analisadas 18 amostras de areia e 18 amostras de água. No total, nas amostras de areia foram identificados 1 538 isolados, ao passo que nas amostras de água foram identificados 180 isolados. Os isolados fúngicos detetados com mais frequência foram Cladosporium sp. (na Praia Verde e em Alburrica) e Acremonium kiliense (em Carcavelos). Foram também identificadas algumas espécies responsáveis por causar alergias e infeções, tais como Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea e Aspergillus nidulans. No entanto, não foi possível identificar 19 isolados presentes nas amostras. A realização desta dissertação permitiu identificar os isolados fúngicos presentes nos locais em estudo, assim como a frequência de cada uma das espécies presente nas amostras. Permitiu também verificar a presença de determinadas espécies que podem provocar doenças graves, o que representa um risco para a saúde dos utilizadores das praias. Filamentous fungi and yeast are ubiquitous in nature, including bathing areas. Sand that is visited both by people and animals has a growing population of human and animal-specific fungi, in comparison to sand that is not. However, certain fungal species can cause infections or allergies in humans. Previous studies have shown that there are opportunistic or pathogenic microorganisms that can survive and grow in sand. The diseases can result from inhalation and ingestion of fungal spores and vegetative cells, or by direct contact with fungal cells. Since bathing areas are frequented by large numbers of people, especially during the summer months, the microbiological quality of sand and bathing water is particularly important. Thus, the aim of this study is to collect data on the fungal species present in the three bathing areas in this study - Carcavelos, Alburrica and Praia Verde. The identification of the isolates was performed by observing morphological characteristics and by using molecular tools. For this purpose, 18 sand samples and 18 water samples were analysed. The total number of colonies identified in sand samples was 1 538; the total number of colonies identified in water samples was 180. The most frequently isolated fungi were Cladosporium sp. (at Praia Verde and Alburrica) and Acremonium kiliense (at Carcavelos). Some species responsible for causing allergies and infections, such as Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea and Aspergillus nidulans have also been identified. However, it was not possible to identify 19 isolates found on the samples. For this dissertation, it was possible to identify the fungal isolates present at the chosen locations. It was also possible to determine the frequency of each species present in the samples. Lastly, this work has made it possible to confirm the presence of certain species that can cause serious illness, which potentially poses a health risk to all beach users. N/A

Introdução: A utilização do tubo endotraqueal (TE) e da traqueia respiratória (TR) é fundamental na prática cirúrgica veterinária e a reutilização dos mesmos é também uma prática recorrente de forma a obter uma diminuição de custos. A avaliação da contaminação microbiológica dos mesmos está amplamente documentada em Medicina Humana. O mesmo não se sucede em Medicina Veterinária, pois devido aos altos custos de manutenção, torna-se impraticável realizar estudos microbiológicos de rotina. Material e Métodos: O presente estudo foi realizado num Hospital de Medicina Veterinária na zona de Lisboa, com o objectivo de determinar a contaminação bacteriana e fúngica nestes equipamentos. Procedeu-se à avaliação clínica e radiográfica de todos os pacientes. Foram recolhidas amostras microbiológicas a partir de 30 TEs e 30 TRs reutilizados, escolhidos aleatoriamente, antes do procedimento cirúrgico e cultivadas em meios de cultura para bactérias e fungos. Este procedimento foi realizado independentemente do sexo, raça e idade do animal, tipo e tempo de cirurgia. Seguido de determinação, caracterização e identificação microbiológica. Resultados: Verificou-se crescimento bacteriano e/ou fúngico total de 73% (44 amostras positivas em 60 amostras). Por fim, correlacionaram-se os resultados com o aparecimento de afecções respiratórias. Conclusão: O estudo de fontes de contaminação em ambientes hospitalares veterinários é uma actividade em crescimento, sendo necessário o desenvolvimento de programas de controlo mais específicos e eficazes, que tenham como pilares básicos um sistema de vigilância efectivo combinado com uma rotina de análises microbiológicas., Background: The use of the endotracheal tube (ET) and the tubing of breathing circuit systems (tBCS) is fundamental for the practice of the veterinary surgery and reusing them is also a recurring way of reducing costs. The evaluation of the microbiological contamination is widely documented in Human Medicine. In Veterinary Medicine however, due to high maintenance costs, it is impossible to perform routine microbiological studies. Materials and methods: The current study was done in a Veterinary Medicine Hospital in the Lisbon area, with the objective of defining the bacteriological and fungi contamination of these medical devices. All patients underwent a clinical and radiographic evaluation. Microbiological samples were taken from 30 ET and 30 tBCS reused randomly chosen and were collected before initiating the surgical procedure and cultured for bacteria and fungi. This procedure was performed regardless of the sex, race and age of the animal, type and time of surgery. Followed by determination, characterization and microbiological identification. Results: Bacterial and/or fungal growth was found to be 73% (44 positive samples in 60 samples). In the end the results were correlated with the appearance of respiratory disorders. Conclusion: The study of the sources of contamination in veterinary hospital environments is a growing activity, creating the need to develop more specific and efficient control programs, which will be supported by a basis of a surveillance system combined with a routine of microbiological analysis., Orientação: Pedro Faísca

Relatório de estágio de mestrado, Análises Clínicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015 Submitted by Repositório FFUL (repositorio@ff.ul.pt) on 2015-12-10T13:21:10Z No. of bitstreams: 2 Monografia (2).pdf: 7480425 bytes, checksum: 285597b117e68f8ef16cba9b6e8b0e67 (MD5) Relatório final.pdf: 7722738 bytes, checksum: 8e59b3dbe73063e3269ca67b0e00c039 (MD5) Made available in DSpace on 2015-12-10T13:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Monografia (2).pdf: 7480425 bytes, checksum: 285597b117e68f8ef16cba9b6e8b0e67 (MD5) Relatório final.pdf: 7722738 bytes, checksum: 8e59b3dbe73063e3269ca67b0e00c039 (MD5) Previous issue date: 2015

Mestrado em Biologia Aplicada - Microbiologia Clínica e Ambienta Candida albicans é um dos principais fungos patogénicos causadores de infeções fúngicas oportunistas, as quais se manifestam particularmente em indivíduos imunocomprometidos. As infeções fúngicas invasivas estão associadas a uma elevada taxa de mortalidade, devido a um diagnóstico tardio e consequente atraso no início da terapêutica antifúngica. Este trabalho teve como principal objetivo avaliar o impacto das condições de crescimento (tempo e temperatura) no perfil metabolómico global da C. albicans, assim como em alguns metabolitos alvo. A microextração em fase sólida em modo espaço de cabeça combinada com a cromatografia de gás bidimensional abrangente acoplada a espectrometria de massa com analisador por tempo de voo de alta resolução (HS-SPME/GC×GC-ToFMS) foi a metodologia utilizada neste estudo. Foram selecionadas duas temperaturas (25 °C e 37 °C) e quatro tempos de crescimento (6 h, 12 h, 24 h e 48 h). Foi ainda realizado um estudo exploratório com vista a avaliar a aplicabilidade da metodologia desenvolvida de modo a distinguir Candida albicans de outras espécies de Candida não-albicans, Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus niger. Este estudo permitiu concluir que a temperatura e o tempo de crescimento influenciaram o metabolismo de Candida albicans, sendo produzido um maior teor global de metabolitos por UFC/mL às 6 h a 25 °C. Relativamente aos metabolitos alvo, verificou-se que os primeiros tempos de crescimento (6 h e 12 h) foram caracterizados pela presença de álcoois, aldeídos e 2-propanona e os tempos mais tardios (24 h e 48 h), pela presença de ésteres e sesquiterpenóides, sendo a abundância relativa destes metabolitos variável com a temperatura. Os metabolitos alvo selecionados, os quais incluem metabolitos reportados como estando associados ao quorum sensing, permitiram distinguir C. albicans das restantes leveduras num tempo de crescimento curto (6 h). Para o tempo de crescimento mais longo, estes metabolitos permitiram a distinção entre o fungo filamentoso e as leveduras. Usando o subconjunto de 5 metabolitos foi possível distinguir C. albicans das restantes leveduras. Em conclusão, este estudo revelou que o padrão de metabolitos alvo estudados caracteriza C. albicans, podendo este ser possivelmente usado no futuro na deteção de infeções fúngicas por esta espécie. Candida albicans is a major fungal pathogen causing opportunist fungal infections, which manifest particularly in immunocompromised individuals. Invasive fungal infections are associated with high mortality rate due to a late diagnosis and subsequent delay in early antifungal therapy. This work aimed to assess the impact of growth conditions (time and temperature) on the global metabolomic profile of C. albicans, as well as on target metabolites. Headspace solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry with a high resolution time of flight analyser (HS-SPME/GC×GC-ToFMS) was used. It was selected two temperatures (25 °C and 37 °C) and four growth times (6 h, 12 h, 24 h e 48 h). An exploratory study was performed in order to assess the applicability of the developed methodology to distinguish C. albicans from the other non-albicans Candida species, and Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger, as well. This study allowed to conclude that the temperature and time of growth influence Candida albicans metabolism, producing a high global metabolite content per CFU/mL for 6 h at 25 °C. Concerning target metabolites, it was observed that the lower growth times (6 h and 12 h) are characterized by the presence of alcohols, aldehydes and 2-propanone and the later times (24 h and 48 h) are characterized by the presence of esters and sesquiterpenoids. The relative abundance of these metabolites is modulated by growth temperature. The target metabolites, which include metabolites reported as being associated to quorum sensing, allowed to distinguish C. albicans from the other yeasts in a short growth time (6 h). For longer times, these metabolites allowed the distinction between filamentous fungus and yeasts. Using the subset of 5 metabolites, it was possible to distinguish C. albicans from the other yeasts. In conclusion, this study revealed that the pattern of studied target metabolites characterizes C. albicans and, in the future, this pattern may be used in detection of fungal infections by this specie.

Grande parte da população já sofreu de infeções fúngicas superficiais facilmente tratáveis. Contudo, milhões de indivíduos são vítimas de infeções fúngicas invasivas potencialmente fatais, de difícil diagnóstico e tratamento. A incidência de infeções fúngicas invasivas em pacientes imunodeprimidos e/ou hospitalizados tem vindo a aumentar nos últimos anos, originando elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A Candida spp, Cryptococcus neoformans e Aspergillus spp. são os fungos mais frequentemente isolados neste tipo de infeções. Por outro lado, as micoses superficiais afetam cerca de 25% da população sendo as infeções fúngicas mais comuns em todo o mundo. Trichophyton rubrum representa o agente etiológico da maioria dos casos de tinea unguium, tinea cruris, tinea corporis e tinea pedis. Não menos importantes, destacam-se o Microsporum canis e Trichophyton tonsurans responsáveis por tínea capitis principalmente em crianças.

O número de infeções fúngicas nosocomiais tem vindo a aumentar drasticamente sendo causa, cada vez mais comum, de elevada morbilidade e mortalidade em doentes hospitalizados. O grau de contaminação fúngica ambiental é considerado um fator de extrema importância na incidência e epidemiologia destas infeções. Em contexto hospitalar, a infeção fúngica poderá ocorrer por contacto direto ou indireto com superfícies ou objetos contaminados, através das mãos de profissionais de saúde e por ingestão ou inalação de partículas ou bioaerossóis contaminados. As espécies de Aspergillus e Candida são responsáveis pela maioria das infeções fúngicas em pacientes imunocomprometidos e são frequentemente isolados em ambiente hospitalar. Descrevem-se neste trabalho dois case-study em Hospitais da região de Lisboa onde para além da caracterização do ambiente hospitalar quanto às espécies fúngicas predominantes, foram efetuadas pesquisas dirigidas aos géneros Aspergillus e Candida. Verificou-se que o controlo das infeções nosocomiais requer um conhecimento aprofundado da espécie/estirpe infetante, bem como do seu padrão de suscetibilidade aos antifúngicos, determinando assim o risco de infeção tanto para doentes como para os profissionais de saúde. The number of nosocomial fungal infections has been increasing dramatically, causing high morbidity and mortality rates in hospitalized patients. The level of environmental fungal contamination is considered an extremely important factor in the incidence and epidemiology of these infections. In a hospital environment, fungal infection may occur through direct or indirect contact with contaminated surfaces or objects, through the hands of health care workers and by ingestion or inhalation of contaminated particles or bioaerosols. Aspergillus and Candida species are the most frequent etiological agents of fungal infections in immunocompromised patients, being frequently isolated from the hospital environment. This paper reports two case- -studies from Hospitals situated in Lisbon. These studies were carried out in order to perform the characterization of the hospital environment in regard to the predominant fungal species, but also to perform directed search of isolates belonging to Aspergillus and Candida genera. These studies demonstrate that control of nosocomial infections requires a deep knowledge of the infecting species/strain, as well as their antifungal susceptibility pattern, thus determining the risk of infection for both patients and health care professionals. info:eu-repo/semantics/publishedVersion