Search

Orientadora : Leda Satie Chubatsu Co-orientador : Emanuel Maltempi de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Cięncias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçăo em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 10/05/2006 Inclui bibliografia

Orientador: Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Coorientadora: Drª. Edileusa C. Marques Gerhardt Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 30/11/2020 Inclui referências: p. 45-49 Resumo: As enzimas málicas catalisam a decarboxilação oxidativa do malato a piruvato com a redução associada de NAD+ ou NADP+. Em eucariotos, enzimas málicas citoplasmáticas, mitocondriais e plastidiais já foram caracterizadas e apresentam estrutura conservada. Por outro lado, as enzimas málicas procarióticas, que são mais diversas em estrutura, são bem menos caracterizadas. As enzimas málicas tipo MaeB são encontradas em bactérias gramnegativas como Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti e Azospirillum brasilense e possuem uma estrutura multimodular composta por dois domínios característicos, um Nterminal, responsável pela atividade málica, e outro C-terminal com homologia as fosfotransacetilases (PTA), cuja função não é bem esclarecida. Em A. brasilente, são encontradas duas isoformas de proteínas tipo MaeB, uma NADP+-dependente (AbMaeB1), já caracterizada cineticamente, e outra, como demonstrado pelos resultados aqui descritos, NAD+-dependente (AbMaeB2). Estudos anteriores demonstraram que as enzimas tipo MaeB participam de processos metabólicos essenciais, tendo um papel central controlando o destino de carbono no nó metabólico fosfoenolpiruvato / piruvato / oxaloacetato graças a capacidade de responderem aos níveis de diferentes metabólitos. Nesse sentido, no presente trabalho, a enzima málica AbMaeB2 foi purificada e caracterizada a fim de esclarecer o possível papel desta enzima no metabolismo de A. brasilense. Análises de gel-filtração sugerem uma massa molecular aproximada de 696 kDa para AbMaeB2, sendo a massa teórica do monômero estimada em 83 kDa, o que sugere que essa enzima corresponde a um octâmero de alto peso molecular, assim como observado para a proteína MaeB de E. coli (EcMaeB). Os resultados dos ensaios sobre os efeitos de diferentes metais na atividade málica de AbMaeB2 indicam que ambos os metais, Mg2+ e Mn2+, podem ser utilizados como co-fatores por esta enzima, com preferência por Mn2+, o que está de acordo os resultados obtidos em estudos anteriores para a MaeB de E. coli e MaeB1 de A. brasilense. Além disso, a ativação por KCl, anteriormente relatada para EcMaeB e AbMaeB1, também foi observada para AbMaeB2. Através dos ensaios realizados para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de KM para os substrados da enzima AbMaeB2 foram estimados em 25,4 mM e 21,9 mM para L-malato na presença de NAD+ e NADP+ saturantes, respectivamente, e 0.8 mM para NAD+ e 1,1 mM para NADP+ em concentrações saturantes de L-malato. Por fim, dadods preliminares sobre o efeito de diferentes metabólitos na atividade málica de AbMaeB2 indicam uma possível regulação desta enzima por acetil-fosfato, ATP e ADP. Abstract: Malic enzymes catalyze the oxidative carboxylation of malate to pyruvate with the associated reduction of NAD+ or NADP+. In eukaryotes, cytoplasmatic, mitochondrial and plastidial malic enzymes have already been characterized and have a conserved structure. On the other hand, prokaryotic malic enzymes, which are more diverse in structure, are much less characterized. Malic enzymes MaeB-like are found in gramnegative bacteria like Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti and Azospirillum brasilense and have a multimodular structure composed of two characteristic domains, a N-terminal domain, responsible for malic activity, and another C-terminal domain with homolgy to phosphotransacetylases (PTA), whose function in not well understood. In A. brasilense, two isoforms of MaeB-like proteins are found, the NADP+-dependent (AbMaeB1), already characterized kinetically, and another, as shown by the results described here, NAD+-dependent (AbMaeB2). Previou studies have shown that MaeBlike enzymes participate in essential metabolic processes, playing a central role in controlling the fate of carbon in the phosphoenolpyruvate / pyruvate / oxaloacetate metabolic node due to the ability to respond to the levels of different metabolites. In this sense, in the presend work, the malic enzyme AbMAeB2 was purified and characterized in order to clarify the possible role of this enzyme in the metabolism of A. brasilense. Gel-filtration cromatography analyses suggest a molecular mass of 696 kDa for AbMaeB2. The predicted molecular weight of the MaeB2 polypeptide is 83 kDa, hence, MaeB2 is also likely to be arranged in a high molecular weigh oligomer as observed in E. coli and S. meliloti, likely forming an octamer. The results of tests of metals on the malic activity indicate that Mg2+ and Mn2+ are essential to the malic activity of AbMaeB2, with a preference for Mn2+, in agreement with the results obtained with E. coli MaeB and A. brasilense MaeB1. In addition, KCl activation, previously reported for EcMaeB and AbMaeB1, has also been observed for AbMaeB2. The KM values for the substrates of the AbMaeB2 enzyme were estimated to be 25,4 mM and 21,9 mM for L-malate in the presence of saturating NAD+ and NADP+, respectively, and 0,8 mM for NAD+ and 1,1 mM for NADP+ in saturating concentrations of L-malate. Finally, preliminary data on the effect of different metabolites on the AbMaeB2 malic activity indicate a possible regulation of this enzyme by acetyl-phosphate, ATP and ADP.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Coorientador: Prof. Dr. Rafael Metri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Litoral, Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Territorial Sustentável. Defesa : Matinhos, 26/11/2020 Inclui referências: p.64-76 Resumo: O ambiente marinho é caracterizado por possuir parâmetros típicos, como alta pressão, salinidade, temperatura, ausência de luz, entre outros e por possuir uma enorme diversidade de microrganismos. Estudar a comunidade bacteriana marinha é de suma importância para compreender a estrutura e o padrão de distribuição dessa comunidade. A diversidade bacteriana marinha pode ser mais bem estudada, combinando técnicas convencionais e técnicas que empreguem tecnologias modernas para sua melhor compreensão. Portanto, este estudo buscou analisar a comunidade microbiana marinha de um dos únicos afloramentos rochosos existente no Estado do Paraná, encontrado no Parque Nacional Marinho das Ilhas dos Currais, a qual foi estudada pela primeira vez, através da utilização de uma metodologia inovadora como o sequenciamento do gene 16S rRNA e ainda o emprego das estruturas denominadas de ARMS, para a captura passiva das amostras a serem analisadas em dois pontos dentro do parque (Ponto RAM e Ponto Currais). Foram identificados 36 diferentes tipos de filos na amostra total do ponto de coleta RAM e 34 diferentes tipos de filos na amostra total do ponto de coleta Currais. Ambos os pontos apresentaram como mais representativos os seguintes filos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Acidobacteria e Verrucomicrobia. Foi possível identificar 74 diferentes classes no ponto RAM e 77 no ponto Currais. Com prevalência para as classes pertencentes ao filo Proteobacteria em ambos os pontos: Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria. A classificação em nível de gênero do ponto RAM contabilizou um total de 309 diferentes possíveis gêneros, contando com as OTUs que não foram atribuídas a nenhum gênero encontrado no Banco de dados SILVA 132. Já no ponto Currais foram identificados 333 possíveis gêneros. Todos esses dados são únicos no afloramento rochoso das Ilhas dos Currais, esses dados contribuem diretamente para o conhecimento sobre a biodiversidade microbiana em ambientes recifais rochosos e podem contribuir ainda para o desenvolvimento de estudos sobre a dinâmica ecológica e ecossistêmica da comunidade microbiana marinha no litoral paranaense. Palavras-chave: Microbiota marinha. 16S rRNA. Metagenômica. ARMS. Abstract: The marine environment is characterized by having typical parameters, such as high pressure, salinity, temperature, absence of light, among others, and by having a huge diversity of microorganisms. Studying the marine bacterial community is of paramount importance to understand the structure and distribution pattern of that community. Marine bacterial diversity can be better studied, combining conventional techniques and techniques that employ modern technologies for their better understanding. Therefore, this study sought to analyze the marine microbial community of one of the only rocky outcrops in the State of Paraná, found in the Marine National Park of the Currais Islands, which was studied for the first time, using an innovative methodology such as sequencing of the 16S rRNA gene and also the use of structures called ARMS, for the passive capture of samples to be analyzed at two points within the park (Ponto RAM and Ponto Currais). 36 different types of phyla were identified in the total sample of the RAM collection point and 34 different types of phyla in the total sample of the Currais collection point. Both points presented the following phyla as most representative: Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Acidobacteria and Verrucomicrobia. It was possible to identify 74 different classes at the RAM point and 77 at the Currais point. With prevalence for the classes belonging to the phylum Proteobacteria in both points: Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria. The gender level classification of the RAM point accounted for a total of 309 different possible genres, including OTUs that were not assigned to any gender found in the SILVA 132 database. In the Currais point, 333 possible genres were identified. All these data are unique in the rocky outcrop of the Currais Islands, these data directly contribute to the knowledge about microbial biodiversity in rocky reef environments and may also contribute to the development of studies on the ecological and ecosystem dynamics of the marine microbial community on the Paraná coast. Key-words: Marine microbiota. 16S rRNA. Metagenomic. ARMS

Orientador: Prof. Dr. Luciano F. Huergo. Coorientadores: Prof. Dr. Glaucio Valdameri, Drª Edileusa C. M. Gerhardt. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Bioquímica. Defesa : Curitiba, 19/08/19. Inclui referências: p. 82-97. Resumo: O nitrogênio é um elemento necessário para a biossíntese de diversas biomoléculas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos. Na ausência de nitrogênio, procariotos como Escherichia coli cessam imediatamente o crescimento. Amônio é a fonte de nitrogênio de preferência para E. coli e confere as maiores taxas de crescimento. Sob condições de limitação de amônio, E. coli é capaz de utilizar fontes alternativas de nitrogênio, sendo que esta reprogramação é conduzida através da indução do regulon NtrC. Neste trabalho foi utilizada a técnica de proteômica livre de marcação para determinar a dinâmica da expressão de proteínas de E. coli em resposta à privação de nitrogênio, tanto inicialmente (30 min) quanto tardiamente (60 min). A abundância de proteínas e modificações pós-traducionais confirmaram que a ativação do regulon NtrC atua como a primeira linha de defesa da célula contra a falta de nitrogênio. A poteína Rmf (ribosome modulation fator) foi induzida logo após a célula ser submetida à privação de amônio, seguido da expressão de outras proteínas que atuam inativando os ribossomos, como Hpf e RaiA, apoiando a hipótese de que a inativação dos ribossomos é um processo importante durante a limitação de nitrogênio. O promotor rmf foi estudado e contém um promotor sigma54 além do sítio de ligação sigma70. Os dados proteômicos revelaram que a parada do crescimento devido à falta de nitrogênio se correlaciona com o acúmulo de proteínas envolvidas na condensação do DNA, no catabolismo de RNA e proteína e com hibernação de ribossomo. Coletivamente, essas adaptações proteômicas resultam em células metabolicamente inativas que possivelmente exibem tolerância a múltiplas drogas. Abstract: Nitrogen is needed for the biosynthesis of biomolecules including proteins and nucleic acids. In the absence of fixed nitrogen, prokaryotes such as E. coli immediately ceases growth. Ammonium is the preferred nitrogen source for E. coli supporting the fastest growth rates. Under conditions of ammonium limitation, E. coli can use alternative nitrogen sources and this reprogramming is orchestrated by the induction of the NtrC regulon. We use label free proteomics to determine the dynamics of E. coli proteins expression in response to nitrogen starvation after both short (30 min) and long (60 min) term. Protein abundances and post-translational modifications confirmed that activation of the NtrC regulon acts as the first line of defense against nitrogen starvation. The ribosome inactivating protein Rmf was induced shortly after ammonium exhaustion and this was followed by induction of other ribosome inactivating proteins such as Hpf and RaiA. These data support the hypothesis that ribosome shut-down is a key process during nitrogen limitation stress. The rmf promoter was studied and it contains a sigma54 promoter in addition to the sigma70 binding site. The proteomic data revealed that growth arrest due to nitrogen starvation correlates with the accumulation of proteins involved in DNA condensation, RNA and protein catabolism and ribosome hibernation. Collectively, these proteome adaptations will result in metabolic inactive cells which are likely to exhibit multidrug tolerance.

Orientador: Prof. Dr. Luciano F. Huergo Coorientadores: Prof. Dr. Ricardo H. M. Godoi, Prof. Dr. Rodrigo A. Reis Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Litoral, Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Territorial Sustentável. Defesa : Matinhos, 14/06/2019 Inclui referências Resumo: O Brasil tem a maior porcentagem da biodiversidade do planeta, mantendo aproximadamente 20% de todas as espécies conhecidas. Bioaerossóis, são partículas associadas a compostos de origem biológica, de fonte natural ou antrópica, inclui os fungos e bactérias patogênicas e não patogênicas, viáveis e não viáveis, pólens, algas, entre outros. São originários do solo, vegetação e superfícies aquáticas, como rios, baías e oceanos. A Floresta Amazônica é a maior floresta tropical do mundo, é também considerada o bioma com maior biodiversidade do planeta. O presente estudo tem como objetivo investigar o microbioma da atmosfera nas proximidades da Torre Instant, localizada na Estação Científica do Uatumã, dentro da Reserva de Desenvolvimento Sustentável do Uatumã. Uma campanha de coleta no local foi realizada durante a estação seca, na segunda quinzena de agosto de 2018, através do Harvard Inertial Impactor, adaptado para coleta de partículas suspensas totais. Um número de amostras (n = 5) foi submetido à extração e cultura de células bacterianas viáveis em diferentes meios de cultura, contabilizando 78 isolados em todos os meios utilizados. Com a combinação de espectrometria de massa e os métodos de sequenciamento do rDNA16S, 14 isolados foram identificados como pertencentes aos filos Firmicutes e Actinobacteria. A segunda parte das amostras (n = 1) foi submetida à extração de rDNA metagenômico, seguida de análise taxonômica do sequenciamento massivo de um fragmento amplificado do gene 16S rDNA. Um total de 271.577 leituras com 250 pb foram obtidas pelo sequenciamento da amostra, das quais 197.970 (~ 72%) foram identificadas para o domínio Bacteria. Os filos identificados com as maiores abundâncias foram: Proteobacteria (36%), Actinobacteria (24%), Firmicutes (20%), Cyanobacteria (11%). Estes dados contribuem para o conhecimento sobre a biodiversidade de bioaerossóis em ambientes naturais e podem contribuir para o desenvolvimento de estudos sobre a dinâmica ecológica e ecossistêmica de procariotos na atmosfera. Palavras chave: Bioaerossóis; Bactéria; Amazônia; Abstract: ABSTRACT Brazil has the highest percentage of biodiversity on the planet, approximately 20% of all known species. Bioaerosols, are particles associated with compounds of biological origin, from natural or anthropogenic source, includes pathogenic and non-pathogenic fungi and bacteria, viable and non-viable, pollens, algae, among others. They originate from soil, vegetation and aquatic surfaces, such as rivers, bays and oceans. The Amazon Rainforest is the largest tropical forest in the world, it is also considered the biome with the greatest biodiversity on the planet. The present study aims to investigate the microbiome in the atmosphere in the vicinity of the Instant Tower, located in the Uatumã Scientific Station, within the Uatumã Sustainable Development Reserve. A collection campaign was conducted during the dry season, in the second half of August 2018, through the Harvard Inertial Impactor, adapted for collecting total suspended particulates. A number of samples (n = 5) were subjected to extraction and culture of viable bacterial cells in different culture media, counting 78 isolates in all media used. With the combination of mass spectrometry and rDNA16S sequencing methods, 14 isolates were identified as belonging to the Firmicutes and Actinobacteria phyla. The second part of the samples (n = 1) was submitted to metagenomic rDNA extraction, followed by taxonomic analysis of the massive sequencing of the 16S rDNA amplified fragment. A total of 271,577 readings with 250 bp were obtained from the sequencing of samples, of which 197,970 (~ 72%) were identified for the Bacteria domain. The phyla identified with the greatest abundances were: Proteobacteria (36%), Actinobacteria (24%), Firmicutes (20%), Cyanobacteria (11%). These data contribute to the knowledge about the biodiversity of bioaerosols in natural environments and can contribute to the development of studies on the ecological and ecosystem dynamics of prokaryotes in the atmosphere. Key words: Bioaerosols; Bacteria; Amazon

Com o desenvolvimento de sequenciadores de segunda geração, uma revolução ocorreu na pesquisa genômica, e atualmente o genoma completo de milhares de linhagens de bactérias são conhecidos. A análise de proteínas por espectrometria de massas (MS) também passou por grandes desenvolvimentos tecnológicos na última década em termos de sensibilidade e capacidade de sequenciamento. A caracterização de sequências peptídicas em amostras de proteômica pode ser utilizada para validar regiões do genoma como codificantes, área de pesquisa conhecida como proteogenômica. A abordagem proteogenômica é aplicada por meio da construção de bancos de dados de sequências proteicas customizadas, que podem ser inspecionados contra dados de sequências peptídicas coletadas por MS. A natureza probabilística da identificação de peptídeos por MS, e as limitações encontradas na construção de bancos precisos de proteínas tem sido gargalos relevantes no que se refere ao desenvolvimento de abordagens para análise de amostras contendo proteínas de uma comunidade bacteriana. O desenvolvimento dessas abordagens torna-se cada vez mais crítico, dada a importância de se caracterizar biomas de relevância clínica, ambiental e industrial. Como a identificação de peptídeos depende da qualidade e precisão dos bancos de dados de proteínas, este trabalho tem como objetivo desenvolver uma abordagem computacional para construir bancos de sequências de proteínas customizados, a partir do processamento e análise de dados de sequências proteicas de várias linhagens de uma mesma espécie de bactéria. Para a construção dos bancos, a abordagem realiza o alinhamento de sequências proteicas de linhagens de bactérias. Em seguida, identifica e compara as proteínas homólogas e as unicamente anotadas em todas as linhagens. E por fim, reporta as sequências de proteínas de forma não redundante, ou seja, sequências extensivamente repetidas entre anotações são reportadas somente uma vez com o intuito de manter o tamanho do banco sob controle. Os bancos também reportam variações de sequência, sejam elas resultantes de variações genéticas ou divergências de anotação de genes, que normalmente são abdicadas em bancos de dados utilizados em análise proteômica. Utilizando dados de espectrometria de massa coletados de 8 linhagens clínicas de Mycobacterium tuberculosis, avaliou-se o desempenho de identificação de proteínas de dois bancos de dados de sequências, um incluindo todas as proteínas de 65 linhagens sequenciadas e outro construído com essa abordagem usando as mesmas 65 linhagens. Além de reduzir o tempo computacional, o número de identificações obtidas em ambas as buscas foi praticamente idêntico. Além disso, foram criados bancos para 10 espécies bacterianas com genomas completamente sequenciados. Esses bancos foram monitorados de acordo com as características relevantes para a identificação de proteínas baseadas em probabilística por proteômica. Além dos bancos, houve também uma preocupação de se criar um arquivo de registro, no qual cada observação referente a presença de homólogos, diferenças de sequências, tipo de modificação e presença em linhagens estivesse bem descrita. Ao analisar os bancos criados com essa abordagem, mostrou-se que, conforme esperado, o aumento na complexidade do banco de dados se correlaciona com a complexidade pangenômica das espécies de bactérias. No entanto, Mycobacterium tuberculosis e Bortedella pertusis geraram bancos de dados muito complexos, mesmo com baixa complexidade pangenômica ou nenhum pangenoma, respectivamente. Isso indica que as diferenças na anotação genética são mais altas que a média entre as linhagens dessas espécies. Demonstrou-se também a possibilidade de se utilizar tal abordagem para criar bancos contendo sequências de múltiplas espécies, com o intuito de realizar análises metaproteômicas de dados de MS. Next-generation sequencers development cause a revolution in genomic research, and nowadays the complete genomic information of thousands of bacterial strains is available. Similar technological breakthroughs also happened for protein analysis by mass spectrometry (MS) in the last decade regarding sensitivity and throughput. Peptide sequence characterization in proteomics samples can be used to validate genomic regions as coding, research field known as proteogenomics. The proteogenomic approach is applied through the construction of customized protein sequence databases which will be inspected against peptide sequence data collected by MS. The probabilistic nature of peptide identification by MS, and the limitations found in the construction of precise protein databases have been relevant bottlenecks in the development of approaches for the analysis of samples containing proteins from a bacterial community. The development of these approaches becomes increasingly critical given the importance of characterizing biomes of clinical, environmental and industrial relevance. As the peptides identification depends on the quality and accuracy of the protein databases, this work aims to develop a computational strategy that builds customized protein databases sequence, through processing and analysis of protein sequence data from several strains of the same bacterial species. For the construction of databases, the approach performs the alignment of protein sequences of bacteria strains. Then, identifies and compares homologous and uniquely annotated proteins in all strains. And finally, reports those sequences in a non-redundant manner, which means, sequences extensively repeated among annotations are reported only once in order to keep the size database under control. Databases also report sequence variations, whether they result from genetic variations or annotation divergences, which are usually abdicated in databases used in proteomic analysis. Using mass spectrometry data collected from 8 clinical strains of Mycobacterium tuberculosis, assessed whether the protein identification performance of two sequence databases, one including all proteins from 65 sequenced strains, and one constructed with this approach using the same strains 65 strains. Besides reducing the computacional time, the number of identifications obtained in both searches was practically identical. Besides, databases for 10 bacterial species containing at least 65 strains characterized were created. These databases were monitored according to the relevant characteristics for the identification of proteins based on probabilistic by proteomics. Besides the databases, there was also a concern to create a registration file, in which each observation regarding the presence of homologous, differences of sequences, modification type and presence in strains was well described. When analyzing the databases created with this approach, it has been shown that, as expected the increase in database complexity correlates with pangenomic complexity of bacterial species. However Mycobacterium tuberculosis and Bortedella pertusis generated very complex databases even having low pangenomic complexity or no pangenome at all respectively. This indicates that differences in gene annotation is higher than average between strains of those species. It has also been demonstrated the possibility to use such strategy to create databases containing sequences of multiple species, in order to perform metaproteomic analyzes of MS data.

Orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães Cruz Coorientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa : Curitiba, 05/02/2018 Inclui referências Resumo: Metagenômica é o estudo das comunidades microbiológicas encontradas em um ambiente, combinando técnicas de extração de material genético, genômica e bioinformática. Através deste estudo, podemos acessar um microbioma que não pode ser encontrado e analisado normalmente através de técnicas tradicionais de cultivo, devido à impossibilidade de cultivar muitos microrganismos em condições de laboratório. O acesso mais amplo à biodiversidade que esta tecnologia pode fornecer, nos permite identificar novos microrganismos, sua quantidade e seu papel no ecossistema, através da classificação taxonômica e predição funcional. O solo é considerado um dos ecossistemas biológicos mais complexos. Eles são responsáveis pelos ciclos biogeoquímicos mais fundamentais na Terra, mantendo relações vitais entre si e com organismos superiores. Os seus papéis principais estão relacionados com a decomposição da matéria orgânica, fornecimento de nutrientes para as plantas e degradação de substâncias químicas. A inoculação de microrganismos que podem realizar uma relação simbiótica benéfica com plantas, pode ajudar no crescimento vegetal e aumentar a produção agrícola. Vários microrganismos já foram identificados como bactérias promotoras de crescimento vegetal, como por exemplo o Azopirillum brasilense, uma bactéria fixadora de nitrogênio, que é usada como bio-fertilizante na agricultura em vários compostos comerciais. Este microrganismo não é aplicado apenas para promover o crescimento das plantas, mas também para moldar a região da rizosfera com outros microrganismos benéficos, que também podem atuar diretamente como bactérias promotoras de crescimento vegetal ou indiretamente na solubilização de minerais, controle biológico patógenos ou contribuindo para a estrutura e agregação de solo. Palavras-chave: Bioinformática, Fixação Biológica de Nitrogênio, Bactérias Promotoras de Crescimento Vegetal Abstract: Metagenomics is the study of the microbiological communities recovered from a environment by combining techniques of genetic material extraction, genomics and bioinformatics. Through this study we are able to access a microbiome that can't be found normally with traditional techniques of cultivation and analysis due to the impossibility to cultivate many microorganisms in laboratory conditions. The broader access to biodiversity that this technology can provides allows us to identify new microorganisms, their abundance and their roles in the ecosystems through taxonomic classification and functional predictions. The soil is considered one of the most complex biological ecosystems. They are responsible to the most fundamentals biogeochemical cycles in earth, maintaining vital relationships between each other and with higher organisms. Their main roles are related with the decomposition of the organic matter, nutrients privation to the plants and the degradation of chemical substances. The inoculation of microorganisms that can performed a beneficial symbiotic relationship with plants, can help in the plant growth and increase the agricultural production. Several microorganisms were already identified as plant growth promoting bacterias such as Azopirillum brasilense, a nitrogen-fixation bacteria, that has been used as bio-fertilizer in agriculture in several commercial compounds. This microorganism is not only applied to promote plant growth, but also to shape the rhizosphere region with other beneficial microorganisms that can also acts directly as plant promoting bacterias or indirectly in the solubilization of minerals, biological control of plant pathogens or contributing to the structure and aggregation of soil. Keywords: Bioinformatics, Biological Nitrogen Fixation, Plant Growth Promoting Bacterias

Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza Coorientador: Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 26/06/2018 Inclui referências Resumo: O manguezal é um bioma costeiro que apresenta fauna e flora adaptadas a inundações periódicas, causando grandes variações de salinidade. Dentre os estudos sobre manguezais no mundo, aproximadamente 20% estão relacionados com manguezais brasileiros, e destes apenas 1% apresentam ensaios relacionados a identificação ou caracterização de enzimas hidrolíticas presentes nesses ambientes. Assim, este projeto de doutorado teve como objetivo identificar e caracterizar enzimas com potencial aplicação biotecnológica a partir de genes presentes em microrganismos do manguezal da baía de Paranaguá, do estado do Paraná. Amostras desse bioma foram coletadas e semeadas em meios seletivos específicos, permitindo o isolamento de 17 bactérias. Dentre elas, o isolado XL-2 teve seu genoma totalmente sequenciado e foi classificado como Bacillus safensis BRM1. Seu genoma apresenta 3,74 Mb e conteúdo GC de 41,8%. Dentre os 3.983 genes preditos, 23 podem estar relacionados com genes que codificam para celulases e hemicelulases, evidenciando o potencial biotecnológico presente desta estirpe. Além disso, outro isolado (XS-14, Pseudomonas sp.) teve seu genoma parcialmente sequenciado, onde foi possível identificar uma esterase (Est1) com atividade em substratos de cadeia curta e em níveis elevados de NaCl, sendo parcialmente caracterizada. Dessa forma, o estudo realizado nesse período de doutorado permitiu contribuir para o conhecimento sobre os manguezais brasileiros Abstract: Mangrove is a coastal biome with fauna and flora adapted to periodic flooding, causing great variations of salinity. Among the mangrove studies in the world, approximately 20% are related to Brazilian mangroves, and only 1% of these have been analyzed for identification or characterization of hydrolytic enzymes. Thus, this project had the objective of identifying and characterizing enzymes with potential biotechnological application from genes microorganisms of the Paranaguá bay mangrove, in the state of Paraná. Samples of the soil from this biome were collected and microorganisms were seeded into specific selective media, allowing the isolation of 17 bacteria. Among them, the XL-2 isolate had its genome fully sequenced and, after deposition in GenBank, was classified as Bacillus safensis BRM1. Its genome has 3.74 Mb and 41.8% of GC content. Among the 3,983 predicted genes, 23 may be related to genes encoding cellulases and hemicellulases, evidencing the biotechnological potential present in this strain. Another isolate (XS-14, Pseudomonas sp.) had its genome partially sequenced, where it was possible to identify an esterase (Est1) with activity on short-chain substrates and high levels of NaCl, being partially characterized. Thus, the study conducted in this doctoral period contributed to the knowledge on Brazilian mangroves.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Coorientadora: Dra. Edileusa Cristina Marques Gerhardt Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 21/03/2018 Inclui referências Resumo: As proteínas PII são conhecidas por regular o metabolismo de nitrogênio e carbono em bactérias, algas e plantas. Ensaios preliminares utilizando a proteobactéria diazotrófica Azospirillum brasilense mostraram que a proteína PII GlnZ deste organismo pode interagir com a enzima málica NADP+ dependente (MaeB1) e com a enzima N-acetil glutamato quinase (NAGK). MaeB1 está envolvida na conversão de malato a piruvato, com redução de NADP+ a NADPH. Essa enzima possui uma extensão C-terminal extra, homóloga às fosfotransacetilases (PTA). NAGK atua na biossíntese de arginina, e em muitos organismos é inibida por este aminoácido. Vários estudos demonstram que NAGKs de cianobactérias, algas e plantas, que são sensíveis à arginina, são capazes de interagir com PII. Para validar estes ensaios preliminares, nós realizamos ensaios de co-precipitação das enzimas em questão com as proteínas PII de A. brasilense. Nossos resultados mostram que GlnZ interage com AbMaeB e AbNAGK in vitro, em condições de alta concentração de nitrogênio celular. GlnZ parece regular a atividade málica de AbMaeB a fim de fornecer mais NADPH para as reações biossintéticas. Ensaios cinéticos visando a caracterização da atividade de enzima málica de AbMaeB1 foram realizados, AbMaeB1 é fortemente ativada por concentrações fisiologicamente relevantes de glutamina Este efeito também foi observado para a enzima ortóloga de E. coli (EcMaeB). Nós também demonstramos pela primeira vez que AbMaeB e EcMaeB possuem domínio PTA ativo capaz de converter coenzima A e acetil-fosfato em Acetil-CoA. Palavras-chave: Proteínas PII, interação, MaeB, NAGK Abstract: The PII are signal transduction proteins that are known to regulate the nitrogen and carbon metabolism, in bacteria, plants and algae. Preliminary assays using the diazotrophic Proteobacterium Azospirillum brasilense showed that the PII protein GlnZ interacts with the malic enzyme (AbMaeB1) and with the N-acetyl glutamate kinase (NAGK). The AbMaeB1 converts malate to pyruvate, with reduction of NADP+ to NADPH. This enzyme also carries a C-terminal extension, which shows homology with phophotransacetylases (PTA). NAGK acts in the arginine biosynthesis and in many organisms is feed-back inhibited by this aminoacid. Several studies showed that NAGKs from cyanobacteria, algae and plants are arginine-sensitive and can interact with PII to relieve such feedback inhibition. In this work we have performed co-purification assays to show that both MaeB1 and NAGK interact with the PII proteins in A. brasilense. Our data show that GlnZ forms a complex with AbMaeB and AbNAGK in condition of high intracellular nitrogen concentrations. GlnZ may be regulating the direct malic activity in order to provide NADPH to nitrogen assimilation. Kinetic analysis of the malic activity of AbMaeB1 indicated strong activation by physiological relevant glutamine concentrations. The same effect was detected in the E. coli orthologue enzyme (EcMaeB). We also demonstrated for the first time that the PTA domain of AbMaeB and EcMaeB is active and that they are activated by glutamine on a dose-dependent manner. Keywords: PII proteins, interaction, MaeB, NAGK

Orientadora : Prof.ª Dra. Maria Berenice Reynaud Steffens Coorientadores : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo, Dra. Edileusa Cristina Marques Gerhardt Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 21/03/2018 Inclui referências : p. 85-97 Resumo : A família das proteínas PII é presente em bactérias, arqueias e plantas, possuindo a capacidade de modular a atividade de outras proteínas por interações do tipo proteína-proteína. Dessa forma, elas coordenam processos celulares relacionados, principalmente, ao metabolismo de nitrogênio. A ligação de uma PII aos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG) altera sua conformação e, consequentemente, pode modular a interação com seus alvos. Outro evento que pode influenciar nas interações de PII é a sua uridililação, que responde aos níveis de nitrogênio. Recentemente, 125 proteínas de Azospirillum brasilense foram descritas como potencias alvos de interação da proteína PII GlnZ, em diferentes vias metabólicas. O objetivo deste trabalho foi validar alguns desses potenciais alvos, através da clonagem e expressão heteróloga dessas proteínas para posteriores ensaios de interação por coprecipitação in vitro. Como resultados, não foram visualizadas interações entre GlnZ e RpoN ou EIIANtr de A. brasilense FP2. Por outro lado, GlnZ foi capaz de formar complexos, na presença de ATP ou ADP, com uma diguanilato ciclase e uma fosfodiesterase de A. brasilense Sp245, enzimas envolvidas na síntese e degradação, respectivamente, do diguanilato cíclico (c-di-GMP), um importante segundo mensageiro em bactérias. A formação dos complexos DGC/GlnZ e PDE/GlnZ foi inibida pela adição de 2-OG junto ao ATP, de maneira dependente da concentração de 2-OG. A uridililação de GlnZ, entretanto, não aparentou influenciar nas interações. Os resultados sugerem que a interação de GlnZ com DGC ou PDE parece ser mais responsiva ao metabolismo de carbono do que ao de nitrogênio, e que essas interações podem influenciar a sinalização por c-di-GMP. Palavras-chave: Proteínas PII. Diguanilato ciclase. Fosfodiesterase. Interação proteína-proteína. Abstract : The PII protein family is present in bacteria, archea and plants, and can modulate the activity of other proteins through protein-protein interactions. For this reason, they coordinate cellular processes that are mainly related to nitrogen metabolism. The PII binding to the effectors ATP, ADP and 2-oxoglutarate (2-OG) changes its conformation and, consequently, can modulate the interaction with their targets. Another event that can influence the PII interactions is its uridylilation, which is controlled by nitrogen levels. Recently, 125 proteins of Azospirillum brasilense were described as potential interaction targets of the GlnZ PII protein, in different metabolic pathways. The objective of this work was to validate some of these potential targets through the cloning and heterologous expression of these proteins, followed by in vitro co-precipitation assays. As result, no interactions between GlnZ and RpoN or EIIANtr of A. brasilense FP2 were visualized. On the other hand, GlnZ was able to interact, in the presence of ATP or ADP, with a diguanylate cyclase and a phosphodiesterase of A. brasilense Sp245, enzymes involved in the synthesis and degradation of cyclic diguanylate (c-di-GMP), an important second messenger in bacteria. The formation of the DGC/GlnZ and PDE/GlnZ complexes was inhibited by the 2-OG in the presence of ATP, in a 2-OG concentration-dependent manner. GlnZ uridylilation, however, did not appear to influence the interactions. The results suggest that the interaction of GlnZ with DGC or PDE is more responsive to carbon than to nitrogen metabolism, and that these interactions may influence c-di-GMP signaling. Key-words: PII proteins. Diguanylate cyclase. Phosphodiesterase. Proteinprotein interaction.

Orientador: Dr. Luciano Fernandes Huergo Orientador no exterior: Dr. Liang Tong Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 31/01/2018 Inclui referências: p.110-125 Resumo: As proteínas PII constituem uma das mais amplamente distribuídas famílias de proteínas transdutoras de sinais, encontradas em Bacteria, archaeas fixadoras de nitrogênio e cloroplastos de eucariotos fototróficos (algas vermelhas e plantas). Em E. coli, há dois representantes da família de proteínas PII, GlnB e GlnK. Essas proteínas atuam por meio da interação proteína-proteína, regulando alvos de acordo com flutuações dos níveis de moléculas sinalizadoras do status de nitrogênio, carbono e energia. Assim, as proteínas PII são tidas como integradoras dos metabolismos de nitrogênio, carbono e energia. Recentes estudos mostraram a interação de PII com BCCP, subunidade da enzima acetil-CoA carboxilase (ACC), de forma dependente de ATP e negativamente regulada por 2- oxoglutarato (2-OG). A enzima ACC de E. coli é composta pelas subunidades BCCP, BC e CT que catalisam a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, sendo esta a primeira e irreversível etapa da biossíntese de ácidos graxos. Neste trabalho, foram obtidos resultados mostrando a formação de complexo ternário entre as proteínas PII, BCCP e BC e o efeito inibitório in vitro desta interação na atividade da ACC em E. coli. Além disso, os resultados aqui apresentados sugerem que estirpes de E. coli mutantes PII apresentam maior produção de ácidos graxos do que as células selvagens, quando sob super-expressão de uma tioesterase (TesA). Também, é mostrado neste trabalho que os níveis de malonil-CoA são diminuídos sob super-expressão de GlnB, sugerindo que as proteínas PII exercem efeito inibitório na atividade de ACC in vivo e que, assim, são funcionalmente importantes no ajuste fino na síntese de ácidos graxos de acordo com os sinais de carbono, nitrogênio e energia. Estes dados podem potencialmente contribuir para a otimização da produção microbiana de biocombustíveis por meio da engenharia genética em E. coli. Além disso, foram determinadas as condições de purificação e cristalização da enzima GlnD de E. coli. Neste organismo, GlnD catalisa a uridililação/desuridililação de PII de acordo com os níveis de glutamina, direcionando as proteínas PII a interagir com alvos específicos em resposta a este metabólito. Palavras-chave: proteínas PII, metabolismo de nitrogênio, metabolismo de carbono, ácidos graxos, acetil-CoA carboxilase, GlnD. Abstract: PII proteins are one of the most widespread family of signal transduction proteins, found in Bacteria, nitrogen-fixing Archaea and in the chloroplasts of eukaryotic phototrophs (red algae and plants). In E. coli, there are two representatives of the PII family, GlnB and GlnK. These proteins act by protein-protein interaction with target proteins. These interactions are determined according to the level of nitrogen, carbon and energy signaling molecules. Hence PII are considered as a control integrating module between the nitrogen, carbon and energy metabolisms. Recently, the interaction between PII and BCCP was shown. BCCP is a subunit of the acetyl-CoA carboxylase (ACC) enzyme and the interaction between PII and BCCP is ATP-dependent and negative regulated by 2- oxoglutarate (2-OG). E. coli ACC is a multi-subunit enzyme formed by BCCP, BC and CT subunits. ACC catalyze the first and committed step in fatty acid biosynthesis, the formation of malonyl-CoA from acetyl-CoA. In this work, we show the formation of a ternary complex between PII, BCCP and BC in vitro and the inhibitory effect of this interaction on the ACC activity in E. coli. In addition, we show that PII mutants strains have increased fatty acid productivity in comparison to E. coli wildtype, under TesA overexpression. Also, in this work it was observed that GlnB overexpression decreases the levels of malonyl-CoA when ACC was overexpressed in E. coli. Collectively these results indicate the inhibitory effect of PII over ACC activity in vivo. These data provide the basis to increase microbial biofuels production by genetic engineered E. coli. Here we also show the preliminary purification and crystallization condition of the E. coli GlnD enzyme. The GlnD enzyme uridylylates/deuridylylates PII proteins in response to glutamine levels, thereby controlling the interaction between PII proteins and specific targets. Keyworkds: PII proteins, nitrogen metabolism, carbon metabolism, fatty acids, acetyl-CoA caroboxylase, GlnD.

Orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães Cruz Coorientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa: Curitiba, 10/03/2017 Inclui referências : f. 50-52 Resumo: A utilização da espectrometria de massa MALDI-TOF permite a identificação de microrganismos através da geração de espectros de massa, representando um perfil característico de sinais obtidos a partir de peptídeos ionizados de células inteiras ou extratos celulares. A comparação de espectros de massa obtidos de microrganismos desconhecidos contra um banco de dados de espectros de massa para microrganismos conhecidos, permite sua identificação. Essa utilização permite o usufruto de algumas vantagens frente a algumas limitações da técnica padrão, tal como agilidade na análise e redução de custos. Entretanto, faltam alternativas gratuitas aos softwares proprietários capazes de suprir características chaves na análise dos dados extraídos por tal técnica. Para auxiliar nessa análise nós criamos o JMSA, que é uma ferramenta de análise dos picos de um espectro de massa. O JMSA é capaz de facilitar a visualização comparativa, incluir dados descritivos de amostras. O JMSA também pode executar uma comparação de similaridade entre espectros selecionados. Desta forma o programa foi capaz de identificar um espectro, dado como desconhecido, em nível de espécie. O programa é capaz de ser executado consumindo poucos recursos nos principais sistemas operacionais que suportem Java, tal como MacOSX, Linux e Windows. Palavras-chave: Espectrometria de massa, Identificação de microrganismos, Análise de espectros de massa, MALDI-TOF, Desenvolvimento de software, Java. Abstract: The use of MALDI-TOF mass spectrometry allows microorganism identification by generating mass spectra representing a characteristic profile of signals from ionized whole cell peptides or cell extracts. Comparing of mass spectra obtained from unknown microorganisms with a database of mass spectra for known microorganisms allows their identification. This usage allows the exploitation of some advantages over some limitations of the standard technique, such as agility in the analysis and reduction of costs. However, there is a lack of free alternatives to proprietary software capable of supplying key characteristics in its extracted data analysis. To assist in this analysis we have created the JMSA, which is a tool for analyzing the peaks of a mass spectrum. The JMSA is able to facilitate comparative visualization as well as include descriptive sample data. JMSA can also perform a similarity comparison of selected spectra. In this way the program was able to identify a spectrum, given as unknown, at species level. The program is able to run by consuming few resources on major operating systems that support Java, such as MacOSX, Linux and Windows. Key-words: Mass spectrometry, Identification of microorganisms, Mass spectrum analysis software, MALDI-TOF, Software development, Java.

Orientadora : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientador : Profª Drª. Vivian Rotuno Moure e Prof. Dr. Marco A. S. de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 21/03/2016 Inclui referências : f. 77-83 Resumo: A enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase (NadE) catalisa a amidação do ácido nicotínico adenina dinucleotídeo (NaAD) para formar NAD+. Essa reação é o último passo da biossíntese de NAD, e portanto é uma enzima chave no metabolismo. Enzimas NadE tipicamente usam glutamina ou amônia como doadores de nitrogênio, em uma reação dependente de ATP. Dada a função de NadE para o metabolismo de procariotos, NadE vêm atraindo interesse como alvo para antibióticos. Em vários organismos, podem ser encontradas várias cópias de genes que codificam para NAD sintetases. A bactéria associativa de plantas Herbaspirillum seropedicae possui dois genes que codificam para duas enzimas NadE1 e NadE2. O gene nadE1 é ligado por contexto genômico ao gene glnB que codifica para a proteína transdutora de sinal GlnB. Anteriormente a NadE1 foi caracterizada cineticamente, e ela mostrou ter preferência por glutamina. Este trabalho mostra a confirmação da preferência de glutamina por NadE1 por ensaio de LC/MS, assim como a caracterização da proteína NadE2 de H. seropedicae. Após a clonagem, expressão e purificação da proteína NadE2, a análise de cromatografia de gel filtração sugere que NadE2 é uma enzima homo-dimérica. A caracterização cinética de NadE2 indica que seu domínio glutaminase é funcional, porém há preferência por glutamina em relação a amônia é sutil. Essa é a primeira investigação cinética de uma enzima glutamina-dependente dimérica. Palavras chave: NAD+, glutaminase, enzima. Abstract: Nicotinamide adenine dinucleotide synthetase enzyme (NadE) catalyzes the amidation of nicotinic acid adenine dinucleotide (NaAD) to form NAD+. This reaction is the last step of NAD biosynthesis, therefore is a key enzyme of metabolism. NadE enzymes typically use glutamine or ammonium as nitrogen donors in an ATP-dependent reaction. Given the NadE function to prokaryote metabolism, it has attracted interest as a potential target for novel antibiotics. In several organisms, it is possible to find several copies of genes that codify to NAD synthetases. The plant associative bacterium Herbaspirillum seropedicae has two genes that encode for two different NAD synthetases, NadE1 and NadE2. The nadE1 gene is genetically linked to glnB, encoding the signal transduction protein GlnB. Previously, NadE1 was characterized kinetically, and it shows preference for glutamine. In this work, the preference for glutamine is confirmed by LC/MS assay, as well as the characterization of H. seropedicae NadE2. After cloning, expression and purification of NadE2, gel filtration chromatography analysis suggests that NadE2 is a homodimer. Kinetic characterization of NadE2 indicates a functional glutaminase domain, although the preference for glutamine vs ammonium as nitrogen donor was only modest. This is the first biochemical characterization of a dimeric glutamine-dependent NAD synthetase. Keywords: NAD+, glutaminase, enzyme.

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientador : Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 17/03/2015 Inclui bibliografia Resumo: As proteínas Dps (DNA-binding protein from starved cells) formam uma subfamília particular de ferritinas. Os membros deste grupo possuem uma estrutura tridimensional comum em forma de dodecâmeros esféricos com uma cavidade central oca. Estas proteínas são capazes de armazenar na sua cavidade central ~500 átomos de ferro por dodecâmero. O centro ferro-oxidase é a assinatura mais marcante deste grupo. Ele está localizado na interface entre as subunidades adjacentes e é composto por aminoácidos altamente conservados, onde ocorre a ligação e oxidação do Fe+2 para Fe+3, seguido por sua acomodação no interior da proteína em uma forma não reativa. A proteína Dps de Campylobacter jejuni (CjDps) tem sido relatada por suas inúmeras funções, mas principalmente, por proteger o DNA de radicais hidroxila altamente tóxicos e reativos. A fim de facilitar estudos de caracterização in vitro da proteína CjDps, foi importante estabelecer um protocolo simples e reprodutível para sua purificação. Neste trabalho, foi demonstrado que a temperatura de desnaturação da proteína CjDps nativa (CjDps wt) é de 94,2°C. Esta característica foi utilizada para auxiliar no processo de purificação, estabelecendo-se um protocolo com um prévio tratamento térmico a 80°C seguido de dois passos cromatográficos. Com objetivo de melhor entender o funcionamento da CjDps, também foi utilizada a proteína CjDps H25G/H37G que possui alterações em resíduos conservados localizados no centro ferro-oxidase. Foi observado que a proteína CjDps H25G/H37G tem menor atividade de oxidação de ferro e menor capacidade de ligar metais em relação à proteína selvagem. A proteína CjDps H25G/H37G não apresentou capacidade de ligar DNA nas condições testadas sugerindo que as histidinas H25 e H37 podem ser importantes para ligação ao DNA. Abstract: The Dps (DNA-binding protein from starved cells) proteins form a particular subfamily of ferritins. All members of this group share a commum three-dimensional structure assembled forming spherical dodecamers with a hollow central cavity. These proteins are capable of storing ~500 iron atoms per dodecamer. The ferroxidase center (FOC) is the most remarkable signature of these proteins. The FOC is located at the interface between the subunits and is composed by highly conserved aminoacids that bind Fe+2 and oxidize to Fe+3, followed by the storage of the latter ion into the central cavity of the dodecamer. The Campylobacter jejuni Dps protein is related to various cellular functions, including DNA protection against the highly toxic and reactive hydroxyl radicals. In order to facilitate in vitro characterization studies of CjDps, it is important to stablish a simple and reprodutive protocol for its purification. In this study, it was determined that CjDps has a high melting temperature (94.2°C). This thermal stability was used to facilitate the purification process by the introduction of a thermal treatment at 80°C followed by two chromatographic steps. In order to better understand the function of CjDps, we employed a CjDps H25G/H37G variant, where the conserved histidines at the FOC were substituted to glycines. It was observed that the CjDps H25G/H37G variant had iron oxidation and metal binding activities reduced in comparison to the wild-type protein. This protein variant was not able to bind DNA under the conditions tested suggesting that the histidines H25 and H37 might be important for the CjDps DNA-binding activity.

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 09/11/2015 Inclui referências : f. 137-154 Resumo: As proteínas PII são proteínas transdutoras de sinais, ubíquas em bactérias. Elas estão envolvidas com a regulação do metabolismo de nitrogênio e atuam principalmente por interação direta com proteínas alvo em resposta a ligação dos efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG). A ligação de efetores por PII acarreta em alterações conformacionais que refletem diretamente na interação de PII com proteínas alvo. Em Azospirillum brasilense existem duas proteínas PII denominadas GlnB e GlnZ, relacionadas com a ativação transcricional de genes do metabolismo de nitrogênio e regulação pós traducional da nitrogenase em resposta a alteração dos níveis celulares de amônio e 2-OG. Visto que proteínas PII têm a capacidade de sensoriar 2-OG, um metabólito diretamente relacionado ao nível de carbono e nitrogênio celular, é possível que proteínas PII possam desempenhar um papel regulatório no metabolismo de carbono, porém essa hipótese ainda não foi confirmada. Como a atuação de proteínas PII se dá principalmente por interação proteína-proteína, o objetivo deste trabalho foi detectar novas proteínas ligantes das proteínas PII em A. brasilense, para melhor compreender o papel de PII no metabolismo deste organismo. Foram realizados ensaios de interação entre a proteína GlnZ com cauda 6xHis imobilizada em coluna de afinidade e extratos proteicos de A. brasilense 2812 (glnB-/glnZ-), com variação dos efetores ADP, ATP e 2-OG para interação e eluição das proteínas. As proteínas obtidas foram analisadas por espectrometria de massa e classificadas em grupos funcionais. Dentre as proteínas identificadas destacou-se a proteína BCCP (componente da enzima acetil- CoA carboxilase - ACC) por já ter sido descrita por interagir com PII em Arabidopsis thaliana. O gene accB (BCCP) foi clonado do genoma de A. brasilense FP2 e ensaios in vitro foram realizados para caracterização do complexo PII-BCCP. Foram realizados ensaios de atividade com a enzima ACC de Escherichia coli (EcACC) e com proteínas PII de E. coli (EcGlnB), A. brasilense (AbGlnB) e Synechococcus elongatus (SeGlnB) para verificação do efeito de PII na atividade de ACC. Os dados obtidos sugerem uma função conservada de GlnB na regulação da biossíntese de ácidos graxos através de inibição de ACC, uma vez que as proteínas GlnB diferentes organismos foram capazes de inibir a enzima EcACC. O efeito inibitório de EcGlnB e AbGlnB sobre EcACC foi afetado por altas concentrações de 2-OG e por uridililação de PII. Esses dados, juntamente com a análise de variantes de GlnB, sugerem a participação do loop T de GlnB na interação GlnB-ACC. O modelo proposto para a inibição de ACC por GlnB sugere que isso ocorra em baixos níveis de carbono e altos níveis de nitrogênio, quando a concentração de 2-OG é baixa. Além de BCCP, algumas proteínas encontradas nos ensaios de interação têm alta probabilidade de serem alvos de PII. Dentre elas, outras proteínas do metabolismo de ácidos graxos, e proteínas envolvidas com vias metabólicas diversas, como NAD+ sintetase, proteínas do sistema PTS, Glutamato sintase, RelA e RNAses. Os resultados obtidos indicam que em A. brasilense as proteínas PII podem estar atuando na regulação de processo metabólicos diversos. Abstract: PII proteins are signal transducer proteins, ubiquitous in bacteria. They are involved in nitrogen metabolism regulation and act mostly by direct protein-protein interaction in response to effector binding of ATP, ADP and/or 2-oxoglutarate (2-OG). Effectors binding by PII cause conformational changes, which reflect directly on PII interaction with target proteins. In Azospirillum brasilense there are two PII proteins named GlnB and GlnZ, involved with transcriptional activation of nitrogen metabolism genes and nitrogenase post-translational regulation in response to variation of ammonium and 2-OG cellular levels. Since PII proteins are able of sensing 2-OG, which is directly involved with carbon and nitrogen cellular levels signaling, a role in carbon metabolism by PII proteins have been addressed. As PII act by protein-protein interaction, in this study protein interaction assays were performed using a Histagged GlnZ fusion immobilized on a Ni2+-bound resin and a crude extract of A. brasilense strain 2812 (glnB-/glnZ-), using different levels of the effectors ADP, ATP and 2-OG. Protein that were retained by this affinity chromatography were identified by mass spectrometry and classified into functional groups. One of the identified proteins was BCCP protein (component of acetyl-CoA carboxylase or ACC) which interaction with PII has been described earlier in Arabidopsis thaliana. The accB gene (coding for BCCP) was cloned from A. brasilense FP2 genome allowing in vitro assays to be performed in order to characterize PII-BCCP interaction. Enzymatic assays with Escherichia coli ACC and PII proteins from E. coli, A. brasilense and Synechococcus elongatus were carried out to determine the effect of PII on ACC activity. Our data suggested a conserved role of GlnB regulating fatty acids biosynthesis by inhibiting ACC, since GlnB protein from E. coli, A. brasilense, S. elongatus and A. thaliana produced an inhibitory effect on the acetyl-CoA carboxylase activity. 2-OG levels and the uridylylated state of PII affected the inhibitory effect of EcGlnB and AbGlnB on EcACC. These results and assays using GlnB variants suggest involvement of GlnB T loop in the GlnB-ACC interaction. The proposed model for the inhibition of ACC by GlnB suggests that it occurs in low carbon and high nitrogen levels, when the concentration of 2-OG is low. Besides BCCP, some proteins found in interaction assays have a high probability of being the targets of PII. Among these, other proteins from fatty acids metabolism, and proteins involved in various metabolic pathways, like NAD+ synthetase, PTS system proteins, glutamate synthase, RelA and RNAses. The results indicate that in A. brasilense PII proteins can act in the regulation of many metabolic processes.

Orientador : Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães Cruz Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa: Curitiba, 12/03/2015 Inclui referências Resumo: Nitrogenase é a enzima responsável pelo processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), no qual o gás dinitrogênio é reduzido para amônia por microorganismos. Em algumas bactérias fixadoras de nitrogênio, como Azospirillum brasilense, a atividade da enzima é regulada ao nível pós-traducional através da ADP-ribosilação. A enzima dinitrogenase redutase ADP-ribosil trasnferase (DraT) catalisa a ADP-ribosilação e, assim, inativa a nitrogenase. Por outro lado, a dinitrogenase redutase glicohidrolase (DraG), remove o grupo modificador e deste modo reativa a nitrogenase. Neste trabalho foram identificadas proteínas semelhantes às enzimas DraT e DraG, depositadas no banco de dados GenBank utilizando softwares de Bioinformática, em especial utilizando BlastP e CD-HIT. As análises revelaram que: os homólogos ao gene draT estão restritos a algumas bactérias fixadoras de nitrogênio uma vez que 93 diferentes organismos foram encontrados. Ao contrário, os homólogos ao gene draG são ubíquos na natureza e a análise indicou 1.405 organismos, distribuídos nos três domínios de vida, incluindo os vírus. Finalmente, os resultados mostram que: os homólogos a enzima DraT estão restritos a poucos organismos fixadores de nitrogênio e que os homólogos a enzima DraG são comuns na natureza. Análise de vizinhança gênica sugere que proteínas homólogas a DraG, presentes em organismos não fixadores de nitrogênio, podem estar relacionadas com vias de degradação e/ou biossintese de nucleotídeos e/ou moléculas relacionadas. Palavras-chave: Bioinformática, Fixação Biológica de Nitrogênio, ADP-ribolisalação, Dinitrogenase Redutase ADP-ribosil transferase, Dinitrogenase Redutase Glicohidrolase. Abstract: Nitrogenase is the enzyme responsible for the process of Biological Nitrogen Fixation (BNF), in which dinitrogen gas is reduced to ammonia by microorganisms. In some nitrogen-fixing bacteria such as Azospirillum brasilense, the enzyme activity is regulated at the post-translational level by ADP-ribosylation. The dinitrogenase reductase ADP-ribosyl transferase (DraT) enzyme catalyzes the ADP-ribosylation and then inactivates the nitrogenase. On the other hand, glicohidrolase dinitrogenase reductase (DraG) removes the modifier group and reactivates the nitrogenase. This work identified proteins similar to DraT and DraG enzymes, stored at the GenBank database, using bioinformatics software, especially BlastP and CD-HIT. The analysis revealed: the draT homologous genes are restricted to some nitrogen-fixing bacteria as 93 different organisms were found. In other hand, the draG homologous genes are ubiquitous in nature and the analysis indicated 1,405 organisms distributed into three different life domains, including viruses. Finally, the results show: DraT enzyme homologous are restricted to few nitrogen fixing organisms and, DraG enzyme homologous are common in nature. Gene neighborhood analysis suggests that DraG protein homologous, presented in non nitrogen-fixing organisms, may be related to degradation pathways and/or biosynthesis of nucleotides and/or related molecules. Keywords: Bioinformatics, Biological Nitrogen Fixation, ADP-ribosylation, Dinitrogenase Reductase ADP-ribosiltransferase, Dinitrogenase Reductase ADP-ribosil-hydrolase.

Orientador : Prof. Dr. David A. Mitchell Co-orientador : Prof. Dr. Luciano F. Huergo Co-orientador : Prof. Dr. Marcelo K. Lenzi Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/06/2015 Inclui referências : f. 97-100 Resumo: UTase é uma enzima regulatória em Escherichia coli que realiza a modificação covalente por uridililação das duas proteínas PII encontradas neste organismo, GlnB e GlnK. Além de sofrerem esta modificação covalente, as proteínas PII sofrem modulação alostérica pelos efetores ATP, ADP e 2-OG. O estado de PII, em termos da ligação destes efetores e da uridililação, define a ação de PII frente a seus diversos alvos regulatórios. Modelos matemáticos anteriores para a atividade de UTase não foram consistentes com seu mecanismo, de complexo ternário ordenado, pois não eram capazes de descrever seu perfil de inibição pelos produtos (Jiang et al., 1998). Esta dissertação é dividida em duas partes. Na primeira, é deduzido um conjunto de equações para a atividade de UTase que descrevem corretamente seu perfil de inibição pelos produtos. A limitação deste primeiro modelo, comum aos modelos prévios para UTase, é não descrever como o estado de ligação de PII, em termos de seus efetores, afeta sua uridililação por UTase. Na segunda parte desta dissertação, o primeiro modelo é integrado ao modelo de Rocha et al. (2013) para a ligação de efetores alostéricos à PII, resultando no primeiro modelo da atividade de UTase que leva em conta o estado de ligação de PII. Valores para as constantes do modelo foram obtidas da literatura diretamente (Jiang et al. 1998) ou estimados ajustando o modelo a dados experimentais extraídos (Jiang and Ninfa, 2011), mas conjunto de valores obtido não é consistente. Apesar disso, a abordagem e o conjunto de equações do modelo integrado fazem uma contribuição válida para a modelagem da uridililação de PII em E. coli. Palavras-chave: modelagem matemática, cinética enzimática, Uridililtransferase, Escherichia coli, PII, efetores alostéricos Abstract: UTase is a regulatory enzyme in Escherichia coli that modifies by uridylylation the two PII proteins found in this organism, GlnB and GlnK. Besides uridylylation, these PII proteins also suffer allosteric modulation by the effectors ATP, ADP and 2-oxoglutarate. The state of PII, in terms of the binding of these effectors as well as uridylylation, defines the action of PII towards is various regulatory targets. Previous mathematical models for the activity of UTase were not consistent with its mechanism, which is an ordered ternary complex mechanism, because they were not capable of describing its product inhibition profile (Jiang et al. 1998). This dissertation has two parts. In the first part, a set of equations is deduced for the activity of UTase which correctly describe its product inhibition profile. The limitation of this first model, common to the previous UTase models, is that it does not describe how the ligation state of PII, in terms of its effectors, affects the uridylylation of PII by UTase. In the second part of this dissertation, the first model is integrated with the model number 4 o Rocha et al. (2013) for the binding of allosteric effectors to PII, resulting in the first model of UTase activity to take into account the binding of effectors to PII. Values for the constants of the model were obtained from the literature directly (Jiang et al., 1998) or were estimated by adjusting the model to extracted experimental data from Jiang and Ninfa (2011), but the final set of values is not consistent. Despite that, the approach and set of equations of the integrated model make a valid contribution to the modelling of the uridylylation of PII in E. coli. Key-words: mathematical modelling, enzyme kinetics, Uridylyltransferase, Escherichia coli, PII, allosteric effectors

Orientadora : Profª Drª Emanuel Maltempi de Souza, Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientadores : Dr.Helisson Faoro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2014 Inclui referências Resumo: Celulases apresentam diversas utilidades industriais, desde uso em etapas de polimento de tecidos até produção de biocombustíveis, especialmente de bioetanol de 2ª geração. Na busca por novas celulases, a prospecção em bactérias colonizadoras de plantas pode levar a identificação de enzimas particulares. Este trabalho teve como objetivo identificar, expressar e caracterizar genes de possíveis celulases e hemicelulases presentes no genoma de Azospirillum brasilense, uma bactéria colonizadora de rizosfera de gramíneas. Genes codificando glicosil-hidrolases foram identificados por comparação de sequências. Os genes identificados foram posteriormente clonados e expressos em E. coli. Dos 10 genes codificando prováveis glicosil hidrolases, 4 foram clonados em vetor de expressão. Dois dos plasmídeos obtidos, contendo genes de uma celulase e uma hemicelulase, permitiram superexpressar as proteínas recombinantes em E.coli que foram purificadas com sucesso. Porém, as 4 enzimas não demonstraram atividade de degradação celulolítica ou hemicelulolítica. Com a finalidade de se identificar se realmente há enzimas com atividade de degradação de celulose ou xilana em A. brasilense, a bactéria foi cultivada em meios específicos contendo apenas celulose ou xilana como fonte de carbono. Evidência de crescimento foi observada apenas na presença de xilana, o que leva a crer que há maquinaria ativa capaz de degradar este polímero em A. brasilense estirpe FP2. Palavras-chave: celulases, xilanases, Azospirillum brasilense. Abstract: Cellulases have many industrials uses, from polishing fabrics to biofuel production, especially second generation bioethanol. Searching for new cellulases, bioprospection in plant-root-colonizing bacteria could lead to discover novel enzymes. This study aimed to identify and characterize possible cellulolytic and hemicellulolytic enzymes in genome of Azospirillum brasilense. Sequence comparison was used for identification of glycosyl hydrolases (cellulases and xylanases) in the A. brasilense draft genome. Four out of 10 selected genes were cloned and overexpressed in E. coli. Of these four, a probable cellulase and a hemicellulase were purified successfully. However, the four enzymes had no degradation activity. In order to determine if A. brasilense is capable of degrading cellulose or xylan, the bacterium was grown in media containing either cellulose or xylan as sole carbon source. Only xylan sustained A. brasilense growth, suggesting the presence of active machinery capable for degrading this polymer in A. brasilense strain FP2. Key-words: cellulases, xylanases, Azospirillum brasilense.

Resumo: As proteínas PII são importantes reguladoras do metabolismo de nitrogênio em uma grande variedade de microrganismos. Tanto a estrutura tridimensional quanto a presença de sítios de ligação para os efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG) são altamente conservadas na família das proteínas PII. Neste trabalho, a ligação de efetores alostéricos à GlnB de Escherichia coli foi modelada, considerando pela primeira vez a ligação simultânea de ATP, ADP e 2-OG. Diferentes modelos com relação às mudanças de afinidade durante ligações subsequentes dos nucleotídeos a um mesmo trímero foram construídos e comparados. O modelo escolhido foi capaz de predizer, de maneira precisa, a ligação de efetores à GlnB. Este modelo assume que a ligação da primeira molécula de nucleotídeo à PII causa uma mudança de conformação na proteína, fazendo com que a ligação subsequente de nucleotídeos à PII seja dificultada, além de assumir que ATP e ADP podem se ligar a diferentes subunidades do mesmo trímero. O modelo também incorpora a hipótese de que o 2-OG só pode se ligar à PII depois da ligação de ATP. Em proteobactérias, as proteínas PII também podem sofrer uridililação através da ação da UTase, que é regulada pela concentração de glutamina. Para medir a uridililação de PII e estudar como isto afeta os estados de PII no que diz respeito à combinação de efetores ligados a ela, foi utilizada uma constante de pseudo-equilíbrio, KU, que correlaciona o balanço entres os processos de uridililação e desuridililação de PII e a concentração de glutamina. Através do KU, foi possível predizer a influência exercida pela glutamina nos estados de GlnB. Além disso, já foi sugerido que as PII podem agir como sensores não só da concentração de 2-OG, mas também da razão ATP/ADP. As simulações indicam que as PII podem, de fato, agir como sensores de 2-OG e da razão ATP/ADP e que o modelo pode ser usado para investigar os efeitos de concentrações fisiológicas de ATP, ADP, 2-OG e glutamina nas concentrações dos estados de GlnB que interagem com ATase e NtrB. Em suma, o modelo pode ser usado para simular como esta parte do metabolismo reage de acordo com variações das condições celulares e, portanto, poderá ser usado como uma ferramenta para estudos futuros relativos aos estados de PII e sua interação com proteínas alvo.

Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe e sofre modificação pós-traducional. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADP-ribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela DraT em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela DraG, promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Além das proteínas DraT e DraG, as proteínas PII estão diretamente envolvidas neste processo de desligamento da nitrogenase. Neste trabalho são apresentados resultados referentes ao controle de DraT exercido pelas proteínas PII. Um protocolo alternativo para a purificação de PII nativas foi desenvolvido com a utilização de um tratamente térmico (80°C/15 min) anterior a injeção na coluna. Este tratamento térmico melhorou a homogeneidade da GlnB de A. brasilense de 70 para 99%. A alta estabilidade térmica foi uma característica comum de proteínas PII de várias Proteobactérias. Os valores de Tm utilizando Sypro Orange foram maiores do que 77°C. Experimentos 1H RMN mostraram que a GlnB de A. brasilense foi estável até 70°C. Além disso, experimentos 1H-15N TROSY confirmaram que as amostras de GlnB obtidas com e sem a etapa de tratamento térmico mantiveram a mesma conformação global. A partir destes resultados, o protocolo de purificação de proteínas PII de Proteobactérias foi desenvolvido com a utilização de uma etapa de tratamento térmico de 70°C/15 min anterior a injeção na coluna que promoveu aumento da homogeneidade de 70 para 95%, com maior quantidade de GlnB após cromatografia. Para avaliar o envolvimento de GlnB e GlnZ de A. brasilense na regulação de DraT, a proteína Fe de Azotobacter vinelandii foi utilizada como substrato para atividade in vitro de DraT complexada ou não com as proteínas PII. Nas condições estabelecidas, GlnB foi necessária para a atividade de DraT na presença de Mg-ADP. O efetor de PII 2-oxoglutarato, na presença de Mg-ATP, inibiu a atividade do complexo DraT-GlnB, possivelmente induzindo a dissociação do complexo. A DraT também foi ativada por GlnZ, bem como ambas proteínas uridililadas. Entretanto, uma variante com deleção parcial na volta T não foi capaz de ativar DraT, sugerindo que este seja o sítio de interação entre DraT e GlnB. Estudos cinéticos revelaram que o complexo DraT-GlnB de A. brasilense é, pelo menos, 18 vezes mais eficiente do que DraT purificada de R. rubrum, mas com um valor de Km para NAD+ similar. Finalmente, os resultados mostraram que a ADPribosilação da proteína Fe não afeta o estado eletrônico do seu centro metálico, mas impede a associação da proteína Fe com a MoFe, consequentemente inibindo a transferência de elétrons.

Resumo: A família de proteínas PII é uma das mais amplamente distribuída família de proteínas transdutoras de sinais na natureza. As PII têm sido descritas como sendo proteínas chave na regulação do metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII são capazes de sensoriar sinais de nitrogênio, carbono e energia. As proteínas PII controlam a atividade de diversas proteínas alvo através de interação proteína-proteína. Tais interações são moduladas pelos níveis celulares de glutamina, 2- oxoglutarato e a razão ATP/ADP. Estes metabólitos regulam a capacidade das proteínas PII de alterar sua conformação tridimensional e isto, por sua vez, afeta a habilidade de PII de interagir com suas diferentes proteínas alvo. Devido à capacidade única das proteínas PII de sensoriar importantes metabólitos celulares acredita-se que o número de vias metabólicas reguladas por PII seja bem maior do que as interações já descritas na literatura. Recentemente, em Arabdopisis thaliana, PII foi reconhecida como sendo capaz para interagir com a proteína carreadora de carboxil-biotina (BCCP), uma das subunidade da acetil-CoA carboxilase (ACC), a enzima que catalisa a primeira e irreversível etapa da síntese ácidos graxos. A ACC teve sua atividade inibida em até 50% na presença da proteína PII em A. thaliana. Neste trabalho, foi hipotetisado que a interação PII-BCCP seria um evento conservado também em bactérias. Ensaios in vitro utilizando as proteínas purificadas de Escherichia coli confirmaram essa hipótese. Além disso, foi verificado que a interação entre as proteínas PII e BCCP de E. coli é afetada positivamente por MgATP e negativamente por 2-oxoglutarato, de maneira dose dependente. A interação foi modestamente afetada pela uridililação de PII, no entanto, o estado de biotinilação de BCCP foi fundamental para a interação, ocorrendo somente com a BCCP biotinilada. No presente estudo, foi demonstrado que somente a proteína PII GlnB, mas não a proteína PII GlnK, de E. coli é capaz de formar complexo ternário com as subunidades BCCP e BC da enzima acetil-CoA carboxilase. Além disso, resultados preliminares indicam que GlnB, mas não GlnK, é capaz de inibir parcialmente a atividade da ACC de E. coli in vitro.

Orientadora : Profa. Dra. Cyntia M.T. Fadel Picheth Co-orientadores : Profa. Dra. Leda S. Chubatsu, Prof. Dr. Luciano Huergo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 01/03/2012 Bibliografia: fls. 59-68 Área de concentração: Análises clínicas Resumo: Aeromonas spp. são bactérias capazes de causar uma série de infecções em humanos, variando de diarréia não complicada até meningite e septicemia. Escherichia coli fazem parte da microbiota intestinal de humanos, onde são benéficas para o hospedeiro. No entanto existem estirpes patogênicas capazes de causar infecções intestinais, denominadas E. coli diarreiogênicas (DEC), e extra-intestinais (ExPEC) como as E. coli uropatogênicas (UPEC). O objetivo desse trabalho foi caracterizar estirpes de Aeromonas spp. e E. coli através de Espectrometria de Massa MALDI-TOF. Foram analisadas 99 estirpes de Aeromonas spp. e 143 estirpes de E.coli, incluindo comensais isoladas da microbiota intestinal, patotipos, e estirpes de referência. As bactérias foram cultivadas em ágar MacConkey por 18 horas, a 36±1°C, ao ar. O extrato celular preparado a partir de ~10 colônias foi utilizado para análise. O ácido ?-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/ml) dissolvido em acetonitrila:ácido trifluoroacético 2,5% (1:1) foi utilizado como matriz. Alíquotas dos extratos foram analisadas em espectrômetro de massa MALDI-TOF-MS (Autoflex; Bruker Daltonics) equipado com um laser de nitrogênio (337nm) (Bruker Daltonics). Os íons positivos foram obtidos utilizando uma aceleração de 20Hz no modo linear. Os espectros resultaram da soma dos íons obtidos de 100 tiros do laser em 10 posições diferentes da amostra. A aquisição dos espectros foi realizada de forma manual com uma resolução mínima de 600 arb e máxima de 1500 arb e analisados em uma faixa de relação carga/massa (m/z) de 3.000 a 20.000 Da.O processamento dos espectros foi realizado utilizando o software Flex Analysis v. 3.0 (Bruker Daltonics).Para E. coli os ensaios foram feitos em triplicata, e para Aeromonas spp em triplicata e em duas datas diferentes. Os espectros gerados foram analisados com o software Speclust gerando a lista de picos em comum e um dendrograma. Os picos m/z 4259, 5051, 6304 foram detectados em todas as estirpes de Aeromonas analisadas, o que indica que podem ser marcadores para bactérias deste gênero. O pico m/z 9180 foi observado em Aeromonas spp e E. coli, mas é importante para a identificação de Aeromonas. A espectrometria de massa MALDI-TOF foi capaz de diferenciar as espécies de Aeromonas. Dois picos, m/z 5380 e 7271, foram encontrados em todas as estirpes de E. coli analisadas. Os picos m/z 4364, 5095, 6253, 6314, 9060 e 9532 foram observados em 92 a 99% das E. coli. Estes picos são importantes para identificar E. coli. Foi possível diferenciar o grupo das E. coli comensais e das UPEC das demais categorias dessa bactéria. A metodologia de MALDI-TOF tem capacidade para distinguir as bactérias estudadas, no entanto é necessário otimizar a metodologia para distinguir maior número dos grupos de E. coli. Abstract: Aeromonas spp are bacteria associated with human infections varying from diarrhea to meningitis and septicemia. Escherichia coli are part of intestinal microbiota of humans where are beneficial to host. However there are several pathogenic strains able to cause intestinal infections, called diarrheagenic E. coli (DEC), and extra-intestinal infections (ExPEC), as uropathogenic E. coli (UPEC). The aim of this work was to characterize Aeromonas and E. coli strains using MALDI-TOF Mass Spectrometry. We analyzed 99 Aeromonas strains, and a total of 143 E. coli including commensal, pathotypes and reference strains. Bacteria were grown overnight on MacConkey agar at 36±1°C, under air. Cells extracts were prepares with ~10 colonies. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (10mg/ml) in acetonitrile:2,5% trifluoroacetic acid (1:1) was used as matrix. Aliquots of extracts were analyzed in a MALDI-TOF mass spectrometer (Autoflex, Bruker Daltonics) equipped with a nitrogen laser (337 nm). The positive ions were obtained with a 20 Hz acceleration in linear mode. The spectra were obtained from the sum of 100 laser shots in 10 different positions of sample. Acquisition of spectra was performed manually with a minimum resolution of 600 and maximum of 1500 arb, in a range of 3000 - 20000 Da. Processing of spectra was done with Flex Analysis v.3 (Bruker Daltonics). For E.coli tests were realized in triplicates, and for Aeromonas spp in triplicates and at 2 different days. The spectra were analyzed with software SPECLUST which generated lists of common peaks and a dendrogram. Peaks m/z 4259, 5051, 6304 were found in all Aeromonas strains, indicating that may be markers for the genera. Peak m/z 9180 was found in Aeromonas spp and also in E. coli, but is also important to identification of Aeromonas. MALDI-TOF mass spectrometry allowed to distinguish Aeromonas species. In E. coli, peaks m/z 5380 and 7271 were found in all strains. Peaks m/z 4364, 5095, 6253, 6314, 9060 and 9532 were detected in 92 to 99% of E. coli. All these peaks are important to identify E. coli strains. In addition, commensal E. coli strains and UPEC strains were distinguished from other categories of these bacteria. The MALDI-TOF metodology has the ability to distinguish the bacteria studied, however it should be optimized to achieve this objective.