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Agradecimentos: This research was supported by the São Paulo State Research Foundation (FAPESP, Brazil; grants no. 2015/10356-2, 2018/07888-0) and the Brazilian National Council for Research and Development (CNPq, grant no. 421299/2018-5). The funders had no role in study design, data collection, and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. D.S.S. received a fellowship from FAPESP (grant no. 2019/20833-3). M.A.R. was recipient of a fellowship from the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brazil, code 001). M.L.S.M. received a fellowship from CNPq (grant no. 304797/2019-7) Abstract: Valproic acid in association with sodium valproate (VPA) is an important anticonvulsant drug used for decades to treat neurological disorders. VPA also acts as an epigenetic modulator by inhibiting histone deacetylases, permitting histone acetylation, affecting the DNA and histone methylation status and gene expression, and inducing chromatin remodeling. Insects represent an important animal model for studies in several areas of science. Their high phenotypic plasticity makes them alternative models for epigenetic studies. This brief review emphasizes recent reports on insect epigenetics and the contribution of studies on the VPA action in insects, including effects on epigenetic markers, extending the pharmacological understanding of the potential of this drug, and demonstrating the usefulness of insects as an alternative animal model to drug studies Resumo: O ácido valproico associado ao valproato de sódio (VPA) é um importante agente anticonvulsivo usado há décadas no tratamento de distúrbios neurológicos. Também atua como um modulador epigenético ao inibir as desacetilases de histonas, permitindo a acetilaçao de histonas, afetando o estado de metilação do DNA e das histonas e a expressão gênica, e induzindo a remodelação da cromatina. Os insetos representam um importante modelo animal para estudos em diversas áreas da ciência e dada a sua alta plasticidade fenotípica os torna modelos alternativos para estudos epigenéticos e de resposta a agentes moduladores epigenéticos. Esta breve revisão enfatiza relatos recentes sobre epigenética em insetos e a contribuição de estudos sobre a ação do VPA nesse grupo animal, incluindo efeitos sobre marcadores epigenéticos, estendendo a compreensão farmacológica do potencial desta droga e demonstrando a utilidade dos insetos como um modelo animal alternativo para estudos de drogas FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

La sepsis es un síndrome complejo que provoca una respuesta inmunitaria exacerbada como resultado a una infección, lo que puede causar disfunción orgánica y, en última instancia, la muerte. La sepsis puede avanzar a shock séptico (SS), caracterizado por una disfunción orgánica aguda que puede provocar una insuficiencia circulatoria y metabólica grave, aumentando el riesgo de mortalidad. Los pacientes con sepsis o SS ingresados durante al menos 7 días en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) que presentan disfunción orgánica y necesidad de ventilación mecánica se clasifican como enfermos críticos crónicos (ECC), los cuales, si están ingresados al menos 14 días y cumplen una serie de características inmunológicas y metabólicas específicas, se clasifican como pacientes con PICS (Síndrome de inflamación persistente, activación del catabolismo e inmunosupresión). Por lo tanto, la detección temprana de la sepsis es fundamental para el manejo de la enfermedad, y comprender los mecanismos moleculares que llevan a los diferentes fenotipos clínicos ayudará a predecir su evolución. La identificación de nuevos biomarcadores permite establecer protocolos de seguimiento adecuados para estos pacientes, con el objetivo de reducir la elevada mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes sépticos que sobreviven a una sepsis. En esta tesis doctoral se caracterizó, en un modelo de células endoteliales humanas, cómo afectan las histonas citrulinadas. Estas histonas son liberadas al torrente sanguíneo mediante procesos de la inmunidad innata, como la ETosis, siendo el tejido endotelial el primero en entrar en contacto con las histonas. Así mismo, se correlacionaron los niveles plasmáticos de histonas circulantes y citrulinadas con las características clínicas de los pacientes con sepsis y SS supervivientes y no supervivientes. Así, se identificó que las histonas citrulinadas no causan daño a las células endoteliales, aunque sí son capaces de activar respuestas inmunitarias mediadas por el endotelio, facilitando la respuesta inmune. Además, en los pacientes con SS, observamos que las histonas circulantes se relacionaron con factores de coagulación e inmunomodulación, mientras que las histonas circulantes citrulinadas correlacionaron negativamente con los eventos de coagulación. Por otro lado, se caracterizó cómo están involucrados los cambios de expresión de microRNAs y los patrones de metilación del DNA en la evolución de los pacientes con sepsis, ECC y PICS. Se observó que los niveles circulantes del miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p y miR-133a, así como los cambios de metilación de los genes IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, TNFSF4 a tiempos iniciales indican qué pacientes evolucionarán a estos subgrupos clínicos. Así mismo, los microRNAs miR-150-5p y miRNA-335-5p sugieren una inflamación persistente, mientras que los microRNAs miR-27b y miR-4512, junto a los cambios de metilación de los genes PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 podrían ayudar a discernir qué pacientes sufrirán una inmunosupresión a largo plazo. Sepsis is a complex syndrome that causes an exaggerated immune response as a result of infection, which can lead to organ dysfunction and ultimately death. In some cases, sepsis can progress to septic shock, which is characterized by acute organ dysfunction that can result in severe circulatory and metabolic failure, increasing the risk of mortality. Patients with sepsis or septic shock who are admitted to the Intensive Care Unit (ICU) and experience organic dysfunction and need for mechanical ventilation for at least 7 days are classified as chronically critically ill (CCI). If they are hospitalized for at least 14 days and meet a series of specific immunological and metabolic characteristics, they are classified as patients with PICS (Persistent Inflammation, Activation of Catabolism, and Immunosuppression Syndrome). Therefore, early detection of sepsis is essential for disease management, and understanding which molecular and epigenetic mechanisms are altered in each group of patients can help predict their evolution. The identification of new biomarkers will allow the establishment of adequate follow-up protocols for these patients to reduce high mortality and improve the quality of life of septic patients who survive sepsis. In this doctoral thesis, the effect of citrullinated histones was characterized in a model of human endothelial cells. These histones are released into the bloodstream by innate immunity processes, such as ETosis (extracellular traps), and the endothelial tissue is the first to come into contact with the histones. Likewise, circulating and citrullinated histone levels were analyzed in plasma samples and correlated with the clinical characteristics of surviving and non-surviving patients with sepsis and SS. Thanks to this, we identified that citrullinated histones do not cause damage to endothelial cells, especially in comparison with those histones without induced modifications, and are capable of activating endothelium-mediated immune responses. In addition, we observed that in patients, histones were related to coagulation and immunomodulation factors, while citrullinated histones were negatively correlated with coagulation events. On the other hand, we characterized which microRNA expression changes and DNA methylation patterns are involved in the evolution of septic patients, CCI, and PICS. Thanks to this, we observed that the analysis of miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p, and miR-133a, or the gene methylation changes of IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, and TNFSF4 will allow us to predict at early stages which patients will evolve into these clinical subgroups. Likewise, miR-150-5p and miRNA-335-5p will help discern which patients will present persistent inflammation, while miR-27b and miR-4512, together with the methylation changes of the PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 genes, would help discern whether patients who develop PICS will suffer long-term immunosuppression.

Classical Genetics and Molecular Biology are disciplines of great importance within the curriculum of Higher Education courses linked to Biological Sciences. Because it contains many abstract terms and mechanisms, most students report some difficulty in effectively understanding the topics covered. In this way, many authors highlight the importance of using didactic models to facilitate the learning of complex themes, making classes more attractive, in addition to promoting the inclusion of students with special needs, such as those with visual impairments and deficits in Warning. The didactic model created uses simple and low-cost materials (such as styrofoam balls, biscuit dough, cords and ropes), which allows the teacher to work on the topic of Compaction levels of eukaryotic genetic material, in addition to the approach of the theme of Epigenetics (chromatin remodeling mechanisms), which is much discussed nowadays. We believe that the use of the proposed didactic model can positively impact students learning, enabling a better contextualization and visualization of the aforementioned topics, applied in the disciplines of Classical Genetics and Molecular Biology, in Higher Education. La Genética Clásica y la Biología Molecular son asignaturas de gran importancia dentro del plan de estudios de las carreras de Educación Superior relacionadas con las Ciencias Biológicas. Debido a que contienen muchos términos y mecanismos abstractos, la mayoría de los estudiantes afirman tener cierta dificultad para comprender efectivamente los temas tratados. De esta manera, muchos autores destacan la importancia del uso de modelos didácticos con el fin de facilitar el aprendizaje de temas complejos, haciendo las clases más atractivas, además de promover la inclusión de alumnos con necesidades especiales como deficiencias visuales y déficit de atención. El modelo didáctico creado, utiliza materiales sencillos y de bajo coste (como bolas de poliestireno, masa de galletas, cuerdas y cordeles), lo que permite al profesor trabajar el tema de los Niveles de compactación del material genético eucariota, además del abordaje del tema de la Epigenética (mecanismos de remodelación de la cromatina), siendo éste, muy discutido en la actualidad. Creemos que el uso del modelo didáctico propuesto puede impactar positivamente en el aprendizaje de los estudiantes, permitiendo una mejor contextualización y visualización de los temas antes mencionados, aplicados en las disciplinas de Genética Clásica y Biología Molecular en la Educación Superior. A Genética Clássica e a Biologia Molecular, são disciplinas de grande importância dentro do currículo de cursos de Ensino Superior ligados a Ciências Biológicas. Por conter muitos termos e mecanismos abstratos, grande parte dos discentes relatam certa dificuldade para a efetiva compreensão dos tópicos abordados. Dessa maneira, muitos autores destacam a importância do uso de modelos didáticos com a finalidade de facilitar a aprendizagem de temas complexos, tornando as aulas mais atrativas, além de promover a inclusão de alunos com necessidades especiais como portadores de deficiências visuais e déficit de atenção. O modelo didático criado, utiliza-se de materiais simples e de baixo custo (como bolas de isopor, massa de biscuit, cordões e cordas), que permite ao docente trabalhar o tópico dos Niveis de compactação do material genético eucariótico, além da abordagem do tema de Epigenética (mecanismos de remodelamento da cromatina), sendo este, muito discutido nos dias atuais. Acreditamos que, o uso do modelo didático proposto poderá impactar positivamente a aprendizagem dos discentes, possibilitando uma melhor contextualização e visualização dos tópicos supra-citados, aplicado nas disciplinas de Genética Clássica e Biologia Molecular, no Ensino Superior.

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2022. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O carcinoma de células escamosas de cavidade oral é oriundo de desregulação celular causada por alterações genéticas e epigenéticas. Das diversas formas de alteração fenotípica sem mudanças na sequência de DNA, esta pesquisa se dedicou a verificar as modificações póstraducionais das histonas provocadas pelas enzimas metiltransferases Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 1 (EHMT1 - GLP) e Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 2 (EHMT2- G9a) em câncer oral. Em geral, as metiltransferases tem múltiplos papeis moleculares, dentre eles: metilar resíduos de lisina (K) das histonas, permitindo a transcrição gênica (H3K4me, H3K36me, H3K79me) ou levando ao silenciamento gênico, (H3K9me, H3K24me e H4K20me). Além disso, podem metilar proteínas não histonas como a p53, guardiã do genoma humano. Essas alterações proteicas afetam a organização da cromatina e consequentemente a regulação gênica, estando associadas a processos fisiológicos ou a processos patológicos. A superexpressão de EHMT1 e EHMT2 tem sido atribuída a eventos promotores de câncer como: desregulação transcricional, proliferação celular, adaptação metabólica do microambiente tumoral, transição de células epiteliais com aquisição de características mesenquimais. Esses processos são dinâmicos e permitem ganho de características como: motilidade, invasividade, resistência à apoptose e a fármacos. Esta pesquisa objetivou analisar o perfil de expressão gênica das metiltransferases EHMT1 e EHMT2 em carcinomas de células escamosas orais por PCR quantitativa. Obtido o perfil de expressão, foram feitas análises com as características clínicas dos pacientes, sendo elas: idade, gênero, estadiamento tumoral, metástases e recidiva. A fim de complementar os achados laboratoriais, foi realizada análise in silico para verificar o perfil de expressão gênica de EHMT1 e EHMT2 em câncer oral em dados disponíveis na plataforma online OncoMine. Os resultados da qPCR detectaram hipoexpressão de EHMT1 e EHMT2 nas amostras tumorais em relação ao grupo controle, com significância estatística para o primeiro gene. Avaliando a expressão gênica de EHMT1 e EHMT2 de acordo com as características clínicas e na análise de contingência, utilizando o teste de Fischer, não foi detectada significância estatística, embora na análise descritiva dos dados brutos, observou-se algumas associações esperadas, de acordo com a literatura, resultados estes que necessitam de confirmação. Na análise in silico com dados de estudos distintos, foi constatada hipoexpressão de EHMT2 nas amostras tumorais em relação às amostras normais, assim como também foi encontrada, em outro estudo, hiperexpressão nas amostras tumorais tanto de EHMT1 como de EHMT2. Desta forma, é possível inferir que a expressão de EHMT1 e EHMT2 parece variar e depender de contextos celulares, sítios anatômicos e populações estudadas, portanto o significado clínico-patológico dessas enzimas em carcinoma de células escamosas orais ainda não está totalmente esclarecido, sendo necessários estudos complementares. Oral cavity squamous cell carcinoma arises from cellular deregulation caused by genetic and epigenetic changes. Among the different forms of phenotypic alteration without changes in the DNA sequence, this research was dedicated to verifying the post-translational modifications of histones caused by the methyltransferase enzymes Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 1 (EHMT1 - GLP) and Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 2 (EHMT2- G9a) in oral cancer. In general, methyltransferases have multiple molecular roles, including methylating lysine (K) residues of histones, allowing gene transcription (H3K4me, H3K36me, H3K79me) or leading to gene silencing (H3K9me, H3K24me and H4K20me). In addition, they can methylate non-histone proteins such as p53, guardian of the human genome. These protein alterations affect chromatin organization and, consequently, gene regulation, being associated with physiological or pathological processes. The overexpression of EHMT1 and EHMT2 has been associated to cancer-promoting events such as: transcriptional dysregulation, cell proliferation, metabolic adaptation of the tumor microenvironment, transition of epithelial cells with acquisition of mesenchymal characteristics. These processes are dynamic, allowing the gain of characteristics such as: motility, invasiveness, apoptosis and drug resistance. This research aimed to analyze the gene expression profile of methyltransferases EHMT1 and EHMT2 in oral squamous cell carcinomas by quantitative PCR. Besides the expression profile, analyses with the clinical characteristics of patients, namely: age, gender, tumor staging, metastases and recurrence were performed. To complement the experimental findings, in silico analysis was performed to verify gene expression profile of EHMT1 and EHMT2 in oral cancer in data available at the OncoMine online platform. The qPCR results detected EHMT1 and EHMT2 down expression in tumor samples compared to the control group, with statistical significance for the firs t gene. Evaluating EHMT1 and EHMT2 gene expression according to clinical characteristics and with contingency analysis, using Fischer's test, no statistical significance was found, although the descriptive analysis of the data revealed some expected associations, according to the literature, which still need confirmation. In the in silico analysis with data from different studies, it was found down expression of EHMT2 in tumor samples compared to normal samples, as well as overexpression in tumor samples of both EHMT1 and EHMT2. Therefore, it is possible to infer that the expression of EHMT1 and EHMT2 seems to vary and depend on cellular contexts, anatomical sites and populations studied, so the clinicopathological significance of these enzymes in oral squamous cell carcinoma is still not fully understood and further studies are necessary.

The stability and function of eukaryotic genomes is closely linked to histones and to chromatin structure. The state of the chromatin not only affects the probability of DNA to undergo damage but also DNA repair. DNA damage can result in genetic alterations and subsequent development of cancer and other genetic diseases. Here, we identified two mutations in conserved residues of histone H3 and histone H4 (H3E73Q and H4E53A) that increase recombinogenic DNA damage. Our results suggest that the accumulation of DNA damage in these histone mutants is largely independent on transcription and might arise as a consequence of problems occurring during DNA replication. This study uncovers the relevance of H3E73 and H4E53 residues in the protection of genome integrity., Research was supported by the European Research Council (ERC2014 AdG669898 TARLOOP), the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (BFU2016-75058-P), the Foundation Vencer el Cáncer and the European Union (FEDER). P. O. was supported by a predoctoral training grant from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and B.G.-G. by the Span-ish Association Against Cancer (AECC).

Post-translational histone modifications and chromatin remodelling play a critical role controlling the integrity of the genome. Here, we identify histone lysine demethylase PHF2 as a novel regulator of the DNA damage response by regulating DNA damage-induced focus formation of 53BP1 and BRCA1, critical factors in the pathway choice for DNA double strand break repair. PHF2 knockdown leads to impaired BRCA1 focus formation and delays the resolution of 53BP1 foci. Moreover, irradiation-induced RPA phosphorylation and focus formation, as well as localization of CtIP, required for DNA end resection, to sites of DNA lesions are affected by depletion of PHF2. These results are indicative of a defective resection of double strand breaks and thereby an impaired homologous recombination upon PHF2 depletion. In accordance with these data, Rad51 focus formation and homology-directed double strand break repair is inhibited in cells depleted for PHF2. Importantly, we demonstrate that PHF2 knockdown decreases CtIP and BRCA1 protein and mRNA levels, an effect that is dependent on the demethylase activity of PHF2. Furthermore, PHF2-depleted cells display genome instability and are mildly sensitive to the inhibition of PARP. Together these results demonstrate that PHF2 promotes DNA repair by homologous recombination by controlling CtIP-dependent resection of double strand breaks., Ministerio de Ciencia e Innovación [SAF2016-80626-R to V.A.J.S./R.F., SAF2016-74855-P to P.H. and BFU2017-90889-REDT to V.A.J.S./P.H.], co-funded by EU-ERDF; Fundación Canaria Instituto de Investigación Sanitaria de Canarias (FIISC) [PIFUN16/18 to V.A.J.S.]; I.A.V. is supported by a predoctoral fellowship from the Gobierno de Canarias; J.R.H.F. by the Asociación Española Contra el Cáncer; H.v.A. by an ERC Consolidator grant from the European Research Council and a VICI grant from the Netherlands Organisation for Scientific Research. Funding for open access charge: FIISC [PIFUN16/18]; Ministerio de Ciencia e Innovación [SAF2016-80626-R].

Resumen El n��cleo de las c��lulas eucariotas es un organelo voluminoso que esta delimitado por una envoltura nuclear. Dentro del n��cleo se encuentra el ADN gen��mico o genoma de la c��lula, el cual se encuentra repartido en los cromosomas lineales. La matriz semifluida del n��cleo (nucleoplasma) rodeado por la envoltura nuclear, contiene la cromatina, el cual es el material gen��tico m��s todas las mol��culas que se encuentran relacionadas con su organizaci��n, fundamentalmente histonas. El ADN no se encuentra libre en el nucleoplasma sino asociado a prote��nas como las histonas y a otras prote��nas implicadas en su procesamiento (prote��nas de andamiaje), formando en conjunto la cromatina. Las histonas son prote��nas asociadas al ADN que determinan su organizaci��n. El ADN se organiza estructuralmente en cromosomas. A nivel funcional se organiza en genes, que son piezas de ADN que generan caracter��sticas f��sicas espec��ficas. Para poder entender mejor como es la actividad de una macromol��cula compleja, como lo es el ADN, es necesario conocer como se integra dicha mol��cula y las estructuras en las que se puede organizar [1-4]., {"references":["[1]. Benjamin Lewin. (2008). Genes Ix (9th ed.). McGraw+Hill Interamericana Editores.","[2]. Karp Gerald. (2010). Biología celular y molecular (6th ed.). McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V.","[3]. Olby, R. (1974). The Path to the Double Helix. MacIvl..illan, London.","[4[. Ridgway P, Maison C, Almouzni G . Chromatin. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. April 2002."]}

Resumen El núcleo de las células eucariotas es un organelo voluminoso que esta delimitado por una envoltura nuclear. Dentro del núcleo se encuentra el ADN genómico o genoma de la célula, el cual se encuentra repartido en los cromosomas lineales. La matriz semifluida del núcleo (nucleoplasma) rodeado por la envoltura nuclear, contiene la cromatina, el cual es el material genético más todas las moléculas que se encuentran relacionadas con su organización, fundamentalmente histonas. El ADN no se encuentra libre en el nucleoplasma sino asociado a proteínas como las histonas y a otras proteínas implicadas en su procesamiento (proteínas de andamiaje), formando en conjunto la cromatina. Las histonas son proteínas asociadas al ADN que determinan su organización. El ADN se organiza estructuralmente en cromosomas. A nivel funcional se organiza en genes, que son piezas de ADN que generan características físicas específicas. Para poder entender mejor como es la actividad de una macromolécula compleja, como lo es el ADN, es necesario conocer como se integra dicha molécula y las estructuras en las que se puede organizar [1-4].

Agradecimentos: This work was supported by the São Paulo state Research Foundation (FAPESP, Brazil; grant no. 2015/10356-2) and the Brazilian National Council for Research and Development (CNPq; grants no. 304668/2014-1 and 421299/2018-5). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish or preparation of the manuscript. The authors thank Mr. E.H.M. dos Anjos for assistance with formatting of the figures Abstract: Valproic acid/sodium valproate (VPA), a drug primarily used for treatment of seizure disorders, is recognized as an efficient epigenetic agent, inducing inhibition of histone deacetylases, promoting changes in the methylation status of DNA and histones, and affecting chromatin structure. In addition to these epigenetic effects, molecular affinity of VPA for histone H1 has been proposed based on thermal denaturation, fluorescence spectroscopy and circular dichroism assays. VPA interactions with DNA and histones using Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy and high-performance polarization microscopy that are not related to the effects promoted on epigenetic markers have been recently explored. Data in this article provide supplementary information for a better understanding of the resulting FTIR spectra for mixtures of VPA and histones H1 and H3 and of the potential effect of VPA directly on histones that has been reported in the literature FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

[eng] The histone variant macroH2A is the only structural chromatin component containing a macrodomain. In vertebrates, two genes and one event of alternative splicing give rise to three macroH2A proteins that differ in their macrodomains. As histone variants, macroH2A proteins contribute to the protein content of chromatin (Buschbeck & Hake, 2017). On the other hand, the capacity to bind ADP-ribose via its macrodomain is limited to the splice variant macroH2A1.1 (Kustatscher et al., 2005). As a consequence, macroH2A1.1, but not macroH2A1.2 or macroH2A2, binds auto-ADP-ribosylated PARP1 (Timinszky et al., 2009). Since the alternative splicing of the exon 5 affects the binding pocket of macroH2A1.2, as a consequence it cannot bind ADP-ribose (Kustatscher et al., 2005) and it remains an orphan protein. In the first study presented here, we investigated the evolution of the macrodomain-containing histone variant macroH2A1.1, an integral chromatin component that limits nuclear NAD+ consumption by inhibiting PARP1. We found that macroH2A originated in pre-metazoan protists. The crystal structure of the macroH2A macrodomain from the protist Capsaspora allowed us to identify highly conserved principles of ligand binding and pinpoint key residue substitutions, selected for during the evolution of the vertebrate stem lineage. Metabolic characterization of the Capsaspora life cycle indicated that the metabolic function of macroH2A was associated with non-proliferative stages. Taken together, we provide insight into the evolution of a chromatin element involved in compartmental NAD regulation, relevant for understanding of its metabolism and potential therapeutic applications. In the second study, we described the structurally relevant elements for ligand binding by the orphan macroH2A isoform, macroH2A1.2. Furthermore, using targeted and untargeted approaches on the verge of in silico, in vitro and in cellulo approaches, we detected phospholipids as the first putative physiological ligands of macroH2A1.2. We further observed a behavioral phenotype in macroH2A1.2 knock-out mice and report for the first time the upregulation of macroH2A1.2 expression in the differentiated cells, more specifically in differentiated neurons. We postulate that macroH2A1.2 might have a binding-pocket related role in the regulation of behavior, similarly to what was observed for PPARα in hypothalamus, whereby it regulates animal behavior depending on the binding of its phospholipid ligands (Chakravarthy et al., 2007; Roy et al., 2016).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The actinic cheilitis (AC) and lip squamous cell carcinoma (LSCC) are caused by prolonged exposure to the ultraviolet radiation in sunlight. Histone modifications are epigenetic deregulation that are associated with diverse cellular processes such as, for example, transcription, replication, repair, and present in pathological processes such as cancer. The aim of this study was to investigate the expression of antigens related to histone modifications in AC and LSCC compared to normal tissue by immunohistochemistry. Were evaluated 33 samples of AC, 27 cases of LSCC and nine cases of normal mucosa lip, diagnosed in the Pathology Laboratory of the School of Dentistry, Federal University of Uberlandia, between 1978 and 2013. After histopathological review, immunohistochemical was performed with antibodies against H3K36me3, H3K9ac, H4K12ac and H3S10ph. The proportion of reactive cells and the intensity were evaluated through the Quickscore index. There was a significant reduction (p

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Several functions have been attributed to the addition of glycidyl radicals in nuclear proteins. It is believed that the structural and functional changes through which they pass along the neurons of aging are associated with different patterns of protein glycosylation in the nucleus of these cells. Previous data refer that the glycosylation of nuclear proteins, mainly histones, plays an important role in epigenetic control of nuclear functions. In this context, the changes in chromatin structure epigenetic changes associates with type O-glycosylation depend, for example, the chromatin remodeling complex recruitment necessary for regulating gene transcription, with this type of control over the aging-related rise neurodegenerative diseases such as Alzheimer s disease and others. Thus, to understand the association between changes in chromatin structure due to O-glycosylation of histones and aging is critical to the development of treatments that can improve the quality of life of the population. For this purpose, it propose to study the in situ distribution of two types of sugar residues attached to proteins, as well as histones are glycosylated and if there differential glycosylation of the proteins along with aging. To this end, isolated neuronal nuclei were underwent cytochemical analysis, and biochemical assays to identify and quantify reactive glycidiy markers to ConA and WGA lectins. Results indicate that glycoproteins containing glucose / mannose and Nacetylglucosamine have differences in their pattern of nuclear distribuition, which depend on the animal age, indicating different functions depending on the composition glicidic of these glycoproteins. Our data show that all canonical (H2A, H2B, H3 e H4) in neurons are glycosylated, with different patterns are observed for each different ages. It is believed that these changes are related to structural changes in chromatin observed during the aging period, which may have a fundamental role in altered patterns of gene expression observed with increasing age. Diversas funções têm sido atribuídas à adição de radicais glicídicos em proteínas nucleares. Acredita-se que as mudanças estruturais e funcionais pelas quais passam os neurônios ao longo do envelhecimento estejam associadas com diferentes padrões de glicosilação protéica no núcleo dessas células. Estudos anteriores remetem que a glicosilação de proteínas nucleares, principalmente histonas, tem um importante papel epigenético no controle das funções nucleares. Nesse contexto, as alterações na estrutura da cromatina associadas com modificações epigenéticas tipo O-glicosilação dependem, por exemplo, do recrutamento de complexos de remodelamento da cromatina necessários à regulação da transcrição gênica, estando esse tipo de controle, ao longo do envelhecimento relacionado ao surgimento de doenças neurodegenerativas, como o mal de Alzheimer e outras. Dessa forma, entender a associação entre as mudanças da estrutura cromatínica devido à O-glicosilação de histonas e o envelhecimento é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos que possam melhorar a qualidade de vida da população. Nesse sentido, este trabalho objetivou estudar a distribuição in situ de dois tipos de resíduos de açúcar ligados a proteínas, bem como se as histonas são glicosiladas e se há glicosilação diferencial dessas proteínas ao longo do envelhecimento em núcleos de neurônios corticais de camundongos. Para tanto, núcleos isolados de neurônios foram submetidos à análise citoquímica e ensaios bioquímicos para identificação e quantificação de marcadores glicídicos reativos às lectinas ConA e WGA. Os resultados demonstram que glicoproteínas contendo glicose/manose ou N-acetilglicosamina possuem diferenças no seu padrão de distribuição nuclear, que independem da idade do animal, evidenciando funções diferenciadas dependendo da composição glicídica dessas glicoproteínas. Adicionalmente, os dados indicam que todas as histonas canônicas (H2A, H2B, H3 e H4) são glicosiladas em neurônios, sendo que padrões diferenciados de marcação foram observados em cada uma delas para as diferentes idades. Acredita-se que tais alterações estejam relacionadas com as mudanças estruturais observadas na cromatina ao longo do envelhecimento, as quais podem ter um papel fundamental nos padrões alterados de expressão gênica observados com o avanço da idade. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

34 pags., 8 figs. (+SI), The Akirin family of transcription cofactors are involved throughout the metazoan in the regulation of different biological processes (BPs) such as immunity, interdigital regression, muscle and neural development. Akirin do not have catalytic or DNA-binding capability and exert its regulatory function primarily through interacting proteins such as transcription factors, chromatin remodelers, and RNA-associated proteins. In the present study, we focused on the human Akirin2 regulome and interactome in neutrophil-like model human Caucasian promyelocytic leukemia HL60 cells. Our hypothesis is that metazoan evolved to have Akirin2 functional complements and different Akirin2-mediated mechanisms for the regulation of gene expression. To address this hypothesis, experiments were conducted using transcriptomics, proteomics and systems biology approaches in akirin2 knockdown and wildtype (WT) HL60 cells to characterize Akirin2 gene/protein targets, functional complements and to provide evidence of different mechanisms that may be involved in Akirin2-mediated regulation of gene expression. The results revealed Akirin2 gene/protein targets in multiple BPs with higher representation of immunity and identified immune response genes as candidate Akirin2 functional complements. In addition to linking chromatin remodelers with transcriptional activation, Akirin2 also interacts with histone H3.1 for regulation of gene expression., This work was supported by the Ministerio de Economıa, Industria y Competitividad (Spain) [grant number BFU2016-79892-P]; the Predoctoral Fellowship of the UCLM (to Sara Artigas-Jeronimo); the University of Castilla La Mancha, Spain (to Margarita ´ Villar); and the Fondo Europeo de Desarrollo Regional, FEDER, EU (to Margarita Villar).

Orientadores: Marco Aurélio Ramirez Vinolo, Mariana Portovedo de Oliveira Araújo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A interação entre componentes da microbiota intestinal e as células epiteliais intestinais é essencial para a manutenção da homeostase. Essa interação ocorre por diferentes mecanismos, incluindo os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) (acetato [C2], propionato [C3] e butirato [C4]) e outros metabólitos microbianos que modulam a expressão gênica nessas células via modificações pós-traducionais de histonas (MPTHs), incluindo a acetilação e a crotonilação. Em nosso estudo analisamos o perfil de acetilação e crotonilação de histonas em células do cólon obtidas de animais tratados com dextran sulfato de sódio (DSS, modelo de colite) e indivíduos com doença de Crohn em atividade. No modelo experimental observamos aumento na acetilação e crotonilação de H3 e H4 no terceiro dia após administração de DSS. Com esse tempo de tratamento, a estrutura das criptas, quantidade de infiltrado inflamatório e concentração de citocinas ainda não é diferente em relação a condição controle. No sétimo dia, quando se observa inflamação exacerbada e redução drástica da concentração colônica de AGCCs, há diminuição em H3K18cr e H4K8ac, enquanto as demais MPTHs apresentam níveis semelhantes ao controle. Um padrão parecido ocorre nas amostras de pacientes com a doença de Crohn, nas quais observamos a diminuição ou níveis próximos das acilações em regiões inflamadas do cólon comparados aos pacientes sem enfermidades. Estes achados nos indicam que as MPTHs podem ser importantes nas alterações que ocorrem antes e após o estabelecimento da inflamação no cólon. Além disso, fornecem novas informações relevantes sobre as doenças inflamatórias intestinais e abrem novas possibilidades a serem investigadas nos mecanismos envolvidos nessas patologias Abstract: The interaction between components of the intestinal microbiota and intestinal epithelial cells is essential for the maintenance of homeostasis. This interaction occurs through different mechanisms, including short-chain fatty acids (SCFAs) (acetate [C2], propionate [C3] and butyrate [C4]) and other microbial metabolites that modulate gene expression in these cells via histone post-translational modifications (HPTMs), including acetylation and crotonylation. In our study we analyzed the histone acetylation and crotonylation profile in colon cells obtained from animals treated with dextran sulfate sodium (DSS, colitis model) and individuals with active Crohn's disease. In the experimental model, we observed an increase in acetylation and crotonylation of H3 and H4 on the third day after DSS administration. With this treatment time, the structure of the crypts, the amount of inflammatory infiltrate and the concentration of cytokines is still not different from the control condition. On the seventh day, when exacerbated inflammation and a drastic reduction in the colonic concentration of SCFAs are observed, there is a decrease in H3K18cr and H4K8ac, while the other HPTMs show levels similar to the control. A similar pattern occurs in samples from patients with Crohn's disease, in which we observe decreased or near levels of acylations in inflamed regions of the colon compared to patients without disease. These findings indicate that HPTMs may be important in the changes that occur before and after the establishment of inflammation in the colon. In addition, they provide new relevant information about inflammatory bowel diseases and open up new possibilities to be investigated in the mechanisms involved in these pathologies Mestrado Imunologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 CNPQ 132338/2019-0 FAPESP 2018/15313-8

Glioma stem cells (GSCs) are crucial in the formation, perpetuation and recurrence of glioblastomas (GBs) due to their self-renewal and proliferation properties. Although GSCs share cellular and molecular characteristics with neural stem cells (NSCs), GSCs show unique transcriptional and epigenetic features that may explain their relevant role in GB and may constitute druggable targets for novel therapeutic approaches. In this review, we will summarize the most important findings in GSCs concerning epigenetic-dependent mechanisms. Yes

[ES] Saccharomyces cerevisiae es ampliamente utilizada como modelo eucariota debido a su rápido crecimiento y alto grado de conservación con respecto a los mamíferos. El modo de crecimiento vegetativo más común en S. cerevisiae es la reproducción asexual por gemación. Sin embargo, bajo condiciones de estrés por falta de nutrientes, las células diploides son inducidas a sufrir meiosis y esporulación formando cuatro células haploides. Estos eventos están altamente regulados para garantizar la supervivencia celular, siendo los patrones específicos de expresión génica cruciales para la inducción correcta de la meiosis. Uno de los pasos más importantes durante la expresión génica es la síntesis de todos los ARNm realizada por la ARN polimerasa II (RNAPII), complejo multiproteico que forma el núcleo de la maquinaria de transcripción. Además de la RNAPII, se requiere una amplia gama de factores de transcripción y complejos de proteínas para dirigir la RNAPII a los promotores génicos y comenzar la transcripción. Uno de ellos es el complejo de factores asociados a la polimerasa (PAF1c). PAF1c está formado por 5 subunidades y es requerido para la monoubiquitinación de la histona H2B y la metilación de H3K4, dos de las modificaciones epigenéticas más importantes en las histonas. Curiosamente, PAF1c no solo es importante para la transcripción durante el crecimiento vegetativo, sino que mutaciones en algunas subunidades indican que también es importante en la formación de rupturas bicatenarias (DSB) de cromosomas meióticos, un evento importante que ocurre en la profase I. El objetivo de este proyecto es hacer un estudio bibliográfico de las funciones de las proteínas involucradas en la transcripción, que recientemente se ha descubierto que participan en eventos meióticos tempranos, así como algunas modificaciones epigenéticas implicadas en este proceso. Se construye un interactoma in silico entre PAF1c y una proteína implicada en la ubiquitinación de H2B y la metilación de H3K4, Mog1, para establecer algunas conexiones entre la regulación y la meiosis. Por último, el estudio de estas proteínas y complejos en la levadura resulta útil porque los ortólogos humanos se pueden sobreexpresar en algunos tipos de cáncer, como el carcinoma paratiroideo (PC) y otros trastornos del desarrollo., [EN] Saccharomyces cerevisiae is widely used as a eukaryotic model because of its fast growth and high degree of conservation with regard to mammals. The most common mode of vegetative growth in S. cerevisiae is asexual reproduction by budding. However, under high-stress nutrient starvation, diploid cells are induced to undergo meiosis and sporulation forming four haploid cells. These events are highly regulated to ensure cell survival. In these lines, specific patterns of gene expression are crucial to guarantee the correct induction of meiosis. One of the most important steps during gene expression is the synthesis of all mRNAs carried out by the RNA polymerase II (RNAPII), which is a multiprotein complex that forms the core of the transcription machinery. In addition to RNAPII, a wide range of transcription factors and protein complexes are required for targeting RNAPII to upstream gene promoters and begin transcription. One of them is the polymerase associated factor complex (PAF1c). PAF1c is formed by 5 subunits and it is required for the monoubiquitination of histone H2B and the methylation of H3K4, two of the most important epigenetic modifications in histones. Interestingly, PAF1c is not only important for transcription during vegetative growth, but mutations in some subunits indicate it to be also important in the formation of double-stranded breaks (DSBs) of meiotic chromosomes, an important event that occurs in prophase I. The aim of this project is to do a bibliographical study of the moonlighting functions of proteins involved in transcription, which have been recently discovered to participate in early meiotic events as well as some epigenetic modifications implied in this process. An in silico interactome between PAF1c and a protein involved in H2B ubiquitination and H3K4 methylation, Mog1, is constructed to establish some connections between regulation and meiosis. Last, the study of these proteins and complexes in yeast is useful because human orthologs can be found overexpressed in some cancers, like parathyroid carcinome (PC) and other development pathologies.

[EN] Mog1 was first described as a Gsp1-binding protein involved in nuclear protein import both in humans and yeast, being Gsp1 the homologue of the human Ran-GTPase. Later, it was found that human Mog1 also regulates the traffic of Nav1.5, the ¿-subunit of the cardiac sodium channel, that has been associated with Brugada syndrome, a cardiac disease. Recently, it has been discovered that Mog1 regulates mRNA transcription and export to the cytoplasm in Saccharomyces cerevisiae by participating in the establishment of epigenetic marks during transcription, specifically H2B monoubiquitylation on lysine 123 (H2Bub1) and H3 trimethylation on lysine 4 (H3K4me3). These post-translational modifications (PTMs) are correlated with actively transcribed genes, being important for transcription elongation, amongst other functions. In addition, there is a crosstalk between H2Bub1 and H3K4me3 since H2Bub1 has been shown to stimulate H3K4me3. However, the exactly molecular mechanism explaining why these PTMs enhance transcription is not fully understood, although some mechanisms have been proposed in which several proteins and complexes are involved. How Mog1 participate in this process is unknown but it was proposed that it is independent on its role in Gsp1 binding, suggesting the existence of two cellular pools of Mog1 protein. Moreover, it has been shown that two subunits of the COMPASS complex, Shg1 and Sdc1, and histones H2B1, H3 and H4, amongst other proteins, co-precipitate with Mog1-Tap tagged. The interaction between Shg1 and Mog1 has been validated through a genome wide Shg1 two-hybrid screening, finding a region in Mog1 between amino acids residues 114 and 154 as the putative binding domain. Part of this region is located in a long loop connecting two beta sheets where there is a tryptophan residue at position 145 especially exposed. Therefore, it is interesting to study if this loop and, especially, W145 are important for Mog1-Shg1 binding. On the other hand, Mog1 co-immunoprecipitation with histones H2B1, H3 and H4 revealed that Mog1 could participate in the establishment of H2Bub1 and H3K4me3 by directly or indirectly binding histones. Of especial interest is H2B because of H3-K4 trimethylation dependency on H2B-K123 monoubiquitylation. Consequently, it is important to clarify if Mog1 interacts with H2B directly and if so, to determine the interaction domain. Furthermore, it was found in a screening that lysine at position 189 in Mog1 can be ubiquitylated which points Mog1 as a putative substrate for posttranslational modifications. Therefore, the main objective of this study is to gain knowledge about the role of Mog1 in the modulation of histone epigenetic modifications H2Bub1 and H3K4me3 by, on the one hand, analysing the phenotypic effect of several Mog1 mutants and, on the other hand, characterising histone H2B-Mog1 interaction., [ÈS] Mog1 fue descrita por primera vez como una proteína de unión a Gsp1, proteína homóloga a Ran- GTPasa en humanos, que participa en la importación de proteínas al núcleo tanto en levadura como en humanos. Más tarde, se encontró que, en humanos, Mog1 regula el tráfico de Nav1.5, la subunidad α del canal de sodio cardiaco, que ha sido asociada con el síndrome de Brugada, una enfermedad cardiaca. Recientemente, se ha descubierto que Mog1 también regula la transcripción y exportación del ARNm en Saccharomyces cerevisiae mediante la participación en el establecimiento de marcas epigenéticas durante la transcripción. Estas modificaciones postraduccionales (PTMs por sus siglas en inglés) son la monoubiquitinación de H2B en la lisina 123 o H2Bub1 y la trimetilación de la histona H3 en la lisina 4 o H3K4me3 que están relacionadas con genes activamente transcritos y son importantes en la elongación transcripcional, entre otras funciones. Además, existe una intercomunicación entre H2Bub1 y H3K4me3 ya que se ha demostrado que H2Bub1 estimula la trimetilación de H3 en K4. Sin embrago, no se ha caracterizado todavía un mecanismo molecular que explique por qué estas PTMS aumentan la transcripción, aunque varios mecanismos se han propuesto englobando varias proteínas y complejos. Se desconoce cómo Mog1 participa en este proceso, pero se ha propuesto que esta función es independiente a su unión a Gsp1, sugiriendo la existencia de dos pools celulares de Mog1. Además, se ha encontrado que dos subunidades del complejo COMPASS, Shg1 y Sdc1, y las histonas H2B1, H3 y H4, entre otras proteínas, coprecipitan en un ensayo con Mog1 con cola Tap. La interacción entre Mog1 y Shg1 ha sido validada en un ensayo de doble híbrido empleando Shg1 como la proteína bait, en el que además se describió una región en Mog1 entre los aminoácidos 114 y 154 como posible dominio de interacción. Parte de esta secuencia está localizada en una región de bucle que conecta dos láminas beta y que contiene un triptófano en posición 145 con su cadena lateral especialmente expuesta. Por lo tanto, es interesante estudiar si esta región de bucle y, en concreto, W145 son importante para la interacción entre Mog1 y Shg1. Por otra parte, la co-inmunoprecipitación de Mog1 e histonas H2B1, H3 y H4 sugiere que Mog1 podría desempeñar su función en el establecimiento de H2Bub1 y H3K4me3 interaccionando directa o indirectamente con las histonas. H2B es de especial interés por su influencia en la trimetilación de H3 en K4. Por ello, es importante estudiar si Mog1 interacciona con H2B directamente y en tal caso, determinar el dominio de interacción. Además, un estudio ha encontrado que la lisina 189 en Mog1 puede estar ubiquitinada, indicando que Mog1 también puede ser sustrato para las modificaciones postraduccionales. En consecuencia, el objetivo principal del presente estudio es indagar en la implicación de Mog1 en el establecimiento de las marcas epigenéticas H2Bub1 y H3K4me3 mediante el análisis del efecto fenotípico de varias mutaciones en la proteína Mog1, y la caracterización de la interacción entre la histona H2B y Mog1.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 En este Trabajo de Tesis se describieron tres enzimas presentes en la base genómica de datos de G. lamblia como posibles histonas metiltransferasas, HMT1, HMT2 y SET2 encargadas de metilar residuos de lisina en histonas. Se estudió su rol durante el crecimiento y el enquistamiento de G. lamblia. Se observó que estas enzimas presentaban una localización nuclear, perinuclear y citoplasmática y que regulaban tanto positiva como negativamente el proceso de enquistamiento. A su vez, se identificaron y estudiaron las diferentes modificaciones post-traduccionales presentes en las histonas de los trofozoítos de G. lamblia. En primera instancia, se aislaron e identificaron diferentes péptidos de H2A, H2B, H3 y H4 comprendidos en la base de datos de histonas de G. lamblia. Se encontraron modificaciones conservadas en otros organismos, tales como metilación, acetilación y ubiquitinación de lisinas, metilación de argininas, y también fosforilación de treoninas, tirosinas y lisinas. Con respecto a la metilación de argininas, en el genoma de G. lamblia no hay enzimas descriptas como HRMT (histona-arginina metiltransferasa), por lo que la presencia de argininas metiladas indica que posiblemente algunas de las HMTs (histona metiltransferasas) las que normalmente modifican lisinas, puedan estar modificando a su vez argininas. Este trabajo proporciona la primera caracterización a gran escala del código de las histonas de G. lamblia, lo cual constituye una plataforma para el desarrollo de futuras investigaciones en el campo de la epigenética en este parásito. 2023-06-30 Salusso, Agostina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Ropolo, Andrea Silvana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Echenique, José Ricardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Monti, Mariela Roxana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Nicola, Juan Pablo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Ténicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Carranza, Pedro Gabriel. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Salud, Tecnología y Desarrollo; Argentina.

105 p, Yarrowia lipolytica es un ascomiceto oleaginoso con un amplio potencial biotecnológico, capaz de sintetizar metabolitos de interés industrial y ampliamente reconocido por ser un modelo de estudio de procesos de diferenciación celular, tales como el dimorfismo, dada su capacidad de producir verdaderos filamentos, responder a múltiples efectores y a su fácil manipulación genética. Aunque no se le reconoce como un organismo patógeno, actualmente se ha registrado un creciente número de reportes sobre infecciones oportunistas asociadas a este microorganismo. De acuerdo con lo anterior, el estudio de las bases epigenéticas del dimorfismo en esta levadura reviste particular interés. El objetivo del presente trabajo fue analizar el papel de la desacetilación de las histonas sobre el crecimiento y dimorfismo de Yarrowia lipolytica, cepa P01a. Como primer paso, se caracterizó fenotípicamente el crecimiento de la cepa en diferentes fuentes carbonadas (Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Maltosa, Manitol, N-acetilglucosamina) y nitrogenadas (Sulfato de amonio, Fosfato de Diamonio, Nitrato de potasio y Urea), mediante valoración del crecimiento cinético. La máxima velocidad de crecimiento fue obtenida utilizando glucosa en combinación con sulfato de amonio (velocidad de crecimiento: 0,38 generaciones/hora). Las condiciones requeridas para inducir la transición dimórfica fueron estandarizadas con base en protocolos descritos en la literatura, logrando los máximos porcentajes de filamentación a las 16 horas de incubación, con N-acetilglucosamina 1% y pH 7,0 como efectores del cambio de fase. Finalmente, se investigó el efecto del butirato de sodio y el ácido valproico sobre el crecimiento vegetativo y dimorfismo de Y. lipolytica. Se pudo establecer que la cepa exhibe mayor tolerancia a altas dosis de estos inhibidores que otros modelos fúngicos dada su naturaleza lipolítica y que una vez superada su capacidad metabólica, la adición de estos inhibidores disminuye significativamente la filamentación, lo cual indica que la acetilación de las histonas cumple un papel en la regulación de la transición dimórfica., Yarrowia lipolytica is an oleaginose ascomycete with broad biotechnological potential, capable to synthesize metabolites of industrial interest and widely recognized for being a model of studying cell differentiation processes, such as dimorphism, given its ability to produce true hyphae, respond to multiple effectors and their easy genetic manipulation. Although it is not recognized as a pathogenic microorganism, there have now been an increasing number of reports of opportunistic infections associated with this yeast. According to the above, the study of the epigenetic bases of dimorphism in this yeast is of particular interestHere, we analyzed the role of histone deacetylation on the growth and dimorphism of Yarrowia lipolytica, strain P01a. As a first step, phenotypically the growth of the strain was characterized in different carbonated sources (Glucosa, Lactose, Sucrose, Maltose, Manitol, N-acetylglucosamine) and nitrogen (Ammonium Sulfate, Diamonium Phosphate, Potassium Nitrate and Urea), by means of kinetic growth assessment. The maximum growth rate was obtained using glucose in combination with ammonium sulfate (growth rate: 0.38 generations/hour). The conditions required to induce the dimorphic transition were standardized based on protocols described previously, achieving the maximum percentages of filamentation at 16 hours of incubation, with 1% N-acetylglucosamine and pH 7.0 both as effectors of dimorphic switch. Finally, the effect of sodium butyrate and valproic acid on the vegetative growth and dimorphism of Y. lipolytica was investigated. It was stablished that the strain exhibits higher tolerance to these inhibitors than other fungal models, probably due to its lipolytic nature. However, when its metabolic capacity has been exceeded, the addition of valproic acid and/or sodium butyrate inhibits yeast-to-hyphae switching, indicating that histone acetylation plays an role in the regulation of dimorphic transition., Pregrado, Microbiólogo Industrial, Introducción .................................................................................................................................. 17 1. Planteamiento del problema .................................................................................................. 19 2. Justificación ........................................................................................................................... 21 3. Hipótesis ................................................................................................................................ 23 4. Objetivos ................................................................................................................................ 24 4.1 Objetivo general .................................................................................................................. 24 4.2 Objetivos específicos........................................................................................................... 24 5. Marco teórico ......................................................................................................................... 25 5.1.1 Efectores del dimorfismo ........................................................................................ 28 6. Yarrowia lipolytica ................................................................................................................ 31 6.1 Hábitat, taxonomía y relación filogenética ...................................................................... 32 7. Asimilación de fuentes de carbono ........................................................................................... 35 7.1 Utilización de hidrocarburos como fuente carbonada ......................................................... 35 8. Epigenética y su relación con el dimorfismo ............................................................................ 37 8.1.1 Mecanismos de la remodelación de la cromatina ......................................................... 39 8.1.2 Metilación del ADN ..................................................................................................... 40 9. Inhibidores químicos de las enzimas epigenéticas .................................................................... 42 9.1 Ácido Valproico .................................................................................................................. 44 10. Metodología. ...................................................................................................................... 47 10.1 Material biológico, medios de cultivo y condiciones de crecimiento ............................ 47 10.2 Caracterización fenotípica de la cepa Y. lipolytica en distintas fuentes de carbono y nitrógeno.................................................................................................................................... 47 10.3 Establecimiento de las condiciones experimentales para inducir la transición dimórfica ................................................................................................................................ 48 10.4 Evaluación del efecto de los HDACi sobre el crecimiento vegetativo de Yarrowia lipolytica .................................................................................................................................... 50 10.4.1 Selección de los inhibidores químicos de las HDAC ............................................. 50 10.4.2 Selección de las concentraciones de prueba ........................................................... 50 10.4.3 Evaluación de la viabilidad celular en condiciones de inhibición de las enzimas desacetilasas de histonas de Y. lipolytica .............................................................................. 52 10.4.4 Evaluación del efecto de la inhibición química de las enzimas desacetilasas de histonas sobre la diferenciación celular ................................................................................. 54 11. Resultados .......................................................................................................................... 56 11.1 Caracterización fenotípica de la cepa Y. lipolytica en distintas fuentes de carbono y nitrógeno.................................................................................................................................... 56 11.2 Establecimiento de las condiciones experimentales para inducir la transición dimórfica 58 11.2.1. Selección del mejor inductor del dimorfismo............................................................ 61 11.3 Efecto de la inhibición química de las HDAC sobre el crecimiento vegetativo de Yarrowia lipolytica .................................................................................................................... 63 11.3.1 Identificación in silico de las HDAC de Y. lipolytica ............................................. 63 11.3.2 Efecto del Butirato de Sodio sobre el crecimiento vegetativo de Yarrowia lipolytica 64 11.3.3 Efecto del Butirato de Sodio sobre la viabilidad celular de Y. lipolytica P01a ...... 67 11.3.4 Efecto del Ácido valproico sobre el crecimiento vegetativo de Yarrowia lipolytica . 68 11.3.5 Efecto del Butirato de Sodio sobre la viabilidad celular de Y. lipolytica P01a .......... 71 11.4 Evaluación del efecto de la inhibición química de las enzimas desacetilasas de histonas sobre el dimorfismo de Y. lipolytica.......................................................................................... 72 12. Discusión............................................................................................................................ 75 13. Conclusiones. ..................................................................................................................... 82 14. Recomendaciones .............................................................................................................. 83 15. Referencias ......................................................................................................................... 84 16. Apéndice ............................................................................................................................ 98, Ej. 1

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No. of bitstreams: 1 barbeiro_co_me_arafor.par.pdf: 390336 bytes, checksum: 69f69dd327a49ff77d424c1f022a09a3 (MD5) Previous issue date: 2020-02-19 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) As desordens potencialmente malignas orais (DPMOs) são apresentações clínicas que apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de câncer na cavidade oral, seja ela uma lesão precursora definida ou mucosa clinicamente normal. Dentre as principais DPMOs, a leucoplasia oral (LO) se apresenta como uma placa branca não raspável de risco questionável, podendo ser homogênea ou não homogênea, cuja taxa de transformação maligna varia de 0,2% até 17,5%. Além disso, a LO apresenta os mesmos fatores de riscos que são observados no desenvolvimento de carcinoma espinocelular (CEC) oral, o qual é a principal neoplasia maligna que afeta a cavidade oral. Outra DPMO importante é a leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), a qual também se apresenta como uma placa branca não raspável, porém multifocal e possui um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna de 70% até 100% dos casos. Diferente da LO, os fatores de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Os graus de displasias identificados nas DPMOs são utilizados atualmente como preditores de risco para transformação maligna, no entanto diversos estudos têm mostrado que este não é um preditor fiel. Estudos recentes sugerem ainda que o infiltrado inflamatório associado as DPMOs pode estar associado a sua etiologia e comportamento clínico. Além disso, recentemente, tem-se estudado as alterações epigenéticas envolvendo histonas e metilação de DNA em diferentes tipos de câncer, bem como em algumas DPMOs a fim de descobrir alvos para medidas terapêuticas efetivas. Dentre os diversos fatores indutores de alterações epigenéticas, a inflamação crônica tem sido apontada como um destes fatores. Assim, o presente estudo teve como objetivos específicos: (1) comparar os níveis de acetilação de histona H3, o acúmulo de danos no DNA e os níveis de metilação global de DNA entre LO e LVP; (2) avaliar se os níveis de acetilação de histona H3 em linhagens celulares displásicas e tumorais sofrem alterações pelo contato com as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs); e (3) avaliar se tais alterações são acompanhadas de alterações na proliferação celular e transição epitélio-mesenquimal (TEM). Para alcançar estes objetivos, os níveis de acetilação de histona H3, dano de DNA e metilação foram avaliados por imumofluorescência. Adicionalmente, ensaios de co-cultura celular com PBMCs e linhagens de queratinócitos orais (NOK-SI, DOK, SCC-25 e Detroit 562) foram realizados para avaliar a influência dos PBMCs na aquisição de vantagens para a progressão tumoral. Os resultados da imunofluorescência mostraram que ambas as DPMOs estavam hipoacetiladas em relação ao controle. Contudo, quando realizada uma comparação somente entre LO e LVP, observamos que o grupo LVP está mais hiperacetilado do que LO. Foram observados também que os níveis de dano de DNA e metilação estavam aumentados no grupo LO em relação a LVP. Os experimentos com cultura de células revelaram que o contato dos queratinócitos orais displásicos e normais com os PBMCs, foi capaz de favorecer a TEM. Nossos resultados revelaram dois pontos importantes: 1) ambas as DPMOs apresentam perfil epigenético distintos; 2) o contato direto de PMBCs com queratinócitos orais normais, displásicos e tumorais parece ser importante em eventos iniciais da tumorigênese como a TEM. Oral potentially malignant disorders (OPMDs) are clinical presentations that present an increased risk of cancer development in the oral cavity, whether in a clinically definable precursor lesion or clinically normal oral mucosa. Among the main OPMDs, oral leukoplakia (OL) presents itself as a non-scratchable white plaque of questionable risk, which can be homogeneous or non-homogeneous, whose malignant transformation rate varies from 0.2% to 17.5%. In addition, OL has the same risk factors that are observed in the development of oral squamous cell carcinoma (OSCC), which is the main malignant neoplasm affecting the oral cavity. Another important OPMD is proliferative verrucous leukoplakia (PVL), which also presents itself as a white, non-scratchable, but multifocal plaque and has a persistent and progressive behavior for malignancy, with a malignant transformation rate of 70% to 100% of the cases. Unlike OL, risk factors such as tobacco, alcohol and areca nut do not appear to be associated with the development of PVL. Additionally, PVL has a poor response to all treatment modalities, suffers rapid dissemination through oral sites and often shows recurrence. The degree of epithelial dysplasia identified in OPMDs is currently used as a risk predictor for malignant transformation, however several studies have shown that it is not a reliable predictor. Recent studies also suggest that the inflammatory infiltrate associated with OPMD may be due to its etiology and clinical comportment. Furthermore, recently, epigenetic changes involving histones and DNA methylation in different types of cancer have been studied, as well as in some OPMDs in order to discover targets for effective therapeutic measures. Among the several factors inducing epigenetic changes, chronic inflammation has been identified as one of these factors. Thus, the present study had specific objectives: (1) to compare the levels of histone H3 acetylation, the accumulation of DNA damage and the levels of global DNA methylation between OL and PVL; (2) to evaluate whether the levels of histone H3 acetylation in dysplastic and tumor cell lines are altered by the contact with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); and (3) assess whether such changes are accompanied by changes in cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition (EMT). To achieve these goals, the levels of histone H3 acetylation, DNA damage and methylation were assessed by immunofluorescence. In addition, cell co-culture assays with PBMCs and oral keratinocyte lines (NOK-SI, DOK, SCC-25 and Detroit 562) were performed to assess the influence of PBMCs on the acquisition of advantages for tumor progression. The results of the immunofluorescence showed that both OPMDs were hypoacetylated compared to the control. However, when comparing only OL and PVL, we observed that the PVL group was more hyperacetylated than OL. It was also observed that the levels of DNA damage and methylation were increased in the OL group in relation to PVL. The experiments with cell culture revealed that the contact of dysplastic and normal oral keratinocytes with PBMCs was able to favor EMT. Our results revealed two main points: 1) both OPMDs have different epigenetic profiles; 2) the direct contact of PMBCs with normal, dysplastic and tumoral oral keratinocytes seems to be important in early events of tumorigenesis such as EMT. FAPESP: 2018/04954-2

Orientador: Pablo Agustin Vargas Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: O ameloblastoma é um tumor odontogênico epitelial benigno clinicamente agressivo com alterações epigenéticas pouco conhecidas. Nesse tumor, a expressão das proteínas MSH2 e MSH6 da via antimutagênica do Sistema de Reparo Mismatch se encontram reduzidas, sugerindo a ocorrência de alterações epigenéticas. Os objetivos desse trabalho são investigar o perfil imunohistoquímica dos marcadores epigenéticos envolvidos com a metilação do DNA e com a acetilação de histonas em ameloblastomas e carcinomas ameloblásticos, além de reportar o perfil de metilação dos genes MSH2, MSH3 e MSH6 (MutS) nos ameloblastomas. Foram realizadas reações imunohistoquímicas para os marcadores DNMT1, DNMT3A, DNMT3B e H3K9ac em 10 germes dentais, 38 ameloblastomas convencionais e seis carcinomas ameloblásticos, buscando determinar a comparação das expressões entre os grupos. Em seguida, 59 ameloblastomas convencionais organizados em um bloco de tissue microarray contendo informações clínicas, patológicas, genéticas e relato de recidiva, foram submetidos às mesmas reações para correlacionar com as variáveis qualitativas. Foram observadas a superexpressão de DNMT3B nos ameloblastomas em relação aos germes dentais (p = 0,0001), assim como aumentos nas expressões de DNMT1 (p = 0,0175), DNMT3A (p = 0,0113) e H3K9ac (p = 0,0004) nos carcinomas ameloblásticos em relação aos ameloblastomas. Adicionalmente, os casos de ameloblastomas que apresentavam a mutação BRAFV600E (p = 0,0114), envolvimento maxilar (p = 0,0072), e rompimento de corticais vestíbulo-palatina (p = 0,0066) possuíam um aumento na expressão de DNMT1, enquanto que casos com recidivas (p = 0,0477) possuíam aumento na expressão de DNMT3B. Para determinar o perfil de metilação dos genes MutS, 10 folículos dentários e 10 ameloblastomas convencionais frescos foram submetidos a análises quantitativas de PCR em tempo real (qPCR) assay, utilizando a técnica de restrição enzimática. Foram observados que os ameloblastomas apresentam baixo percentual dos genes MutS metilados, sem apresentar diferença significativa com os folículos dentários (p < 0,05). Esses resultados sugerem que novos perfis de genes metilados estejam presentes nos ameloblastomas, favorecendo o seu comportamento clínico mais agressivo e a sua progressão para carcinomas ameloblásticos. Contudo, a baixa expressão de MSH2 e MSH6 reportada na literatura não parece estar associada com alterações nos perfis de metilações dos seus respectivos genes, sugerindo que outros mecanismos possam estar presentes Abstract: Ameloblastoma is a benign epithelial odontogenic tumour clinically aggressive with epigenetics alterations fewer know. In this tumour, the MSH2 and MSH6 proteins in the Mismatch repair system antimutagenic pathway are low-expressed, suggesting the occurrence of epigenetic changes. This study aims to investigate the immunohistochemical profile of the epigenetic markers involved with the DNA methylation and histones acetylation in ameloblastomas and ameloblastic carcinomas, besides to reporting the MSH2, MSH3 and MSH6 (MutS) genes methylation profile in ameloblastomas. Immunohistochemical reactions were performed for DNMT1, DNMT3A, DNMT3B and H3K9ac markers in 10 dental germs, 38 conventional ameloblastomas and six ameloblastic carcinomas, seeking to determine the comparison of expressions between groups. Then, 59 conventional ameloblastomas organized in a tissue microarray block containing clinical, pathological, genetic information and a report of recurrence, underwent the same reactions to correlate with qualitative variables. Overexpression of DNMT3B in ameloblastomas was observed in relation to dental germs (p = 0.0001), as well as increases in the expressions of DNMT1 (p = 0.0175), DNMT3A (p = 0.0113) and H3K9ac (p = 0.0004) in ameloblastic carcinomas in relation to ameloblastomas. Additionally, ameloblastomas cases that presented the BRAFV600E mutation (p = 0.0114), maxillary involvement (p = 0.0072), and the vestibular-palatine cortical bone ruptured (p = 0.0066) had an increase in DNMT1 expression, while cases with recurrences (p = 0.0477) showed DNMT3B expression increased. Ten dental follicles and 10 conventional ameloblastomas fresh samples were selected to determine the MutS genes methylation profile. The samples were subjected to quantitative analyzes of real-time PCR (qPCR) assay, using the enzymatic restriction technique. It was observed that ameloblastomas have a low percentage of methylated MutS genes, without significant difference with dental follicles (p

O Transtorno Depressivo Maior (TDM) é uma patologia psiquiátrica grave e multifatorial. Avanços científicos vêm demonstrando que fatores ambientais, como o estresse, tem importante influência na etiologia da TDM. Em estudos pré-clínicos, o Estresse Crônico Moderado e Imprevisível (ECMI) é um modelo animal com alto potencial translacional, que mimetiza situações que os seres humanos podem experimentar cotidianamente, tornando-se relevante para ampliar os estudos no campo do TDM. Atualmente, estudos indicam que ativação de fatores epigenéticos podem estar envolvidos com o sistema glutamatérgico no TDM. As histonas estão sujeitas a uma complexidade de modificações epigenéticas, como por exemplo, a metilação. Esta, pode alterar a interação núcleo-histona, o que acaba por influenciar a expressão gênica. Nesta perspectiva, mesmo que alguns estudos já tenham sido realizados, uma investigação pormenorizada considerando o modelo de TDM do ECMI e as possíveis modificações na histona 3 lisina 4 trimetilada (H3K4me3), H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3 e H3K79me3 se fazem necessário. Desta maneira, esta dissertação teve como objetivo geral, investigar modificações epigenéticas em resíduos de lisina da histona 3 que podem estar relacionadas com genes astrocitários e neuronais em ratos Wistar submetidos ao ECMI. Para isto, foram utilizados 29 ratos Wistar, sendo 8 controles e 21 submetidos ao ECMI durante 42 dias. Posterior ao ECMI, foram realizados testes comportamentais e em seguida, os animais foram eutanasiados para a retirada do sangue, medula óssea femural, córtex, hipotálamo e hipocampo, os quais foram utilizados em técnicas para verificar possível dano ao DNA, estado de cromatina, padrão de trimetilação das lisinas específicas e expressão gênica. A partir dos resultados comportamentais, foi possível subdividir o grupo dos animais que foram submetidos ao ECMI em animais com comportamento tipo-depressivo e resilientes ao estresse. Quando avaliamos as alterações na H3, verificamos que as modificações H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 e H3K36me3 possuíam um padrão de trimetilação tecido-específico. Ainda, analisamos a expressão de genes astrocitários e neuronais e observamos diferença de expressão tecidoespecífico também. Desta maneira, observamos que a H3K27me3 e H3K9me3 podem estar relacionadas com a regulação da homeostase de glutamato em animais tiporesilientes e tipo-depressivo enquanto, a H3K4me3 e H3K36me3 com o aumento da neurogênese e neurodiferenciação nos animais com o fenótipo tipo-resiliente. Por fim, concluímos que as modificações epigenéticas podem estar envolvidas com o desenvolvimento do fenótipo tipo-depressivo interagindo com os transportadores de glutamato e que o fenótipo tipo-resiliente pode ser desenvolvido por um aumento de neurogênese que pode proporcionar um equilíbrio da homeostase glutamatérgica. Major Depressive Disorder (MDD) is a serious and multifactorial psychiatric disorder. Scientific advances have shown that environmental factors, such as stress, have an important influence on the etiology of MDD. In preclinical studies, Chronic Moderate and Unpredictable Stress (ECMI) is an animal model with high translational potential, which mimics situations that humans can experience daily, becoming relevant to expand studies in the field of MDD. Currently, studies indicate that activation of epigenetic factors may be involved with the glutamatergic system in TDM. Histones are subject to a complexity of epigenetic changes, such as methylation. This can alter the nucleus-histone interaction, which ends up influencing gene expression. In this perspective, even if some studies have already been carried out, a detailed investigation considering the TDM model of ECMI and the possible modifications in trimethylated lysine 4 histone 3 (H3K4me3), H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3 and H3K79me3 are necessary. Thus, this dissertation had the general objective of investigating epigenetic changes in lysine residues of histone 3 that may be related to astrocytic and neuronal genes in Wistar rats submitted to ECMI. For this, 29 Wistar rats were used, 8 controls and 21 submitted to ECMI for 42 days. After ECMI, behavioral tests were performed and then the animals were euthanized to remove blood, femoral bone marrow, cortex, hypothalamus and hippocampus, which were used in techniques to check for possible DNA damage, chromatin status, pattern trimethylation of specific lysines and gene expression. From the behavioral results, it was possible to subdivide the group of animals that underwent ECMI in animals with type-depressive behavior and resilient to stress. When we evaluated the changes in H3, we found that the changes H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 and H3K36me3 had a tissue-specific trimethylation pattern. Furthermore, we analyzed the expression of astrocytic and neuronal genes and observed a difference in tissue-specific expression as well. Thus, we observed that H3K27me3 and H3K9me3 may be related to the regulation of glutamate homeostasis in type-resilient and type-depressive animals, while H3K4me3 and H3K36me3 with the increase in neurogenesis and neurodifferentiation in animals with the resilient type phenotype. Finally, we conclude that epigenetic changes may be involved with the development of the type-depressive phenotype interacting with glutamate transporters and that the type-resilient phenotype can be developed by an increase in neurogenesis that can provide a balance of glutamatergic homeostasis.

[spa] La enfermedad cardiovascular (CV) es la principal causa de muerte de los pacientes con enfermedad renal crónica terminal (ERCT). Es especialmente llamativa la diferencia que existe, con respecto la población general, en el grupo de pacientes más jóvenes, siendo ésta de hasta 50 veces superior. A pesar de las mejoras técnicas implementadas en diálisis o de las estrategias farmacológicas disponibles, no se ha conseguido reducir la mortalidad de origen CV en este grupo de pacientes. Esta elevada prevalencia de enfermedad CV (en forma de alteraciones microvasculares o macrovasculares -aterosclerosis o arteriosclerosis-) tiene como nexo común la disfunción endotelial (DE), se encuentra agravada en la enfermedad renal crónica (ERC) y se manifiesta presentando un fenotipo proinflamatorio, prooxidante y protrombótico. Esta Tesis Doctoral (TD) plantea la hipótesis de que es posible mejorar la DE presente en la uremia mediante nuevos enfoques de modulación farmacológica a partir de la identificación de nuevas potenciales dianas terapéuticas. Los objetivos son: explorar los efectos de la modulación de distintos sistemas antioxidantes-antiinflamatorios, y la posibilidad de intervención sobre los cambios epigenéticos asociados a la exposición crónica de las células endoteliales (CE) al medio urémico. La metodología se centra en el estudio de los cambios y capacidad de modulación de la DE. Para ello, se ha utilizado un modelo in vitro de cultivo de CE procedentes de venas de cordón umbilical humano (HUVECs), incubadas con suero de pacientes con ERCT en programa de diálisis (diálisis peritoneal o hemodiálisis) y donantes sanos tras la exposición a los distintos compuestos estudiados. Las técnicas utilizadas en el primer trabajo incluyen: inmunofluorescencia para medir la expresión de ICAM-1, técnicas de fluorescencia para la determinación de la generación de radicales libres de oxígeno (ROS), técnicas de ELISA y Western blot para el estudio de la expresión del factor de transcripción NFкB y de la íva p38MAPK y fl uorimetría para la medición de glutatión (GSH). Las técnicas utilizadas en el segundo trabajo incluyen: análisis proteómico para detectar proteínas expresadas de manera diferencial; Western blot e inmunofluorescencia para la cuantificación de la histona desacetilasa (HDAC) tipo 1 (HDAC1) y tipo 2 (HDAC2), y de la vía PI3-kinasa/AKT; inmunofluorescencia para medir la expresión de ICAM-1, Toll Like Receptor 4 (TLR4), factor von Willebrand (FvW) y técnicas de fluorescencia para la determinación de la generación de (ROS). Los resultados del primer trabajo demuestran que la modulación farmacológica de los sistemas antioxidantes, mediante la potenciación de la vía de la glutatión peroxidasa (GPX) inducen una mayor respuesta antioxidante y antiinflamatoria que las estrategias que potencian la vía de la superóxido dismutasa (SOD) o los distintos flavonoides, que obtienen unos resultados parciales. Los resultados del segundo demuestran que el medio urémico induce cambios en la expresión de proteínas a nivel de las CE. Algunos de estos cambios son revertidos por el fármaco defibrotide (DF), con reconocidas propiedades protectoras del endotelio en otros contextos. De las proteínas sobreexpresadas en las CE expuestas al medio urémico y que son normalizadas por el DF destacamos, por su relevancia biológica, HDAC1 y HDAC2. El DF, regulando la sobreexpresión de HDAC1 y HDAC2, logra una mejoría del fenotipo proinflamatorio, protrombótico y prooxidante, y una disminución de la actividad de la inmunidad innata, de las CE expuestas al medio urémico. Así pues, esta TD permite concluir que es posible mejorar la DE presente en la ERC in vitro mediante un abordaje distinto al disponible hasta la fecha, con estrategias que se centren en contrarrestar el entorno prooxidante, así como algunos de los cambios epigenéticos observados en estas CE, abriendo las expectativas de posibles nuevas dianas terapéuticas., [eng] Cardiovascular disease (CV) is the leading cause of death of patients with terminal chronic kidney disease (ERCT). This high prevalence of CV disease (in the form of microvascular or macrovascular alterations - atherosclerosis or arteriosclerosis) has as a common link endothelial dysfunction (ED), is aggravated in chronic kidney disease (CKD) and manifests itself by presenting a proinflammatory, prooxidant and prothrombotic phenotype. This Doctoral Thesis (TD) hypothesizes that it is possible to improve the ED present in uremia through new pharmacological modulation approaches based on the identification of new potential therapeutic targets. The objectives are: to explore the effects of the modulation of different antioxidant-anti-inflammatory systems, and the possibility of intervention on epigenetic changes associated with chronic exposure of endothelial cells (EC) to the uremic environment. he results of the first work show that the pharmacological modulation of antioxidant systems, through the potentiation of the glutathione peroxidase (GPX) pathway, induces a greater antioxidant and anti-inflammatory response than the strategies that enhance the superoxide dismutase (SOD) pathway or the different flavonoids, which obtain partial results. The results of the second show that the uremic medium induces changes in protein expression at the EC level. Some of these changes are reversed by the drug defibrotide (DF), with recognized endothelial protective properties in other contexts. Of the overexpressed proteins in the EC exposed to the uremic environment and which are normalized by the DF, we highlight, due to their biological relevance, HDAC1 and HDAC2. The DF, regulating the overexpression of HDAC1 and HDAC2, achieves an improvement of the proinflammatory, prothrombotic and prooxidant phenotype, and a decrease in the activity of innate immunity, of the EC exposed to the uremic environment. Thus, this TD allows us to conclude that it is possible to improve the ED present in CKD in vitro through a different approach to that available to date, with strategies that focus on counteracting the prooxidant environment, as well as some of the epigenetic changes observed in these CE, opening the expectations of possible new therapeutic targets.

Orientador: Fernanda Janku Cabral Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O "Schistosoma mansoni", agente causador da esquistossomose, tem um processo de desenvolvimento complexo, devido aos diferentes estágios e habitats que o parasita possui. Recentemente, tem sido investigados aspectos da maquinaria epigenética envolvidos em seu ciclo. Objetivou-se investigar a transcrição dos genes das enzimas modificadoras de histonas e determinar a modificação pós-traducional do ciclo de vida de S. mansoni. Sendo assim, uma busca em bancos de dados GeneDB e NCBI foi realizada para as sequências dos genes que codificam essas enzimas. A partir disso, foram obtidos resultados através de qRT-PCR que permitiu uma análise geral do perfil de transcrição ao longo dos diferentes estágios do parasita que teve maior número de genes com expressão aumentada, em cercária e esquistossômulo 3 dias. Os genes encontrados nessas fases pertenciam a classe das metilases e deacetilases e os transcritos que se sobressaíram foram: Smp_091990, Smp_191310, Smp_160700, Smp_121610 e Smp_1368770, demonstrando potenciais alvos terapêuticos. Para verificar as modificações pós-traducionais da histona presentes ao longo do ciclo, foi padronizado um método de extração de histonas propioniladas que demonstrou-se eficaz em comparação as histonas não-propioniladas. As modificações identificadas foram, sobretudo, metilações no estágio de cercária. Além disso, em verme adulto macho foi visto marcas nunca vistas antes em analises por espectrometria de massas como a ubiquitinação e crotonilação. Portanto, conclui-se que os dados obtidos com a espectrometria validaram a análise de expressão dos transcritos que codificam as enzimas modificadoras de histona, tendo visto alta metilação em cercária em ambas análises Abstract: "Schistosoma mansoni", an agent that causes schistosomiasis, has a complex development process due to different stages and habitats that the parasite has. Recently, aspects of epigenetic machines involved in its cycle have been investigated. The objective was to investigate a gene transcription of histone-modifying enzymes and to determine the post-traditional alteration of the S. mansoni life cycle. Therefore, a search in the GeneDB and NCBI databases was carried out for gene sequences that encode these enzymes. From that, results were obtained through qRT-PCR that allowed a general analysis of the transcription profile and over the different stages of the parasite that had the highest number of genes with increased expression, in cercariae and schistosomal 3 days. The genes found in these phases belong to a class of methylases and deacetylases and the transcripts that stand out were: Smp_091990, Smp_191310, Smp_160700, Smp_121610 and Smp_1368770, demonstrating the therapeutic risks. In order to verify how post-traditional changes in history present throughout the cycle, a method of extracting propionylated histories was standardized which proved to be effective in comparison with non-propionylated histories. The identified modifications were mainly methylations in the cercariae stage. In addition, in the adult male worm, ubiquitination and crotonylation has been seen by mass spectroscopy. Therefore, we conclude that the data obtained with spectrometry validated an analysis of transcript expression that encodes as histone-modifying enzymes, having seen high methylation in cercariae in exhibitions Mestrado Parasitologia Mestra em Parasitologia FAPESP 2017/07364-9 CAPES 001 FAEPEX 2547/17; 2813/18; 2476/18

Producción Científica, Epigenetic marks are modest chemical modifications on DNA and histone proteins that regulate the activation or silencing of genes through modulation of the intermolecular interactions between the DNA strands and the protein machinery. The process is complex and not always well understood. One of the systems studied in greater detail is the epigenetic mark on H3K9: lysine 9 of histone 3. The degree of methylation or acetylation of this histone is linked to silencing or activation of the corresponding gene, but it is not clear which effect each mark has in gene expression. We shed light on this particular methylation process by using density functional theory (DFT) calculations. First, we built a model consisting of a DNA double strand containing three base pairs and a sequence of three amino acids of the histone's tail. Then, we computed the modulation introduced into the intermolecular interactions by each epigenetic modification: from mono- to trimethylation and acetylation. The calculations show that whereas acetylation and trimethylation result in a reduction of the DNA-peptide interaction; non-, mono-, and dimethylation increase the intermolecular interactions. Such observations compare well with the findings reported in the literature, and highlight the correlation between the balance of intermolecular forces and biological properties, simultaneously advancing quantum-mechanical studies of large biochemical systems at molecular level through the use of DFT methods., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad - Fondo Europeo de Desarrollo Regional (grants PGC2018-098561-B and UNLR-094E2C-225), Gobierno Vasco (grant IIT62-19)

Emerging evidence has suggested global histone H4 acetylation status plays an important role in neural plasticity. For instance, the imbalance of this epigenetic marker has been hypothesized as a key factor for the development and progression of several neurological diseases. Likewise, astrocytic reactivity - a well-known process that markedly influences the tissue remodeling after a central nervous system injury - is crucial for tissue remodeling after spinal cord injury (SCI). However, the linkage between the above-mentioned mechanisms after SCI remains poorly understood. We sought to investigate the relation between both glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S100 calcium-binding protein B (S100B) (astrocytic reactivity classical markers) and global histone H4 acetylation levels. Sixty-one male Wistar rats (aged ~3 months) were divided into the following groups: sham; 6 hours post-SCI; 24 hours post-SCI; 48 hours post-SCI; 72 hours post-SCI; and 7 days post-SCI. The results suggested that GFAP, but not S100B was associated with global histone H4 acetylation levels. Moreover, global histone H4 acetylation levels exhibited a complex pattern after SCI, encompassing at least three clearly defined phases ( first phase: no changes in the 6, 24 and 48 hours post-SCI groups; second phase: increased levels in the 72 hours post-SCI group; and a third phase: return to levels similar to control in the 7 days post-SCI group). Overall, these findings suggest global H4 acetylation levels exhibit distinct patterns of expression during the first week post-SCI, which may be associated with GFAP levels in the perilesional tissue. Current data encourage studies using H4 acetylation as a possible biomarker for tissue remodeling after spinal cord injury.

Epigenetics is a rapidly growing field that studies gene expression modifications not involving changes in the DNA sequence. Histone H3, one of the basic proteins in the nucleosomes that make up chromatin, is S-glutathionylated in mammalian cells and tissues, making Gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, glutathione (GSH), a physiological antioxidant and second messenger in cells, a new post-translational modifier of the histone code that alters the structure of the nucleosome. However, the role of GSH in the epigenetic mechanisms likely goes beyond a mere structural function. Evidence supports the hypothesis that there is a link between GSH metabolism and the control of epigenetic mechanisms at different levels (i.e., substrate availability, enzymatic activity for DNA methylation, changes in the expression of microRNAs, and participation in the histone code). However, little is known about the molecular pathways by which GSH can control epigenetic events. Studying mutations in enzymes involved in GSH metabolism and the alterations of the levels of cofactors affecting epigenetic mechanisms appears challenging. However, the number of diseases induced by aberrant epigenetic regulation is growing, so elucidating the intricate network between GSH metabolism, oxidative stress and epigenetics could shed light on how their deregulation contributes to the development of neurodegeneration, cancer, metabolic pathologies and many other types of diseases. Sin financiación 6.020 JCR (2017) Q1, 39/292 Biochemistry and Molecular Biology, 17/143 Endocrinology and Metabolism UEV

En el tiempo actual la epigenética y la enfermedad periodontal representan temáticas investigativas con cada vez mayor interacción entre sí. Objetivo: describir las características bibliométricas de las publicaciones encontradas en las diferentes bases de datos con relación a la epigenética en enfermedad periodontal. Métodos: este estudio bibliométrico desarrolló con el fin de poder recopilar la información que suministrada por los artículos científicos que trataran sobre epigenética y enfermedad periodontal, los cuales fueron recuperados mediante ecuaciones búsqueda en las bases de datos Pubmed, Scopus, Web of Science y Google académico. Resultados: en los 169 artículos obtenidos para la investigación se observó que los continentes con más aportes al campo de la investigación fueron: Asia, América del Norte, Europa, América del Sur, seguidamente de Oceanía y por último África. De los países que presentaron mayor predominio en publicaciones se encontró a Estados Unidos, China, India, Japón y seguidamente a Brasil. Por otra parte, las instituciones que demostraron mayor aporte al área fueron University of Michigan, University of North Carolina Chapell Hill y Unversity of Campinas, entre otras. Asimismo, las revistas con mayor participación de publicaciones científicas fueron Journal of periodontal dental research y Journal of Peridontology. Por otra parte, se observó que los investigadores con mayor participación en publicaciones fueron De Souza AP y Lena Larsson. Por último, el tipo de estudio más usado por parte de los investigadores fue el de ‘revisión bibliográfica’ seguidamente de ‘casos y controles’. Conclusión: se observó un aumento considerable de las publicaciones entre el año 2008 y el 2018, lo cual indica una preocupación por parte de los investigadores por obtener información más detallada sobre la interacción entre la enfermedad periodontal y la epigenética. At present epigenetics and periodontal disease represent research themes with increasing interaction each. Objective: to describe the bibliometric characteristics of the publications found in the different databases in relation to epigenetics in periodontal disease. Methods: This bibliometric study has been developed in order to gather information provided by scientific articles dealing with epigenetics and periodontal disease, which were retrieved through search equations in the databases Pubmed, Scopus, Web of Science and Academic google. Results: in the 169 articles obtained for the investigation it was observed that the continents with more contributions to the field of the investigation were: Asia, North America, Europe, South America, followed by Oceania and finally Africa. Of the countries with the greatest predominance in publications, the United States, China, India, Japan and then Brazil were found. On the other hand, the institutions that showed greater contribution to the area were the University of Michigan, University of North Carolina Chapell Hill and Unversity of Campinas, among others. Likewise, the journals with greater participation of scientific publications were Journal of periodontal dental research and Journal of Peridontology. On the other hand, it was observed that the researchers with greater participation in publications were De Souza AP and Lena Larsson. Finally, the type of study most used by the researchers was that of 'bibliographic review' followed by 'casescontrol studies'. Conclusion: A considerable increase in publications was observed between 2008 and 2018, indicating a concern on the part of researchers to obtain more detailed information on the interaction between periodontal and epigenetic disease. Odontólogo http://www.ustabuca.edu.co/ustabmanga/presentacion Pregrado

Submitted by Carolina Miziara Nogueira (carolina.nogueira@unesp.br) on 2019-12-16T19:52:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Carol Mestrado ULTIMO.pdf: 2006918 bytes, checksum: 55ab64263b1b51326243b24f4cd1ce70 (MD5) Approved for entry into archive by Laudicélia Martins Arantes (lm.arantes@unesp.br) on 2019-12-17T12:57:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 miziara_c_me_jabo.pdf: 2013812 bytes, checksum: fa93cc85c744bd8edfe9faac97cef67f (MD5) Made available in DSpace on 2019-12-17T12:57:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 miziara_c_me_jabo.pdf: 2013812 bytes, checksum: fa93cc85c744bd8edfe9faac97cef67f (MD5) Previous issue date: 2019-10-14 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) As tecnologias de reprodução assistida ou ARTs (“Assisted Reproductive Technology”) são amplamente utilizadas na reprodução humana e animal. Para estes procedimentos, gametas e embriões são expostos a um ambiente artificial que mimetiza o trato reprodutivo. Um dos fatores mais discrepantes neste contexto é a atmosfera gasosa, visto que in vivo a concentração de O2 encontrada no trato reprodutivo é menor do que a utilizada no ambiente in vitro, sendo comumente utilizada a concentração de 20% de oxigênio neste sistema artificial. Altas concentrações deste gás provocam estresse oxidativo e aumento das concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, consequente maior proporção de células apoptóticas em oócitos e embriões. Entretanto, pouco se sabe sobre as consequências da mudança de atmosfera gasosa durante as fases iniciais da produção in vitro de embriões e as possíveis consequências no remodelamento epigenético. Para validar a hipótese de que diferentes concentrações de oxigênio durante a maturação e a fecundação in vitro modulam a transcrição de genes envolvidos no estresse oxidativo e modeladores epigenéticos em oócitos, células do cumulus e embriões bovinos. Além disso, o estresse oxidativo gerado nos embriões exerce efeito sobre os níveis globais de metilação do DNA e marcas de histonas, cinco experimentos foram realizados com objetivo de investigar o papel da atmosfera gasosa nos passos iniciais da produção in vitro de embriões bovinos. Para diferenciar os efeitos da tensão de oxigênio nas etapas iniciais da PIVE o desenvolvimento embrionário foi analisado, testando a tensão de oxigênio atmosférica (20% O2) e a baixa tensão de oxigênio (5% O2) na maturação e fecundação in vitro de embriões bovinos. Os grupos formados foram: baixa tensão de O2 na maturação e fecundação in vitro (M5F5), baixa tensão de O2 na maturação e alta tensão na fecundação in vitro (M5F20), alta tensão de O2 na maturação e fecundação in vitro (M20F20) e alta tensão de O2 na maturação e baixa tensão na fecundação in vitro (M20F5). No primeiro experimento, analisou-se o efeito da tensão de oxigênio na maturação in vitro por meio da análise da metáfase II, quantificação da concentração intracelular de EROs e glutationa reduzida (GSH), assim como expressão de mRNAs relacionados a vias de resposta ao estresse oxidativo e remodelamento epigenético em oócitos e células do cumulus. Os resultados iniciais indicaram que oócitos maturados em alta e baixa tensão de O2 não apresentam diferença na maturação nuclear. Oócitos maturados em alta tensão de O2 geram maior concentração de EROs e GSH comparado ao ambiente de baixa tensão de oxigênio. As células do cumulus de oócitos submetidos a alta tensão de oxigênio na maturação in vitro, apresentaram níveis de transcritos maiores para o gene SOD1 relacionado a via de resposta ao estresse oxidativo celular. No segundo experimento, analisou-se o efeito da tensão de oxigênio na fecundação in vitro por meio da análise da taxa de fecundação. A partir dos dados obtidos neste experimento, foi constatado que zigotos expostos a um ambiente de baixa tensão de O2 na FIV não resultam em maior taxa de polispermia. Todos os presumíveis zigotos foram cultivados em baixa tensão de oxigênio até atingirem o estágio de blastocisto. No terceiro experimento, avaliou-se o efeito da tensão de oxigênio na maturação e fecundação in vitro e sua influência no desenvolvimento embrionário. Na taxa de blastocisto, quando houve interação entre ambos os fatores (tensão de oxigênio na MIV e FIV) (one way ANOVA, p≥0.05), a produção de embriões demonstrou que o grupo M20F20 apresentou uma maior produção (50.63 ± 4.55) em relação aos grupos M20F5 (29.66 ± 2.81), M5F5 (32.00 ± 3.27) e M5F20 (31.88 ± 3.99). No entanto, na análise dos efeitos dos fatores (two way ANOVA, p≤0.05), a alta tensão de oxigênio mostrou um efeito benéfico na MIV e FIV através das taxas de desenvolvimento. Na análise de expressão gênica dos blastocistos não houve interação (p>0.05), de modo que os efeitos principais de MIV (p 0.05), so that the main effects of IVM (p

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As famílias Acanthuridae e Holocentridae constituem grupos de peixes marinhos com alta representatividade em recifes de corais, onde desempenham importantes funções ecológicas no equilíbrio ambiental. Aspectos biológicos, filogeográficos e taxonômicos destas famílias são amplamente conhecidos, contudo, seus aspectos citogenéticos são incipientes. Com vistas a ampliar o conhecimento acerca da evolução cariotípica e possíveis variações citogenéticas interpopulacionais foram analisadas quatro espécies de Acanthuridae (A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus – Atlântico Ocidental; e Acanthurus triostegus - Índico) e três espécies de Holocentridae (Myripristis jacobus, Holocentrus adscensionis – Atlântico Ocidental; e Sargocentron rubrum – Índico). As análises utilizaram técnicas citogenéticas convencionais, coloração com fluorocromos base-específicos e mapeamento de sequências repetitivas DNAr 18S, DNAr 5S, histonas H3 e H2B-H2A, microssatélites (GA)15, transposons Tol2 e retrotransposon Rex3, através da hibridação fluorescente in situ. Entre os Acanthuridae, A. triostegus apresentou um padrão cariotípico considerado basal para Percomorpha (2n=48; NF=48), enquanto as espécies do Atlântico Ocidental exibiram uma divergência cariotípica sequencial associada à divergência filogenética. Variação interpopulacional de sítios DNAr 18S foi identificada entre populações de A. coeruleus do Atlântico Ocidental e do Caribe. O mapeamento de sítios DNAr 18S, DNAr 5S, DNAhis H2B-H2A e H3 mostraram padrões microestruturais no gênero Acanthurus. As espécies de holocentrídeos M. jacobus e S. rubrum apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos, enquanto H. adscensionis, 2n=50 (2m+6sm+16st+26a). Neste grupo os sítios DNAr 18S e 5S constituem marcadores citotaxonômicos discriminantes, onde elementos Rex e repetições microssatélites (GA)15 se mostraram co-localizados. Apesar das amplas distâncias geográficas não foram evidenciadas variações interpopulacionais em M. jacobus e H. adscensionis. Os resultados obtidos, indicaram uma evolução horotélica e mais diversificada nas espécies de Acanthurus do Atlântico, com diversificação mais recente, em relação a A. triostegus, pertencente ao Indo-Pacífico, centro de origem deste grupo. Enquanto a presença de cariótipos 2n=48a em espécies de Holocentrinae (Sargocentron) e Myripristinae (Myripristis), destaca o compartilhamento de uma condição conservada em Percomorpha e sugere uma condição ancestral para a Holocentriformes. Ambos os grupos revelam divergências filogenéticas, mas também a manutenção de homeologias cromossômicas, e eventuais indícios de variação populacional (A. coeruleus), destacando a importância das análises citogenômicas correlacionadas aos padrões biogeográficos na compreensão das mudanças cariotípicas em grupos marinhos. The families Acanthuridae and Holocentridae are groups of marine fish with high representation in coral reefs, where they play important ecological functions in environmental balance. Biological, phylogeographic and taxonomic aspects of these families are widely known, however, their cytogenetic aspects are incipient. In order to increase the knowledge about karyotypic evolution and possible interpopulation cytogenetic variations, four species of Acanthuridae (A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus - Western Atlantic; and Acanthurus triostegus - Indian) and three Holocentridae species were analyzed. (Myripristis jacobus, Holocentrus adscensionis - West Atlantic; and Sargocentron rubrum – Indian Ocean). The analyzes used conventional cytogenetic techniques, base-specific fluorochrome staining and repetitive sequence mapping of 18S rDNA, 5S rDNA, histones H3 and H2B-H2A, microsatellites (GA)15, Tol2 transposons and Rex3 retrotransposon through fluorescent in situ hybridization. Between Acanthuridae, A. triostegus showed a karyotypic pattern considered basal for Percomorpha (2n = 48; NF = 48), while West Atlantic species exhibited a sequential karyotypic divergence associated with phylogenetic divergence. Interpopulation variation of 18S rDNA sites was identified between A. coeruleus populations of the Western Atlantic and Caribbean. The mapping of 18S rDNA, 5S rDNA, DNAhis H2B-H2A and H3 sites showed microstructural patterns in the Acanthurus genus. Holocentric species M. jacobus and S. rubrum presented 2n = 48 acrocentric chromosomes, while H. adscensionis, 2n = 50 (2m + 6sm + 16st + 26a). In this group the 18S and 5S rDNA sites constitute discriminating cytotaxonomic markers, where Rex elements and microsatellite repeats (GA)15 were co-located. Despite the wide geographical distances, no interpopulation variations were observed in M. jacobus and H. adscensionis. The results indicated a more diverse horotelic evolution in Atlantic Acanthurus species, with latest diversification, in relation to A. triostegus, belonging to the Indo-Pacific, center of origin of this group. While the presence of 2n = 48a karyotypes in Holocentrinae (Sargocentron) and Myripristinae (Myripristis) species, highlights the sharing of a conserved condition in Percomorpha and suggests an ancestral condition for the Holocentriformes. Both groups reveal phylogenetic divergences, but also the maintenance of chromosomal homeologies, and possible signs of population variation (A. coeruleus), highlighting the importance of cytogenomic analyzes correlated with biogeographic patterns in understanding karyotypic changes in marine groups.

A lesão central de células gigantes (LCCG) é uma lesão osteolítica benigna que acomete os ossos gnáticos, apresenta etiologia controversa e possui comportamento biológico variável, podendo ser classificada em agressiva e não agressiva. Apesar de ser bastante vascularizada, não existe consenso se é uma lesão de origem vascular neoplásica ou proliferativa reacional, e entidade distinta do tumor de células gigantes (TCG). Acredita-se que os TCG compartilhem de características histológicas e possuam comportamento biológico semelhante ao da LCCG agressiva, entretanto, o TCG apresenta uma mutação gênica localizada no gene H3F3A códon G34W da proteína histona H3.3, ainda pouco explorada nas LCCG. O propósito deste estudo foi avaliar comparativamente 38 espécimes de LCCG agressivas (n=9) e não agressivas (n=29) utilizando os marcadores WT1, CD31 e CD105 (angiogênicos) e histona H3.3 G34W (mutacional), por meio da técnica de imunoistoquímica. O WT1 foi expresso positivamente em todos os espécimes, tanto nas células mononucleares como nas células gigantes, com maior expressão em células mononucleares de lesões agressivas. O CD31 e o CD105 foram expressos nos microvasos, e a densidade microvascular (DMV) de ambos foi maior nas lesões agressivas. A DMV do CD105 foi superior a encontrada pelo CD31, indicando um grau de neoangiogênese superior para ambos os grupos quando comparados com a vascularização pré-existente identificada pela expressão de CD31. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a expressão dos marcadores angiogênicos e o comportamento biológico das LCCG. Não houve expressão de mutação gênica da histona H3.3, tanto nas lesões agressivas quanto nas não agressivas. Em síntese, os resultados indicam que as LCCG são lesões de natureza vascular neoplásicas proliferativas, apresentam um perfil angiogênico proliferativo nas lesões agressivas e não agressivas e que, independente do seu comportamento biológico, não expressam mutação da histona H3.3, o que caracteriza sua distinção dos TCG. A central giant cell lesion (CGCL) is a benign osteolytic lesion that affects gnathic bones and has a controversial etiology, a variable biological behavior, and can be classified as aggressive or nonaggressive. Although it is highly vascularized, there is no consensus about its neoplastic or proliferative vascular origin or whether it is a distinct lesion from a giant cell tumor (GCT). It is speculated that a GCT shares histological features and has a biological behavior similar to aggressive CGCLs. A genetic mutation located in the H3F3A gene codon G34W of the histone H3.3 protein has been found in GCTs; however, little is known about this mutation in CGCLs. The purpose of this study was to evaluate aggressive (n = 9) and nonaggressive (n = 29) CGCL specimens using WT1, CD31 and CD105 (angiogenic) and histone H3.3 G34W (mutational) markers using an immunohistochemistry technique. WT1 was positively expressed in all specimens, both in mononuclear and giant cells, with higher expression in aggressive CGCL mononuclear cells. CD31 and CD105 were expressed on microvessels, and their microvascular density (MVD) was higher in aggressive lesions. The CD105 MVD was higher than the CD31 MVD, indicating a higher degree of neoangiogenesis in both groups compared to the preexisting vascularization. There was no statistically significant difference between angiogenic marker expressions between groups. There was no expression of histone H3.3 gene mutation in aggressive or nonaggressive lesions. In summary, the results indicate that CGCLs are proliferative neoplastic vascular lesions that present a high proliferative angiogenic profile in aggressive and nonaggressive lesions and, despite their biological behavior, do not express histone H3.3 mutation, which characterizes the distinction of GCTs. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

Las modificaciones epigenéticas tales como acetilación, fosforilación, ubiquitinación y ADP-ribosilación de las histonas influyen en la genética potencial del DNA. El nivel de acetilación de las histonas está controlado por las acetilatransferasas de histonas (HAT) y las Desacetilasas de histonas (HDAC). El patógeno humano Candida albicans puede crecer en al menos cuatro diferentes morfologías: levaduras, pseudohifas, hifas y clamidosporas. Las pseudohifas y las hifas son formas elongadas y se engloban bajo la denominación de formas filamentosas. El cambio entre todas las morfologías es resultado de compleja interacción entre factores internos y externos y está coordinado in parte por proteínas que regulan polaridad y que están conservadas en las células eucariotas. En C. albicans existen múltiples rutas de regulación que controlan la transición levadura-hifa. Estas rutas controlan la transcripción de un set de genes específicos de hifa, la mayoría de ellos codifican conocidos factores de virulencia. Efg1p es el mayor regulador morfogenético de C. albicans. Sin3p, un componente del complejo multiproteico de Desacetilasas de histonas Sin3p-Rpd3p en Saccharomyces cerevisiae, se une al promotor del gen EFG1. Con todos los datos obtenidos se propuso un modelo que explica la relación entre Efg1p-Sin3p y las HDAC en la morfogénesis de C. albicans. En esta levadura existen al menos cinco HDACs. El objetivo de este trabajo fue entender el papel de dos de ellas, Hos3p y Rpd3p en la regulación de la morfogénesis de la levadura patógena C. albicans.En este trabajo, se interrumpieron tres genes que codifican las proteínas Hos3p y Rpd3p (dos de ellos) en C. albicans y se analizó el papel de los mismos en la morfogénesis, en especial en la transición levadura-hifa.Las células carentes del gen HOS3 mostraron una morfología similar a la del silvestre tanto en medio sólido como en medio líquido, incluso durante la transición dimórfica. También fueron capaces de formar clamidosporas. Se analizó el perfil global de transcripción y se obtuvieron 233 genes cuya expresión se veía afectada por la interrupción del gen HOS3 tras la comparación del mutante ?hos3 y la cepa silvestre. Estos genes pertenecían a diferentes categorías funcionales, principalmente metabolismo, transporte celular y comunicación celular y transducción de la señal.C. albicans tiene dos genes homólogos al gen que codifica la HDAC Rpd3p en S. cerevisiae. Ambos genes fueron interrumpidos y el doble mutante presentaba alteraciones en la transición levadura-hifa y la formación de clamidosporas. Los mutantes sencillos presentaron fenotipo similar a la cepa silvestre. El doble mutante además presentó alterada la expresión de los genes implicados en el cambio dimórfico EFG1, CPH1, YWP1 y HWP., Epigenetic modifications, such as acetylation, phosphorylation, methylation, ubiquitination, and ADP ribosylation, of the highly conserved core histones, H2A, H2B, H3, and H4, influence the genetic potential of DNA. The enormous regulatory potential of histone modification is illustrated in the vast array of epigenetic markers found throughout the genome. The histone acetylation level is balanced by histone acetyltrasferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC). The human fungal pathogen, Candida albicans can grow in at least four different morphologies: yeast, pseudohyphae, hyphae and chlamydospore. Pseudohyphae and hyphae are both elongated and sometimes there has been little attempt to distinguish between them, as both are "filamentous forms" of the fungus. The switch between these forms is the result of a complex interplay of external and internal factors and is coordinated in part by polarity-regulating proteins that are conserved among eukaryotic cells. C. albicans uses a network of multiple signaling pathways to control the yeast-->hypha transition. These pathways control the transcription of a common set of hypha-specific genes, many of which encode known virulence factors. Efg1p is the mayor regulator of morphogenesis in C. albicans. Sin3p, a component of a specific histone deacetylase complex Sin3p-Rpd3p in S. cerevisiae, was shown to bind to the EFG1 promoter. A proposed model explains the relationship between Efg1p-Sin3p and HDAC in morphogenesis. C. albicans has at least five HDACs. The focus of our work was on understanding the role of two of them, Hos3p and Rpd3p in the regulation of the morphogenesis in the pathogen yeast C. albicans.In this work, we have disrupted three genes which codified to Hos3p and Rpd3p (two of them) in C. albicans and have analyzed their role in morphogenesis and especially in the yeast-hypha transition.Cells lacking of HOS3 gene could grow normally on solid or in liquid media, even during the yeast-hypha transition. ?hos3 cells were able to form normal chlamydospores. We have analyzed global transcription profile and we obtained 233 differentially expressed genes after comparison of the hos3 mutant with the C. albicans wild type strain. These genes belong to several functional categories mainly those involved in metabolism, cellular transport and cellular communication/signal transduction. C. albicans has two genes homologous to ScRpd3p. We have disrupted both genes and the double mutant showed an altered behaviour during the dimorphic switch and chlamydospores formation. Single mutants presented wild type phenotype. The double mutant has also altered the expression of EFG1, CPH1, YWP1 and HWP1, genes implicated in morphogenesis.

Introduction: Multiple factors, including both genetic and environmental mechanisms, appear to play a role in the aetiology of headache. An interesting area of study is the possible involvement of epigenetic mechanisms in headache development and the transformation to chronic headache, and the potential role of these factors as a therapeutic target. Methods: We performed a literature review of the involvement of different epigenetic mechanisms in headache, mainly using the Medline/PubMed database. To this end, we used the following English search terms: headache, migraine, epigenetics, DNA methylation, histones, non-coding RNA, and miRNA. Results: A total of 15 English-language publications related to the above terms were obtained. Conclusion: There is limited but consistent evidence of the relationship between epigenetics and headache; it is therefore essential to continue research of epigenetic changes in headache. This may help to understand the pathophysiology of headache and even to identify candidate biomarkers and new, more effective, therapeutic targets. Resumen: Introducción: En las cefaleas parece existir una influencia multifactorial, tanto de mecanismos genéticos como ambientales, siendo interesante el estudio de la posible participación de mecanismos epigenéticos en su desarrollo, cronificación y potencial papel como diana terapéutica. Métodos: Hemos llevado a cabo una revisión bibliográfica, principalmente a través de la base de datos Medline/PubMed, de la implicación de los distintos mecanismos epigenéticos en las cefaleas. Para ello hemos utilizado los términos de búsqueda en inglés: headache, migraine, epigenetics, DNA methylation, histones, non-coding RNA y miRNA. Resultados: Se obtuvieron un total de 15 publicaciones en idioma inglés relacionadas con los términos anteriores. Conclusiones: Existen indicios de la relación entre la epigenética y las cefaleas, siendo imprescindible, debido al reducido número de estudios, continuar con la investigación de las modificaciones epigenéticas en las cefaleas. Esto podría ayudar a comprender la fisiopatología de las cefaleas e incluso identificar biomarcadores y nuevas dianas terapéuticas más eficaces.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Os estudos sobre epigenética no carcinoma de células escamosas de boca (CCEB) são raros. As modificações pós-traducionais de histonas (MPTHs) são reguladores essenciais da expressão gênica e estão desreguladas nos cânceres. Nesse estudo, objetivou-se avaliar a expressão de demetilação de H3K4 (H3K4me2), trimetilação de H3K4 (H3K4me3) e acetilação de H3K14 (H3K14ac) no CCEB e a relação delas com metástase e sobrevida. Amostras parafinadas de 90 casos de CCEB foram obtidas e submetidas à marcação imuno-histoquímica com os anticorpos anti-H3K4me2, anti-H3K4me3 e anti-H3K14ac. Para determinar seu papel na metástase, os pacientes foram divididos em tumores primários não metastáticos (PNM) e primários metastáticos (PM). Todas as imunomarcações foram avaliadas usando o software Image J e as expressões nucleares aferidas de acordo com o índice de densidade ótica integrada (IOD). A expressão de cada MPTH foi comparada entre PNM e PM, análises de correlação entre elas e as características clinicopatológicas foram investigadas. Testes de sensibilidade e especificidade foram estabelecidos para cada MPTH através da curva ROC; sendo a curva também usada para estabelecer o cut off de cada modificação e distinguir entre tumores com alta e baixa expressão. Curvas de sobrevida e análises univariada e multivariada também foram empregadas. A positividade das células tumorais foi nuclear. A mediana da expressão de H3K14ac foi significativamente maior no grupo PM. O aumento de H3K4me3 foi correlacionado com tabagismo, diferenciação tumoral e sobrevida. Além disso, altos expressão de H3K4me3 tiveram um impacto negativo na sobrevivência dos pacientes. A curva ROC mostrou que a H3K14ac apresentou a maior sensibilidade (81,3%), sugerindo o uso desta como ferramenta de triagem de pacientes com potencial de desenvolver metástases (N0). Nenhuma das MPTHs mostrou ser um fator de prognóstico independente pela análise multivariada. A avaliação conjunta dos níveis de expressão das MPTHs mostrou que a combinação de baixos níveis de H3K4me2, altos H3K4me3 e altos H3k14ac afetaram significativamente a sobrevivência do grupo PM. Em conclusão, nossos achados mostraram que H3K14ac estava altamente expressa no grupo PM. Altos níveis de H3K4me3 diminuíram a sobrevida dos pacientes, além do aumento desta estar correlacionado aos pacientes tabagistas e também com tumores menos diferenciados. Studies on epigenetics in oral squamous cell carcinoma (OSCC) are rare. Post-translational histone modifications (MPTHs) are essential regulators of gene expression and are deregulated in cancers. In this research we investigated the expression of demethylation of H3K4 (H3K4me2), trimethylation of H3K4 (H3K4me3) and acetylation of H3K14 (H3K14ac) in OSCC and their relationship with metastasis and survival. Paraffin-embedded tissue samples of 90 OSCC patients were raised and submitted to immunohistochemical staining with the antibodies against H3K4me2, H3K4me3 and H3K14ac. To determine their role in metastasis, OSCC patients were divided into two groups: primary non-metastatic tumors (PNM) and primary metastatic ones (PM). The nuclear MPTHs expression was measured according to the integrated optical density index (IOD) by using the software Image J. The expression of each MPTH was compared between the PNM and PM groups; correlation analyzes between them and the clinicopathological characteristics were also investigated. Sensitivity and specificity tests were established for each MPTH through the ROC curve; The ROC curve was also used to establish the cutoff point for each MPTH in order to distinguish high and low-expressing MPHT tumors. Survival curves and univariate and multivariate analyzes were also employed. All tumor cells were positive in the nucleus. Median H3K14ac expression was significantly higher in the PM group. An increased H3K4me3 expression was correlated with smoking, tumor differentiation and reduced survival. In addition, high levels of H3K4me3 had a negative impact on patient’s survival. The ROC curve showed that H3K14ac had the highest sensitivity (81.3%), suggesting that it might be used as a screening test for detecting N0 OSCC patients with great potential to develop metastasis during the course of their diseases. None of the MPTHs showed to be an independent prognostic factor in the multivariate analysis. A combination of MPTHs expression levels showed that low H3K4me2, high H3K4me3 and high H3k14ac expression significantly affected the patients’ survival from the PM group. In conclusion, our findings showed that H3K14ac was highly expressed in the PM group. High levels of H3K4me3 decreased the survival of patients and were correlated with tobacco use and less differentiated tumors. Tese (Doutorado)

[spa] En los metazoos existen múltiples variantes de histona H1, siendo algunas de ellas específicas de la línea germinal y la embriogénesis temprana. Las variantes embrionarias están presentes mientras el genoma del zigoto está transcripcionalmente inactivo y posteriormente son reemplazadas por las variantes de H1 somáticas. En el caso de Drosophila, la reducción de los niveles de la variante embrionaria, dBigH1, tiene como resultado la activación prematura del genoma zigótico, lo que sugiere una posible implicación de dBigH1 en la represión del genoma. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral hemos utilizado células S2 de Drosophila, que no expresan dBigH1, para caracterizar los efectos diferenciales de dBigH1 sobre la transcripción en comparación con la variante somática, dH1. Hemos visto que cuando expresamos dBigH1 en células S2 se incorpora a la cromatina uniformemente y, además, reemplaza la dH1. La expresión de dBigH1 en estas células, además, regula negativamente la transcripción. Esta regulación negativa se debe a que dBigH1 interfiere en la unión de la RNA polimerasa II y en la acetilación de las histonas. Por otro lado, en este trabajo también hemos estudiado la función de los diferentes dominios de dBigH1 y hemos encontrado que el dominio C-terminal es necesario para su unión a la cromatina. En cambio, la región N-terminal contiene una región rica en residuos ácidos, llamada dominio ED, que es el responsable del reemplazo de dH1 y la represión de la transcripción ya que cuando expresamos una forma truncada de la proteína que no contiene el dominio ED, dBigH1 no interfiere en la unión de la RNA polimerasa II y la acetilación de las histonas. Además, dBigH1 está presente en la línea germinal femenina. dBigH1 se expresa en las células madre germinales y en sus hijas, los cistoblastos. Posteriormente desaparece en la región de divisiones mitóticas y se vuelve a expresar en las cámaras ováricas. A medida que se desarrollan las cámaras ováricas, la expresión de dBigH1 queda restringida al oocito. Además, en la línea germinal femenina encontramos dH1, que coexiste con dBigH1 en las células madre germinales, cistoblastos y, durante los primeros estadios del desarrollo de las cámaras ováricas, el oocito. En este trabajo hemos visto que las células que contienen ambas variantes son activas transcripcionalmente. Sin embargo, cuando el genoma del oocito está totalmente silenciado únicamente encontramos dBigH1, a excepción de los estadios 8-11, en los que dBigH1 permite la reanudación de la actividad transcripcional. En este trabajo también hemos estudiado la regulación de la expresión de dBigH1 en la línea germinal femenina y hemos encontrado que está regulada postranscripcionalmente mediante señales localizadas en la región 3’UTR del mRNA. Finalmente, hemos encontrado que uno de los responsables de la regulación de dBigH1 es Brat, probablemente de manera directa a través de la unión al 3’UTR del mRNA de dBigH1., [eng] Linker histones H1 are one of the main components of chromatin. Histone H1 is a highly heterogeneous family of proteins and several variants have been described in metazoa. Some of them are specifically expressed in the germline and are retained in the early embryo. However, in Drosophila, only one somatic H1, dH1, and one embryonic and germline-specific variant, dBigH1, have been described. dBigH1 is present during early embriogenesis, when the zygotic genome is silenced and is replaced at cellularization by dH1. The reduction of dBigH1 levels results in a premature activation of the zygotic genome, suggesting a role of dBigH1 in transcriptional silencing. We report here that ectopic expression of dBigH1 in Drosophila S2 cells results in dBigH1 binding across chromatin and replacement of dH1. This binding and replacement result in down-regulation of gene expression by altering RNApol II binding and histone acetylation at promoters. We also show that the effects of dBigH1 depend on the highly acidic ED-domain of the N-terminal tail, since a truncated form lacking this domain does not replace dH1 or affect transcription. We also show that dBiH1 is present in the female germline. dBigH1 is expressed in the germ stem cells and cystoblasts, disappears in the mitotic divisions region and is expressed again in cysts cells that are surrounded by the follicular cells to form an egg chamber. As the egg chambers develop, dBigH1 expression is restricted to the oocyte. In the germline dBigH1 and dH1 coexist in germ stem cells, cystoblasts and early oocytes. However, dBigH1 is the only variant present in the oocyte when is completely silenced. We demonstrate also that in cyst cells, dBigH1 expression is postranscriptionally regulated through signals present in the mRNA 3’UTR region. Finally, we show that Brat participates in the down-regulation of dBigH1 expression, probably through a direct mechanism.

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA, microRNAs e modificações pós-traducionais (MPT) de histonas tem sido alvo de grande estudo para as mais diversas doenças, inclusive o câncer, uma vez que estão envolvidas no controle de expressão gênica. Modificações pós-traducionais de histonas (MPTH) controlam o acesso da cromatina aos mais diversos fatores de transcrição e modulam assim a expressão e o silenciamento dos genes, e portanto, alterações em suas expressões contribuem para o aparecimento de tumores. Este trabalho teve como objetivo obter dados sobre a presença de MPTH, em especial acetilação, em dois dos mais frequentes tumores malignos de glândulas salivares que possuem similaridades morfohistogenéticas, mas comportamentos distintos: o adenocarcinoma polimorfo (ACP) e o carcinoma adenoide cístico (CAC). Para isso, avaliamos por imunohistoquímica a expressão de H3K9ac e H4K12ac em 29 casos de ACP e 38 de CAC, tendo como referência de sua expressão em amostras teciduais glandulares não neoplásicas, admitidamente normais. Para tanto, foi construído um índice traduzisse intensidade de absorbância por área nuclear do parênquima tumoral, designada IOD. As análises mostraram que valores de IOD para H3K9ac foram significativamente diferentes entre ACP (média: 0,144; DP: ± 0,08) para o controle e CAC (média: 0,27; DP: ± 0,07) (p < 0,05). Já os valores de IOD obtidos para H4K12ac apresentaram diferenças estatisticamente significativas tanto para o ACP (média: 0,114; DP: ± 0,06) como para o CAC (média: 0,115; DP: ± 0,06) comparado aos controles (p < 0,05). Quando os valores de IOD para H3K9ac e H4K12ac foram analisados segundo estratificações predefinidas das variáveis clinicopatológicas, as diferenças significativas foram observadas para os casos recidivantes, que apresentaram valores menores de IOD para H3K9ac em relação aos não recidivantes (p = 0,02). Para H4K12ac, portadores de metástase do grupo de CAC apresentaram valores maiores em relação aos não metastáticos (p = 0,04). Não encontramos correlação entre H3K9ac e H4K12ac com a proliferação celular (Ki67). Conclui-se que variações de expressão nessas modificações podem contribuir para o surgimento desses tumores. Os resultados apontam para a possiblidade de fenômenos de acetilação influenciarem no comportamento do tumor. Todavia, os resultados obtidos necessitam de maior consistência para sua confirmação. Epigenetic changes such as DNA methylation, microRNAs, and post-translational modifications (PTM) of histones have been the subject of major study for a variety of diseases, including cancer, since they are involved in the control of gene expression. Histone post-translational modifications control chromatin access to the most diverse transcription factors and thus modulate gene expression and silencing, therefore, changes in these modifications contribute to the appearance of tumors. The aim of this study was to obtain data on the presence of PTM, especially acetylation, in two of the most common malignant tumors of salivary glands that have morphohistogenetic similarities, but different behaviors: polymorphous adenocarcinoma (PAC) and adenoid cystic carcinoma (ACC). For this, we evaluated by immunohistochemistry the expression of H3K9ac and H4K12ac in 29 cases of PAC and 38 of ACC, with reference to its expression in admittedly normal non-neoplastic glandular tissue samples. For this, an index was constructed to translate absorbance intensity by nuclear area of the tumor parenchyma, called IOD. The analysis showed that IOD values for H3K9ac were significantly different between PAC (mean: 0.144; SD: ± 0.08) for the control and ACC (mean: 0.27, SD: ± 0.07) (p < 0.05). On the other hand, the values of IOD obtained for H4K12ac showed statistically significant differences for the PAC (mean: 0.114, SD: ± 0.06) and for the ACC (mean: 0.115, SD: ± 0.06) compared to controls (p < 0.05). When IOD values for H3K9ac and H4K12ac were analyzed according to predefined stratifications of clinicopathological variables, significant differences were observed for recurrent cases, which presented lower IOD values for H3K9ac than non-recurrent ones (p = 0.02). For H4K12ac, carriers of metastasis in the ACC group presented higher values than non-metastatic (p = 0.04). We found no correlation between H3K9ac and H4K12ac with cell proliferation (Ki67). It is concluded that variations in expression of these modifications may contribute to the appearance of these tumors. The results also point to the possibility that acetylation phenomena influence the behavior of the tumor. However, the results obtained require more consistency for its confirmation. Dissertação (Mestrado)

El glutatión (GSH) es el antioxidante no enzimático más abundante en las células de mamífero, constituido por un tripéptido glutamato-cisteína-glicina. Gracias al grupo sulfhidrilo de la cisteína, actúa como donador de electrones para reducir enlaces disulfuro entre cisteínas, reaccionar con especies reactivas de oxígeno mediante su grupo tiol oxidándose a glutatión disulfuro (GSSG)- o para convertir el peróxido de hidrógeno en dos moléculas de agua inocua para la célula mediante la acción de la enzima glutatión peroxidasa, entre otros antioxidantes enzimáticos. No obstante, en la actualidad se están estudiando otras funciones relacionadas con el GSH como es el caso de las modificaciones postraduccionales glutationilación de proteínas o su relación con la regulación epigenética, dado que algunas moléculas y metabolitos intermediarios de la síntesis de glutatión lo son a su vez de las rutas de metilación de ADN e histonas. Con la finalidad de analizar la relación entre el nivel de estado redox celular debido a niveles de GSH y la alteración de modificaciones postraduccionales en histonas, se ha optimizado un protocolo para disminuir la concentración de GSH celular mediante tratamiento con diamida en células HeLa, y se ha analizado mediante citometría de flujo, fluorimetría y microscopía de fluorescencia. En algunas patologías de carácter progeroide, caracterizadas por cursar con envejecimiento prematuro y en las que se ha observado alteraciones en la estructura de la cromatina, se ha comprobado que uno de los factores de relevancia es el estrés oxidativo que padecen a nivel celular, además de mostrar niveles disminuidos de GSH. Por esta razón, paralelamente se ha trabajado con líneas de fibroblastos humanos dos controles y un paciente de la patología progeroide síndrome de Werner analizando tanto enzimas antioxidantes, como modificaciones en histonas., Glutathione (GSH) is the most abundant non-enzymatic antioxidant in mammalian cells, constituted by a glutamate-cysteine-glycine tripeptide. Thanks to its sulfhydryl residue, acts as an electron donor to reduce disulfide bonds between cysteines, to react with reactive oxygen species by means of its thiol group, or to convert hydrogen peroxide into two molecules of water -safe for the cell- through the action of the enzyme glutathione peroxidase, among other antioxidant enzymes. However, other functions related to GSH are currently being studied, as is the case of post-translational modifications protein glutathionylation- or its relation to epigenetic regulation, since some molecules and intermediate metabolites in the synthesis of glutathione are also involved in DNA and protein methylation pathways. In order to analyze the relationship between the cellular redox state due to GSH levels and alterations in histone posttranslational modifications, a treatment has been optimized to reduce cellular GSH concentration by treatment with diamide in HeLa cells, and the effect has been analyzed by flow cytometry, fluorimetry, and fluorescence microscopy. In some pathology with progeroid features, characterized by premature ageing and in which alterations in chromatin structure have been observed, it has been shown that one of the relevant factors is the oxidative stress they show at the cellular level, besides having reduced levels of GSH. For this reason, in parallel we have worked with human fibroblast cell lines two controls and a patient with Werner syndrome analyzing antioxidant enzymes and modifications in histones.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2019. As células estromais mesenquimais (CEM), originalmente isoladas da medula óssea, estão presentes em vários outros tecidos, como o tecido adiposo (TA) e apresentam grande potencial de uso na Medicina Regenerativa. A facilidade de obtenção, a eficiência e a qualidade das CEM são fundamentais para o sucesso da terapia celular. De acordo com a localização anatômica, o TA é obtido por procedimentos cirúrgicos distintos, como lipoaspiração (mais comum), abdominoplastia e ritidoplastia, além de apresentar origem embrionária diferente. Sabe-se que longos períodos de cultivo podem comprometer a integridade das células levando ao aumento do estresse oxidativo e predispor a danos no DNA. Tendo em vista estes aspectos, neste trabalho foram avaliadas comparativamente as CEM de TA (CEM-TA) facial e abdominal quanto à integridade celular e genética durante a senescência replicativa (passagens baixa, média e alta) e após a exposição à radiação ultravioleta (RUV) A e B. Inicialmente foi avaliado o rendimento tecidual e celular das amostras obtidas do TA por ritidoplastia e lipoaspiração. A seguir, foram avaliados o padrão fenotípico mesenquimal, a morfologia e adesão ao plástico, a viabilidade celular e o acúmulo de yH2AX (biomarcador de dano de DNA) durante as passagens celulares (baixas, médias e altas) submetidas ou não à RUV. Os resultados mostraram que as CEM analisadas são similares quanto às características mesenquimais: morfologia fusiforme, adesão ao plástico, presença de marcadores de membrana de células mesenquimais e ausência de células hematopoiéticas. Na condição padrão de cultivo (não exposição à RUV), ambas as CEM-TA (faciais e abdominais) apresentaram redução progressiva do número total de células com o aumento das passagens. Destaca-se que as CEM-TA faciais apresentaram maior número de células do que as abdominais em passagens baixas e menor acúmulo de dano antes e após a exposição à RUV-B. Por outro lado, o TA abdominal apresentou melhor rendimento celular e tecidual, e as CEM-TA desta região anatômica, menor acúmulo de dano de DNA após a exposição à RUV-A do que as CEM-TA faciais. Entretanto, após a RUV as CEM-TA de ambas as fontes apresentaram alterações morfológicas durante a expansão celular tornando-se mais espalhadas e hipertróficas, similares às células senescentes. Em conclusão, CEM-TA de diferentes regiões anatômicas possuem propriedades biológicas distintas. Este trabalho fornece ainda evidências da importância de se avaliar a estabilidade das CEM-TA durante o cultivo e expansão celulares visando o uso em futuras aplicações clínicas. Abstract: Mesenchymal stromal cells (MSCs), originally isolated from bone marrow, are also found in other tissues, including adipose tissue (TA). They are applicable for the use in the Regenerative Medicine because of the easy obtaining. Therefore, the efficiency and quality of MSCs are fundamental for the success of the cellular therapy. According to the anatomical location, TAs are obtained by distinct surgical procedures, such as liposuction (the most commonly and widely used), abdominoplasty and rhytidoplasty and have different embryonic origin and distribution. Long periods in culture can compromise the cellular integrity resulting in oxidative stress and promoting DNA damage. Therefore, in this study MSCs form facial and abdominal TA were comparatively evaluated regarding cellular and genetic integrity during replicative senescence (at low, medium and high passages) and after exposure to ultraviolet radiation A (UVA) and B (UVB) in culture. The efficiency of tissue and cell obtaining from the TA were evaluated as well as the mesenchymal characterization profile (cell morphology and plastic adhesion, cell viability and accumulation of yH2AX - a DNA damage biomarker). Both MSC-TAs displayed the mesenchymal fusiform morphology, plastic adhesion and were positives to the mesenchymal cell surface markers and thus were characterized as facial and abdominal adipose tissue mesenchymal stromal cells (ASCs). The total number of ASCs (assessed by nuclei staining with DAPI) progressively decreased with the passages of culture. Under control conditions (no UVA or UVB stimulus) higher number of facial ASCs was recorded at low passages compared to abdominal ASCs. On the other hand, abdominal ASCs displayed higher levels of DNA damage before and after UVB exposure although they showed improved efficiency of cellular and tissue production. Moreover, Both UVA and UVA induced morphological changes in both ASCs that became more spread and hypertrophic during cell expansion and passages. Therefore, ASCs from different anatomical locations display distinct biological properties. In summary, this paper provides evidence for the importance of assessing ASC stability during cell culture and expansion aiming their safer use in future applications of cell therapy and regenerative medicine.