Search

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2014. Compostos bioativos com propriedades antioxidantes, tais como flavonoides e glutationa, agem como tampões redoxes, interagindo com numerosos componentes celulares. Este trabalho tem por objetivo avaliar a regulação transcricional por óxido nítrico da via de biossíntese de glutationa em folhas de milho e elucidar a regulação molecular da via de síntese de flavonoides em frutos de pimenta através da análise de QTL. No primeiro estudo a apocinina foi utilizada como um indutor da síntese de óxido nítrico em folhas de duas cultivares de milho (Zea mays L.), SHS 3031 e DKB 240. Os níveis de transcritos dos genes codificadores de ß-glutamilcisteína sintetase (y-ecs), glutationa sintetase (gshs), chalcone sintase (chs), flavanona 3-ß-hidroxilase (fht1), glutationa S-transferase (gst23), ascorbato peroxidase (apx1, apx2), catalase (cat1, cat3) e superóxido dismutase (sod2) foram quantificados e a presença de NO foi detectada por microscopia de fluorescência. Não foi observado aumento na fluorescência nas folhas da variedade DKB 240 tratadas com apocinina, entretanto as folhas de SHS 3031 mostraram maior intensidade de fluorescência após 6 e 12 horas de tratamento. Já em relação aos níveis de transcritos analisados, foi observado que a transcrição de y-ecs, apx1, cat1 e sod2 aumentou 24 h após o tratamento com apocinina nas folhas da variedade SHS 3031. Observou-se que o óxido nítrico pode regular a transcrição de genes da via de síntese da glutationa e de enzimas antioxidantes em folhas de milho. No segundo estudo foi realizado o mapeamento genético de uma população F2 segregante derivada do cruzamento entre Capsicum annuum AC1979 (acesso nº 19) e Capsicum chinense seleção nº 4661 (acesso nº 18), onde foram encontrados 279 mQTLs, sendo dois hotspots de mQTL no cromossomo 9. A confirmação dos mQTLs utilizando cinco marcadores de genes candidatos dos flavonóides e os seus dados de expressão (eQTLs) indicou o fator de transcrição Ca-MYB12 no cromossomo 1 e o gene que codifica a flavona sintase (FS-2) no cromossomo 6, como os prováveis genes causadores da variação da chalcona naringenina e de flavona-C-glicosídeo, respectivamente. A combinação do perfil metabólico com a análise de QTL forneceu informações sobre a regulação molecular, as regiões genômicas e genes importantes da via de síntese dos flavonoides e outros metabólitos, o que poderá contribuir em estratégias de melhoramento para otimizar o conteúdo de metabólitos específicos em frutos de pimenta. Abstract : Bioactive compounds with antioxidant properties, such as flavonoids and glutathione, act as redox buffers interacting with numerous cellular components. This work aims to evaluate the transcriptional regulation of the glutathione biosynthesis pathway genes by nitric oxide in maize leaves and elucidate the molecular regulation of the flavonoids biosynthesis pathway in pepper fruits by QTL analysis. In the first study the apocynin was used as an inducer of nitric oxide synthesis in leaves of two maize (Zea mays L.) cultivars, DKB 240 and SHS 3031. The transcripts levels of the genes encoding y-glutamylcysteine synthetase (y-ecs), glutathione sintetase (gshs), chalcone synthase (chs), flavanone 3-ß-hidroxilase (fht1), glutathione S-transferase (gst23), ascorbate peroxidase (apx1, apx2), catalase (cat1, cat3) and superoxide dismutase (sod2) were quantified and the presence of NO was detected by fluorescence microscopy. No increase in fluorescence was observed in the leaves of the maize variety DKB 240 after the treatment with apocynin. However, the SHS 3031 leaves showed an higher fluorescence intensity after 6 and 12 hours of apocynin treatment. In relation to the transcript levels it was observed that the transcription of ?-ecs, apx1, cat1 and sod2 increased 24 h after apocynin treatment in leaves of SHS 3031. It was noted that the nitric oxide can regulate the transcription of the glutathione biosynthesis genes and in the antioxidant enzymes genes in maize leaves. In the second study it was conducted a genetic mapping of a F2 segragating population derived from a cross between Capsicum annuum AC1979 (access 19) and Capsicum chinense selection No. 4661 (access No. 18), where 279 mQTLs were found, with two mQTLs hotspots on chromosome 9. Confirmation of flavonoid mQTLs using a set of five flavonoid candidate gene markers and their corresponding expression data (e QTLs) indicated the Ca-MYB12 transcription factor gene on chromosome 1 and the gene encoding flavone synthase (FS-2) on chromosome 6 as likely causative genes determining the variation in naringenin chalcone and flavone C-glycosides, respectively. The combination of large-scale metabolite profiling and QTL analysis provided valuable insight into the genomic regions and important genes for the production of secondary metabolites, which may influence the breeding strategies aimed at optimising the content of specific metabolites in pepper fruit.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato. Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.