Search

Kayma gerilmelerine duyarlı hücrelerin üretilmesine yönelik tasarlanan, hassas karıştırma ve düşük kesme kuvvetlerinin oluşturulmasının yanında düşük yerçekimi etkisiyle 3 boyutlu (3D) hücre proliferasyonu sağlayabilen karıştırma elemanlarına sahip bir biyoreaktörün, prototipi üzerinde optimizasyon çalışmaları ve laboratuvar ölçeğinde HepG2 hayvan hücre hattı üzerinde kültür denemeleri gerçekleştirilmiştir. Düşük kesme kuvvetlerinin ve yerçekimi etkisinin sağlanması tez çalışmasının ana amacı olmakla birlikte, yapılan hücre ve doku kültürü denemeleri ile elde edilen sonuçlar ile bu hedef karşılanmıştır. Sözü edilen biyoreaktör tasarımı, yatay konumlandırılmış silindirik bir gövdeye ve karşılıklı yerleştirilen iki adet U biçimli karıştırıcıya sahiptir. Karşılıklı yerleştirilmiş ve biri diğerinin iç kısmına geçmiş olan çapa (anchor) benzeri karıştırıcılar, birbirlerinin hidrodinamik kuvvetlerini azaltıcı etki göstererek, biyoreaktörün merkezinde düşük kayma gerilimi karakterine sahip bir bölge oluşturmaktadır. Bilgisayar tabanlı akış dinamiği simülasyonları ile biyoreaktör içi hidrodinamik kuvvetler incelenmiş, bu bilgiler ışığında imalatı tamamlanan biyoreaktör sferoid üretimi için kullanılmaya başlanmıştır. Hali hazırda ticari olarak üretimi gerçekleştirilen benzer özelliklere sahip biyoreaktörlerin düşük çalışma hacmi ve döner gövdeye sahip olmalarının neden olduğu kontrol güçlüğü ve sürekli üretime olanak sağlamamaları, çalışmaların alanını kısıtlayan en önemli etkenlerdir. Tasarımı yapılan ve patentleme aşaması tamamlanmış olan söz konusu biyoreaktörün, ileri hücre kültürüne uygun şekilde prototiplendirilmesi ve hücre çalışmalarının yapılması ile mevcut düşük kayma gerilimi sağlayan biyoreaktörlerin sorunlarının üstesinden geldiği gösterilmiştir., The experiment in the studies was carried out on the prototype of a bioreactor, which is designed for the production of cells sensitive to shear stresses, with mixing systems that can provide sensitive mixing and low shear stress, as well as 3D cell proliferation with low gravity effect. It was attempted cell culture experiments on the HepG2 animal cell line at laboratory scale. The effect of gravity and low shear stress on the production of HpG2 spheroids in the bioreactor is the main purpose of the thesis.this goal has been met with the results obtained from the cell and tissue culture experiments. The aforementioned bioreactor design has a horizontally positioned cylindrical body and two U-shaped mixers placed opposite each other. Anchor-like stirrers placed opposite and intertwined with each other create a region with low flow characteristics in the center of the bioreactor by reducing the hydrodynamically forces of each other. The bioreactor, for which computer-based flow dynamics simulations (computational fluid dynamics) have been made, has been started to be used for the production of HepG2 spheroids, whose manufacturing has been completed. The difficulties in online control of process caused by the low working volume and rotating body of the bioreactors with similar characteristics, which are currently produced commercially, and the fact that they do not allow for continuous production are the most important factors limiting the scope of the studies. It is thought that the problems of existing low shear stress bioreactors can be overcome by prototyping the bioreactor in question, which has been designed and whose patenting phase has been completed, in accordance with advanced cell culture and conducting cell culture studies.

Kanser tedavisinde cerrahi yaklaşım, radyoterapi ve kemoterapi yıllardan beri kullanılmaktadır. Özellikle kemoterapik tedavide kanserli hücre ve dokuların dışında kalan kısımlarda oluşan yan etkileri azaltacak kombine tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi kanser tedavisinin başarı şansını artırmaktadır. Bu nedenle söz konusu yan etkileri azaltacak alternatif yöntemler sıkça araştırmalara konu olmaktadır. Sunulan çalışmada da bir antioksidan olarak arbutinin karaciğer karsinomu (HepG2) hücreleri üzerine olası etkileri ile bir kemoterapik ajan olan cisplatinin oluşturduğu toksikasyona karşı arbutinin HepG2 hücrelerinde etkinliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Arbutin ve cisplatinin antikanserojenik etkinlikte dozları MTT analizleri ile belirlendi. Arbutin izoformlarına ve cisplatine ait lethal lozlar (LD) belirlendikten sonra deney grupları (Grup 1: Kontrol, Grup 2:LD0 dozunda α-arbutin, Grup 3:LD50 dozunda α-arbutin, Grup 4: LD50 dozunda cisplatin Grup 5: Tedavi grubu LD50 dozunda Cisplatin + LD0 dozunda α-arbutin oluşturuldu. Deney gruplarından elde edilen numunelerde biyokimyasal olarak total antioksidan statü (TAS), total oksidan statü (TOS), oksidatif stres indeksi (OSI), proinflamatuvar stokin düzeyleri (TNF-α, IL-6 ve TGF-β1) belirlendi. Moleküler analizlerle ise DNA hasarı (comet testi ile), mikronükleus oluşumu aracılığı ile deney gruplarında yapılan uygulamaların genotoksisiteye etkisi belirlenmeye çalışıldı. Apoptozisle ilgili kaspaz 3 ve proliferasyonla ilgili Bcl-2 genlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri RT-PCR yardımıyla analiz edildi. Ayrıca oluşturulan in-vitro modellemede yapılan uygulamaların p53 ve kaspaz3 düzeylerine etkileri immunostokimyasal yöntemlerle analiz edildi. Sitotoksisite analizleri sonucunda α-arbutinin LD50 dozundaki sitotoksiste düzeyi β-arbutine göre daha yüksek çıktığı için çalışmalarda α-arbutin kullanıldı. Düşük doz (LD0 dozunda) α-arbutinin tek başına hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerine uygulandığında herhangi bir genotoksik ve sitotoksik etkileri olmadığı, inflamasyon, apoptoz ve proliferasyonu etkilemediği belirlendi. Bununla birlikte cisplatin toksikasyonu oluşturulduktan sonra tedavi amacıyla düşük doz arbutin kullanıldığında, cisplatin toksikasyonu sonucu artan oksidatif stres, inflamasyon, genotoksisite düzeylerinde düşüşler gözlenirken, bu durumdan kaspaz 3 seviyelerinin etkilenmediği belirlendi. α-arbutinin yüksek dozlarda (LD50 dozunda) HepG2 hücrelerine uygulanması sonucunda ise oksidatif stresi, genotoksisiteyi, inflamasyonu, apoptozu artırarak, proliferasyonu ise baskılayarak hepatosellüler karsinom hücrelerinde antikanserojen etkiler gösterebileceği belirlenmiştir. Elde edilen bulgular karaciğer karsinomu HepG2 hücre hattında cisplatin toksikasyonu sonucu oluşan hasarda arbutinin yararlı etkiler gösterebileceğine işaret etmektedir. Ayrıca sunulan çalışma ile HepG2 hücre hattında özellikle de yüksek dozlarda arbutin izoformlarının antikanserojenik etkilerinin olabileceğini göstermektedir. Surgical approach, radiotherapy and chemotherapy have been used in cancer treatment for many years. Especially in chemotherapeutic treatment, the development of combined treatment methods to reduce the side effects that occur outside the cancer cells and tissues increases the chance of success of cancer treatment. Therefore, alternative methods to reduce these side effects are frequently investigated. In the present study, it was aimed to determine the efficacy of arbutin against hepatic toxicity caused by cisplatin, a chemotherapeutic agent, with the possible effects of arbutin on liver carcinoma (HepG2) cells as an antioxidant. The doses of arbutin and cisplatin in anticarcinogenic efficacy were determined by MTT analysis. After lethal loses (LD) of arbutin isoforms and cisplatin were determined, experimental groups (Group 1: Control, group, Group 2: LD0 dose α-arbutin, Group 3: LD50 dose α-arbutin, Group 4: LD50 dose cisplatin, Group 5: Treatment group LD50 dose Cisplatin + LD0 dose α-arbutin was created. Biochemical total antioxidant status (TAS), total oxidant status (TOS), oxidative stress index (OSI), proinflammatory stokin levels (TNF-α, IL-6 and TGF-β1) were determined in the samples obtained from the experimental groups. Molecular analysis of DNA damage (comet test), the effect of micronucleus formation on genotoxicity in experimental groups were tried to determine the applications. mRNA expression levels of apoptosis-related kaspaz 3 and proliferation-related Bcl-2 genes were analyzed by RT-PCR. In addition, the effects of in-vitro modeling on p53 and kaspaz3 levels were analyzed by immunocytochemical methods. As a result of cytotoxicity analyzes, α-arbutin was used in the studies since the level of α-arbutine in LD50 dose cytotoxicity was higher than β-arbutine. When low dose (in LD0 dose) α-arbutine was administered to hepatocellular carcinoma (HepG2) cells alone, it was determined that it did not have any genotoxic and cytotoxic effects and did not affect inflammation, apoptosis and proliferation. However, when low dose arbutin was used for treatment after cisplatin toxicity was created, it was observed that the levels of oxidative stress, inflammation and genotoxicity decreased due to cisplatin toxicity. Caspase 3 levels were not affected. As a result of the application of α-arbutine to HepG2 cells at high doses (LD50 dose), it was determined that it may exhibit anticancergenic effects in hepatocellular carcinoma cells by increasing oxidative stress, genotoxicity, inflammation, apoptosis and suppressing proliferation. The findings suggest that arbutin may have beneficial effects in liver carcinoma HepG2 cell damage caused by cisplatin toxicity. Furthermore, the present study demonstrates that arbutin isoforms may have anticarcinogenic effects, especially at high doses in the HepG2 cell line.

Bisphenols belong to a chemical group known as diphenylmethanes and widely used in the production of polycarbonate plastics, as basic chemicals in the resin coating of food and beverage tins. These substances are suggested to affect many basic physiological processes such as growth, stress response, gender development, reproduction ability, insulin production and utilization, and metabolic rate by disrupting the normal functioning of the endocrine system. There are many animal studies and limited number of in vitro studies in the literature evaluating the different effects of BPA exposure. The results of these studies have shown that BPA can have adverse health effects, and the use BPA is banned or restricted, particularly in different products used by children. Considering the potential adverse effects of BPA in recent years, alternative bisphenols such as bisphenol F (BPF) and bisphenol S (BPS) have begun to be used instead of BPA. In the last years, by taking into account the potential unwanted effects of BPA, different alternative bisphenols like bisphenol F (BPF) and bisphenol S (BPS) are being used instead of BPA. However, there is little information on the toxicity of alternative bisphenols and most of these information is limited only to the endocrine disrupting effects of these derivatives. The metabolism of BPS and BPF, their fate within the organism and the possible toxic substances have not been studied adequately. The possible toxic effects of BPA, BPF and BPS in HepG2 cells were evaluated comparatively by the research conducted In this thesis. For this purpose, the possible changes caused by bisphenols, like cytotoxicity and intracellular reactive oxygen species (ROS) and the effects on antioxidant/oxidant parameters, have been examined. In cytotoxicity experiments, the cytotoxicity potentials of different bisphenol derivatives was found to be as BPS> BPF> BPA according to the median inhibitor concentration (IC50) values . When the increase of intracellular ROS levels was evaluated, BPA and BPF caused significant and similar increases in intracellualr ROS production compared to control, while BPS also caused a significant increase compared to control; but the cytotoxicity induced by BPS was found to be significantly lower than BPA and BPF. In addition, BPA has increased superoxide dismutase (SOD) activity; but other bisphenols did not cause alterations in SOD activity. BPF and BPS treatments significantly decreased glutathione peroxidase (GPx) activity. No bisphenol derivative catalase (CAT) activity has significantly changed CAT activity. At the end of the study, we observed that the bisphenols used as alternatives to BPA, namely BPF and BPS, had similar toxic effects to BPA. Therefore new and different alternatives to BPA must be discovered and the toxic effects of these alternatives must be investigated in the future. İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI İv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER xvi TABLOLAR xviii 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Endokrin bozucu kimyasal maddeler 4 2.2.Endokrin Bozucuların Sağlık Üzerine Etkileri 6 2.3. Bisfenoller 7 2.4. Bisfenol A’nın (BPA) Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 8 2.4.1. Bisfenol A’nın Biyotransformasyonu 9 2.4.2. Bisfenol A Kullanım Alanları Ve Maruziyet Yolları 10 2.4.3. Bisfenol A’nın Toksisitesi 12 2.5. Bisfenol F’nın (BPF) Genel, Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 16 2.5.1.Bisfenol F’in Biyotransformasyonu 16 2.5.2. Bisfenol F’in Toksisitesi 17 2.6. Bisfenol S’in (BPS) Genel, Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 22x 2.6.1. Bisfenol S Kullanım Alanları ve Maruziyet Yolları 22 2.6.2. Bisfenol S’in Biyotransformasyonu 23 2.6.3. Bisfenol S Toksisitesi 24 2.7. Oksidatif Stres 32 2.7.1. Oksidatif Stresin Hücresel Düzeyde Etkisi 34 2.7.2. Lipitler Üzerine Etkileri 35 2.7.3. Proteinler Üzerine Etkileri 36 2.7.4. DNA Üzerine Etkileri 36 2.8. Antioksidan Savunma Sistemleri 38 2.8.1. Antioksidanlar 39 2.8.2. Enzimatik Olmayan Antioksidanlar 41 3. MATERYAL VE METOT 43 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 43 3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 44 3.2.1. Çalışmada Kullanılan Hücreler 45 3.3. Deneylerde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması 46 3.3.1. 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) Yöntemi ile Sitotoksisitenin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler 46 3.3.2. ROS Deneyinde Kullanılan Çözeltiler 46 3.3.3. HepG2 Hücrelerinin Lizisinde kullanılan çözeltiler 47 3.3.4. Protein Tayin Deneyinde [Bişinkoninik asit (BCA) Deneyi] Kullanılan Çözeltiler 47xi 3.3.5. Glutatyon Peroksidaz 1 Aktivitesinin Ölçümü İçin Kullanılan Çözeltiler 48 3.3.6. Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü İçin Kullanılan Çözeltiler 49 3.3.7. Katalaz Aktivitesinin Ölçümü İçin Kullanılan Çözeltiler 50 3.3.8. Total Glutatyon Düzeylerinin Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler 52 3.3.9. Tiyobarbitürik Asit Reaktif Bileşikleri (TBARS) Deneyinde Kullanılan Çözeltiler 53 3.3.10. Protein Karbonil Deneyinde Kullanılan Çözeltiler 54 3.3.11.BPA, BPF ve BPS’in Stok Konsantrasyonlarının Hazırlanması ve Uygun Konsantrasyonlarda Hücreye Uygulanması 55 3.4. Hücreler ve Deney Grupları 55 3.4.1. Deney Grupları 55 3.4.2. Donmuş Hücrelerin Çözülme Basamakları 56 3.4.3. Hücrelerin Durumunun Kontrol Edilmesi Ve Pasajlama 56 3.4.4. Hücrelerin Besiyerinin Değiştirilmesi 57 3.4.5. Daha Sonra Yapılacak Testler İçin Hücrelerin Dondurulup Saklanması 57 3.4.6. Hücrelerin Sayılması Ve Plağa Ekilmesi 58 3.5. Deneysel İşlemler ve Yöntemler 59 3.5.1.HepG2 Hücrelerinde 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür (MTT) Yöntemi ile Sitotoksisitenin Belirlenmesi 59xii 3.5.2. Hücre İçi Reaktif Oksijen Türlerinin Belirlenmesi 61 3.5.3. HepG2 Hücrelerinin Lizisi ve Fraksiyonlanması 63 3.5.4. Glutatyon Peroksidaz 1 Aktivitesinin Ölçümü 64 3.5.5. Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü 65 3.5.6. Katalaz Aktivitesinin Ölçümü 67 3.5.7. Total Glutatyon Düzeylerinin Belirlenmesi 69 3.5.8. Lipit Peroksidasyonunun Belirlenmesi 70 3.5.9. Karbonil Grubu Düzeylerinin Ölçümü 71 3.5.10. Protein Miktarının Belirlenmesi 73 4. BULGULAR 75 4.1. MTT Yöntemi ile Sitotoksisitenin Belirlenmesi 75 4.2. Hücre İçi Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Belirlenmesi 80 4.3. Glutatyon Peroksidaz 1 Aktivitesi 81 4.4. Süperoksit Dismutaz Aktivitesi 82 4.5. Katalaz Aktivitesi 84 4.6. Lipit Peroksidasyonu Düzeyleri 86 4.7. Glutatyon Düzeyleri 88 4.8. Protein Oksidasyonu Düzeyleri 90 4.9. İstatistiksel Değerlendirme 91 4. TARTIŞMA 93 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 100 6. KAYNAKÇA 102 7. ÖZGEÇMİŞ 116 Bisfenoller, difenilmetanlar olarak bilinen bir kimyasal gruba aittir ve polikarbonat plastiklerin üretiminde, gıda ve içecek kutularının reçine kaplamasında temel kimyasal olarak yaygın bir şekilde kullanılır. Bu maddelerin endokrin sistemin normal işleyişini bozarak büyüme, stres yanıtı, cinsiyet gelişimi, üreme yeteneği, insülin yapımı ve kullanımı ve metabolik hız gibi birçok temel fizyolojik süreci etkiledikleri düşünülmektedir. Literatürde BPA maruziyetinin farklı etkileri değerlendirilmesi amacıyla yapılan birçok hayvan çalışması ve sınırlı sayıda da in vitro çalışma da bulunmaktadır. Bu çalışmaların sonuçları BPA’nın sağlık üzerinde olumsuz etkileri olabileceğini göstermiş ve BPA özellikle çocukların kullandığı birçok üründe yasaklanmış veya kullanımı kısıtlanmıştır. Son yıllarda BPA’nın potansiyel istenmeyen etkileri göz önüne alınarak, BPA’nın yerine bisfenol F (BPF) ve bisfenol S (BPS) gibi alternatif bisfenoller kullanılmaya başlanmıştır. Bununla birlikte, alternatif bisfenollerin toksisitesi hakkında çok az bilgi vardır ve toksikolojik bilgilerin çoğu, bu türevlerinin sadece endokrin bozucu etkileriyle sınırlıdır. BPS ve BPF'nin metabolizması, organizmadaki yazgısı ve olası toksik tkileri yeterli düzeyde çalışılmamıştır. Tez kapsamında yapılan araştırmalarda, BPA, BPF ve BPS’nın HepG2 hücrelerindeki olası toksik etkileri karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Bu amaçla, bisfenollerin sitotoksisite, hücre içi reaktif oksijen türlerinde (ROS) yol açabileceği olası değişiklikler ve antioksidan/oksidan parametreler üzerindeki etkileri incelenmiştir. Sitotoksisite deneyleri sonrasında bulunan medyan inhibitör konsantrasyon (IC50) değerlerine göre bisfenol türevlerinin sitotoksisite potansiyelleri BPS>BPF>BPA olarak belirlenmiştir. Hücre içi ROS artışı değerlendirildiğinde BPA ve BPF aynı oranda ve kontrole göre anlamlı artışlara neden olurken, BPS’nin de kontrole göre anlamlı artışa yol açtığı; ancak neden olduğu değişimin BPA ve BPF’den anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiştir. BPF ve BPS uygulamalarının glutatyon peroksidaz (GPx) aktivitesini anlamlı derecede azalttığı belirlenmiştir. Ayrıca, BPA’nın süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesini arttırdığı; ancak diğer bisfenollerin SOD aktivitesini değiştirmediği görülmüştür. Hiçbir bisfenol türevi katalaz (CAT) aktivitesini anlamlı derecede değiştirmemiştir. Çalışmanın sonunda, endüstride BPA’ya alternatif olarak kullanılan BPF ve BPS’nin de BPA’ya benzer toksik etkilerinin olabileceği görülmüştür. Bu nedenle, BPA’ya yeni ve farklı alternatiflerin bulunması ve gelecekte bu alternatiflerin de toksik etkilerinin araştırılması gerekmektedir.