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Acute myeloid leukemia (AML) is a poor prognosis hematopoietic malignance characterized by abnormal proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs). Although advances in treatment have greatly improved survival rates in young patients, in the elderly population, ~70% of patients present poor prognosis. A pan-cancer analysis on the TCGA cohort showed that AML has the second higher HUWE1 expression in tumor samples among all cancer types. In addition, pathway enrichment analysis pointed to RAS signaling cascade as one of the most important pathways associated to HUWE1 expression in this particular AML cohort. In silico analysis for biological processes enrichment also revealed that HUWE1 expression is correlated with 13 genes involved in myeloid differentiation. Therefore, to understand the role of HUWE1 in human hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) we constitutively expressed KRASG12V oncogene concomitantly to HUWE1 knockdown in stromal co-cultures. The results showed that, in the context of KRASG12V, HUWE1 significantly reduces cell cumulative growth and changes myeloid differentiation profile of HSPCs. Overall, these observations suggest that HUWE1 might contribute to leukemic cell proliferation and impact myeloid differentiation of human HSCs, thus providing new venues for RAS-driven leukemia targeted therapy approach.

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese ( doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Chlorella vulgaris (CV) é uma alga microscópica bastante rica em nutrientes. Além de alto valor nutritivo, a Chlorella tem demonstrado possuir importantes atividades terapêuticas. Vários trabalhos do nosso laboratório e outros demonstram os efeitos protetores desta alga contra infecções virais e bacterianas, tumores, entre outros. No presente trabalho avaliamos os efeitos do tratamento profilático/terapêutico com a dose de 50mg/Kg/dia de CV sobre a resposta imunohematopoética de animais normais e portadores de tumor ascítico de Ehrlich (TAE). O estudo dos mecanismos envolvidos na proteção produzida pela alga frente às alterações induzidas pelo TAE no sistema imuno-hematopoético, demonstrou aumentos significativos na atividade de células NK, na produção de citocinas com padrão Th1 (IL-2 e INF-g) e na liberação de TNF-a por células esplênicas, paralelamente a uma diminuição na produção de IL-10 (padrão Th2). Além disso, o tratamento com CV protegeu o hospedeiro da mielossupressão provocada pelo desenvolvimento tumoral, seja agindo diretamente na formação e manutenção do estroma medular, estimulando a atividade das células estromais, ou ainda estimulando a produção de citocinas reguladoras da hematopoese como a IL-6 e a IL-1a. Constatamos ainda que o tratamento com CV aumenta a atividade estimuladora de colônias (CSA) no soro de animais portadores de tumor e a capacidade proliferativa de células esplênicas. Outros resultados que merecem destaque são aqueles relacionados à ativação macrofágica. Nossos resultados demonstram que, em animais normais, o tratamento com CV promove aumento significativo nos níveis de TNF-a nos sobrenadantes das culturas de macrófagos peritoneais e esplênicos sem alterar a produção de IFN-g e IL-10. Além disso, o restabelecimento da produção normal de TNF-a, IFN-g e IL-10 por macrófagos peritoneais de animais portadores de TAE e reversão parcial dos efeitos produzidos pela presença do tumor na atividade dos macrófagos esplênicos, também foram observados. Outro efeito do CV sobre macrófagos peritoneais de animais portadores de TAE foi o estímulo da produção de H2O2 e NO2 -. Analisando nossos resultados podemos dizer que a CV além de possuir alto valor nutritivo, capacidade antioxidante e atividade anti-viral e antibacteriana, apresenta importante atividade imunomoduladora frente ao desenvolvimento tumoral, já que na presença do tumor o hospedeiro que vem recebendo Chlorella é capaz de reagir mais prontamente e com maior vigor na indução de mecanismos essenciais de defesa imunológica. Neste sentido, sugerimos que a alga Chlorella vulgaris pode ser um candidato a agente preventivo e complementar no tratamento do câncer. Abstract: Chlorella vulgaris (CV) is a microscopic alga rich in nutrients. Besides the high nutritive value, this alga has shown important therapeutic properties. Many studies from our laboratory and others have shown the protective effects of CV against viral and bacterial infections, tumors, among others. In this work we evaluated the effects of the prophylactic/therapeutic treatment with a dose of 50 mg/Kg/day in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. The study of the mechanisms involved in the protection produced by the CV against the EAT, induced alterations in the immune-hematopoietic system; demonstrating significant improvements in the NK cells activity, Th1 (IL-2 and INF-g) and TNF-a cytokines production by mononuclear spleen cells, concomitantly with the decrease of IL-10 (Th2) production. Moreover, treatment with CV protected the host of myelosuppression caused by tumor development, it is acting directly in the formation and maintenance of bone marrow stroma, by stimulating the activity of stromal cells, or stimulating the production of important hematopoiese regulatory cytokines like IL-6 and IL-1a. We are also certain that the treatment with CV increases the colony-stimulating activity (CSA) in the serum of tumor bearing mice and the proliferative capacity of spleen cells. Other results that deserve attention are those related to macrophage activation. Our results show that in normal mice, treatment with CV, promotes significant increase in the TNF-a levels in upernatants of the cultures of peritoneal and spleen macrophages without altering the production of IFN-g and IL-10. Moreover, restoration of the normal production of TNF-a, IFN-g and IL-10 by peritoneal macrophages from animal carriers of EAT and partial reversal of the effects produced by the presence of tumor in the splenic macrophages activity were also observed. Another effect of CV on peritoneal macrophages of tumor bearing mice was the stimulation in the production of NO2 - and H2O2. Looking at our results we can say that the alga Chorella vulgaris in addition to its high nutritional value, antioxidant capacity and antiviral and antibacterial activities, it also presents important immunomodulatory activity against tumor development, since that in the presence of the tumor, the host that has received Chlorella is able to react more promptly and with greater force in the induction of essential mechanisms of immune defense. Accordingly, we suggest that the alga Chlorella vulgaris can be a candidate for the preventive and complementary treatment of cancer by strengthening the immune system. Doutorado Doutora em Farmacologia

Orientadores: Mary Luci de Souza Queiroz, Giselle Zenker Justo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho investigamos o efeito imunomodulador do extrato seco da raiz de Echinacea purpurea (EEP) sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoéticos da medula óssea e do baço para a série granulócito/macrófago (CFU-GM) de animais infectados com Listeria monocytogenes. A atividade dos fatores estimuladores de colônias do soro, alterações no peso do baço e a resistência dos animais à infecção também foram estudados. Camundongos BALB/c receberam um tratamento prévio por 7 dias, via oral, de EEP nas doses de 100 mg/kg, 300 mg/kg, 750 mg/kg e 1000 mg/kg. Ao final deste período os animais foram infectados intraperitonealmente com uma dose letal de Listeria monocytogenes (lxl06 bactérias/animal) para determinação da curva de sobrevida e com uma dose subletal (lxl03 bactérias/animal) para avaliação dos parâmetros hematopoéticos. Os resultados demonstraram que o EEP administrado previamente aos animais infectados, nas doses de 300, 750, e 1000 mg/kg protegeu contra mielossupressão característica deste modelo experimental. Valores similares aos do grupo controle foram obtidos para o número de células progenitoras de granulócitos/macrófagos (CFU-GM) na medula óssea desses animais 48 horas e 72 horas após a infecção com Listeria monocytogenes, enquanto nenhuma alteração estatisticamente significativa neste parâmetro foi encontrada nos animais apenas tratados com o extrato nos quatro níveis de doses experimentais testados. Da mesma forma que para medula óssea, apenas as doses de 300, 750, e 1000 mg/kg inibiram completamente o desenvolvimento da hematopoese extramedular nos animais infectados, apresentando níveis normais de CFU-GM no baço 48 horas e 72 horas após a inoculação da bactéria. Embora o CFU-GM no baço dos animais pré-tratados com 100 mg/kg de extrato e infectados fosse estatisticamente superior ao do grupo controle, esta dose de EEP proporcionou uma redução estatisticamente significativa no número de precursores neste órgão em relação aos grupos somente infectados, nas 48 horas e 72 horas de avaliação. O aumento no peso do baço que acompanha a hematopoese esplénica no modelo murino de listeriose foi apenas parcialmente regulado pelo EEP, quando aàninistrado nas doses de 300, 750 e 1000 mg/kg. Nenhum efeito sobre este parâmetro foi observado nos animais apenas tratados. Na avaliação da atividade do EEP sobre a produção de fatores estimuladores de colônias de células hematopoéticas foi observado um aumento no número de CFU-GM para o grupo de animais pré-tratados e infectados similar ao estímulo produzido apenas pela infecção. Nos grupos de animais somente tratados, a atividade do soro também foi estatisticamente superior à do grupo controle. Este mesmo protocolo de tratamento também aumentou a resistência de animais letalmente infectados com histeria monocytogenes, alcançando 33, 50 e 16% de sobrevida para as doses de 300, 750 e 1000 mg/kg respectivamente. Concluímos, portanto, que o EEP apresenta atividade estimuladora sobre a mielopoese de camundongos BALB/c infectados com Listeria monocytogenes crítica para a resistência à infecção letal observada Abstract: In this work, we investigated the effects of Echinacea purpurea extract (EPE) on the growth and differentiation of bone marrow and spleen hematopoietic progenitors (CFU-GM) in normal and in Listeria monocytogenes-infected mice. Serum colony-stimulating activity, changes in spleen weight and resistance to a lethal dose of bacteria were also evaluated. BALB/c mice were treated orally with 100, 300, 750 and 1000 mg/kg doses of EPE for 7 consecutive days and, at the end of this period, they were infected intraperitoneally with a sublethal dose of the bacteria (lxlO3 bacteria/animal). As expected, a significant decrease in the number of bone marrow CFU-GM in mice infected with L. monocytogenes was observed during the early phase of infection. This effect was accompanied by the development of splenic hematopoiesis with splenomegaly. Treatment of these animals with 300, 750 and 1000 mg/kg of EPE previously to infection significantly stimulated myelopoiesis, reaching normal values of bone marrow CFU-GM at 48 and 72 h after infection. In addition, these doses of EPE markedly inhibited the extramedullar hematopoiesis and significantly reduced the spleen weight in infected mice. On the other hand, no effects on these parameters were observed with the 100 mg/kg dose. In addition, this extract did not affect myelopoiesis and spleen weight when administered to normal mice. Regarding the production of colony-stimulating factors (CSFs), we observed that serum from infected animals presented a higher stimulatory activity on the CFU-GM generation, and similar degrees of serum colony-stimulating activity were found in EPE-treated infected mice at all doses tested. Treatment of normal mice with all doses of EPE for 7 days also produced higher concentrations of CSFs relative to controls. Resistance to infection was studied in mice submitted to a lethal dose of L. monocytogenes (lxlO6 bacteria/animal). Administration of EPE at 300, 750 and 1000 mg/kg significantly improved the survival of mice lethally infected with L. monocytogenes, given 33%, 50% and 16% of survival, respectively. We suggest that the modulatory effect of EPE on the myelopoietic response is related to its prophylactic activity in infected mice as a mechanism to improve immunity Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientadores: Mary Luci de Souza Queiroz, Nancy Airoldi Teixeira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho investigamos o crescimento e diferenciação das células precursoras da medula óssea após estresse induzido pelo modelo do desamparo aprendido. Ratos Wistar fêmeas pesando 180 + 20 g foram divididos em 4 grupos: Grupo Controle; Grupo Confinado (CF); Grupo Estressado (CHE) - recebeu 60 choques escapáveis de 1 mA com intervalos randômicos variando de 5 a 25 segundos e com duração determinada pela fuga do animal; Grupo Deprimido (CHI) - recebeu choques inescapáveis de mesma intensidade, freqüência e duração dos administrados aos animais do grupo CHE. A medula óssea foi retirada 24 h após o tratamento e as células formadoras de colônias (CFU-C) estudadas através da técnica de cultura donal em meio semi-sólido. Os resultados demonstraram que ocorre redução reversível significativa no número de. CFU-C nos animais dos grupos CHI e CF. Estudamos também o envolvimento do eixo hipotálamo-hipófiseadrenal na resposta observada através do tratamento dos animais CHI, CF e Controle com o inibidor da síntese de corticóides metirapone (O ou 47 mg/Kg/dia) ou com dexametasona (O ou 1 mg/Kg). O envolvimento dos receptores opióides foi estudado através do uso da naltrexona (O ou 8 mg/Kg) ou indução de tolerância cruzada à morfina (O ou 12 mg/Kg/dia). A administração de metirapone reduziu o número de CFU-C no grupo Controle mas não alterou o quadro de mielossupressão observado anteriormente nos grupos CHI e CF. Por outro lado, a administração de dexametasona promoveu uma proteção contra os efeitos mielossupressores do estresse. Observamos também uma reversão da mielossupressão após bloqueio dos receptores opióides com o antagonista naltrexona e após a suspensão da administração de morfina em animais tratados cronicamente com a droga. Concluímos portanto, que a proteção contra a mielossupressão causada pelo estresse depende da integridade do eixo hipotálamo-hipófiseadrenal. As endorfinas promovem mielossupressão que pode ser revertida pelo uso de antagonistas ou pela redução na liberação de fatores hipotalâmico-hipofisários, induzida por altos níveis de corticóides Abstract: In this work we have investigated the growth and differentiation of bone marrow stem cells after stress induced by the learned helplessness model. Female Wistar rats weighing 180 + 20g were divided into four groups: Control Group; Confined Group (CF); Stressed Group (CHE) - received 60 escapable shocks of 1 mA with random interval between 5 to 25 seconds determinated by the escape of the animal; and Helpless Group (CHI) received inescapable shocks in the same intensity and frequency given to the CHE group. Twenty-four hours later, the bone marrow was collected and the colony forming cells (CFU-C) studied by the technique for the clonal culture of hematopoietic cells in semi-solid medium. In the animais of the groups CHI and CF, CFU-C numbers were reversibly reduced. We have also studied the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the above response using in the groups CHI, CF and Control, the drugs metyrapone which inhibits the synthesis of corticosteroids (O or 47 mg/Kg/day) or dexamethasone (O or 1 mg/Kg). The involvement of opioid receptors was investigated using naltrexone (O or 8 mg/Kg) or induced cross-tolerance to morphine (O or 12 mg/Kg/day). The administration of metyrapone reduced the number of CFU-C in the control group, whereas in the CHI and CF group we observed the same pattern of mielossupression observed previously. On the other hand, the administration of dexamethasone protected against the mielossupression induced by the stress. Similarly, the same protection was observed after blockade of opíoid receptors with the antagonist naltrexone and after the interruption of the chronic morphine administration. We therefore conclude that the protection against mielossuppression induced by stress depends on the integrity of the hypothalamic pituitary axis. On the other hand, the endorphins lead to mielossuppression which is reverted by the use of antagonists or by the reduced liberation of pituitary hypothalamic factors, induced by high levels of corticosteroids Mestrado Farmacologia Mestre em Ciências

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho, investigamos o efeito do extrato de Maytenus i/icifolia Mart. ex Reissek (ES), sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoeticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea e do baço, a atividade estimuladora de colônias do soro de animais infectados com dose sub-Ietal (5xI03 BaclmL) de Listeria monocytogenes, a atividade das células "natural killer" (NK) e a produção de INF-y. Redução significativa no número de CFU-GM da medula óssea foi observada na fase inicial da infecção em paralelo a um aumento significativo na hematopoése esplênica. O tratamento dos camundongos, com as doses de 250, 500 e 1000 mgIKgldia por 5 dias anteriores .à infecção, estimulou a produção de CFU-GM na medula óssea, reduziu, aos níveis normais o número de CFU-GM no baço e aumentou a atividade hematopoética do soro. A presença da infecção estimulou a produção de IFN-y e a atividade lítica das células NK nestes animais, o tratamento com as três doses do extrato de ES utilizando-se o mesmo protocolo anterior, potencializou a produção de IFN-y e a atividade lítica das células NK, sendo este efeito mais marcante às 48 horas para as células NK e às 72 horas para o IFN-y . A avaliação da eficácia terapêutica do extrato de ES, avaliada através da resistência produzida em camundongos infectados com dose letal da bactéria (5xI05 BaclmL), demonstrou proteção de 40% com a dose de 1000 mglKg e 30% com a dose de 250 mgIKg, sendo que esta diferença entre as doses não foi significativa. Nossos resultados demonstram que o extrato de ES pode aumentar a resistência antibacteriana na listeriose através da geração de CFU-GM, da produção de IFN-y e do aumento na atividade lítica das células NK Abstract: In this work, we have investigated the effects of Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek (ES) extract on the growth and differentiation of bone marrow and spleen granulocyte- macrophage progenitor cells (CFU-GM), serum colony stimulating activity (CSA), natural killer (NK) cell activity and IFN-y production in a Listeria monocytogenes infected mice.A significant rOOuction in the CFU-GM number was observed in the initial phase of the infection with sublethal dose of (5x103 baclrnL), in parallel to a signiticant increase in the spleen hematopoiesis. The treatment of mice with 250, 500 and 1000 mg/Kg/day ES extract for tive days prior to the infection stimulated bone marrow myelopoiesis, reduced to normal levels CFU-GM number in the spleen and increased the serum colony stimulating activity. The infection enhanced IFN-y levels and NK cell activity. Treatment with ES extract using the same dose schOOule presented above, 100 to further increases in IFN-y levels and NK cell activity. Peak levels of IFN-y was seen at 72 h after the infection and NK cell activity was mostly increased at 48 h after the infection. Evaluation of the therapeutic efficacy of the ES extract, evaluatOO by the resistence of infected mice exposed to letha1 dose of the bacteria (5x10s BaclmL), resulted in protection of 400.10 with dose of 1000 mg/Kg and of 30% with 250 mg/Kg. Difference between the doses was not significant. Our results show that ES extract can increase antibacterial resistance in the listeriosis by modulation of CFU- GM generation, increased IFN-y production and lytic NK cells activity Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador : Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho, dando prosseguimento a estudos prévios realizados em nosso laboratório investigamos os efeitos do composto diciclopentadienildiclorotitânio IV, DDCT, (15 mg/kg/dia/ dois dias) sobre a capacidade funcional das células ¿natural killer¿ (NK) e a produção das citocinas do perfil Th1 [interleucina (IL)-2 e interferon-g (IFN-g)] e do perfil Th2 (IL-4 e IL-10) de animais normais e portadores do tumor ascítico de Ehrlich (TAE). Além disso, para efeito comparativo, acrescentamos ao nosso estudo o diciclopentadienilditiocianatotitânio IV, BCDT, o qual é um derivado do DDCT com substituições dos radicais halogênios do DDCT por pseudo-halogênios. Com o composto BCDT, além dos parâmetros imunológicos acima mencionados, avaliamos, os efeitos do tratamento com uma, duas e três doses de BCDT (10, 15 ou 30 mg/kg/dia) sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoiéticos [Células formadoras de colônias de granulócitos/macrófagos (CFU-GM)], de animais normais e portadores do TAE, os quais foram previamente realizados com o DDCT. Nestes animais, avaliamos ainda a celularidade da medula óssea, a presença de fatores estimuladores de colônias hematopoéticas (CSFs ) e a sobrevida. Nossos resultados demonstraram uma maior eficácia do composto DDCT em relação ao BCDT. No entanto, apesar das diferenças encontradas, verificamos que estes titanocenos compartilham a habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoiéticos e imunológicos envolvidos na evolução temporal do TAE. Como já esperado, o TAE produziu, concomitante à mielossupressão, um aumento no número de CFU-GM esplênico e uma diminuição da celularidade da medula óssea. O tratamento dos animais portadores do TAE com o BCDT produziu, de forma dose-dependente, paralelamente a um aumento na sobrevida, um aumento da mielopoiese, uma redução no número de colônias esplênicas e uma restauração no número total e diferencial da medula óssea. A maior eficácia foi encontrada com a dose de 10 mg/kg/dia/ três dias, a qual, em animais normais, produziu melhor recuperação no número de CFU-GM na medula óssea e estimulou a produção de CSFs. Efeitos tóxicos foram observados nas maiores doses do composto associado à presença de hematopoiese esplênica e uma menor sobrevida dos animais. Quanto à produção das citocinas, o tratamento com os compostos impediu a polarização Th1-Th2 encontrada nos animais portadores do TAE. Neste sentido, o tratamento destes animais com o DDCT (15 mg/kg/dia/por dois dias) ou com o BCDT (10 mg/kg/dia/por 3dias), aumentou os níveis de secreção de IL-2, regulou positivamente a secreção atípica de IFN-g e reduziu os níveis de IL-10 aumentados durante a evolução temporal do TAE. O estudo da atividade funcional das células NK em animais portadores do TAE e tratados com os titanocenos demonstrou, especialmente com o DDCT, um aumento na capacidade citotóxica das células NK, a qual se encontrava reduzida. Estes resultados são encorajadores, uma vez que favorecem a utilização dos titanocenos em combinações terapêuticas com outros quimioterápicos visando reduzir a mielotoxicidade e suplementar a eficácia tumoricida destes agentes Abstract: In this work, as a continuation of previous studies in our laboratory, we investigated the effects of the titanocene dicyclopentadienyldichlorotitanium IV compound, DDCT, (15 mg/kg/day/ per two days) on the natural killer cell activity (NK) and on Th1 [interleukin (IL)-2 and interferon-g (IFN-g)] and Th2 (IL-4 and IL-10) responses in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. Moreover, for comparative effect, we also studied the dicyclopentadienylditiocianatetitanium IV, BCDT. The structural difference between these compounds is the substitution of the halides halogens present in DDCT by pseudo halogens in BCDT. With the BCDT compound, besides the immunological parameters mentioned above, we evaluated the effect of the treatment using one, two or three doses of BCDT (10, 15 or 30 mg/kg/day) on the growth and differentiation of granulocyte-macrophage progenitor cells [colony-forming units of granulocyte-macrophage (CFU-GM)], of normal and EAT-bearing mice. As studied previously with the DDCT compound, we also evaluated the bone marrow cellularity, the presence of colony stimulating factors (CSFs) and survival of these animals. Our results demonstrated that the DDCT compound is more effective than the BCDT one. In despite of the differences found, we observed that these compounds share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunologic unbalance during the EAT evolution. As expected for the EAT-model, concomitant myelosuppression, increased number of spleen CFU-GM and changes in bone marrow cellularity were observed. The treatment of EAT-bearing mice with BCDT produced a dose-dependent increase in myelopoiesis, a reduction in splenic colonies and a restoration of the total and differential marrow cell counts. In addition, BCDT treatments also increased the survival of these animals. The most effective dose schedule was 10 mg/kg/day/per three days, which, in normal animals, also produced increased bone marrow CFU-GM numbers along with a CSF production boost. High doses of BCDT cause toxic effects and induced extramedular hematopoiese. Regarding the production of cytokines, the treatment with the titanocene compounds blocked the Th1-Th2 polarization found during the EAT progression. In this respect, the treatment of these animals with DDCT (15 mg/kg/day/per two days) or BCDT (10 mg/kg/day/per three days) increased the IL-2 levels, regulated the atypical IFN-g secretion positively and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. In relation to the functional activity of NK cells, the treatment with both compounds enhanced the NK cell function, reduced during the EAT growth. Only the DDCT compound rescued to normal values the activity of NK cells. These up-modulatory effects demonstrated in this study, specially using the DDCT compound, indicated a new aspect of the antitumoral action mechanism of the titanocenes. Thus, it is encouraging, in this context, to consider these compounds for combination chemotherapy, protecting the host from hematotoxicity as well as supplementing tumoricidal efficacy Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A identificação e caracterização estrutural e funcional de genes diferencialmente expressos entre tecidos tumorais e normais constituem etapas fundamentais para permitir a compreensão do processo neoplásico e o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e verificar sua função nos processos celulares. Neste estudo foi demonstrado que o gene ANKHD1localiza-se no cromossomo 5, possui vários transcritos variantes possivelmente gerados por mecanismos de clivagem alternativa e codifica proteínas com domínios de repetições de anquirina. A região promotora desse gene possui vários elementos regulatórios importantes como sítios de ligação ao fator de transcrição GATA-1 e sequências ricas em dinucleotídeos CG, as ilhas CpG. A expressão do gene ANKHD1 e de algumas de suas variantes em tecidos normais e em linhagens de células neoplásicas foi detectada em intensidades variáveis. Em modelos de diferenciação e proliferação celular foi demonstrado o aumento da expressão desse gene ao longo desses processos. No entanto durante o processo de apoptose observou-se diminuição na expressão de ANKHD1 e transcritos variantes. Em células de pacientes diagnosticados com Síndrome Mielodisplásica (SMD) foi constatada baixa expressão de ANKHD1. Durante a diferenciação eritróide de células CD34+ obtidas de medula óssea desses pacientes não foi observado o aumento da expressão do gene ANKHD1 e do fator de transcrição GATA-1 como era esperado. As células mononucleares de pacientes com SMD tratadas com decitabina, um agente desmetilante, apresentaram aumento na expressão do gene ANKHD1 em comparação às células não tratadas. O mesmo foi observado em células CD34+ tratadas durante a diferenciação eritróide. No entanto em células de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e com Mieloma Múltiplo (MM), caracterizadas pela proliferação e resistência aos mecanismos de apoptose, foi demonstrada a alta expressão do gene ANKHD1 e de seus transcritos variantes. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada através de Western Blotting, em células da linhagem de MM denominada RPMI 8226. Foi observada a diminuição da expressão do gene ANKHD1 nessas células quando induzidas ao processo de apoptose por dexametasona. Em conclusão o presente estudo identificou ANKHD1 e alguns de seus transcritos variantes como um novo gene com perfis de expressão variados em células hematopoéticas normais e neoplásicas, demonstrou seu envolvimento em processos celulares básicos à manutenção da homeostase e a sua associação com SHP2 em Mieloma Múltiplo. ANKHD1 pode estar envolvida com o fenótipo anormal da célula neoplásica através de uma possível função na via da apoptose. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e neoplásicas. Abstract: The identification and the structural and functional characterization of genes differentially expressed between tumors and normal tissues are fundamental steps towards the understanding of the neoplastic process and the development of new anti-cancer strategies. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, the expression pattern and function of ANKHD1 have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene expression pattern of ANKHD1 in normal and leukemic hematopoietic cells and to determine their function in cellular process.This study has demonstrated that the ANKHD1 gene is located on chromosome 5, this gene has several possible variant transcripts generated by splicing alternative mechanisms and encodes proteins with domains of ankyrin repeats. The promoter region of this gene has several regulatory elements such as the transcription factor GATA-1 binding sites and rich sequences in dinucleotide CG, CpG islands.The expression of the ANKHD1 gene and some of the gene's variants in normal tissues and neoplastic cell lines was detected in different intensities. The increase in the expression of this gene was demonstrated using cellular differentiation and proliferation models. However, during the process of apoptosis, a decrease in the expression of ANKHD1 transcripts variants was observed. In the cells of patients with myelodysplastic syndrome (MDS), a low expression of ANKHD1 was observed. During erythroid differentiation of CD34+ cells obtained from the bone marrow of these patients, no increase in the expression of ANKHD1 gene and transcription factor GATA-1 was observed, as expected. The mononuclear cells of MDS patients were treated with decitabine, a demethylation agent, and showed an increase in the ANKHD1 gene expression compared to untreated cells. The same was observed in CD34+ cells treated during erythroid differentiation. However in cells of acute myeloid leukemia (AML) or Multiple Myeloma (MM) patients, characterized by proliferation and resistance mechanisms of apoptosis, the high expression of gene transcripts ANKHD1 and its variants was demonstrated. The association of SHP2 with ANKHD1 was identified by Western Blot in RPMI 8226 MM cell line. A decrease in the ANKHD1 gene expression in these cells when the process of apoptosis was induced by dexamethasone was observed. In conclusion, this study identified ANKHD1 and some of gene's transcripts variants as a new gene with a variable expression profile in normal and neoplastic hematopoietic cells. The study has also demonstrated the involvement of the ANKHD1 in basic cellular processes, which maintain homeostasis and the association of ANKHD1 with SHP2 in multiple myeloma. ANKHD1 may be involved with the abnormal phenotype of tumor cells through a possible role in the apoptosis pathway. The findings herein described suggest that ANKHD1 could be a molecular target for neoplasic disease therapy and could guide further studies towards a better elucidation of the specific functions of ANKHD1 in normal and neoplasic hematopoietic cells. Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Mary Luci de Souza Queiroz, Mario Jose Abdalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade é um problema de epidemia mundial. Considerada um processo inflamatório crônico, favorece a resistência à insulina e o desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2. Além disso, pode gerar diversos mediadores capazes de influenciar a complexa regulação hematopoética. A procura de agentes naturais que minimizam os transtornos da obesidade está recebendo uma atenção da comunidade científica. Nesse sentido, a Chlorella vulgaris (CV) surge como uma alternativa terapêutica e profilática das complicações da obesidade. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram o efeito da alga na restauração da mielossupressão em diferentes modelos experimentais. Considerando estes aspectos, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ação profilática da CV na modulação imunohematopoética, metabólica e de sinalização da insulina em animais obesos. Para tanto, camundongos Balb/C foram divididos em 4 grupos: controle (C), dieta padrão e CV (C+CV), dieta hiperlipídica (DH) e DH+CV, em diferentes períodos. A administração de CV restaurou a redução da hematopoese medular e o aumento na hematopoese extramedular promovidos pela DH. A CV aumentou os níveis de atividade estimuladora de colônias (CSA) em todos os grupos estudados, sendo que o grupo DH+CV produziu um aumento adicional de 2 vezes em todos os períodos avaliados. O grupo DH apresentou diminuição no número de progenitores de granulócitos-monocítico na medula, a CV reverteu tal alteração. Em relação ao metabolismo e sinalização de insulina, o grupo DH demonstrou glicemia significativamente elevada em relação ao grupo C, CV foi capaz de reduzi-la neste grupo. Além disso, o grupo DH+CV mostrou maior tolerância à glicose e insulina, paralelamente a melhora na fosforilação de IR?, IRS-1 e AKT no fígado, músculo esquelético e tecido adiposo. Como esperado, o grupo DH apresentava níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, TNF-?, TGF-? e INF?) confirmando a presença de inflamação subclínica nesses animais. A CV reduziu significativamente os níveis séricos dessas citocinas. Além disso, o grupo DH apresentou diminuição dos níveis de IL-10, sendo que a CV reverteu tais valores. A CV manteve os níveis de ácidos graxos livres, corpos cetônicos, triglicérides, colesterol e suas frações dentro dos valores fisiológicos no grupo DH+CV. Portanto, tais resultados mostram que a CV foi capaz de modular os parâmetros imunohematopoéticos e prevenir os efeitos deletérios induzidos pela DH em camundongos obesos. Sendo assim, a alga Chlorella vulgaris surge como uma promissora alternativa terapêutica e/ou complementar no tratamento da obesidade e suas complicações Abstract: Obesity is a worldwide epidemic problem. Considered a chronic inflammatory process, promotes insulin resistance and development of Diabetes Mellitus type 2 (DM2). In addition, could generate several mediators, which are capable to influence the complex hematopoiesis regulation, including tumor necrosis factor-? (TNF-?), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6) and leptin. The search for natural agents that minimize obesity-associated disorders is receiving attention from the scientific community. In this sense, Chlorella vulgaris (CV) has emerged as an alternative treatment and prophylaxis agent against obesity-related complications. Studies by our group have demonstrated the alga effect in myelosuppression recovery in different experimental models. Considering these aspects, the present study aimed to evaluate the prophylactic effect of CV on immunohematopoietic modulation, metabolic and insulin signaling in obese animals. To this, Balb/C mice were divided into 4 groups (n=6): control (C), standard diet and CV (C+CV), high-fat diet (HFD), HFD and CV (HFD+CV) in different periods. The administration of CV restored medullar hematopoiesis reduction and increased extramedullar hematopoiesis promoted by HFD. The CV increased the CSA levels in all groups. While, HFD+CV group produced a twice additional increase in the CSA levels in all periods studied. Only HFD group showed decrease in the number of GMP in BM, CV reverted this change. In relation to metabolism and insulin signaling, HFD group showed a significant increase in blood glucose compared to C, CV was able to decrease blood glucose on this group. In addition, HFD+CV group improve tolerance of glucose and insulin, together with the improvement of IR?, IRS-1, and AKT phosphorylation in the liver, skeletal muscle and adipose tissue. As expected, HFD group showed increased levels of pro-Inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF-?, TGF-? and IFN?), confirming the presence of subclinical inflammation in these animals. The CV causes a significant reduction in serum levels of these cytokines in this group. Moreover, HFD group showed reduced levels of IL-10, and the CV reverted such values. The CV maintained the levels of free fatty acids, ketone bodies, triglycerides, cholesterol and its fractions within the physiological values in HFD+CV group. Therefore, these results show that CV was able to modulate the immunohematopoietic parameters and prevent the deleterious effects of diet-induced obese mice. Thus, the alga Chlorella vulgaris appears as a promising prophylactic and therapeutic agent against obesity-related complications Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Neste trabalho avaliamos os efeitos de compostos derivados do nitroestireno, NTS1 e NTS2, sobre a resposta imunohematopoética de camundongos normais e portadores do tumor ascítico de Ehrlich (TAE). O estudo dos mecanismos envolvidos no tratamento de camundongos com NTS1 e NTS2 frente às alterações induzidas pelo TAE mostra efeitos imunológicos distintos dos dois compostos. O composto NTS1 induziu aumentos significativos na atividade de células NK, na proliferação de células mononucleares esplênicas e na produção de citocinas com padrão Th1 (IL-2 e IFN-?) liberadas por células mononucleares do baço. Em contrapartida, a atividade de NTS2 esteve relacionada com ativação macrofágica. Nossos resultados demonstram que o tratamento com NTS2 promove aumento significativo nos níveis de TNF-a e IL-1 no sobrenadante da cultura de macrófagos peritoneais. Outro efeito importante de NTS2 sobre macrófagos peritoneais foi o estímulo na produção de NO2-. Além dos parâmetros imunológicos citados, avaliamos, os efeitos de NTS1 e NTS2 sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoéticos. Tanto NTS1 como NTS2 foram capazes de reverter a mielossupressão provocada pela evolução do tumor, além de aumentar a atividade estimuladora de colônias (CSA) no soro de camundongos Balb/c. Os resultados obtidos demonstram que os compostos compartilham da habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoéticos e imunológicos envolvidos na evolução temporal do TAE. A partir disso, testamos a capacidade dos compostos no processo de diferenciação mielocítica utilizando um sistema de cultura ex- vivo no qual células humanas CD34+ foram tratadas com NTS1 e NTS2. Nossos resultados apresentaram atividade dose-dependente de NTS1 e NTS2 na proliferação e viabilidade de células CD34+. Além de aumentar significativamente o número de progenitores mielóide comum e para granulócitos de macrófagos. Os compostos apresentaram diferentes efeitos durante o processo de diferenciação. Inibiram a formação de neutrófilos maduros, porém, NTS1 aumentou significativamente a produção de metamielócitos e NTS2 de monócitos. Estes efeitos fenotípicos na proliferação e na diferenciação observados após o tratamento com NTS1 e NTS2 podem estar relacionados com a via p38MAPK e o fator transcricional CEBP-a Abstract: In this work, we have investigated the effects of two nitrostirene derivatives compounds, NTS1 and NTS2, in the immune-hematopoeitic system in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. The study of the mechanisms involved in the treatment produced by the NTS1 and NTS2 against induced alterations by EAT were different, showing significant improvements in the NK cells activity, proliferation and Th1 (IL-2 and INF-?) by mononuclear spleen cells. On the other hand, NTS2 activity was related to macrophage activation. Our results show that treatment with NTS2 promotes significant increase in the TNF-a and IL-1 levels in supernatants of the cultures of peritoneal macrophages. Another important effect of NTS2 on peritoneal macrophage was the stimulation in the production of NO2-. Beyond immunological parameters, we investigated the NTS1 and NTS2 effects on hematopoietic progenitors. Treatment with NTS1 and NTS2 protected the host of myelosuppression caused by tumor development and increase the colony-stimulating activity (CSA) in the serum of Balb/c mice. The results showed that NTS1 and NTS2 share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunological unbalance involved in the TAE development. Concerning their effects on myelopoiesis, we investigated the compounds utilizing an ex-vivo differentiation system in which umbilical cord blood derived CD34+ cells were treated with NTS1 and NTS2. Our results show that NTS1 and NTS2 have concentration dependent effects on proliferation and viability of CD34+ cells. Moreover, NTS1 and NTS2 significantly increase common myeloid and granulocyte/macrophage progenitors. The compounds have differential effects on terminal differentiation, inhibiting mature neutrophil, however, NTS1 significantly increased metamyelocytes and NTS2 monocytes. The phenotypic effects on proliferation and differentiation observed after NTS1 and NTS2 treatment can be explained by changes in p38MAPK cell signaling and with CEBP-a transcription factor Doutorado Farmacologia Doutor em Farmacologia

Orientadores: Leticia Fröhlich Archangelo, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: KIS (UHMK1) é uma serina/treonina quinase que possui um domínio UHM (domínio de homologia ao fator U2AF) além do domínio quinase. KIS desenvolve papéis importantes na proliferação celular, através da fosforilação de p27, e na migração celular, através da fosforilação de STATHMINA. Além disso, KIS fosforila a proteína CATS. Apesar das funções de CATS não serem muito bem compreendidas, CATS é capaz de interagir com a proteína fusionada leucêmica CALM/AF10 e modificar sua localização subcelular. KIS também desempenha um papel importante no splicing, através da ligação (domínio UHM) e fosforilação (domínio quinase) de SF1 e SF3b. A fosforilação desses fatores favorece a formação de complexos ternários (SF1-U2AF65-pré-mRNA), de modo que o splicing possa ocorrer adequadamente. Mutações somáticas em genes relacionados ao processo de splicing foram descritas em diversas doenças hematológicas, além de alterações no padrão de fosforilação das proteínas codificadas por esses genes. Apesar de KIS regular os fatores de splicing SF1 e SF3b, estudos que abordam a expressão e a função de KIS na patogênese das doenças neoplásicas são escassos. Dados de microarranjo de DNA não publicados de nosso grupo de demonstram um leve aumento na expressão de KIS em alguns subtipos leucêmicos, indicando que KIS possa estar relacionada ao desenvolvimento dessas doenças. Dessa forma, em vista de (1) KIS estar relacionada ao processo de splicing e de proliferação celular, processos que quando desregulados podem levar não só à leucemogênese, mas também à formação de outros cânceres, (2) a expressão de KIS estar levemente aumentada em alguns subtipos leucêmicos, e (3) KIS fosforilar CATS, que interage com a proteína fusionada CALM/AF10; nossa hipótese é que KIS possa participar do processo de leucemogênese. Nossos resultados demonstraram uma alta expressão de KIS em linfócitos B e T, e um aumento durante a diferenciação mielóide de linhagens leucêmicas e células primárias de doadores saudáveis. Por outro lado, a expressão de KIS não se mostrou alterada nas neoplasias hematológicas estudadas. A inibição de KIS em células de linhagem leucêmica não resultou em alterações na proliferação celular ou na distribuição do ciclo celular, e acarretou em uma maior formação de colônias em meio semi-sólido sem estímulos para proliferação ou diferenciação. De forma contrária, a superexpressão de Kis em células primárias de medula óssea de camundongo acarretou na diminuição da formação de colônias em meio semi-sólido suplementado com citocinas mielóides. Em conclusão, esses resultados nos permitem dizer que KIS não apresenta uma função na proliferação de células hematopoéticas, mas apresenta um papel nunca descrito na diferenciação de células hematopoéticas Abstract: KIS (UHMK1) is a serine/threonine kinase with a unique UHM motif (U2AF homology motif), which is important for cell proliferation, through p27 phosphorylation, and for cell migration, through STATHMIN phosphorylation. KIS also binds to and phosphorylates CATS, a protein with unknown functions. It is known that CATS can interact with the leukemic fusion protein CALM/AF10 and change its subcellular localization. KIS can also bind to (via UHM domain) and phosphorylate (via kinase domain) SF1 and SF3b, being important in the splicing process. Phosphorylation of the Splicing Factor 1 favors ternary complex formation (SF1-U2AF65-mRNA), which is essential for the adequate splicing. Somatic mutations in genes involved in the splicing process have been widely described in hematologic malignancies, as well as modifications in the phosphorylation pattern of the proteins coded by those genes. Though KIS regulates the Splicing Factors SF1 and SF3b, little is known about its expression pattern or function in hematologic malignancies. DNA microarray data from our group (data not published) suggest an increased KIS expression in some leukemic subtypes, which is indicative of KIS involvement in those malignancies. Since KIS (1) has a function in the splicing and proliferation processes, which can lead to leukemia or tumor formation when deregulated, (2) has a mildly increased expression in some leukemic subtypes and (3) phosphorylates CATS, a protein which can interact with a leukemic fusion protein, we hypothesize that KIS may participate in the leukemogenesis process. Our results demonstrate that KIS was highly expressed in B and T lymphocytes and its expression increased during myeloid differentiation of leukemic cell lines and primary cells. KIS expression was unaltered in the studied hematologic malignancies. KIS depletion in the leukemic cell line U937 rendered no alterations in cell proliferation or cell cycle distribution, whereas shKIS cells were more capable of forming colonies in semi-solid media without growth factors. Contrary to KIS depletion, Kis overexpression in mouse bone marrow primary cells reduced colony formation in semi-solid media containing myeloid cytokines. In conclusion, our results demonstrate a novel role of KIS during hematopoetic cells differentiation, whereas no role in hematopoetic cell proliferation could be demonstrated Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências FAPESP 2014/01458-3, 2011/51959-0 CAPES

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O modelo experimental de infecção por Listeria monocytogenes tem provado ser útil na investigação dos efeitos de novos compostos na resposta imunológica primária contra bactérias intracelulares. Em particular, o número de células hematopoéticas na medula óssea e baço é de fundamental importância na resistência a esta infecção. No presente estudo, investigamos o efeito da solução hidro alcoólica de própolis (SHAP), sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea e do baço de animais infectados com Listeria monocytogenes. Além disso, quantificamos os níveis de fatores estimuladores de colônias (CSFs). A eficácia da SHAP frente a uma dose letal da bactéria também foi avaliada. Demonstramos que a SHAP protegeu os animais contra uma dose letal de L. monocytogenes, quando administrada profilaticamente na dose de 4 mg/kg durante 10 dias, com aumento de 20% na sobrevida. Este tratamento também preveniu a mielossupressão e hematopoese extramedular causadas por uma dose subletal de L. monocytogenes, devido a um aumento no número de CFU-GM na medula óssea. Além disso, observamos que os animais somente tratados (não infectados) não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle. Adicionalmente, a investigação da produção de fatores estimuladores de colônias no soro dos animais revelou um aumento de CSA nos grupos infectados após 48 e 72h pré-tratados com SHAP, sugerindo que a estimulação da mielopoese pelo produto seja mediada pela produção de fatores de crescimento. Além disso, observamos o aumento da citocinas interferon- gamma IFN-g no grupo infectado/tratado com o produto nas 48 e 72h. Abstract: Infection with Listeria monocytogenes has proven to be a useful model to investigate early effects of new compounds on the immune response to intracellular bacteria. In particular, the number of hematopoietic cells in the bone marrow and spleen is critically important to resistance to this infection. In this study, we demonstrated the protective effects of hydro alcoholic solution of propolis in mice infected with a lethal dose of Listeria monocytogenes, when administered prophylactically at 4mg/kg for 10 days, with survival rates up to 20%. This dose also prevented the myelosuppression and the splenomegaly caused by a sublethal infection with Listeria monocytogenes, due to the maintenance of granulocytemacrophage progenitors (CFU-GM) numbers in the bone marrow. Non-infected mice treated with hydro alcoholic solution of propolis presented similar numbers of CFU-GM in the bone marrow when compared to the controls. Furthermore, investigation of the production of colony-stimulating factors (CSF) revealed increased colony-stimulating activity (CSA) in the serum of infected mice pre-treated with hydro alcoholic solution of propolis 48 and 72 hours after the infection, suggesting that its effects on the production of growth factors mediate stimulation of myelopoiesis by hydro alcoholic solution of propolis. Moreover, we observed increased level of IFN-g in infected/treated mice. These results sustain our proposal of hydro alcoholic solution of propolis use as an adjuvant agent in the prophylaxis of opportunistic infections and reduction of side effects caused by immunosuppressive therapies. Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientadores: Fabiola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A ocorrência da leucemia aguda resulta de uma combinação de mutações e alterações em funções protéicas que conferem a capacidade de proliferação, defeito na diferenciação e apoptose celular. Síndromes mielodisplásicas (SMD) são desordens hematopoéticas resultantes de alterações na célula pluripotente, caracterizadas por hematopoese ineficaz e alta taxa de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA). Células leucêmicas expressam uma variedade de receptores de fatores de crescimento e citocinas, como o receptor do Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). A via de sinalização do IGF-1 inicia-se através da ativação de seu receptor e subsequente ativação de seus substratos, como os substratos do receptor de insulina (IRS). Algumas evidências indicam a participação das proteínas IRS em doenças hematológicas: (1) IRS1 foi descrito como constitutivamente fosforilado e associado ao BCR-ABL em células K562; (2) a expressão de IRS1 foi relacionada com pior prognóstico em leucemia linfóide aguda (LLA) BCR-ABL positiva; (3) IRS2 associa-se ao receptor de eritropoetina; (4) a expressão de IRS2 foi modulada durante estímulos com eritropoetina e IGF-1 e em processos de diferenciação em células hematopoéticas normais e leucêmicas. Neste estudo, foi observada a presença da expressão gênica e protéica de IRS1 e IRS2 em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, entretanto, o padrão de expressão das duas proteínas foi diferente. Em linhagens celulares de leucemia aguda, IRS1 foi expresso em linhagens de leucemia aguda mieloide (P39, K562, NB4, KG-1, e HL60) e linfoide (MOLT4, Jurkat, Raji e Daudi), enquanto que IRS2 foi expresso preferencialmente em linhagens mieloides. Em células hematopoéticas primárias, não houve diferença na expressão de IRS1 entre células hematopoéticas de pacientes com SMD e LMA e controles normais, e a expressão gênica de IRS1 apresentou-se aumentada em amostras de medula óssea de pacientes com LLA em relação aos controles normais. A expressão de IRS2 foi menor nas amostras de medula óssea de pacientes com SMD, LMA e LLA em relação aos controles normais, e a expressão de IRS2 foi menor em pacientes com SMD de alto risco se comparados com SMD baixo risco, de acordo com a classificação FAB, WHO e com número de citopenias. A participação de IRS2 na diferenciação eritróide de células hematopoéticas normais e mielodisplásicas foi evidenciada através da avaliação da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide de células progenitoras de medula óssea de doadores normais e de pacientes com SMD. O estudo evidenciou o aumento da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide, sendo que nas células mielodisplásicas, IRS2 apresentou um menor aumento se comparado às células hematopoéticas normais. Em células BCR-ABL positivas, a inibição da expressão de IRS1 (realizada através do uso de shRNA mediado por lentivírus específico para IRS1) resultou em inibição da proliferação celular e crescimento clonal, acúmulo de células na fase G0/G1 e redução de células na fase S do ciclo celular. A inibição de IRS1 resultou na inibição da fosforilação das proteínas Akt, P70S6K e ERK. Entretanto, a inibição de IRS1 não modulou a apoptose e as proteínas BCL2, BAX e BAD, assim como não modulou a fosforilação de BCR-ABL e CRKL e não apresentou sinergismo quando associado ao inibidor de tirosina quinase do BCR-ABL (imatinib). Estes dados indicam que IRS1 participa dos processos celulares de proliferação celular e clonogenicidade em células BCR-ABL positivas, através da modulação de Akt, P70S6K e ERK. Os achados aqui descritos sugerem que IRS1 é expresso em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, destacando-se sua elevada expressão em células de LLA e sua participação na via de sinalização BCR-ABL. Estes dados indicam que IRS1 pode ser um alvo terapêutico em LLA e leucemia mieloide crônica (LMC), especialmente nas leucemias BCR-ABL positivas e resistentes a inibidores da atividade tirosina quinase do BCR-ABL. Adicionalmente, IRS2 é expresso em células hematopoéticas, destacando-se a sua expressão reduzida em células mielodisplásicas e leucêmicas quando comparadas às células hematopoéticas normais. A reduzida expressão de IRS2 em células hematopoéticas de pacientes com SMD de alto risco quando comparados aos de baixo risco e o reduzido aumento da expressão de IRS2 na diferenciação eritroide de progenitores de pacientes com SMD sugerem que a expressão de IRS2 participa da fisiopatologia das SMD e pode ser um marcador prognóstico nesta doença Abstract: Acute leukemia results from a combination of mutations and changes in protein functions that confer the ability of proliferation, and defect in differentiation and apoptosis. Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic disorders caused by alterations in pluripotent cells, characterized by ineffective hematopoiesis and a high rate of progression towards acute myeloid leukemia (AML). Leukemia cells express a variety of receptors for growth factors and cytokines, such as Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). The signaling pathway is initiated by activating its receptor and subsequent activation of its substrates such as insulin receptor substrate (IRS). There is evidence that suggests an involvement of IRS proteins in hematopoeitic disease: (1) IRS1 was described as constitutively phosphorylated and associated with BCR-ABL in K562 cells, (2) the IRS1 expression was associated with a poorer prognosis in BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia (ALL), (3) IRS2 bind to erythropoietin receptors, (4) IRS2 expression was modulated during stimulation with erythropoietin and IGF-1 during cell differentiation in normal and leukemia hematopoietic cells. In this study, we observed the presence of the gene and protein of IRS1 and IRS2 in normal hematopoietic, leukemia, and myelodysplastic cells, however, the expression pattern of these proteins was different. In acute leukemia cell lines, IRS1 was expressed in myeloid leukemia cells (P39, K562, NB4, KG-1 e HL60) and lymphoid leukemia cells (MOLT4, Junkat, Raji e Daudi), whereas IRS2 expression was more evident in myeloid cell lines. In primary hematopoietic cells, no difference was observed in IRS1 expression between normal, MDS and AML cells, and the IRS1 expression was increased in bone marrow samples from ALL patients compared to normal controls. IRS2 expression was lower in bone marrow samples from patients with MDS, AML and ALL compared to normal controls, and the IRS2 expression was lower in high risk compared with low risk MDS patients, according to FAB and WHO classification, and number of cytopenias. The participation of IRS2 in erythroid differentiation of normal and myelodysplastic hematopoietic cells was evidenced by evaluating IRS2 expression during erythroid differentiation of progenitor cells from the bone marrow of normal donors and patients with MDS. The study demonstrated an increase in IRS2 expression during erythroid differentiation, whereas in myelodysplastic cells, IRS2 showed a smaller increase compared to normal hematopoietic cells. In BCR-ABL positive cells, IRS1 inhibition (by lentivirus-mediated shrunk specific for IRS1) resulted in inhibition of cell proliferation and clonal growth, accumulation of the cells in G0/G1 phase and reduction of cells in S phase of cell cycle. The IRS1 silencing resulted in inhibition of Akt, P70S6K and ERK phosphorylation. However, IRS1 inhibition did not modulate apoptosis; and the proteins BCL2, BAX and BAD, did not modulate the phosphorylation of BCR-ABL and CRKL, nor did they show synergism when combined with tyrosine kinase inhibitor of BCR-ABL (Imatinib). These data indicate that IRS1 participates in the proliferation and clonogenic of BCRABL positive cells by modulation of Akt, P70S6K and ERK. The findings reported herein suggest that IRS1 is expressed in normal hematopoietic, leukemia and myelodysplastic cells, highlighting its high expression in ALL cells and involvement in the BCR-ABL pathway. These data indicate that IRS1 may be a therapeutic target in ALL and chronic myeloid leukemia (CML), especially in BCR-ABL positive leukemias resistant to inhibitors of tyrosine kinase activity of BCRABL. In addition, IRS2 is expressed in hematopoietic cells, highlighting its reduced expression in myelodysplastic and leukemia cells compared to normal hematopoietic cells. The reduced IRS2 expression in high risk when compared to low risk MDS and the lower increase in IRS2 expression during the erythroid differentiation of progenitor cells from MDS patients suggest that the expression of IRS2 participates in the pathophysiology of MDS and may be a prognostic marker in this disease Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O microambiente da medula óssea é composto principalmente por células endoteliais e mesenquimais e é responsável por dar suporte às células-tronco hematopoiéticas, mantendo seu equilíbrio entre os processos de quiescência e diferenciação. Alterações neste microambiente têm sido cada vez mais relacionadas a doenças hematológicas, como as síndromes mielodisplásicas (SMD) e a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, proteínas envolvidas na regulação tanto das células hematopoiéticas como dos componentes do nicho medular têm sido alvo de estudos destas neoplasias. A ARHGAP21 é uma proteína RhoGAP envolvida na hematopoese normal, porém estudos sobre seu papel nas células não-hematopoiéticas do microambiente da medula óssea ainda é escasso. O objetivo geral desse trabalho foi investigar o papel da proteína ARHGAP21 em células do microambiente da medula óssea (MO). Para isso, avaliamos a expressão gênica de ARHGAP21 em medula óssea total e em células mesenquimais de pacientes com SMD e LMA cultivadas in vitro. O cultivo in vitro de células mesenquimais murinas também foi padronizado a fim de possibilitar o silenciamento de Arhgap21. Além disso, camundongos haploinsuficientes para Arhgap21 (Arhgap21+/-) foram utilizados como modelo para caracterização e estudo funcional das células do microambiente da MO através de imunofenotipagem e transplante de medula óssea. A expressão gênica de ARHGAP21 se mostrou elevada em células mesenquimais de pacientes com LMA de novo quando comparada com as amostras de doadores saudáveis, enquanto não apresentou diferença em amostras de medula óssea total. Uma vez que a padronização da cultura de células mesenquimais murinas não se mostrou viável devido ao crescimento insuficiente dessas células in vitro e/ou pela contaminação de células hematopoiéticas na cultura, demos continuidade aos estudos utilizando o modelo animal haploinsuficiente. Os camundongos Arhgap21+/- apresentaram maior frequência de células da linhagem osteoblástica na medula óssea, assim como maior número de colônias celulares da linhagem osteoblástica com atividade de fosfatase alcalina. Esses camundongos também apresentaram maiores níveis de osteocalcina na medula óssea. Camundongos Arhgap21+/- receptores do MO apresentaram redução nos níveis de leucócitos no sangue periférico após 8 e 16 semanas do transplante de MO em comparação aos camundongos selvagens receptores de MO. Juntos, esses dados indicam que o animal Arhgap21+/- apresenta um microambiente medular alterado, com maior quantidade de células osteoblásticas e menor suporte à reconstituição da MO após transplante, o que sugere um possível papel da ARHGAP21 no suporte à hematopoese e na fisiopatologia de doenças hematológicas, uma vez que alterações no nicho estão a elas relacionadas Abstract: Bone marrow microenvironment is mainly composed of endothelial and mesenchymal cells and is responsible for supporting hematopoietic cells and maintaining their balance between the quiescence and differentiation processes. Studies point that alterations in the bone marrow microenvironment are related to hematological diseases as the Myelodysplastic Syndrome (MDS) and Acute Myeloid Leukemia (AML). MDS is a hematological neoplasia characterized by impaired production of blood cells. The syndrome is classified according to different degrees of severity and approximately one third of the patients progress to (AML). Therefore, proteins related to both, the hematopoietic process and the microenvironment components have been the focus of studies. ARHGAP21 is a RhoGAP protein involved in regular hematopoiesis, however information regarding the role of this protein in the hematopoiesis of patients who present such conditions and in non-hematopoietic cells which compose the bone marrow microenvironment remains scarce. Therefore, the overall objective of this study was to investigate the role ARHGAP21 plays in the bone marrow microenvironment. This research was conducted by the evaluation of ARHGAP21 expression in vitro in mesenchymal cells from bone marrow from MDS and AML patients; by silencing Arhgap21 in the mesenchymal murine cells after the standardization of mesenchymal murine cell culture in vitro; by immunophenotyping the bone marrow microenvironment from haploinsuficient mice for Arhgap21 (Arhgap21+/-) and by the evaluation of the reconstitution of hematopoiesis through the bone marrow transplant. This work showed an increased expression of ARHGAP21 in mesenchymal cells from AML de novo patients¿ bone marrow when compared to those from healthy donors, while ARHGAP21¿s expression presented no significant differences in total bone marrow samples when compared to healthy donors. Since standardization of murine mesenchymal cell culture was not feasible due to insufficient growth of these cells in vitro and / or contamination of hematopoietic cells in the culture, we continued studies using the haploinsufficient animal model. Arhgap21+/- murine model showed a higher osteoblastic lineage frequency when compared to wide-type animals, as well a larger number of osteoblastic lineage cell colonies with alkaline phosphatase activity. Arhgap21+/- mice also possess higher levels of osteocalcin in their bone marrows than wild-type animals. The bone marrow niche of Arhgap21+/- animals showed a reduction in the levels of white blood cells after 8 and 16 weeks from the bone marrow transplant but not significant differences in the other cell populations of the blood system analyzed when compared with wild-type mice. Taken together, these data indicate that the Arhgap21+/- mice present an altered bone marrow microenvironment, with larger amount of osteoblastic cells and less support for BM reconstitution after transplantation, which may indicate a possible role of ARHGAP21 in the pathophysiology of hematological diseases, since disruption in the bone marrow niche is related to these diseases Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências FAPESP 2011/51959-0 CAPES

Micronutrients are indispensable for adequate metabolism, such as biochemical function and cell production. The production of blood cells is named haematopoiesis and this process is highly consuming due to the rapid turnover of the haematopoietic system and consequent demand for nutrients. It is well established that micronutrients are relevant to blood cell production, although some of the mechanisms of how micronutrients modulate haematopoiesis remain unknown. The aim of the present review is to summarise the effect of Fe, Mn, Ca, Mg, Na, K, Co, iodine, P, Se, Cu, Li and Zn on haematopoiesis. This review deals specifically with the physiological requirements of selected micronutrients to haematopoiesis, showing various studies related to the physiological requirements, deficiency or excess of these minerals on haematopoiesis. The literature selected includes studies in animal models and human subjects. In circumstances where these minerals have not been studied for a given condition, no information was used. All the selected minerals have an important role in haematopoiesis by influencing the quality and quantity of blood cell production. In addition, it is highly recommended that the established nutrition recommendations for these minerals be followed, because cases of excess or deficient mineral intake can affect the haematopoiesis process.

Orientador: Konradin Metze Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Durante mais de 100 anos, a coloração de May-Grünwald-Giemsa tem sido utilizada em citologia hematológica. Os avanços recentes na óptica biomédica introduziram novas tecnologias microscópicas que não exigem mais procedimentos de coloração. Neste contexto, a utilização do método FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) é de particular interesse, pois cria imagens virtuais com base nas diferenças das características físico-químicas das células sem qualquer procedimento de coloração. Essa técnica se baseia no contraste do tempo de vida dos fluoróforos individuais, medindo o curto atraso entre a absorção de energia de um pulso de laser e a emissão dos fótons de fluorescência pelas moléculas excitadas, atribuindo pseudo-cores artificiais a imagem com base nas diferenças de tempo de vida da fluorescência medidas para cada pixel. Neste estudo retrospectivo utilizamos 32 lâminas de reserva de esfregaços de medula óssea de pacientes que tiveram indicação clínica para realizar mielograma, mas as lâminas de coloração de leishman desses casos, após revisadas confirmaram padrão hematopoiético normal. Os esfregaços não corados foram fixados por vapor de formaldeído, armazenados à temperatura ambiente e posteriormente analisados no microscópio confocal invertido utilizando o método FLIM. O estudo vizou a viabilidade e reprodutibidade do método para diferenciar sem utilizar corantes por meio do tempo de vida da fluorescência, os precursores hematopoiéticos. Os tempos de vida da fluorescência foram significativamente diferentes entre as células (p

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A interação da quimiocina CXCL12 com o seu receptor CXCR4 tem demonstrado ser essencial na regulação da hematopoese normal e leucêmica. Recentemente, outro receptor para CXCL12, mais comumente conhecido como CXCR7, foi descoberto, porém sua expressão e função em células hematopoéticas é controverso. Dependendo do tipo celular, este receptor pode ativar vias de sinalização mediada por ?-arrestina2, formar heterodímeros com CXCR4 e/ou remover CXCL12 do meio extracelular, intermediando a degradação de CXCL12 e evitando a regulação negativa de CXCR4. Além de estudar as quimiocinas e seus receptores, é importante estudar as proteínas que são ativadas com a sua ligação, como a ARHGAP21, proteína pertencente à família RhoGAP (do inglês, RhoGTPase activating proteins), cujo principal papel é regular negativamente as RhoGTPases. Esta proteína também pode deflagrar eventos biológicos além da sua função GAP, através da interação com outras proteínas. Estudos prévios mostraram que camundongos Arhgap21+/- demonstraram redução na migração, adesão e homing de células progenitoras (Lin-) para orgãos hematopoéticos e redução da frequência de células da linhagem mielóide, linfóide T e eritróide na medula óssea; processos celulares importantes os quais são mediados pela interação CXCL12/CXCR4, e não se sabe ainda se também por CXCR7. O objetivo geral do presente estudo foi investigar e caracterizar a função de CXCR7 na hematopoese normal e leucemia mieloide aguda. Neste trabalho mostramos que CXCR7 é importante na migração e homing de células CD34+ e células de leucemia mieloide aguda para orgãos hematopoéticos. Na leucemia mieloide aguda, CXCR7 pode prevenir a regulação negativa de CXCR4 induzida por CXCL12. Observou-se também que camundongos Arhgap21+/- apresentam menor expressão gênica de CXCR7 nas células totais da medula óssea e menor expressão proteica deste receptor na membrana celular de linfócitos T CD3+. Linfócitos T CD3+ de camundongos Arhgap21+/- apresentam também menor migração em resposta a CXCL12. A redução de CXCR7 na membrana celular destas células pode ser causada por um problema no recrutamento de ?-arrestina2, proteína importante na endocitose e reciclagem de receptores para a membrana celular, pois também foi observado uma redução neste processo nestes camundongos. Juntos, estes resultados indicam que CXCR7 é importante na migração de células normais hematopoéticas: linfócitos T e CD34+; e células de leucemia mielóide aguda, interferindo na ação, do outro importante receptor para CXCL12, CXCR4. Esta interferência seria por sua função de remover CXCL12, formando um gradiente adequado para o funcionamento de CXCR4, e/ou por sua capacidade de formar heterodímeros com esse receptor modulando e potencializando a resposta celular da interação CXCL12/CXCR4 Abstract: The interaction of CXCL12 chemokine to CXCR4 has been shown to be essential in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis. Recently, another receptor for CXCL12, more commonly known as CXCR7 was discovered, however the expression and function of this receptor in hematopoietic cells is controversial. Depending on the cell type, this receptor can activate ?-arrestin2-mediated signaling pathways, form heterodimers with CXCR4 and/or remove CXCL12 from the extracellular medium, mediating degradation and preventing the CXCL12 induced-downregulation of CXCR4. In addition to studying chemokines and their receptors, it is important to study the proteins that are activated as a result of their connection, such as ARHGAP21, a protein belonging to the family RhoGAP (RhoGTPase activating proteins), whose main role is to downregulate the RhoGTPases. This protein can also trigger biological events beyond the GAP function through its interaction with other proteins. Previous studies have shown that Arhgap21+/- mice showed a reduction in migration, adhesion and homing of progenitor cells (Lin-) to hematopoietic organs and reduction in the frequency of myeloid lineage cells, T lymphoid and erythroid in bone marrow; these are important cellular processes mediated by the interaction CXCL12/CXCR4 and possibly also in CXCR7, however this has not yet been verified. The overall objective of this study was to investigate and characterize the CXCR7 function in normal hematopoiesis and acute myeloid leukemia. We show that CXCR7 is important in the migration and homing of CD34+ cells and cells of acute myeloid leukemia to hematopoietic organs. In the latter, CXCR7 can prevent the downregulation of CXCR4 caused by CXCL12. The CXCR7 gene has a lower expression in total bone marrow cells and the receptor's protein is reduced in the cell membrane of CD3+ T lymphocytes in Arhgap21+/- mice. CD3+ T lymphocytes of Arhgap21+/- mice also have a lower migration in response to CXCL12. CXCR7 reduction in the cell membrane of these cells can be caused by a problem in ?-arrestin2-recruiting, an important protein in endocytosis and in the recycling of receptors in the cell membrane, as a reduction in the process in these mice was also observed. Together, these results indicate that CXCR7 is important in the migration of normal hematopoietic cells, T lymphocytes and CD34+ cells, and cells of acute myeloid leukemia, interfering with the action of other important receptor for CXCL12, CXCR4. This interference would be to "remove" CXCL12 in order to reach a suitable gradient for the operation of CXCR4, and/or the ability to form heterodimers with this receptor modulating and potentiating the interaction of CXCL12/CXCR4 Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2012/01030-8 CNPQ

ANKHD1 is highly expressed in human acute leukemia cells and potentially regulates multiple cellular functions through its ankyrin-repeat domains. In order to identify interaction partners of the ANKHD1 protein and its role in leukemia cells, we performed a yeast two-hybrid system screen and identified SIVA, a cellular protein known to be involved in proapoptotic signaling pathways. The interaction between ANKHD1 and SIVA was confirmed by co-imunoprecipitation assays. Using human leukemia cell models and lentivirus-mediated shRNA approaches, we showed that ANKHD1 and SIVA proteins have opposing effects. While it is known that SIVA silencing promotes Stathmin 1 activation, increased cell migration and xenograft tumor growth, we showed that ANKHD1 silencing leads to Stathmin 1 inactivation, reduced cell migration and xenograft tumor growth, likely through the inhibition of SIVA/Stathmin 1 association. In addition, we observed that ANKHD1 knockdown decreases cell proliferation, without modulating apoptosis of leukemia cells, while SIVA has a proapoptotic function in U937 cells, but does not modulate proliferation in vitro. Results indicate that ANKHD1 binds to SIVA and has an important role in inducing leukemia cell proliferation and migration via the Stathmin 1 pathway. ANKHD1 may be an oncogene and participate in the leukemia cell phenotype.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hematopoiese, processo pelo qual a célula-tronco hematopoiética (CTH) dá origem a todas as células do sangue, é regulada através do seu contato com diversos tipos celulares que compõem o estroma da medula óssea, mantendo o balanço entre autorrenovação e diferenciação das CTHs, processos também regulados por vias de sinalização como a via Hedgehog e proteínas reguladoras de citoesqueleto como RhoGTPases. Sendo assim, os objetivos gerais do trabalho foram investigar a via Hedgehog na medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásica (SMD) e a função da ARHGAP21 na autorrenovação das CTH. Através de imunohistoquímica de bióspias de medula óssea de pacientes com SMD em comparação com anemia megaloblástica (usada como controle) observamos o aumento de células marcadas para os ligantes Sonic e Dessert Hedgehog e células positivas para c-Kit nas amostras de SMD. Em seguida, analisamos a expressão gênica dos membros da via Hedgehog em células totais de medula óssea de pacientes SMD e doadores normais. Não houve diferença na expressão de Patched (PTCH) em SMD em comparação com doadores saudáveis, porém quando as amostras são classificadas de acordo com a WHO 2008, observamos aumento significativo de PTCH nos pacientes com 5% de blastos na medula óssea (AREB-1 e 2). Observamos aumento de 7 vezes na expressão de SMO no grupo de SMD e de 14 vezes no grupo AREB-1 e 2 em comparação com doadores normais. Análises de sobrevida de Cox demonstraram que o aumento na expressão de SMO e a redução na expressão de PTCH são fatores independentes na sobrevida global dos pacientes com SMD. Além disso, confirmamos o aumento da ativação da via Hedgehog em células CD34+ de pacientes com SMD através do aumento da expressão dos alvos da via: GLI1, BMI1 e Nanog. Nossos dados indicam que a via Hedgehog está desregulada na medula óssea dos pacientes com SMD e o possível envolvimento dessa via na progressão da doença. Através do modelo murino Arhgap21+/- estudamos a importância dessa proteína na hematopoiese normal e observamos que esses animais apresentam redução nas diferenciações eritroide e megacariocítica juntamente com aumento da mobilização mielóide. Observamos ainda o aumento na frequência das CTHs de curta e longa duração na medula óssea dos heterozigotos. Esse aumento foi responsável pela maior recuperação no número de neutrófilos após indução de estresse hematopoiético nos animais Arhgap21+/-. Durante o transplante seriado de células de medula óssea observamos menor reconstituição após 4 semanas, juntamente com menor reconstituição a longo prazo nos animais que receberam células dos heterozigotos, sugerindo menor autorrenovação das CTHs nas células com redução da Arhgap21. O nicho medular dos animais Arhgap21+/- demonstrou redução no suporte inicial da hematopoiese o que foi relacionado à maior produção de ROS após irradição subletal dos heterozigotos. Juntos, esses resultados indicam que a ARHGAP21 tem importante papel na hematopoiese normal, pois participa de processos como a diferenciação, mobilização e autorrenovação das CTHs Abstract: Hematopoiesis is a process by which hematopoietic stem cell (HSC) gives rise to all blood cells and it is regulated by HSC contact with different cell types that compose the bone marrow stroma and maintain the balance between HSC self-renewal and differentiation, processes that are also regulated by signaling pathways such as the Hedgehog and regulatory proteins of the cytoskeleton as RhoGTPases. The overall aims of this work were to investigate the Hedgehog pathway in myelodysplastic syndrome (MDS) bone marrow and the ARHGAP21 role in hematopoiesis. Immunohistochemistry assays revealed that MDS bone marrow biopsies showed increased Sonic and Dessert Hedgehog together with c-kit positive stained cells compared to megaloblastic anemia (used as control).We also analyzed gene expression of the Hedgehog pathway members in total cells from MDS bone marrow and healthy donors. There was no difference in Patched (PTCH) expression in MDS compared to healthy donors, however, when MDS samples were classified according to WHO 2008, we observed a significant increase in PTCH1 expression in MDS patients 5% bone marrow blast (RAEB-1 and RAEB-2) compared to controls. We also observed 7-fold increase of SMO transcripts in the MDS group and 14-fold increase in RAEB-1 and RAEB-2. Cox survival analyses showed that increased SMO and decreased PTCH expression were considered as independent factors influencing the survival of these patients. We also confirmed the enhanced Hedgehog activation in CD34+ cells from MDS patients through increased expression of the pathway targets: GLI1, BMI1 and Nanog. Together, our data indicate that the Hedgehog pathway is deregulated in MDS bone marrow and the possible role of that pathway in disease progression. Arhgap21+/- murine model study showed the importance of this protein in normal hematopoiesis as these animals showed alterations in erythroid and megakariocyte differentiation along with increased myeloid mobilization. We also observed increased short and long term HSC frequency in the heterozygous bone marrow. This increase was responsible for enhanced neutrophil reconstitution during induced hematopoietic stress in Arhgap21+/-. Serial bone marrow transplantation assay showed lower chimerism in peripheral blood 4 weeks after the transplant together with lower long term reconstitution in animals who received Arhgap21+/- bone marrow, indicating decreased HSC self-renew from heterozygous cells. Bone marrow niche of Arhgap21+/- animals showed a reduction in initial support hematopoiesis and this result was correlated with the increased ROS production from Arhgap21+/- bone marrow after sublethally irradiation. Taken together, our data indicate that ARHGAP21 has an important role in hematopoiesis regulating process such as differentiation, mobilization and self-renewal of HSC Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutora em Fisiopatologia Médica FAPESP CNPQ CAPES

Orientadores: João Agostinho Machado Neto, Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A identificação de genes/proteínas diferencialmente expressos em neoplasias hematológicas e a investigação funcional destas proteínas no fenótipo neoplásico são essenciais para o entendimento da biologia da doença. ANKHD1 é altamente expressa em células de leucemia aguda e tem potencial para regular vários processos celulares através de seus domínios de repetição de anquirina. Nosso grupo de pesquisa havia previamente identificado a interação entre ANKHD1 e SIVA através de ensaio de duplo híbrido. Outras proteínas potencialmente relacionadas à ANKHD1 que foram de interesse deste trabalho foram a Stathmin 1 que interage com SIVA e a YAP1 que interage com ANKHD1 em células não hematológicas. O objetivo principal do presente trabalho foi investigar a participação funcional de ANKHD1 e proteínas relacionadas em neoplasias hematológicas. Utilizamos modelos de linhagens leucêmicas humanas e células hematopoéticas primárias provenientes de indivíduos normais (n=52) e de pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica (SMD; n=65), neoplasia mieloproliferativa (NMP; n=82), leucemia mieloide aguda (LMA; n=60) e leucemia linfoide aguda (LLA; n=19). Técnicas para avaliação de expressão gênica (qPCR), expressão e interação proteica (western blotting), ensaios funcionais de migração (ensaio transwell), proliferação (MTT e clonogenicidade in vitro, formação de tumor in vivo) e apoptose (Anexina V/IP, TUNEL), e inibição de proteínas de interesse através do uso de inibidores farmacológicos ou ferramentas de terapia gênica foram utilizados. A interação entre ANKHD1 e SIVA foi confirmada por ensaios de coimunoprecipitação. Em linhagens celulares leucêmicas U937 e Jurkat, o silenciamento de ANKHD1 reduziu a proliferação celular, migração e o crescimento tumoral, enquanto que a inibição de SIVA aumentou a migração e o crescimento tumoral e reduziu a sensibilidade à apoptose induzida por radiação UV de células U937. A inibição de ANKHD1 reduziu a atividade de Stathmin 1 e a interação entre SIVA/Stathmin 1. Grande parte das linhagens leucêmicas e amostras primárias de pacientes com neoplasias hematológicas não apresentou a expressão de YAP1, e o silenciamento de ANKHD1 não modulou a atividade de YAP1 em células U937. A expressão de Stathmin 1 foi significativamente elevada em amostras de células hematopoéticas de pacientes com neoplasisa hematológicas (SMD AREB-1/AREB-2, LMA, LLA e mielofibrose primária) quando comparada às amostras de doadores saudáveis. O silenciamento de Stathmin 1 reduziu a proliferação celular e clonogenicidade em células leucêmicas U937, Namalwa e células HEL JAK2V617F. Especificamente em células HEL JAK2V617F, a inibição de Stathmin 1 ou o tratamento com o agente estabilizador de microtúbulos paclitaxel teve um efeito potencializador ao tratamento com ruxolitinib, inibidor de JAK1/2, na indução de apoptose. Em conclusão, propomos que a ANKHD1 participa do fenótipo neoplásico de células leucêmicas através de sua interação com SIVA, inibição de SIVA e ativação de Stathmin 1. Os nossos resultados indicam que a função de ANKHD1 na leucemogênese independe de sua interação com YAP1. Em células humanas com ativação constitutiva da via JAK2/STAT, identificamos a relevância funcional da participação de Stathmin 1 no fenótipo neoplásico Abstract: The identification of genes/proteins differentially expressed in hematopoietic neoplasms and the functional investigation of these proteins in the neoplastic phenotype are essential for the understanding of disease biology. ANKHD1 is highly expressed in acute leukemia cells and has a potential role in regulating many cellular processes through its ankyrin repeat domains. Our research group has previously identified the interaction between ANKHD1 and SIVA through two-hybrid assay. Other proteins potentially related to ANKHD1 that were of interest of this research are Stathmin 1 that interacts with SIVA, and YAP1 that interacts with ANKHD1 in non hematologic cells. The aim of this study was to investigate the functional role of ANKHD1 and its related-proteins in hematologic malignancies. We used human leukemia cell lines and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=52) and patients with myelodysplastic syndromes (MDS; n=65), myeloproliferative neoplasms (MPN; n=82), acute myeloid leukemia (AML; n=60) and acute lymphoid leukemia (ALL; n=19). Techniques for the evaluation of gene expression (qPCR), protein expression and interaction (western blotting), functional assays of migration (transwell assay), proliferation (in vitro MTT and clonogenicity, in vivo tumor formation) and apoptosis (Annexin V/PI, TUNEL), and inhibition of proteins of interest through pharmacologic agents or gene therapy tools were used. The interaction between ANKHD1 and SIVA was confirmed by co-immunoprecipitation assays. In leukemia cell lines U937 and Jurkat, ANKHD1 silencing reduced cell proliferation, migration and tumor growth, while SIVA inhibition increased migration and tumor growth, and reduced sensitivity to UV-induced apoptosis of U937 cells. Inhibition of ANKHD1 reduced Stathmin 1 activity and the interaction between SIVA/Stathmin 1. A large proportion of leukemia cell lines and primary samples from patients with hematologic malignancies did not present YAP1 expression, and ANKHD1 silencing did not modulate YAP1 activity in U937 cells. Stathmin 1 expression was significantly higher in primary hematopoietic cells from patients with hematological malignancies (MDS RAEB-1/RAEB-2, AML, ALL and primary myelofibrosis) compared to samples from healthy donors. Stathmin 1 silencing reduced cell proliferation and clonogenicity of U937 and Namalwa leukemia cells, and HEL JAK2V617F cells. Specifically in HEL JAK2V617F cells, Stathmin 1 silencing or treatment with the microtubule-stabilizing agent paclitaxel had a potentiating effect to treatment with the JAK1/2 inhibitor ruxolitinib on apoptosis induction. In conclusion, we propose that ANKHD1 participates in the leukemia phenotype through its interaction with SIVA, SIVA inhibition, and Stathmin 1 activation. Our results indicate that ANKHD1 plays a role in leukemogenesis independently of its interaction with YAP1. In human cells with a constitutive activation of the JAK2/STAT pathway, we identified the relevant role of Stathmin 1 in the malignant phenotype Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Fabíola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas (NMP) apresentam como característica comum a ocorrência de proliferação celular exacerbada, mantendo a capacidade de diferenciação mieloide terminal. Em parcela significativa dos casos, a ativação da proliferação celular ocorre pelo aumento da atividade tirosinoquinase de proteínas específicas. Entretanto, a heterogeneidade molecular observada nos pacientes e as respostas clínicas insatisfatórias observadas em parte dos casos com os tratamentos vigentes sugerem que mecanismos adicionais, como interações proteicas não descritas e novas mutações, possam estar envolvidos na fisiopatologia destas neoplasias. Neste trabalho, objetivamos estudar as vias de ativação tirosinoquinase em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) (subprojeto 1), e em mastocitose sistêmica (subprojeto 2). O foco principal do subprojeto 1 consistiu em avaliar, em NMP, a associação JAK2/IRS2, previamente descrita em células não hematológicas após estímulo, bem como o envolvimento de IRS2 em vias de proliferação celular e apoptose. Utilizamos modelos de linhagens celulares leucêmicas humanas com JAK2 mutado (JAK2V617F) e JAK2 selvagem (JAK2WT), submetendo-as a inibição gênica por shRNA entregue por lentivírus e ao tratamento com o inibidor seletivo de JAK1/2 ruxolitinib. As células foram então submetidas à avaliação da viabilidade celular por MTT, e da apoptose por citometria de fluxo (anexina V/PI e caspase-3) e por imunobloting (caspase-3 clivada). A expressão do mRNA de IRS2 foi avaliada por PCR em tempo real em amostras de células CD34+ de sangue periférico de 99 pacientes com diagnóstico de PV, TE e MFP, e em 28 doadores normais. Através de imunoprecipitação e microscopia confocal, observamos a associação constitutiva entre JAK2 e IRS2 nas células JAK2V617F, mas não nas células JAK2WT. Em células JAK2V617F, a inibição de IRS2 por lentivírus diminuiu significativamente a fosforilação de STAT5, reduziu a viabilidade celular, aumentou as taxas de apoptose, e potencializou os efeitos de ruxolitinib. Não houve mudanças nas taxas de viabilidade celular e apoptose nas células JAK2WT inibidas para IRS2. A expressão do mRNA de IRS2 foi significativamente maior nos pacientes com TE em relação aos doadores normais, e em pacientes com NMP portadores da mutação JAK2V617F em relação aos pacientes com JAK2WT. Estas evidências sugerem que IRS2 possa participar das vias de sinalização celular nas NMP através de interação direta com JAK2. A inibição farmacológica de IRS2, isoladamente ou em conjunto com ruxolitinib, é ferramenta potencial no tratamento de pacientes com PV, TE e MFP. No subprojeto 2, nosso objetivo consistiu em investigar mutações no gene KIT em um caso de mastocitose sistêmica familiar seguido em nosso serviço, em que mãe (caso 1) e filha (caso 2) apresentavam extensa infiltração cutânea e da medula óssea por mastócitos, bem como avaliar a sensibilidade dos mastócitos neoplásicos ao tratamento com os inibidores de tirosinoquinase (ITK) imatinibe, dasatinibe e PKC412. Através de sequenciamento por Sanger, identificamos a mutação KITK509I em células de medula óssea total, CD3+ de sangue periférico e mucosa oral de ambas pacientes. Os pais do caso 1 apresentaram KIT selvagem. O tratamento in vitro por 4, 8 ou 12 dias de células totais de medula óssea dos casos 1 e 2 com os ITK avaliados resultou em menor viabilidade celular, avaliada por MTT, e em redução da fosforilação de P70S6K com todas as drogas testadas. Entretanto, apenas o imatinibe evidenciou resposta consistente na indução de apoptose. Foi iniciado tratamento dos casos 1 e 2 com imatinibe 400mg/dia via oral. Três meses após o início, houve normalização da pele e da medula óssea; após dois anos de seguimento, as pacientes mantêm-se em remissão. Embora rara, a mutação KITK509I deve ser pesquisada em todos os casos de mastocitose sistêmica familiar. O imatinibe pode ser considerado como droga de primeira escolha nestes casos Abstract: The BCR-ABL1 negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by increased cellular proliferation with preserved terminal myeloid differentiation. In most cases, the activation of cell proliferation is caused by an increased tyrosine kinase activity of specific proteins. However, patients' molecular heterogeneity and the incomplete clinical responses observed in part of the cases using the current treatments suggest that additional mechanisms, such as unknown protein interactions and new mutations, can be involved in the pathophysiology of MPN. In this study, our main goal was to investigate tyrosine kinase activation pathways in polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) (subproject 1), and in systemic mastocytosis (subproject 2). The focus of subproject 1 consisted in the investigation of JAK2/IRS2 association in MPN, already described in non-hematological cells following extrinsic stimulus, and in evaluating IRS2 function in MPN cell proliferation and apoptosis. JAK2 wild-type (JAK2WT) and JAK mutated (JAK2V617F) human leukemia cell lines were transduced with lentivirus-mediated shRNA targeting IRS2, and treated with vehicle (DMSO) or with the selective JAK1/2 inhibitor ruxolitinib. Cells were then submitted to evaluation of cell viability (MTT) and apoptosis (anexin V/PI and caspase-3 by flow cytometry, and cleaved caspase-3 by immunoblotting). IRS2 mRNA expression was evaluated by real time quantitative PCR in CD34+ peripheral blood cells of 99 patients with PV, ET and PMF, and in 28 healthy donors. Through immunoprecipitation/immunobloting and confocal microscopy, we observed the constitutive JAK2/IRS2 association in JAK2V617F cells, but not in JAK2WT cell lines. In JAK2V617F, IRS2 silencing significantly decreased phospho-STAT5, reduced cell viability, induced apoptosis, and potentiated the effects of ruxolitinib treatment. No differences in cell viability and apoptosis ratios were observed in IRS2 silenced JAK2WT cells. IRS2 mRNA expression was significantly higher in ET patients when compared to healthy donors, and in patients harboring JAK2V617F mutation in relation to JAK2WT. These evidence suggest that IRS2 participate in MPN cell signaling pathways through its interaction with JAK2. IRS2 pharmacological inhibition, alone or in combination with ruxolitinib, may be a potential tool in the treatment of PV, ET and PMF patients. In subproject 2, our main goal was to seek for KIT mutations in a case of systemic familial mastocytosis, followed in our outpatient clinics, in which the mother (case 1) and the daughter (case 2) had extensive skin and bone marrow infiltration by mast cells. Also, we aimed to evaluate in vitro sensitivity of neoplastic mast cells to the treatment with the tyrosine kinase inhibitors (TKI) imatinibe, dasatinibe and PKC412. Using Sanger sequencing analysis, we identified the KITK509I mutation in total bone marrow, peripheral blood CD3+ and oral mucosa cells in both patients. The parents of case 1 had wild type KIT. The in vitro treatment of total bone marrow cells of cases 1 and 2 with TKI for 4, 8 and 12 days resulted in reduced cell viability, as evaluated by MTT, and in reduced phosphorylation of P70S6K for all tested drugs. However, only imatinibe consistently induced apoptosis in both cases. Patients were started on imatinibe 400mg orally per day. Three months following imatinibe treatment, there was a complete reversion of skin and bone marrow mast cells infiltration; after two years of follow-up, cases 1 and 2 remain in complete remission of the systemic mastocytosis. Although rare, KITK509I mutation should be investigated in all cases of familial systemic mastocytosis. Imatinibe is a good first choice for the treatment of these cases Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os eventos de migração e adesão das células progenitoras hematopoéticas são cruciais para a sua manutenção nos nichos da medula óssea e são regulados por diversos fatores, dentre eles as RhoGTPases. ARHGAP21 é uma proteína RhoGAP (RhoGTPase activating protein, que regulam negativamente as RhoGTPases), e atua na migração e adesão celulares. O papel da Arhgap21 na hematopoese ainda é desconhecido. O objetivo geral do presente estudo foi estudar a função da Arhgap21 na migração e adesão das células progenitoras hematopoéticas. Neste trabalho, mostramos que ainda não foi possível a obtenção do camundongo nocaute para Arhgap21, pois parece que morrem antes do nascimento. O estudo foi realizado com os camundongos Arhgap21+/-, cuja expressão gênica e protéica de Arhgap21 está reduzida. As células progenitoras hematopoéticas Arhgap21+/- apresentaram menor quimiotaxia induzida por CXCL-12 e redução da adesão à fibronectina, o que provavelmente levou a um homing ineficiente para a medula óssea e para o baço. Observou-se também que o microambiente da medula óssea e do baço com redução de Arhgap21 leva à ineficiência do homing das células progenitoras hematopoéticas normais. Não foi observada alteração na expressão gênica e na freqüência de células expressando CXCR-4, bem como não houve diferença na secreção de CXCL-12. As células da medula óssea Arhgap21+/- apresentaram maior expressão de Cdc42 e parecem possuir maior atividade desta RhoGTPase. Pela primeira vez se descreve o papel da Arhgap21 na hematopoese normal e ela parece ser um importante regulador da migração, adesão e homing das células progenitoras hematopoéticas, provavelmente pela regulação negativa de Cdc42, através da sua função GAP Abstract: Migration and adhesion of hematopoietic progenitor cells are crucial events for their maintenance on bone marrow niches. The role and mechanisms underlying hematopoietic progenitors migration and adhesion has been extensively studied and RhoGTPases have been implicated in these events. Regulators and effectors of RhoGTPases functions also have been studied in biology of hematopoietic progenitor cells. ARHGAP21 is a RhoGAP member, which function as negative regulators of RhoGTPases, and plays role in cell migration and adhesion. The aim of this study was to investigate the role of Arhgap21 in migration and adhesion of hematopoietic progenitor cells. It was not possible to generate a knockout mouse until now, because they die before birth, as results indicate. Heterozygous mice (Arhgap21+/-)v have reduction in Arhgap21 gene and protein expression and we used it as model. Hematopoietic Progenitor cells from Arhgap21+/- mice showed reduction in CXCL-12- induced chemotaxis as well as in fibronectin adhesion, which probably leaded to inefficient homing to wild-type bone marrow and spleen observed. In addition, homing of wild-type hematopoietic progenitor cells to Arhgap21+/- bone marrow and spleen was also reduced. It was not observed differences in CXCR-4 gene expression and frequency of progenitor hematopoietic cells expressing this receptor as well as in CXCL-12 secretion in Arhgap21+/- bone marrow or serum. It is the first time that the role of Arhgap21 in hematopoiesis is described and it seems to be an important regulator of hematopoietic progenitor cell migration, adhesion and homing, probably due to Cdc42 negative regulation by its RhoGAP function Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutora em Fisiopatologia Médica

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-05Bitstream added on 2014-06-13T19:23:19Z : No. of bitstreams: 1 000749254.pdf: 1885169 bytes, checksum: 24b6601284053d8b99b0722497bb3702 (MD5) A avaliação da medula óssea e das células do sangue em cães com leishmaniose visceral (LV) pode proporcionar valiosas informações, tanto quantitativas quanto qualitativas, relativas à hematopoiese. Os objetivos deste estudo foram avaliar a medula óssea de cães com LV, por meio de exame citológico, histopatológico e imuno-histoquímico (IHC), avaliando-se a carga parasitária, a quantidade de linfócitos e macrófagos, além de células expressando MHC de classe II, IFN-, IL-10, TNF-α e TGF-β, bem como sua repercussão nas células do sangue. Para tanto, foram utilizados 60 cães, sendo 54 infectados e seis animais não infectados. Os cães infectados apresentaram anemia normocítica normocrômica, porém sem alterações na linhagem eritroide da medula óssea, além de displasia granulocítica, megacariocítica e granulomas na medula óssea. A linfocitose observada na medula óssea se refletiu no sangue. No exame citológico, observou-se grande infiltração de macrófagos, linfócitos e plasmócitos nos animais infectados. Quanto à IHC, os cães infectados apresentaram grande quantidade de células imunomarcadas para TNF-α, IL-10, IFN-,TGF-β e macrófagos The evaluation of the bone marrow and blood cells in dogs with visceral leishmaniasis (VL) can provide valuable information, both quantitative and qualitative, on the hematopoiesis. The objectives of this study were to evaluate the bone marrow of dogs with VL through cytological, histopathological and immunohistochemical (IHC) examination, evaluating the parasitic load, the amount of lymphocytes and macrophages and by cells expressing MHC class II, IFN-, IL-10, TNF-α and TGF-β, as well as its effect on blood cells. To this end, 60 dogs, 54 infected and six uninfected animals were used. Infected dogs showed normochromic normocytic anemia, but without any changes in the erythroid lineage bone marrow, and dysplasia granulocytic, megakaryocytic and granulomas in the bone marrow. The lymphocytosis in the bone marrow was reflected in the blood. On cytological examination, there was extensive infiltration of macrophages, lymphocytes and plasma cells in infected animals. As for IHC, infected dogs showed large amount of immunostained cells to TGF-β, TNF-α, IL-10, IFN- and macrophages

Myelodysplastic syndrome (MDS) is a heterogeneous group of diseases characterized by ineffective and dysplastic hematopoiesis and pancytopenia in the peripheral blood(1). Minimal diagnostic criteria for MDS have been discussed by several working groups. The term idiopathic cytopenia of undetermined significance (ICUS) has been proposed to define patients who do not fill minimal criteria for MDS but present with persistent cytopenia not attributable to a hematological or non-hematological disease(2). In medical services where immunohistochemistry, cytogenetics and studies of progenitor cell assays are still not available, the morphologic parameters may be the center of the diagnosis of ICUS. Several working groups have also discussed minimal morphological criteria for 'bone marrow dysplasia'. Based on these discussions, at least 10% of all cells in a given lineage should produce signs of dysplasia to fill this important criterion(3). Patients with ICUS present mild dysplasia in one or more hematopoietic lineages. Figures 1 & 2 illustrate the myelogram of one patient with ICUS and one patient with MDS showing the levels of dysplasia in both settings. Distinguishing between these entities is important to understand the similarities and differences in pathologic mechanisms of the two hematologic diseases and so to direct the correct management of patients.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:13:15Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final Patricia Alzueta Moreno Martinez.pdf: 2808588 bytes, checksum: ca7465541209c656737f07f5efcd1bef (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final Patricia Alzueta Moreno Martinez.pdf: 2808588 bytes, checksum: ca7465541209c656737f07f5efcd1bef (MD5) Previous issue date: 2012-10-10 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Nowadays it is known that firsts definitive hematopoietic progenitors arise from endothelium differentiation of dorsal aorta, at Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) site. In order to study those events and cells phenotype of dorsal aorta endothelium in this topographical site, fertilized eggs of Gallus gallus domesticus L. were incubated, from E16 to E25 and to be processed by histotechonology to obtain serial sections of the AGM site. After this, they were stained with Hematoxilin-Eosin, histochemistry to PAS, diastase PAS and Alcian Blue pH 1.0 and pH 2.5, to obtain a better overview and characterization from cells, also, histochemistry to fluorescein lectins and immunofluorescense to surface molecules, cytoeskeleton andextracellular matrix were performed. Our results showed endothelial hypertrophy of the aorta floor in the stages analyzed, which shown positive for PAS, with frequent appearance of PAS negatives basal vacuolizations and an occasional intravascular cell clusters arise of. It was also observed that cells which were separated from endothelium basal membrane shown progressively were more PAS positive which however in any time seems to be glycogen. Regard of glycosaminoglycans we noted the main presence of hialuronic acid for all the mesenchyme s site and in others structures like notochord periphery, neural tube and lateral mesoderm. It was observed fibronectin and smooth muscle α-actin co-expression on aorta surrounding walls, at vessel s ventral face. GFAP and BMP-4 are express between the cells of neural tube and surrounding it, as well as at embryo notochord. The lectins Abrus precatorius, Lens culinaris and Ricinus communis showed mostly positive expression on the sub endothelium site of the dorsal aorta floor at the stages analyzed in this work. Bandeiraea simplicifolia showed low expression on dorsal aorta and in Arachis hypogeae it was negative. Other structures of AGM s site also expressed sugar residues revealed by these lectins like: notochord, neural tube, mesenchyme, primitive gut and yolk sac. Acredita-se que os primeiros progenitores da hematopoese definitiva surjam da diferenciação do endotélio da aorta dorsal, na altura da região da Aorta-Gônada-Mesonefros (AGM). Com o intuito de estudar esta região e o fenótipo das células do endotélio da aorta dorsal nesta posição topográfica, ovos galados de Gallus gallus domesticus L. foram incubados em chocadeira, classificados em estádios de E16 a E25 e processados histotecnologicamente para obtenção de secções seriadas na altura da região AGM. Estas passaram por coloração por Hematoxilina-Eosina, histoquímica para PAS, PAS-diastase e Alcian Blue pH 1.0 e pH 2.5, histoquímica por lectinas fluoresceinadas e imunofluorescência para moléculas de superfície, citoesqueleto e matriz extracelular. Foi observada hipertrofia endotelial no assoalho da aorta nos estádios observados, o qual se apresentava positivo ao PAS, com ocorrência frequente de vacuolizações basais PAS negativas, e o surgimento ocasional de grupamentos celulares intravasculares. Nestes, as células que se destacavam da membrana basal do endotélio expressavam progressivamente mais material PAS positivo, o qual, no entanto, em nenhum momento pareceu se tratar de glicogênio. Em relação às glicosaminoglicanas, notamos a presença predominante de ácido hialurônico por todo o mesênquima da região e em outras estruturas como periferia da notocorda, tubo neural e mesoderma lateral. Ocorreu co-expressão de fibronectina e α-actina de músculo liso em células circunjacentes à aorta, na face ventral do vaso. GFAP e BMP-4 são expressas entre as células do tubo neural e em sua periferia, assim como na notocorda do embrião. As lectinas Abrus precatorius, Lens culinarise Ricinus communis mostraram-se positivas principalmente na região subedotelial do assoalho da aorta nos estádios observados neste trabalho. Bandeiraea simplicifolia exibiu pouca marcação na aorta dorsal e a Arachis hypogeae foi negativa. Outras estruturas da região AGM também expressaram resíduos de açúcares revelados por estas lectinas, tais como: notocorda, tubo neural, mesênquima, intestino primitivo e saco vitelínico. Estes resultados acrescentam elementos morfológicos e bioquímicos ao conhecimento sobre a região AGM de embriões de galinha e sobre o endotélio, possivelmente hemogênico, da aorta dorsal.

The visceral leishmaniasis (VL) is a serious problem of public health in the Latin America and has shown an increase mortality in the Brazil. This is a systemic infectious disease involving the bone marrow, causing many hematologic manifestations. Objetives: to describe LV bone marrow features and correlate cytomorphological findings with peripheral blood parameters and the disease severity: Methodology: It is a retrospective study with gathering clinical and laboratory data of patients attended at three references hospital of Ceará State between june 2001 and August 2010. Were included 126 patients with a LV diagnosis confirmed by detection of the parasite in bone marrow and/or by positive sorology, by rK39. The slides of bone marrow aspiration of all patients were evaluated and the parasite load and the hematologic parameters were determined.The gravity was determined by the risk of death using the scoring system. Results: The age ranged from 5 months to 79 years and 74% were male. The patients from urban area accounted 68,2%. Comorbidities were associated in 31,7% patients. The more frequently finding of bone marrow were moderate/high parasite load (57,2%), dysplasia with predominance of dyserythropoiesis (80,9%), hemophagocytosis (30,1%) and granuloma (22,2%).There was one positive association between parasite load and serious neutropenia, neutrophil

O decanoato de nandrolona (DN), um estimulante do sistema hematopoético, caracteriza-se por ser um medicamento acessível aos proprietários de animais com escassos recursos econômicos. Assim, este estudo objetivou avaliar o efeito de diferentes doses do DN no hemograma e na quantificação e a viabilidade das células mononucleares (CM) da medula óssea (MO), juntamente com a marcação das células hematopoéticas CD34+ de ratos Wistar saudáveis. Para isso, 48 animais foram separados em seis tratamentos, de forma aleatória, com oito animais cada. Os grupos foram constituídos por: G1 - controle (solução fisiológica); G2 - controle diluente (somente veículo oleoso de origem vegetal); G3 - 0,42mg kg-1 de DN; G4 - 1,8mg kg-1 de DN; G5 - 4,6mg kg-1 de DN; e G6 - 10,0mg kg-1 de DN. O fármaco foi aplicado semanalmente por três semanas. Os parâmetros hematológicos e medulares avaliados não tiveram diferença significativa entre os grupos, o que pode ter sido influenciado pela condição da MO ou pelo intervalo entre as doses. De acordo com os resultados obtidos e nas condições em que esta pesquisa foi desenvolvida, pode-se concluir que o DN não altera o hemograma, a quantificação e a viabilidade das CM e a marcação de CD34+ em ratos wistar saudáveis. Nandrolone Decanoate (ND), a hematopoietic system stimulant, is characterized as an accessible medicament for low-income pet owners. The aim of this research is to study the effect of different ND doses in the blood cytological parameters and the quantification and viability of the bone marrow (BM) mononuclear cells (MC), together with the labeling of CD34+ hematopoietic stem cells of healthy Wistar rats. Forty eight animals were randomly separated into six different groups of treatment, each composed of eight animals. These groups were divided in: G1 - control group (physiologic solution); G2 - diluent control (only vegetal oily vehicle); G3 - ND 0.42mg kg-1; G4 - ND 1.8mg kg-1; G5 - ND 4.6mg kg-1 and G6 - ND 10.0mg kg-1. The drug was weekly applied for three weeks. The hematologic and medullar analyzed parameters showed no significant difference between the groups, which may have been influenced by the BM conditions or by the applications frequency. According to the results obtained and according to the conditions under which this research was developed, it can be concluded that ND did not affect the blood cytological parameters, quantification and viability of MC and CD34+ labeling in healthy Wistar rats.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O Transplante de Medula Óssea Autólogo (TMOA) é uma terapia consolidada para tratamento de doenças hematológicas como linfomas, mielomas e leucemias. As células-tronco hematopoéticas (CTHs) podem ser obtidas diretamente da medula óssea (MO) ou do sangue periférico por meio de estímulo com quimioterapia e fatores de crescimento. Frequentemente pacientes submetidos a este procedimento mobilizam as CTHs de forma insatisfatória. O microambiente medular e a hematopoese estão intimamente relacionados com o sucesso deste tipo de tratamento, uma vez que a ontogênese da hematopoese depende de estímulos produzidos pelas células do microambiente medular. Os processos relacionados à adesão celular, as alterações do estroma e da matriz extracelular podem estar danificados em pacientes com MO inicialmente comprometida por células clonais, submetidos a esquemas de quimioterapia e radioterapia convencionais. Estudos relacionados à estrutura e funcionalidade do estroma medular e das CTHs foram realizados para elucidar os possíveis danos causados ao microambiente hematopoético e sua correlação com a recuperação hematológica de curto e longo prazo após os transplantes de medula óssea. Neste estudo, avaliou-se o potencial proliferativo, a capacidade de sustentação da hematopoese e os efeitos da criopreservação em amostras de MO de portadores de doenças onco-hematológicas submetidos ao TMOA. Foram avaliados 22 pacientes, com idade variando entre 16 e 60 anos (média de 37,2 anos). Destes, 5 eram portadores de Linfoma Não-Hodgkin (LNH), 6 de Linfoma de Hodgkin (LH), 4 de Mieloma múltiplo (MM) e 7 de leucemias. Os controles foram provenientes de 10 doadores normais de transplante de medula óssea alogênico com idade variando entre 26 e 45 anos. Foram empregadas culturas de medula óssea de longa-permanência, ensaios clonogênicos e análise histopatológica da MO em dois momentos distintos, pré e pós-mobilização com o intuito de observar se a quimioterapia associada ao fator de crescimento causaria algum dano nas CTHs ou no estroma medular. Observou-se diminuição da formação da camada estromal após a mobilização nas amostras dos controles (p =0,03), sugerindo que a medula óssea normal seja mais afetada pelo efeito imediato do G-CSF, ou que ocorra migração mais expressiva das células progenitoras hematopoéticas da MO para o sangue periférico. As amostras de pacientes apresentaram menor capacidade de formação da camada estromal em relação aos controles, indicando danos ao microambiente medular causados pelo tratamento quimioterápico prévio. Não foram detectadas diferenças funcionais nas amostras de pacientes durante o período de mobilização, não se relacionando a capacidade de formação do estroma com a terapêutica citotóxica empregada na mobilização. A presença de fibrose, infiltração e celularidade diminuída na MO contribuíram em parte para a diminuição da capacidade de formação da camada estromal sugerindo fortemente que os danos maiores estão relacionados ao estroma medular possivelmente causados pelo tratamento quimioterápico prévio. Nos ensaios clonogênicos apenas os estromas obtidos de amostras de pacientes pós-mobilização e co-cultivados com células CD34+ apresentaram atividade proliferativa nestes ensaios, com exceção do controle normal co-cultivado com célula CD34+ autóloga. Em relação ao processo de criopreservação não foi observada diferença entre as fases pré e pós-mobilização nas amostras de pacientes e controles, o que pode sugerir que este procedimento não afete a funcionalidade do estroma. Entretanto, as amostras de controles apresentaram diminuição significativa na formação da camada estromal na fase pós-mobilização em relação às amostras de pacientes, principalmente nas amostras a fresco, podendo-se sugerir que a situação do estroma medular de pacientes com doenças onco-hematológicas anteriores à mobilização possa apresentar um efeito protetor aos agentes criopreservadores. Estes achados sugerem que a existência de um estroma doente torna-o menos suscetível ao processo de mobilização e criopreservação. Autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) has proved efficient to treat hematopoietic malignancies such as lymphomas, leukemia and multiple myeloma. Stem cells can be obtained directly from bone marrow or be recruited to enter in the blood stream in response to chemotherapy and hematopoietic growth factors. However, some patients fail to show adequate yield of mobilized HSCs lowering the chances for a successful auto-HSCT. For definitive hematopoiesis to occur, HSCs must interact with a suitable microenvironment, including stromal cells, extracellular matrix and soluble factors. A large number of groups have been trying to elucidate the mechanisms related to mobilization, structural and functionality of marrow stroma and HSC were done to elucidate possible damage caused on marrow microenvironment and their correlation with the short and long time hematological recovery. In this study, it was evaluated proliferate potential, capacity of hematopoiesis support and the cryopreservation effects in bone marrow samples from patients with hematological malignancies submitted to auto-HSC. Were evaluated 22 patients diagnosed with hematological malignancies, aged 16 to 60 (37,2 average) years, including 5 non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) , 6 Hodgkin’s disease (HD), 4 multiple myeloma (MM), 5 acute myeloid leukemia (AML), 1 acute lymphoblastic leukemia (ALL) and 1 chronic lymphocytic leukemia (CLL). Ten allogeneic bone marrow donors were the control group with 26 to 45 years old. Were used long-term bone marrow cultures, clonogenical assays and bone marrow histopathology analysis at pre and post mobilization, with the purpose to observe if chemotherapy with growth factor will cause some damage to the hematopoietic stem cells or marrow stroma. It was observed stromal layer formation decreased at control samples after mobilization (p =0, 03), suggesting that normal bone marrow was more affected by G-CSF effect , or hematopoietic progenitor cells from bone marrow migrate expressively for the whole blood. Patients’ samples showed lower stromal layer formation in the control group, showing marrow microenvironment damage caused by previous chemotherapy or disease. It was not detected functional differences in patients’ samples during mobilization, no relation with capacity of stroma formation during the citotoxic therapy used in mobilization. Fibrosis, infiltration and cell decrease in bone marrow contribute to reduce the stromal layer formation capacity, suggesting that the main damages are related to marrow stroma. About the clonogenical assays only the obtained stromal layers by post-mobilization patients and CD 34+ co-cultivate cells, showing proliferative activity in these assays, with exception of the autologous CD 34+ co-cultivate control group cells. Related to cryopreservation process, it was not observed difference between pre and post phases at control and patients’ samples, which suggest that this procedure not affect marrow stroma functionality. However, the control samples showed significant decrease in stromal layer formation at the post-mobilization phase in relation to the patients’ sample, mainly in fresh samples, can suggest that the situation of marrow stroma patient with hematological malignancies before the mobilization can show one effective protection to cryopreserved agents. This finding suggests that have sick stromas that make it less susceptible to mobilization and cryopreservation process. TEDE BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho, investigamos os efeitos do extrato padronizado de Rhodiola rosea L. (ERR) sobre a resposta imunohematopoética de camundongos infectados com Listeria monocytogenes. Os resultados demonstram que o ERR aumenta a resistência dos animais frente uma dose letal de Listeria quando administrado profilaticamente nas doses de 100 e 250 mg/kg por sete dias consecutivos anteriores à inoculação. Paralelamente, reversão da mielossupressão induzida pela infecção, concomitante ao aumento na atividade de células natural killers (NK) e na produção das citocinas TNF-a, IFN-? e fatores estimuladores de colônias foram observados. Os resultados obtidos demonstram que o ERR compartilha da habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoiéticos e imunológicos envolvidos nos estágios iniciais da infecção com L. monocytogenes. Estes efeitos podem ser atribuídos à recuperação no equilíbrio da resposta hematopoiética através da produção de IL-1a e IL-6 pelas células estromais no microambiente medular e também da produção de fatores estimuladores de colônias a partir das 24 horas de infecção, promovendo aumento no número de progenitores de macrófagos e granulócitos na medula óssea. Além disso, a eficácia do ERR também depende do aumento na produção das citocinas TNF-a e IFN-?, do aumento na atividade funcional das células NK e polarização da resposta celular para Th1. Juntos, estes efeitos contribuem para o aumento na resistência a L. monocytogenes. Abstract: In this work, we have investigated the effects of Rhodiola rosea L. extract (ERR) in Listeria monocytogenes infected mice. Our results demonstrated that ERR protects mice from a lethal dose of L. monocytogenes, when administered prophylactically at 100 and 250 mg/kg, for seven consecutive days prior to the infection. In addition, prevention of myelosuppression induced by infection, concomitant to increasing natural killers (NK) cells activity and production of TNF-a, IFN-? and colony-stimulating factors were observed. The results showed that ERR share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunological unbalance involved in the initial stages of infection with this pathogen. These effects could be attributed to recovering of the hematopoietic response through the production of IL-1a and IL-6 by stromal cells in the bone marrow microenvironment and the production of colony-stimulating factors at 24 hours of infection, promoting an increase in the number of granulocytes and macrophages progenitors in the bone marrow microenvironment. Moreover, the efficacy of ERR depends on high levels of TNF-a and IFN- ?, increased NK cells activity and polarization to Th1 response. Together, these effects contribute to increasing resistance to L. monocytogenes. Doutorado Farmacologia Doutor em Farmacologia

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: As propriedades imunomoduladoras do extrato seco da raiz de Angelica sinensis Diels (EAS) foram avaliadas em camundongos Balb-c machos utilizandose o modelo de infecção por Listeria monocytogenes. Administrou-se profilaticamente doses de 10, 25, 50 e 100mg/Kg de EAS durante 10 dias. As doses de 10, 25 e 50mg/Kg protegeram os camundongos contra uma dose letal de Listeria monocytogenes observando-se uma taxa de sobrevida de 10%, 20% e 30%, respectivamente. Essas doses também impediram a mielossupressão e a esplenomegalia frente a uma dose subletal de Listeria monocytogenes aumentando de forma significativa o número de progenitores de macrófagos e granulócitos (CFU-GM) na medula óssea. A investigação da atividade dos fatores estimuladores de colônia (CSF) demonstrou aumento na atividade estimuladora de colônia no soro (CSA) de animais pré-tratados com EAS. Curiosamente, não se observou efeitos com a dose 100 mg/kg, em comparação com controles infectados não tratados, sugerindo estimulação dose-dependente da mielopoiese e CSA, onde a dose biológica ativa ótima foi a de 50 mg / kg. Esta dose foi utilizada nos experimentos para investigar os níveis de INF-y e TNF-a. Observou-se aumento nos níveis de INF-y e TNF-a em culturas de macrófagos esplênicos de animais tratados com EAS, sugerindo aumento na atividade microbicida de macrófagos. Estes resultados sugerem que EAS modula a atividade imune de forma indireta e provavelmente inibe a atividade supressora da LM por induzir um aumento na reserva de progenitores mielóide da medula óssea em conseqüência de uma liberação ativa de citocinas (CFS, INF-y e TNF-a). Abstract: The immunomodulatory properties of dry extract of the roots of Angelica sinensis Diels (ASE) were evaluated in Male BALB/c mice using the model of infection with Listeria monocytogenes. Prophylactic administration of ASE (10, 25, 50 and 100 mg/kg) stimulated marrow myelopoiesis in a dose-dependent manner and reduced spleen colony formation to control values. Evaluation of the colonystimulating factors (CSF) showed an increase in the colony-stimulating activity (CSA) in the serum of animals pre-treated with ASE. Interestingly, no effects were observed with the 100 mg/Kg dose, compared with infected non-treated controls, suggesting a stimulation of myelopoiesis and CSA occurred in a dose-dependent manner, with a peak being reached with dose of 50 mg/kg. This dose was used to investigate levels of INF-y and TNF-a. There was an increase in the levels of INF-y and TNF-a in culture of splenic macrophages from animals treated with ASE, and this result points to increased microbicide activity of macrophages. All together, the results suggest that the ASE indirectly modulates the immune activity and probably disengages LM-induced suppression of these responses by inducing a higher reserve of myeloid progenitors in the bone marrow in consequence of biologically active cytokine release (CFS, INF-y and TNF-a). Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Objetivos: Este estudo teve como objetivo avaliar a ingestão de micronutrientes relacionados à hematopoiese e determinar a prevalência de anemia em pacientes do sexo feminino com idade superior a 60 anos residentes na periferia do Distrito Federal. Material e Métodos: Para cada paciente, foi determinada a média da ingestão diária de ferro, vitamina B12 e ácido fólico por meio da análise dietética dos registros alimentares estimados de três dias alternados, seguida pela determinação das dosagens séricas de cobalamina livre e homocisteína. O diagnóstico de anemia foi estabelecido pela dosagem de hemoglobina total. Resultados: Encontrou-se uma prevalência de anemia em 9,8% das idosas estudadas. Não foi observada diferença significativa no consumo de ferro e ácido fólico entre pacientes anêmicas e não-anêmicas. No entanto, o consumo médio de vitamina B12 entre as pacientes não-anêmicas mostrou-se 2,6 vezes superior à ingestão média observada no grupo anêmico (p < 0,05). Dosagens séricas de cobalamina e homocisteína mostraram-se aumentadas entre portadoras de anemia. Conclusões: Nossos dados sugerem que a deficiência na ingestão de vitamina B12 constitui fator predisponente ao desenvolvimento de anemia em pacientes idosos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT Aim: This study aimed to estimate the average intake of hematopoiesis related micro-nutrients and to assess the prevalence of anemia in elder female subjects aged 60 years or older residing in the outskirts of the Brazilian Federal District. Material and Methods: Mean daily consumption of iron, folic acid and vitamin B12 were determined for each patient by means of dietary analysis of food registries, followed by evaluation of free serum cobalamin and homocysteine. Anemia diagnosis was established by quantification of total hemoglobin. Results: Prevalence was found to assault 9.8% of elderly studied. No significant difference has been observed in folic acid and iron intakes between anemic and non-anemic subjects. On the other hand, mean consumption of vitamin B12 was 2.6 times higher among anemic patients (p < 0.05). Accordingly, serum cobalamin and homocysteine dosages have shown marked increase in the anemic group. Conclusions: Our findings suggest that deficiency in vitamin B12 intake constitutes a predisposing factor to the onset of anemia in the elderly.

CONTEXTO E OBJETIVO: A contagem e separação de células-tronco hematopoéticas de diferentes fontes tem importância para ensaios clínicos e pesquisa basica. Nosso objetivo foi caracterizar e quantificar as populacões de células hematopoéticas, bem como avaliar a expressão do antígeno CD34 em populações mais primitivas e correlacioná-las com a enxertia nos doadores de medula óssea para transplante alogênico. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo transversal no qual a diferenciação e a seleção de células-tronco hematopoéticas foram realizadas em amostras de medula óssea de doadores de pacientes submetidos a transplante alogênico nos Hospitais São Paulo e Santa Marcelina, São Paulo, Brasil. MÉTODOS: Imunofenotipagem de células mononucleares de medula óssea foi feita na população de células CD45PerCP+ com os seguintes anticorpos: CD34FITC, CD117PE, CD38PE, CD7FITC, CD33PE, CD10FITC, CD19PE, CD14FITC, CD13PE, CD11cPE, CD15FITC, CD22PE, CD61FITC e CD56PE. Após a definição de regiões de células positivas ao CD34, estas células foram selecionadas e analisadas para a co-expressão do CD38 e CD117. Células mononucleares totais de medula óssea e aquelas obtidas após a seleção foram testadas para a retenção de Rh-123. O teste de Friedman e o coeficiente de Sperman foram utilizados para comparar as expressões e correlacionar a contagem de células CD34+ com a enxertia. RESULTADOS: Na região R1, 0,1% a 2,8% das células foram CD34+/CD45+, porém apenas 1,1% das células foram CD34+/CD45-. As principais co-expressões de células CD45+ foram CD38, CD22, CD19 e CD56 na região R2 e CD33, CD11c, CD14, CD15 e CD61 nas regiões R3 e R4. Após a seleção, a mediana de 2,2x106 células CD34+ foi equivalente a 4,9% do total mediano de células da medula óssea. Co-expressões de células CD34+/CD38+ e CD34+/CD117+ ocorreram em 94,95 e 82%, respectivamente. Houve relação positiva entre o número de células CD34+ infundidas e o dia da enxertia. Observamos que mais de 80% das células mononucleares de medula óssea retêm intensamente a Rh-123. Após a seleção, células localizadas em regiões de maior diferenciação, regiões R3 e R4, acumulam mais fortemente a Rh-123 do que células mais primitivas da região R1. CONCLUSÃO: Postulamos que a célula tronco hematopoética mais primitiva expressa o seguinte fenótipo: CD34+/CD45-/CD38-/Rh-123 de baixa retenção. CONTEXT AND OBJECTIVE: Counting and separating hematopoietic stem cells from different sources has importance for research and clinical assays. Our aims here were to characterize and quantify hematopoietic cell populations in marrow donors and to evaluate CD34 expression and relate this to engraftment. DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study on hematopoietic stem cell assays, using flow cytometry on donor bone marrow samples, for allogenic transplantation patients at two hospitals in São Paulo. METHODS: Immunophenotyping of marrow cells was performed in accordance with positive findings of CD34FITC, CD117PE, CD38PE, CD7FITC, CD33PE, CD10FITC, CD19PE, CD14FITC, CD13PE, CD11cPE, CD15FITIC, CD22PE, CD61FITC and CD56PE monoclonal antibodies in CD45PerCP+ cells, searching for differentiation and maturation regions. CD34+ sorting cells were analyzed for CD38 and CD117. Rh-123 retention was done before and after sorting. Antigen expression and CD34+ cells were correlated with engraftment. RESULTS: In region R1, 0.1% to 2.8% of cells were CD34+/CD45+ and 1.1%, CD34+/CD45-. The main coexpressions of CD45+ cells were CD38, CD22, CD19 and CD56 in R2 and CD33, CD11c, CD14, CD15 and CD61 in R3 and R4. After sorting, 2.2x10(6) CD34+ cells were equivalent to 4.9% of total cells. Coexpression of CD34+/CD38+ and CD34+/CD117+ occurred in 94.9% and 82% of events, respectively. There was a positive relationship between CD34+ cells and engraftment. More than 80% of marrow cells expressed high Rh-123. CD34+ cell sorting showed that cells in regions of more differentiated lineages retained Rh-123 more intensively than in primitive lineage regions. CONCLUSION: We advocate that true stem cells are CD34+/CD45-/CD38-/low-Rh-123 accumulations. Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Hospital São Paulo Universidade de São Paulo Department of Medicine Division of Hematology Fundação Maria Cecília Couto Vidigal Head of Laboratory of Cell Biology Fundação Maria Cecília Couto Vidigal Biochemistry researcher in the Cell Biology Laboratory Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Department of Medicine UNIFESP, EPM, Hospital São Paulo UNIFESP, EPM, Department of Medicine SciELO

A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa composta por quatro grandes classes de macromoléculas: colágenos, proteoglicanos (PGs), glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas adesivas. As interações entre as células e a MEC são cruciais para determinar os padrões de comportamento celular, tais como crescimento, morte, diferenciação e motilidade. A hematopoese é o sistema responsável pela produção das células sangüíneas. O controle da proliferação e diferenciação destas células é feito através da interação das células com o microambiente da medula óssea (matriz extracelular). A adesão de progenitores hematopoéticos a moléculas da MEC e a ativação das integrinas são modulados por uma variedade de citocinas e fatores de crescimento, e esta modulação parece ser o mecanismo de regulação que influencia a proliferação de células-tronco e progenitores hematopoéticos, migração transendotelial ou transestromal e homing. Tanto no processo de migração, homing e invasão tumoral, as células seguem os seguintes passos: 1 - Degradação da MEC por enzimas secretadas pelas células: metaloproteinases, colagenases, plasmina, catepsinas, glicosidases e heparanases; 2 - Locomoção das células na região da MEC previamente degradada pelas enzimas; 3 - Adesão das células via receptores específicos da superfície celular, que geralmente interagem com componentes da MEC. Nas doenças onco-hematológicas, a interação das células neoplásicas com a matriz extracelular também influencia na agressividade e prognóstico da doença. The extracellular matrix (ECM) is a complex structure composed of collagens, proteoglycans, glycosaminoglycans and adhesive glycoproteins. Interactions between the cells and the ECM are crucial to determine cell behavior, such as growth, death, differentiation and motility. Hematopoiesis is the system responsible for the production of blood cells. The control of proliferation and differentiation of these cells is attained through the interaction of the cells with the bone marrow microenvironment. The adhesion of hematopoietic progenitors to ECM molecules and the integrin activation are modulated by a variety of cytokines and growth factors, and this modulation seems to be the mechanism of regulation that influences proliferation of hematopoietic cells, transendothelial/transstromal migration and homing. Both in the migration and homing process, and in tumoral invasion the cells undergo the following steps: 1 - Degradation of the ECM by enzymes, including metalloproteinase, collagenase, plasmin, cathepsin, glycosidase and heparanase, secreted by the cells; 2 - Cell migration through the region previously degraded by enzymes; and 3 - Cell adhesion to specific receptors located on the cellular surface, that generally interact with ECM components. In onco-hematologic diseases, the interaction of neoplastic cells with the extracellular matrix also influences aggressiveness and prognosis of the disease.

Receptors belonging to the HER (ErbB) family are essential to the development of organs and systems in general. Although their presence is ubiquitous in adult tissues, their over-expression or dysregulation is associated with poor prognosis in many types of tumors. Curiously, the absence of HER and their ligands in mature blood cells has been reported, suggesting a necessary down-regulation during hematopoieis. However, many reports point to their presence in hematological malignancies, suggesting that in the latter, the new drugs currently being developed for other types of cancer will also putatively contribute to the control of cell growth. Formerly known only as transmembrane signal transducers, HER receptors have recently been found in cell nuclei, indicating new signaling routes. Nuclear localization has been described as a prognostic factor in breast cancer, while the extension of this observation to hematological malignancies remains to be investigated. Os receptores da família HER (ErbB) são fundamentais para o desenvolvimento de diversos órgãos e sistemas. Embora sua presença em tecidos adultos seja ubíqua, sua superativação ou desregulação está relacionada a um mau prognóstico para diversos tipos de tumores. Curiosamente, HER e seus ligantes são ausentes nas células maduras do sangue, o que sugere que sua expressão deva ser "desligada" em algum momento do desenvolvimento hematopoético normal. Diversos relatos, no entanto, têm evidenciado a presença de transcritos e/ou proteínas para esses receptores e seus ligantes em leucemias e linfomas, sugerindo que, também nestas patologias, as novas drogas que vêm sendo desenvolvidas para inibir HER em outros tipos de câncer possam contribuir para o controle do crescimento celular. Largamente conhecidos por suas funções sinalizadoras transmembranosas, os receptores HER foram recentemente observados em núcleos celulares, sugerindo possibilidades adicionais de compreensão e controle da sinalização por esses receptores. Essa presença foi proposta como fator prognóstico para câncer de mama, o que poderá vir a se estender também a malignidades hematológicas.

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Policitemia vera (PV) é uma síndrome mieloproliferativa (SMP) crônica que ocorre por proliferação clonal de progenitores hematopoéticos multipotenciais. Pacientes com PV apresentam expansão das três principais linhagens mielóides na medula óssea, levando à produção aumentada de hemácias, granulócitos e plaquetas. Características importantes de PV incluem elevação de hematócrito em presença de níveis normais ou diminuídos de eritropoetina (EPO) e a formação de colônias eritróides endógenas (CEE). A mutação JAK2 V617F, presente na maioria dos pacientes com PV, causa ativação constitutiva de JAK2 e parece ser responsável pelo fenótipo observado. Apesar disso, as mudanças transcricionais desencadeadas pela mutação ainda não foram completamente caracterizadas. Neste trabalho, utilizou-se Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) para realizar um estudo de expressão gênica global em células da medula óssea de um paciente com PV portador da mutação, ao diagnóstico e em células normais de doadores saudáveis. Genes com expressão aumentada em PV estão envolvidos em processos biológicos importantes, como transdução de sinal, diferenciação e proliferação celular, ciclo celular, apoptose, resposta imune e regulação da transcrição. JUNB foi um dos genes identificados e, usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), detectou-se expressão aumentada de JUNB em dois outros pacientes com PV JAK2 V617F-positivos. Por meio de linhagens murinas Ba/F3-REPO e culturas primárias de eritroblastos humanos, observou-se que JUNB é expresso após adição de EPO e que a proteína JunB é constitutivamente induzida por JAK2 V617F. Além disso, interferência na expressão de JUNB diminuiu o potencial clonogênico e proliferativo de progenitores eritróides humanos Ainda, em PV, a eritropoese causada por JAK2 V617F mostrou-se mais sensível à diminuição de expressão de JunB do que a eritropoese normal. Assim, esses resultados sugerem que JunB tenha um papel fundamental no desenvolvimento de SMPs causadas por JAK2 V617F Abstract: Polycythemia vera (PV) is a chronic myeloproliferative disorder that arises through clonal proliferation of multipotent hematopoietic progenitors. PV patients present bone marrow trilineage expansion, leading to increased production of mature red cells, granulocytes and platelets. Important PV features are elevated red cell mass, despite normal or subnormal erythropoietin (EPO) levels, and endogenous erythroid colony (EEC) formation. The JAK2 V617F mutation, present in the majority of polycythemia vera (PV) patients, causes a JAK2 constitutive activation and seems to be responsible for the PV phenotype. However, the transcriptional changes triggered by the mutation have not yet been totally characterized. Serial analysis of gene expression (SAGE) was used to perform a large scale gene expression study in bone marrow cells of a newly-diagnosed PV patient harboring the JAK2 V617F mutation and in normal bone marrow cells from healthy donors. Genes overexpressed in PV are involved in important biological processes, such as signal transduction, cellular differentiation, cellular proliferation, cell cycle, apoptosis, immune response and transcriptional regulation. JUNB was one of the genes up-regulated in PV and overexpression of JUNB was also detected by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in hematopoietic cells of another two JAK2 V617F PV patients. Using Ba/F3-EPOR cell lines and primary human erythroblast cultures, JUNB was found to be expressed after Epo addition and JunB protein was shown to be constitutively induced by JAK2 V617F. In addition, JUNB knock down reduced the clonogenic and proliferative potential of human erythroid progenitors. Furthermore, in PV, the JAK2 V617F driven erythropoisis was more sensitive to JunB downregulation than normal erythropoiesis. Hence, these results demonstrate that JunB may play a major role in the development of JAK2 V617F myeloproliferative disorders Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Com os recentes progressos na compreensão dos complexos mecanismos moleculares relacionados a diferentes aspectos da modulação imunológica, cada vez mais vem se tornando possível ampliar os conhecimentos acerca das potenciais interferências do ponto de vista imunopatogênico induzidas pela presença e evolução tanto de processos infecciosos quanto tumorais. Modelos experimentais vêm sendo desenvolvidos e aprimorados com a finalidade de criar condições controladas para avaliações de diferentes aspectos relativos a potenciais modificações no comportamento imunológico de linhagens celulares frente à ação de novos agentes. O modelo do Tumor Ascítico de Erlich apresentou-se como uma opção de interesse, uma vez que os conhecimentos experimentais sobre diferentes aspectos relativos a sua manipulação já fazem parte de consagrada linha de pesquisa nacional. Um dos comportamentos mais recentemente estudados a seu respeito se refere a condições onde ocorre a migração do fenótipo Th1 para Th2, relacionadas ao agravamento da doença. A busca de fontes naturais para conhecimento e aplicação de novos princípios ativos vem se caracterizando como uma das mais promissoras soluções do ponto de vista farmacêutico, e pode corresponder a uma importante área de exploração da biodiversidade nacional. Dessa forma, a proposta do presente estudo foi, unindo linhas de pesquisa bastante consolidadas e conhecimentos relativos à nossa biodiversidade, avaliar o potencial terapêutico, com foco em abordagens imunopatológicas, do extrato da planta Tabebuia avellanedae (ETA) através do modelo experimental Tumor ascítico de Ehrlich. Neste trabalho investigamos os efeitos do ETA e seu constituinte isolado, a ß-lapachona (ß-lap), sobre o crescimento e diferenciação de progenitores hematopoéticos [células formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos (CFU-GM)], a capacidade funcional das células ¿Natural Killer¿(NK) e a produção das citocinas do perfil Th1 [fator de necrose tumoral- a (TNF-a ) e interferon- ? (IFN-?)] e do perfil Th2 [interleucina (IL)-10] de animais normais e portadores do TAE. Como esperado, o TAE produziu, concomitante à mielosupressão, um aumento no número de CFU-GM esplênico. O tratamento destes animais com a dose de 120mg/kg de ETA, administrado por 7 dias após a inoculação do tumor, demonstrou uma maior eficácia, produzindo aumento na mielopoiese, redução no numero de colônias esplênicas e reversão dos fatores estimuladores de colônias (CSF) induzidos pelo TAE. Além disso, esta dose de ETA produziu a melhor eficácia na sobrevida de animais portadores do TAE, aumentando em 42% a duração da sobrevida. No entanto, doses de 30 e 500mg/kg não afetaram a mielosupressão e a hematopoese extramedular induzidas pelo tumor. O tratamento dos animais portadores do TAE com 1, 2 ou 5mg/kg de ß-lap por 3 dias após a inoculação do tumor resultou em um padrão semelhante de dose resposta, sendo a mielosupressão prevenida apenas com a dose de 1mg/kg. Interessante observar que esta dose prolongou a duração na sobrevida de animais portadores do TAE de maneira similar à dose mais eficaz do ETA, ambos em 42%. Nosso estudo também demonstrou importantes diferenças entre os tratamentos com ETA e ß-lap. Neste sentido, animais normais tratados com 2 e 5mg/kg de ß-lap apresentaram hematopoese extramedular, respectivamente 2 e 3 vezes maior que o CFU-GM de animais normais. Além disso, uma drástica mielosupressão foi observada após tratamento com ß-lap 5mg/kg, atingindo valores similares aos observados nos animais portadores do TAE e não tratados. Quanto à produção de citocinas, o tratamento com 120mg/kg de ETA impediu a polarização Th1-Th2 encontrada nos animais portadores do TAE. Neste sentido, o tratamento destes animais aumentou os níveis de secreção de TNF-a e IFN-? e reduziu os níveis de IL-10, aumentados durante a evolução temporal do TAE. O estudo da atividade funcional das células NK em animais portadores do tumor e tratados com EAT demonstrou um aumento na capacidade citotóxica das células NK, a qual se encontrava reduzida. O tratamento destes animais com ß-lap 1mg/kg impediu parcialmente a polarização Th1-Th2 em animais portadores, assim como demonstrou aumento parcial na capacidade citotóxica das células NK. Estes resultados sugerem que a eficácia antitumoral demonstrada pelo ETA pode estar relacionada com seu constituinte, a ß-lap. Por outro lado, a ausência de constituintes associados presentes no extrato bruto pode ser responsável pelos efeitos inibitórios dose-dependentes deste composto na hematopoese de animais normais. A comparação entre efeitos de um extrato vegetal e um de seus constituintes ativos isolado é outro aspecto a ser considerado, sendo importante etapa no desenvolvimento de novos fármacos de origem vegetal Abstract: In accordance with the recent progress in the understanding of immunological and molecular mechanisms related to the different aspects of immunological modulation, the improvement of knowledge about the potential interferences, at the immunopathogenic point of view, induced by the presence and evolution of infectious diseases or neoplastic process has increased. Experimental models have been developed and refined in order to create appropriate conditions to evaluate different aspects related to potential changes in the immunological behaviors of determinate cell lines with the presence of new pharmacological agents. The Ehrlich ascites tumor (EAT) model is an option of interest, since the accumulated experimental knowledge about its manipulation is part of a consolidated research line. One of its more recently studied behaviors is concerned with situations where the migration from Th1 to Th2 phenotype occurs, at the same time with the disease impairment. The search for new natural sources of pharmaceutical active principles and the careful and detailed studies about them, has been characterized as one of most promising therapeutic solutions at the moment, and would be seen as a strategic way to explore the national biodiversity. Therefore, the aim of the present study was to combine the well known techniques related to the Ehrlich ascites tumor changing behavior with a potential active principle from our botanical biodiversity, the Tabebuia avellanedae extract (TACE), in order to evaluate its immunological therapeutic potential. The effects of TACE and its isolated naphtoquinone, ß-lapachone (ß-lap), on the growth and differentiation of granulocyte-macrophage progenitor cells in normal and EAT-bearing mice were studied. Myelosupression concomitant with an increased number of spleen CFU-GM was observed in tumour-bearing mice. Treatment of these animals with the dose of 120mg/Kg TACE given for seven days after tumour inoculation elicited optimal modulatory effects on bone marrow formation and also produced a favourable response for the reduction of splenic haematopoiesis. Increased serum colony-stimulating activity induced by the tumour was also reversed with this dose-regimen. In addition, this dose-schedule showed the better efficacy in prolonging life span of EAT-bearing mice, with an extension of 42% in the duration of survival. Conversely, the doses of 30 and 500mg/kg hardly affected the myelosuppression and extramedular hematopoiesis induced by the tumor. Treatment of tumour-bearing mice with 1, 2 and 5mg/kg ß-lap given for 3 days after tumour inoculation resulted in a similar pattern of dose response, with tumour-induced myelosupression being prevented only with the 1mg/kg dose. Surprisingly, this dose-schedule prolonged the duration of survival by the same rate of 42% observed with the optimal dose of TACE. However, an important divergent response of ß-lap was its stimulating effect on the extramedular hematopoiesis of normal mice treated with the doses of 2 and 5mg/kg, which produced, respectively, 2 and 3-fold increases of CFU-GM in the spleen. In addition, in the group of normal mice exposed to the dose of 5mg/kg, a drastic reduction in the number of bone marrow CFU-GM was observed, reaching levels as low as those found in non-treated tumour bearers. We also investigated the effects of TACE and ß-lap on the natural killer cell activity (NK) and on Th1 [tumor necrosis factor- a (TNF-a ) and interferon- ? (IFN-?)] and Th2 [interleukin (IL)-10] responses in normal and EAT-bearing mice. Regarding the production of cytokines, the treatment with TACE blocked the Th1-Th2 polarization found during the EAT progression. In this respect, the treatment of these animals with TACE 120mg/kg increased the TNF-a and IFN-? levels and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. In relation to the functional activity of NK cells, the treatment with this same dose of TACE enhanced the NK cell function, reduced during the EAT growth. The treatment of these animals with ß-lap 1mg/kg produced a significant, but partial response on NK cell activity on EAT-bearing mice. In this respect, this compound only partially increased the TNF-a and IFN-? levels and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. These findings suggest that the antitumoral efficacy demonstrated by the crude extract of T. avellanedae might be related to its constituent, the ß-lapachone. On the other hand, the absence of the associated constituents present in the crude extract might be responsible for the dose-dependent inhibitory effect of this biosynthetic compound on normal murine hematopoiesis. The comparison between a total vegetal extract and some of its isolated compounds remain another significant aspect in phytochemical research, specially focused in new medicines discovery Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

We studied hemopoietic cells in five young and healthy Brazilian cayman (Caiman crocodilus yacare). Peripheral blood samples (in EDTA) were collected by cervical venous sinuses puncture and bone marrow samples were obtained by femural bone needle aspiration. The bone marrow histological study was performed on femoral bone samples, with staining for HE, Giemsa and by Gomori technique for reticulin. Peripheral blood and marrow films were stained by Leishman or Rosenfeld technique. Active hemopoietic tissues were found by transversal section of the femur. Immature erythrocytic cells were found inside of sinusoid capilar vessels. The more immature erythrocytic cells were observed adhered to the vessel walls and the more mature ones were distributed through the central area. On marrow films, the erythrocytic immature cells showed a round shape with a fine nuclear chromatin pattern, while the mature cells were smaller, with an eliptic shape and a dense chromatin pattern. Com o objetivo de estudar o sistema hematopoético do réptil Caiman crocodilus yacare, foram utilizados cinco exemplares hígidos e jovens (aproximadamente um ano de idade), provenientes de São Paulo e de Mato Grosso do Sul. Amostras de sangue periférico foram colhidas em EDTA, através da punção do seio venoso cervical, e da medula óssea por punção aspirativa do osso femural. Estudo histológico da medula óssea femural foi realizado através da coloração por HE, Giemsa e técnica de Gomori para fibras reticulínicas. Os esfregaços de sangue e de medula foram processados para coloração panótica (Leishman ou Rosenfeld). A presença de sítios hematopoéticos ativos foi demonstrada histologicamente nos cortes transversais do fêmur, principalmente no terço distal. As células da linhagem eritrocítica foram encontradas dentro dos vasos capilares sinusóides medulares, na região central do osso. As células precursoras desta linhagem estavam aderidas à parede do vaso, e suas sucessoras distribuídas em direção ao centro do sinusóide à medida que amadureciam. Nos esfregaços de medula, as células imaturas da linhagem eritrocítica mostraram-se arredondadas e com núcleo predominantemente frouxo, em contraposição às células maduras, de núcleo condensado e forma em geral elíptica. Foram vistos pró-eritroblastos, eritroblastos basofílicos, policromáticos e ortocromáticos, e finalmente eritrócitos.

Orientador: Irene Lorand-Metze Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) são desordens clonais da célula precursora hematopoética pluripotencial caracterizadas por alterações na proliferação e maturação celulares e presença de apoptose medular excessiva. Alterações cariotípicas na mielodisplasia são comuns. Apesar dos critérios de diagnóstico estarem bem estabelecidos, o uso da citometia de fluxo (CF) no estudo desta doença tem sido muito explorado, pois desordens não-clonais (DNCs), que também apresentam citopenias periféricas, podem dificultar o diagnóstico. Populações eritroblástica, granulocítica, monocítica, linfóide e blástica em medula óssea (MO) de pacientes com SMD foram estudadas e comparadas à MO normal (doadores para transplante de MO) e às DNCs. Foram incluídos no estudo 32 casos de SMD (20 AR, 05 ARSA, 07 AREB), 11 controles normais e 10 pacientes com DNCs confirmadas. Selecionamos as populações celulares pelo dot plot CD45/side scatter (SSC). A análise quantitativa dos marcadores eritroblásticos CD71 e Glicoforina A (GlyA); granulocíticos e monocíticos CDllb, CD13, CDI6, CDI0 e CD64; linfóide CDI9, CD3, CD4, CD8 e CDI6; além do precursor CD34 e o pan leucocitário CD45, foi obtida através da intensidade média de fluorescência (IMF). A granularidade citoplasmática das células granulocíticas foi observada pela baixa IMF do SSC. Mielopoiese, presença de aberrações fenotípicas e o padrão maturacional também foram avaliados nestas células. Todos os pacientes com SMD tiveram algum tipo de alteração nas populações avaliadas pela CF. Os eritroblastos apresentaram perfil maturacional alterado em 20 casos (64,4%) e os monócitos em 22 (68,7%). Os granulócitos em 7 casos tiveram 1 anormalidade imunofenotípica, em 9 pacientes houve 2, em 9 casos 3 e em 2 pacientes 4 expressões anormais foram encontradas. O SSC esteve alterado em 7 casos (23%), os perfis do CDI6/CDl1b e CDI6/CD13 em 18 (56,2%) e 20 casos (66%), respectivamente, , o CD13 em 22 (73%), o CDllb em 17 (56%), , o CD16 em 11 (36%), o CD45 em 17 (56%), e por fim a deficiência do CDlO encontrada em 3 casos (10,3%). Assincronismo maturacional na população granulocítica foi encontrado enquanto nasDNCs a maturação granulocítica foi mantida. Os monócitos tiveram número aumentado tanto nos pacientes com SMD quanto nos com DNCs. A expressão do SSC, CD13 e CDl1b foram similares nos 3 grupos. CD64 esteve aumentado nos 2 grupos de pacientes enquanto o CD16 apenas na SMD. O CD45 esteve diminuído somente no grupo das DNCs. Os linfócitos B nos pacientes AREB tiveram uma diminuição intensa em relação aos outros subtipos FAR A maturação B está comprometida na SMD tanto numericamente quanto na expressão antigênica dos grupos de baixo e alto risco. Uma aberração fenotípica CD19+/cCD79a-foi encontrada nas células B na SMD mas não nos controles. As células T não tiveram alterações consideráveis. Os mieloblastos foram analisados nos dot plots CD16/CD11b e CD16/CD13 e CD34. Houve uma correlação entre a porcentagem de blastos visualizados pela morfologia (mielograma) com os do dot plot CD16/CD13 e número de células CD34 positivas, mas não com aqueles quantificados pelo dot plot CD16/CDllb. A técnica da CF pôde demonstrar presença de assincronismo maturacional, aberrações fenotípicas, granulopoiese alterada e utilidade na detecção de anormalidades imunofenotípicas na SMD. Além disso, possibilita monitorar a evolução da doença, observada pelo aumento de blastos na MO, e é capaz de diferenciar a SMD das citopenias periféricas não-clonais Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDSs) are characterized by abnormalities in proliferation, apoptosis and maturation of the hemopoietic cell lines. MDS is known by bone marrow (BM) celIs abnormalities identified by morphology. Although MDS diagnostic criteria are well established, flow cytometry (FCM) technique has been explored. Even so, non-clonal disorders that present periphera1 cytopenias such as MDS can difficult the diagnostic, mainly in MDS cases with normal karyotype. lnitially, we analyzed the erythroid, granulocytic and monocytic lineages maturation patterns, and the blastic population in BM from patients with MDS and compared them with normal BM (BM transplantation donors) and patients with pancytopenia due to non-clonal diseases (NCD). MDS are considered as hematopoietic myeloid stem celIs clonal disorders. However, accumulating evidence support that more immature stem celI, which has ability to differentiate into both myeloid and lymphoid celIs, could origin the disease. BM cell populations were separated in CD45/side scatter (SSC) plot. Staining intensity quantitative pattems assessment for CD45, CDI6, CD13, CDllb, CDIO, CD34 and CD64 were performed in 32 MDS BM cases and compared with 10 non-clonal diseases and 11 contrals. Granulocytic and monocyticabnormalities were identified per case and with 2 or more detected alterations. Antigenic expression pattems were determined during maturation. CDI6/CDI3, CD16/CDllb and CDIO/CD64plots were used for monitoring of granulocyte maturation and monocytic celIs, CD711GlyA for erythroblastic population and CD34+/SSC for blasts cells. Mostly MDS patients presented some kind of expression abnonnalities: 7 (23%) low SSC, 18 (56.2%) CD16/CDllb and 20 (66%) CDI6/CD13 abnonnal pattems, 1I (36%) CD16, 22 (73%) CD13, 17 (56%) CDllb, 17 (56%) CD45, 3 (10.3%) CDIO deficiency. Monocytes were increased in both MDS and NCD, but increase in expression of CDI6 occurred exclusively in MDS. The monocytes had similar expression in SSC, CD13 and CDllb among 3 groups. CD64 had increased in both patients groups but the CD45 was decreased more pronounciated in NCD. Asynchronous maturation was found in MDS patients, but was maintained in .NCD. Several abnormalities in CD71/Gly A expression were found in erythroblasts in MDS, but they were normal in NCD. Neither GlyA nor CD71 deficiency were observed in NCD. Myeloblastic celIs were analyzed in the CD16/CDllb and CDI6/CDI3 dot plots and CD34 expression. There was positive correlation between blasts percentage with CDI6/CD13 dot plot and absolut number of CD34 positive celIs, but not with those quantified by CDI6/CDllb dot plot. Ongoing the study, specific enumeration and characterization of CD34+/CDI9+ and CD34-/CDI9+ B-cell precursors and mature B-Iymphocytes was performed in all MDS cases by multiparameter FCM. Both quantitative and qualitative immunophenotypic abnormalities involving BM B-cells were shown in B population. CDI9+/cCD79a- phenotype asynchronous antigen expression was detected on CD34+ B-cell precursors but only when detectable levels of those precursos were shown in the MDS BM. There were not any considerable abnormalities for T lymphocytes. Abnormal B-cell maturation in MDS patients were shown by imunophenotypic evidences, and further investigations shall be used to undertand its nature. Concluding, FCM is an useful toei for differential diagnosis between donal and non-clonal disorders Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O modelo experimental de infecção por Listeria monocytogenes tem provado ser útil na investigação dos efeitos de novos compostos na resposta imunológica primária contra bactérias intracelulares. Em particular, o número de células hematopoéticas na medula óssea e baço é de fundamental importância na resistência a esta infecção. Neste trabalho, investigamos o efeito do extrato de Uncaria tomentosa (EUT) sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea e do baço e a atividade estimuladora de colônias (CSA) do soro de animais normais e infectados com Listeria monocytogenes. A eficácia de EUT frente a uma dose letal da bactéria também foi avaliada. Demonstramos que o EUT protegeu os animais contra uma dose letal de L. monocytogenes, quando administrado profilaticamente nas doses de 50 e 100 mg/kg durante 7 dias, com taxas de sobrevida de 15 e 35%, respectivamente. Este tratamento também preveniu a mielossupressão e hematopoese extramedular causadas por uma dose sub-letal de L. monocytogenes, devido a um aumento no número de CFU-GM na medula óssea. Além disso, observamos uma resposta dose-dependente na estimulação da mielopoese. Animais somente tratados (não infectados) com uma a dose de 100mg/Kg também apresentaram números elevados de CFU-GM na medula óssea em relação ao grupo controle. Adicionalmente, a investigação da produção de fatores estimuladores de colônias no soro dos animais revelou um aumento da CSA nos grupos normais e infectados quando estes foram pré-tratados com EUT, sugerindo que a estimulação da mielopoese pelo extrato seja mediada pela produção de fatores de crescimento. Estes resultados favorecem a nossa hipótese de que a habilidade da Uncaria tomentosa em induzir uma alta reserva de progenitores na medula óssea seja o maior determinante da resistência à infecção Abstract: Infection with Listeria monocytogenes has proven to be a useful model to investigate early effects of new compounds on the immune response to intracellular bacteria. In particular, the number of hematopoietic cells in the bone marrow and spleen is critically important to resistance to this infection. In this study, we demonstrated that Uncaria tomentosa extract (UTE) protects mice from a lethal dose of Listeria monocytogenes when administered prophylacticly at 50 and 100 mg/kg for 7 days, with survival rates of 15 and 35%, respectively. These doses also prevented the myelosuppression and the splenomegaly due to increased numbers of granulocyte-macrophage progenitors (CFU-GM) caused by a sublethal infection with L. monocytogenes. Moreover, stimulation of myelopoiesis ocurred in a dose-dependent manner. Non-infected mice treated with 100 mg/kg UTE also presented higher numbers of CFU-GM in the bone marrow than the controls. Furthermore, investigation of the production of colony-stimulating factors revealed increased colony-stimulating activity in the serum of normal and infected mice pre-treated with UTE, suggesting that stimulation of myelopoiesis by UTE is mediated by its effects on the production of growth factors.These results favour our hypothesis that the ability of Uncaria tomentosa to induce a higher reserve of myeloid progenitors is of major significance in determining early resistance to infection Mestrado Medicina Experimental Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Withania somnifera (WS) é uma planta popularmente conhecida na medicina hindu pela sua potente capacidade de reforçar a saúde e prevenir doenças. Diversas investigações científicas têm atribuído essa qualidade ao potencial adaptógeno das suas raízes, que provaram estimular a celularidade da medula óssea e a atividade de linfócitos e macrófagos peritoneais em camundongos normais e imunocomprometidos, além de elevar os níveis de citocinas e anticorpos circulantes. Estes achados têm qualificado a WS como droga imunopotencializadora e mieloprotetora, e abrem discussão para o seu uso como agente adjuvante em terapias imunossupressoras, tais como a quimioterapia e radioterapia do câncer e a antibioticoterapia em infecções severas. O nosso trabalho consistiu em avaliar os efeitos imunomoduladores da WS em um modelo experimental de infecção, uma vez que a maioria dos estudos in vivo envolvendo a planta foram realizados em animais induzidos artificialmente ao estresse ou ao câncer. No nosso estudo, os camundongos inoculados peritonealmente com uma dose subletal de uma bactéria intracitoplasmática (Listeria monocytogenes) apresentaram uma queda na atividade hematopoética (CFU-GM) da medula óssea e na produção de células linfocitárias do baço que, por sua vez, foram aumentadas nos camundongos profilaticamente tratados com a WS...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Withania somnifera (WS) is a popular plant in the hindu medicine known for its strong capacity to reinforce health and prevent diseases. Many investigations have related this quality to the roots' adaptogenic potential, which proved to stimulate marrow cellularity and to activate lymphocytes and peritoneal macrophages in normal and immunocompromised mice, as well as to elevate cytokine and circulating antibody levels. These fmdings regard WS as an immunopotentializing and myeloprotecting drug, and open discussion for its use as an adjuvant agent in immunosuppressing therapies, such as chemotherapy and radiotherapy in câncer and antibiotictherapy in severe infections. Our work consisted of evaluating WS's immunomodulatory effects in an experimental infection model, once most of the studies involving this plant were carried out in animaIs artificially induced to stress or cancer. In our study, the peritoneal injection of a sublethal dose of an intracitoplasmatic bacteria (Listeria monocytogenes) reduced bone marrow hematopoietic activity (CFU-GM) and spleen lymphocyte production in mice, which were increased when the animaIs were prophylaticlly treated with WS. The oral administration ofthe extract to normal mice significant1y stimulated granulocyte, macrophage and lymphocyte production as well when the results were compared to the non-treated animaIs. We could also note that listeriosis promoted phagocytic cellular migration ITom marrow towards spleen, but the pretreatment with WS...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Medicina Experimental Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia