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Cell shape is linked to cell function. The significance of cell morphodynamics, namely the temporal fluctuation of cell shape, is much less understood. Here we study the morphodynamics of MDA-MB-231 cells in type I collagen extracellular matrix (ECM). We systematically vary ECM physical properties by tuning collagen concentrations, alignment, and gelation temperatures. We find that morphodynamics of 3D migrating cells are externally controlled by ECM mechanics and internally modulated by Rho/ROCK-signaling. We employ machine learning to classify cell shape into four different morphological phenotypes, each corresponding to a distinct migration mode. As a result, we map cell morphodynamics at mesoscale into the temporal evolution of morphological phenotypes. We characterize the mesoscale dynamics including occurrence probability, dwell time and transition matrix at varying ECM conditions, which demonstrate the complex phenotype landscape and optimal pathways for phenotype transitions. In light of the mesoscale dynamics, we show that 3D cancer cell motility is a hidden Markov process whereby the step size distributions of cell migration are coupled with simultaneous cell morphodynamics. Morphological phenotype transitions also facilitate cancer cells to navigate non-uniform ECM such as traversing the interface between matrices of two distinct microstructures. In conclusion, we demonstrate that 3D migrating cancer cells exhibit rich morphodynamics that is controlled by ECM mechanics, Rho/ROCK-signaling, and regulate cell motility. Our results pave the way to the functional understanding and mechanical programming of cell morphodynamics as a route to predict and control 3D cell motility.

Saliva is widely used for clinical and laboratory analysis. This study proposed to use DNA extracted from saliva for genotyping and pharmacokinetics of piroxicam. A fast and efficient genotyping method was used to determine relevant allelic variants of CYP2C9 (*2 and *3), since genetic factors can influence in non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) metabolization. DNA Extract All Reagents Kit® was used for DNA extraction and genotyping was performed using TaqMan® GTXpress™ Master Mix, SNP genotyping assays and a Viia7 Real-Time PCR system. Volunteers performed sequential collections of saliva samples before and after taking a single dose of piroxicam (0.25 to 72 h) which were used for pharmacokinetics assays. Piroxicam concentrations were analyzed using LC-MS/MS. Sixty-six percent of volunteers were ancestral homozygous (CYP2C9*1/*1), and 34% showed one or both polymorphisms. Of these 34%, 22 individuals showed CYP2C9*2 polymorphism, 8 CYP2C9*3, and 4 CYP2C9*2/*3. Piroxicam pharmacokinetics were performed in 5 subjects. Areas under the curve (AUC0-t(h*ng/mL)) for CYP2C9*1/*1, *1/*2 and *1/*3 were, respectively, 194.33±70.93, 166 and 303. Maximum concentrations (Cmax(ng/mL)) for these genotypes were respectively 6.46±2.56, 4.3 and 10.2. Saliva sampling was a very effective matrix for both pharmacogenetic and pharmacokinetic tests, ensuring the speed of the procedure and the well-being and agreement of the participants. Once having the knowledge about the slow and fast metabolizers, it is possible to make an adequate prescription in order to avoid the adverse effects of the medication and to guarantee greater analgesic comfort to the patients respectively. Resumo Saliva é amplamente utilizada para análises clínicas e laboratoriais. Este estudo propôs o uso de DNA extraído da saliva para genotipagem e farmacocinética do piroxicam. Um método de genotipagem rápido e eficiente foi usado para determinar as variantes alélicas clinicamente relevantes de CYP2C9 (* 2 e * 3), uma vez que fatores genéticos podem influenciar nas respostas metabólicas individuais a medicamentos como anti-inflamatórios não esteroides (AINEs). DNA Extract All Reagents Kit® foi usado para extração de DNA e a genotipagem foi realizada usando TaqMan® GTXpress ™ Master Mix, ensaios de genotipagem SNP e um sistema Viia7 Real-Time PCR. Os voluntários realizaram coletas sequenciais de amostras de saliva antes e após a ingestão de uma única dose de piroxicam (0,25 a 72 h) que foram utilizadas para ensaios farmacocinéticos. As concentrações de piroxicam foram analisadas usando LC - MS / MS. Sessenta e seis por cento dos voluntários eram homozigotos ancestrais (CYP2C9 * 1 / * 1) e 34% apresentaram um ou ambos os polimorfismos. Destes 34%, 22 indivíduos apresentaram polimorfismo CYP2C9 * 2, 8 CYP2C9 * 3 e 4 CYP2C9 * 2 / * 3. A farmacocinética do piroxicam foi realizada em 5 indivíduos. As áreas sob a curva (AUC0-t (h * ng / mL)) para CYP2C9 * 1 / * 1, * 1 / * 2 e * 1 / * 3 foram, respectivamente, 194,33±70,93, 166 e 303. Concentrações máximas (Cmax (ng / mL)) para esses genótipos foram, respectivamente, 6,46±2,56, 4,3 e 10,2. A amostra de saliva foi uma matriz muito eficaz tanto para os testes farmacogenéticos quanto para os farmacocinéticos, garantindo a agilidade do procedimento e o bem-estar e concordância dos participantes. Com o conhecimento dos metabolizadores lentos e rápidos, é possível fazer uma prescrição adequada para evitar os efeitos adversos da medicação e garantir maior conforto analgésico aos pacientes respectivamente.

ResumoObjetivoAvaliar, in vitro, o comportamento biológico de células osteoblásticas na presença de diferentes superfícies implantares.MétodosForam utilizados 6 grupos de implantes. Os 2 primeiros formados por implantes maquinados, o terceiro, quarto e quinto por implantes jateados e submetidos a ataque ácido, segundo diferentes protocolos, e o sexto por implantes revestidos a spray de plasma de titânio. Os implantes foram semeados com células de medula óssea humana e cultivados por um período de 33 dias, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: adesão e padrão de crescimento celular por microscopia eletrónica de varrimento, morfologia celular através de microscopia confocal de varrimento laser, atividade da fosfátase alcalina, expressão génica de marcadores osteoblásticos e consumo de cálcio ionizado do meio de cultura. Os dados foram analisados com o teste estatístico MANOVA (alfa=0,05).ResultadosNão se verificaram diferenças entre os 6 grupos no que se refere à adesão e proliferação celular e à expressão génica de marcadores osteoblásticos. O padrão de crescimento apresentou diferenças com maior grau de complexidade nos implantes dos grupos 3 e 5. A atividade da fosfátase alcalina apresentou, aos 21 dias, diferenças estatisticamente significativas entre os grupos 3, 5 e 6 e o grupo controlo 1. Em relação aos níveis de cálcio ionizado no meio cultura os maiores consumos verificaram‐se nos grupos 3, 5 e 6.ConclusõesA superfície dos implantes parece influenciar o comportamento biológico in vitro para o conjunto dos parâmetros analisados, mesmo quando considerados implantes com a mesma designação de superfície, embora preparada segundo protocolos distintosAbstractObjectivesEvaluate the in vitro biological behavior of odontoblastic cells in the presence of different implant surfaces.Methods264 pure titanium implants were divided into six groups. The two first ones were formed by machined implants, the third, fourth and fifth by blast‐etched implants, according to different protocols, and the sixth one by plasma spraying coated titanium implants. The six group implants were cultured with human bone marrow cells for a 33‐day period to evaluate cell adhesion and proliferation by scanning electron microscopy, cytoskeleton organization by confocal laser scanning microscopy, alkaline phosphatase activity, osteoblast markers gene expression and ionized calcium consumption. Groups of data were evaluated using MANOVA (alfa=0.05).ResultsNo differences were observed in cell adhesion and proliferation and in gene expression of osteoblastic markers. The pattern of growth showed differences with more complexity observed in groups 3 and 5. Alkaline phosphatase activity at 21 days in groups 3, 5 and 6 showed statistically significant differences compared with control group 1. Consumption of ionized calcium from the culture media was higher in groups 3, 5 and 6.ConclusionImplant surface seems to influence in vitro biological behavior of osteoblasts even considering implants designate by the same surface treatment although prepared according to different protocols.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 µm) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 µm) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-14T20:50:43Z No. of bitstreams: 1 Stella Maris Lins Terena.pdf: 2089344 bytes, checksum: 21a72af34c64206cc3ab2d9b66964a22 (MD5) Made available in DSpace on 2018-06-14T20:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stella Maris Lins Terena.pdf: 2089344 bytes, checksum: 21a72af34c64206cc3ab2d9b66964a22 (MD5) Previous issue date: 2016-06-28 Skeletal muscle is a tissue of great adaptive capacity and is able to change its characteristics to meet various functional demands. This adaptation can be caused by mechanical overloading which results in an increase in the size of the area of muscle fiber and increase muscle mass. This process is known as muscle hypertrophy and during numerous modifications hypertrophy occur in both the muscle tissue and tendons. Studies with low-level laser (LLL) in skeletal muscle have demonstrated that its effects are positive with respect to the reduction process of inflammation, myonecrosis and reduced influence on the collagen fibers during the remodeling process.The present study aimed to analyze the effects of LLL (780nm) during the compensatory hypertrophy process on the muscular aspects and tendon of the plantaris muscle of mice (in vivo) and also evaluate its effects on human endothelial cells (HUVECs) in vitro. They were used for the in vivo experiment 22 Wistar rats were divided into control group, non-irradiated group and irradiated group hypertrophy hypertrophy. The parameters used for the irradiation were ?? = 780nm, beam area 0.04 cm2, 40mW output power, energy density of 10 J / cm2. periods of 7 and 14 days were analyzed. To cause hypertrophy model was used for ablation of synergists being taken for this study, the gastrocnemius medial and lateral muscles and the soleus muscle, leaving the plantaris muscle suffered overload. the cross-sectional area were analyzed, collagen area, the number of myonuclei and mature blood vessels in muscle tissue and the organization and arrangement of collagen fibers in the tendon. For the experiment in vitro endothelial cells were used (HUVECs) were divided into control group and the other groups irradiated also with ?? = 780nm, 0.04 cm2 beam area, 40mW output power and energy density of 1 J / cm2, 5J / cm2, 10 J / cm2 to 20J / cm2. The different application time was calculated for all groups received the same dose of energy. They assessed cell viability, total protein and vessel formation in Matrigel. The in vivo results showed that there was increased cross-sectional area of the irradiated group after 14 days (26.3%) when compared to non-irradiated group. There was also increased number of myonuclei in the irradiated group after 14 days. The total area of muscle collagen increased (4.2%) in the irradiated group in 7 days and decreased (6.4%) in the irradiated group after 14 days when compared to non-irradiated group in both periods. Analysis by birefringence in the tendons showed better organization of the fibers 7 and 14 days when compared to non-irradiated group. In vitro results have shown decrease in cell viability in all irradiated all groups compared to the control and counting mature vessels was increased number of vessels in the irradiated group even after 14 days. In conclusion laser irradiation increased muscle mass, the number of myonuclei and the number of mature vessels and decreased collagen total area of muscle tissue after 14 days; improved tendon collagen organization for 7 and 14 days and interfere with the viability and total protein concentration in a dose-dependent endothelial cells HUVECs. O m??sculo esquel??tico ?? um tecido de grande capacidade adaptativa e que ?? capaz de alterar suas caracter??sticas para atender ??s diversas demandas funcionais. Essa adapta????o pode ser causada por uma sobrecarga mec??nica que resulta num aumento do tamanho da ??rea da fibra muscular e aumento de massa muscular. Esse processo ?? conhecido como hipertrofia muscular e durante a hipertrofia in??meras modifica????es ocorrem tanto no tecido muscular quanto nos tend??es. Os trabalhos recentes com laser de baixa pot??ncia (LBP) no m??sculo esquel??tico tem demonstrado que seus efeitos s??o positivos no que diz respeito ao processo de redu????o da inflama????o, redu????o da mionecrose e influ??ncia sobre as fibras de col??geno durante o processo de remodelamento. Nesse contexto o presente estudo teve por objetivo analisar os efeitos do LBP (780nm) durante o processo de hipertrofia compensat??ria sobre os aspectos m??sculares e tend??neos do m??sculo plantar de ratos (in vivo) e tamb??m avaliar seus efeitos em c??lulas endoteliais humanas (Huvecs) in vitro. Foram utilizados para o experimento in vivo 22 ratos Wistar, divididos em 3 grupos: controle, n??o irradiado com hipertrofia e irradiado com hipertrofia. Os par??metros utilizados para a irradia????o foram ??= 780nm, ??rea do feixe 0,04 cm2, pot??ncia de sa??da 40mW, densidade de energia de 10J/cm2. Foram analisados os per??odos de 7 e 14 dias. Para causar a hipertrofia foi utilizado o modelo de abla????o dos sinergistas sendo retirados para este estudo os m??sculos gastrocn??mio lateral e medial e o m??sculo s??leo, restando o m??sculo plantar que sofreu a sobrecarga. Foram analisados a ??rea de sec????o transversa, a ??rea do col??geno, o n??mero de mion??cleos e vasos sangu??neos maduros no tecido muscular e organiza????o e disposi????o das fibras de col??geno no tend??o. Para o experimento in vitro foram utilizadas c??lulas endoteliais (Huvecs) divididas em grupos controle e os demais grupos irradiados tamb??m com ??= 780nm, ??rea do feixe 0,04 cm2, pot??ncia de sa??da 40mW e densidades de energia de 1J/cm2, 5J/cm2, 10J/cm2 e 20J/cm2. O tempo de aplica????o foi diferente, calculado para que todos os grupos recebessem a mesma dose de energia. Foram avaliados a viabilidade celular, prote??na total e a forma????o de vasos em matrigel. Os resultados in vivo obtidos demonstraram que houve aumento da ??rea de sec????o transversa do grupo irradiado ap??s 14 dias (26,3%) quando comparado ao grupo n??o irradiado. Houve tamb??m aumento do n??mero de mion??cleos no grupo irradiado ap??s 14 dias. A ??rea total do col??geno muscular aumentou (4,2%) no grupo irradiado em 7 dias e diminui (6,4%) no grupo irradiado ap??s 14 dias quando comparado ao grupo n??o irradiado nos dois per??odos. A an??lise por birrefring??ncia nos tend??es demonstrou maior organiza????o das fibras em 7 e em 14 dias quando comparadas ao grupo n??o irradiado. Os resultados in vitro demonstraram que as diferentes flu??ncias do laser interferiram de maneira diferente na viabilidade de c??lulas Huvecs em todos os per??odos avaliados. Com rela????o a contagem de vasos maduros houve aumento no grupo irradiado ap??s 14 dias. Em conclus??o a irradia????o laser aumentou a massa muscular, o n??mero de mion??cleos e o n??mero de vasos maduros e diminuiu a ??rea total de col??geno no tecido muscular ap??s 14 dias; melhorou a organiza????o do col??geno tend??neo em 7 e em 14 dias e interferiu na viabilidade e concentra????o de prote??na total de maneira dose dependente das c??lulas endoteliais Huvecs.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2022-04-11T19:18:50Z No. of bitstreams: 1 Tatiana Dias Schalch.pdf: 3125907 bytes, checksum: f11e58fb2df45f72a40538d0a299f3be (MD5) Made available in DSpace on 2022-04-11T19:18:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Dias Schalch.pdf: 3125907 bytes, checksum: f11e58fb2df45f72a40538d0a299f3be (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 Squamous cell carcinoma accounts for 95% of cases oral cancer and treatment normally involves surgery, radiotherapy and/or chemotherapy. Oral mucositis is the most common complication in patients who receive chemotherapy and radiotherapy. Depending on the severity, this condition can compromise the continuity of cancer treatment. Low-level laser therapy (LLLT) has been used for the treatment and prevention of oral mucositis, but divergent findings are reported regarding the effects of this form of treatment on unintentionally irradiated tumor cells that may remain after cancer treatment. The aim of the present study was to analyze the effect of LLLT (with dosimetric parameters recommended for the treatment of oral mucositis) on the viability, invasiveness and osteoclastogenic potential of a line of oral squamous cell carcinoma (SCC9). The cells were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with bovine fetal serum (10%) and hydrocortisone (400ng/mL). The cultures were irradiated with InGaAlP (660nm, 40mW, 4J/cm²) and GaAlAs (780nm, 40 and 70mW, 4J/cm²) lasers. Viability was evaluated after 1 and 3 days using MTT assays, crystal violet, neutral red and caspase 3 activity. Invasiveness was evaluated using the wound assay and osteoclastogenic potential was evaluated after 2 and 9 days based on the expression of IL-11 and PTHrP as well as after 7, 14 and 21 days based on the induction of TRAP activity in monocytes. Non- irradiated cultures served as the control for all evaluations. Statistical analysis involved ANOVA complemented by Tukey’s test. Low-level laser with irradiance at a fluence of 4 J/cm², both wavelengths (660 and 780nm) and both output powers (40 and 70mW) led to a reduction in viability as well as induced apoptosis in SCC9 cells. Cells irradiated with 780 nm at output powers of 40 and 70 mW demonstrated less invasive capacity in comparison to the control group. All dosimetric parameters investigated led to a reduction in the ability of SCC9 cells to induce TRAP activity and express IL-11. The expression of PTHrP was only diminished when cells were irradiated at a wavelength of 780nm and output power of 70mW. The present findings demonstrate that laser irradiation at 780nm, 70 mW and 4J/cm2 reduced the viability, osteoclastogenic potential and invasiveness of SCC9 cells. In contrast, infrared laser (780 nm) at a lower output power (40 mW and 4J/cm2) and red laser (660 nm, 40mW and 4J/cm2) did not demonstrate the same inhibition capacity. The findings underscore the importance of the choice of dosimetric parameters to the efficacy and safety of phototherapy for the treatment of oral mucositis. O carcinoma epidermóide de boca representa 95% dos cânceres da cavidade oral e seu tratamento normalmente envolve cirurgia, radioterapia e/ou quimioterapia. A complicação mais comum em pacientes que recebem quimioterapia e radioterapia é a mucosite oral que dependendo de sua severidade pode comprometer a continuidade do tratamento do tumor. O laser em baixa intensidade (LBI) tem sido usado para tratar e prevenir a mucosite, porém ainda existe controvérsia em relação aos efeitos desta irradiação sobre as células tumorais que possam ter permanecido na área a ser irradiada após o tratamento do câncer. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBI (em parâmetros dosimétricos recomendados para o tratamento da mucosite oral) sobre a viabilidade, proliferação, invasividade e potencial osteoclastogênico de uma linhagem de células de carcinoma epidermóide de boca (SCC9). As células foram cultivadas em meio DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino (10%) e hidrocortisona (400 ng/mL). As culturas foram irradiadas com os lasers de InGaAlP (660nm em 40mW- 4J/cm²) e GaAlAs (780nm em 40 e 70mW- 4J/cm²) e avaliadas quanto a sua viabilidade (após 1 e 3 dias pelos ensaios MTT, Cristal Violeta, Vermelho Neutro e atividade da caspase 3), invasividade (pelo ensaio de ferida) e potencial osteoclastogênico (após 2 e 9 dias pela expressão de IL- 11 e PTHrP e após 7, 14 e 21 dias pela indução da atividade da TRAP em monócitos). Culturas não irradiadas serviram como controle em todas as avaliações. Os dados foram comparados pela análise de variância complementada pelo teste de Tukey. Os resultados demonstraram que a irradiação com LBI na fluência de 4J/cm², em ambos os comprimentos de onda (660 e 780nm) e potências (40 e 70mW) diminuiu a viabilidade e induziu a apoptose das células da linhagem SCC9. As células irradiadas com LBI de 780nm (em 40 e 70mW) demonstraram menor capacidade de invasão que as do grupo controle não irradiado. Todos os parâmetros dosimétricos avaliados diminuíram a capacidade das SCC9 em induzir a atividade da TRAP e em expressar IL-11. Já a expressão de PTHrP foi menor apenas quando as células foram irradiadas com laser de 780nm na potência de 70mW. Este estudo concluiu que a irradiação com laser de 780nm (70mW, 4J/cm2) diminuiu a viabilidade, o potencial osteoclastogênico e a invasividade de células da linhagem SCC9. O laser de infravermelho de 780nm utilizado com menor potência (40mW, 4J/cm2) e o laser vermelho de 660nm (40mW, 4J/cm2) não demonstraram a mesma capacidade de inibição nestas avaliações. Estes resultados corroboram a importância da escolha da dosimetria na determinação da eficácia e da segurança da fototerapia no tratamento da mucosite oral.

Mestrado em Materiais e Dispositivos Biomédicos Zircónia e alumina são biocerâmicos bastante conhecidos, e são usados principalmente em aplicações ortopédicas. Estes materiais têm sido aplicados em implantes de anca e joelho graças à reduzida taxa de desgaste e à excelente biocompatibilidade que apresentam. No entanto, estes cerâmicos apresentam também algumas limitações: a fragilidade da alumina ao impacto e a sensibilidade da zircónia ao envelhecimento. Devido a estas limitações, o objectivo passou por desenvolver implantes mais resistentes e com uma resposta inflamatória menos intensa. Surgiram, então, estudos de compósitos de zircónia e alumina. Neste estudo, foram desenvolvidas três diferentes composições de Alumina reforçada com Zircónia (ZTA) com 80 wt% a 90 wt% de alumina, e três composições de Zircónia reforçada com Alumina (ATZ) com 80 wt% a 90 wt% de zircónia. Foram usados dois tipos diferentes de zircónia estabilizada: zircónia estabilizada com 3 mol% de yttria (3YSZ) que foi usada nos compósitos ATZ, e zircónia estabilizada com 2 mol% de yttria (2YSZ) aplicada nos compósitos ZTA. A composição ATZ com o melhor conjunto de propriedades foi também testada com a zircónia 2YSZ, de forma a produzir um compósito com melhores propriedades mecânicas e uma resistência à degradação semelhante à apresentada pelo compósito ATZ, com a zircónia 3YSZ. Foram seleccionados dois aditivos, óxido de lântanio e pentóxido de tântalo, que foram depois adicionados aos compósitos ATZ e ZTA com o melhor conjunto de propriedades (composição 80:20), com o objectivo de melhorar a resistência ao envelhecimento e as propriedades mecânicas dos materiais produzidos. Após uma etapa de moagem, os pós compósitos foram obtidos por atomização, a partir de suspensões estabilizadas, com uma distribuição de tamanho de partícula nanométrica controlada. Estes pós foram caracterizados através de várias técnicas tais como microscopia electrónica de varrimento, difracção de raios-X, fluorescência de raios-X, densidade real, e área superficial específica. De forma a aumentar a densidade dos corpos em verde, foram efectuadas duas diferentes prensagens, prensagem uniaxial e prensagem isostática a frio (CIP). Foram obtidos cerâmicos com uma elevada densidade (com densidade relativa entre 97% e 99%) a uma baixa temperatura de sinterização (1400ºC). O tamanho de grão das amostras sinterizadas foi observado por SEM e, de forma a verificar as fases cristalográficas presentes, foi realizada difracção de raios-X. Em todos os compósitos foi obtida uma microestrutura dispersa, com um tamanho de grão nanométrico (abaixo dos 500 nm). Este conjunto de etapas de produção aplicado levou à obtenção de compósitos com propriedades mecânicas melhoradas. Foram estudadas a dureza de Vickers, a tenacidade à fratura e resistência à flexão das amostras sinterizadas. Os compósitos ATZ atingiram os melhores valores de tenacidade à fractura e resistência à flexão (acima de 5 MPa.m1/2 e 1394 MPa respetivamente), enquanto os compósitos ZTA apresentaram os melhores valores de dureza (acima de 1846 HV). Como era esperado, o compósito ATZ com zircónia 2YSZ apresentou melhores propriedades mecânicas, tendo sido obtidos 7.94 MPa.m1/2 de tenacidade à fratura e 1498 MPa para a resistência à flexão. A aplicação dos dopantes nos compósitos ZTA e ATZ induziram alterações nas suas propriedades. A adição de Ta2O5 melhorou, com sucesso, as propriedades mecânicas dos dois tipos de compósitos. Foi verificado um aumento dos valores de dureza, tenacidade à fratura e resistência à flexão em relação às amostras sem dopantes. A adição de La2O3 não levou a melhorias nas propriedades mecânicas mas, no entanto, também não teve um efeito prejudicial, o que levou à sua preservação. Foram realizados testes de envelhecimento de acordo com a norma ISO13356 (2008) em todos os compósitos produzidos. A quantidade de zircónia monoclínica, indicador de degradação, foi determinada por difracção de raios-X após 5,12,24,48 e 96 horas de testes de envelhecimento. Foi determinado que os compósitos ZTA não dopados, não apresentaram zircónia monoclínica após 96 horas em ambiente agressivo. Para os compósitos ATZ, apesar de a quantidade de zircónia monoclínica aumentar proporcionalmente ao conteúdo de zircónia presente no compósito, foi verificado que a extensão da degradação foi mínima, e relegada apenas para a superfície do material. Esta evidência permitiu que as propriedades mecânicas se mantivessem durante todo o período dos testes de degradação. Como era esperado, o compósito com a zircónia menos estável, o ATZ com a zircónia 2YSZ, apresentou o conteúdo mais elevado de zircónia monoclínica. No entanto, o facto de as propriedades mecânicas se manterem ao longo dos testes de degradação, confirmou que a degradação, mais uma vez, não se expandiu para o interior do material. A adição dos dois dopantes levou a melhorias na resistência à degradação dos compósitos ATZ, que apresentaram um conteúdo de zircónica monoclínica menor em comparação com as amostras não dopadas, após 96 horas de testes de degradação. No entanto, a adição de Ta2O5 teve um efeito desestabilizador na zircónia 2YSZ presente no compósito ZTA, sendo que foi detectada 10% de zircónia monoclínica após as 96 horas de testes de degradação. De novo, foi confirmado que esta degradação esteve presente apenas à superfície do material, visto que as propriedades mecânicas se mantiveram após estes testes. Foi também testada a biocompatibilidade destes compósitos. Células MG63 foram cultivadas nas amostras sinterizadas e foram realizados ensaios MTT e ensaios de atividade da fosfatase alcalina. Para todos os compósitos produzidos foi verificado que a viabilidade/proliferação celular aumentou significativamente desde o dia 1 para o dia 4. Os compósitos ZTA, que possuíam um maior número de locais de adesão, apresentaram uma maior adesão e proliferação celular, em comparação com os compósitos ATZ. A adição de La2O3 e Ta2O5 não induziu diferenças significativas na viabilidade celular dos compósitos ATZ. No entanto, no compósito ZTA, a adição de Ta2O5 levou a um pior desempenho devido à sua verificada hidrofobicidade. O presente estudo mostra que podem ser obtidas composições óptimas destes compósitos, com excelentes propriedades mecânicas, resistência à degradação e biocompatibilidade satisfatória. Zirconia and alumina are well known bioceramics, used in the field of orthopedics. These materials have been used as hip and knee bearings thanks to their reduced wear rate and excellent biocompatibility. However, these ceramics presented some limitations: the brittleness of alumina and the aging sensitivity of zirconia. The aim became to develop long-lasting hip implants, with less inflammatory response and better designs. Zirconia alumina composites were then studied. In this study, three different grades of alumina toughened zirconia composites (ATZ) from 80 wt% to 90 wt% of zirconia, and three grades of zirconia toughened alumina (ZTA) from 80 wt% to 90 wt% of alumina were developed. Two different types of stabilized zirconia were used: 3 mol% yttria stabilized zirconia (3YSZ) was applied on the ATZ samples, and a 2 mol% yttria stabilized zirconia (2YSZ) on the ZTA samples. The ATZ with the best set of properties (80Z20A) was also tested with the 2YSZ, in order to produce a composite with improved mechanical properties and similar aging resistance to the ATZ with 3YSZ. Two selected additives, lanthanum oxide and tantalum pentoxide were added to the best ATZ and ZTA composite (80:20 composition) with the aim of enhance the aging resistance and mechanical properties of the produced materials. After a wet milling stage, the composite powders were achieved by spray-drying, from stabilized suspensions with a controlled nanometric particle distribution. The obtained composite powders were characterized through several techniques, such as scanning electron microscopy, X-ray diffraction, X-ray fluorescence, true density and specific surface area. Two stages of pressing, uniaxial pressing and cold isostatic pressing, were performed in order to improve the density of the green pieces. High density ceramics (with a relative density between 97% and 99%) were achieved with a low sintering temperature (1400ºC). The grain size of the sintered pieces was determined by SEM, and X-ray diffraction was performed in order to verify the present crystallographic phases. A disperse microstructure was obtained for all composites, with a nanometric grain size (under 500 nm). This set of producing stages, lead to the obtention of composites with enhanced mechanical properties. The Vickers Hardness, fracture toughness and flexural strength of the sintered samples were evaluated. Higher values of fracture toughness and flexural strength were achieved for the ATZ samples (up to 5 MPa.m1/2 and 1394 MPa respectively), while ZTA samples presented higher values of hardness (up to 1846 HV). As expected, the ATZ with 2YSZ presented enhanced mechanical properties, with an outstanding fracture toughness of 7.94 MPa.m1/2, and 1498 MPa of flexural strength. The addition of the two dopants to both ZTA and ATZ composites induced changes in their properties. The addition of Ta2O5 successfully improved the mechanical properties of both composites. In comparison with the undoped ATZ and ZTA composites, improvements of the hardness, fracture toughness and flexural strength were verified. The addition of La2O3 did not lead to an enhancement of the mechanical properties; however, it did not led to a deleterious effect either, and these properties were maintained. Accelerated aging tests were made on all produced composites, accordingly to ISO13356 (2008). The amount of monoclinic zirconia, which is an indicator of degradation on these composites, was quantified by X-ray diffraction analysis for 5,12,24,48 and 96 hours of aging tests. It was determined that, the undoped ZTA samples did not present monoclinic zirconia after 96 hours on an aggressive environment. Regarding the ATZ composites, even though the monoclinic zirconia content increased proportionally to the zirconia content present in the composite, it was found that the extent of degradation was minimal, since it was relegated to the material surface. This fact allowed the maintaining of the mechanical properties of the material throughout all the duration of the aging tests. As expected, the less stable composite, the ATZ with 2YSZ, presented the highest content of monoclinic zirconia. Nonetheless, the mechanical properties tested on the aged composite confirmed that the degradation did not expand to the material bulk. The addition of both dopants, successfully improved the aging resistance of the ATZ composite, presenting a lower amount of monoclinic zirconia after 96 hours of aging tests in comparison with the undoped ones. However, the addition of Ta2O5 destabilized the 2YSZ present on the ZTA composites, and 10% of monoclinic zirconia was detected after 96 hours of aging tests. Still, the mechanical properties were maintained on all the doped composites, which again confirmed the presence of degradation only at the material surface. The biocompatibility of these composites was also tested. MG63 cells were seeded on the sintered samples and MTT and alkaline phosphatase activity (ALP) assays were performed. The cell viability/proliferation increased significantly from day 1 to day 4 for all the produced composites. The ZTA composites, with more anchorage sites, presented higher cell adhesion and proliferation in comparison with the ATZ composites. The addition of La2O3 and Ta2O5 did not induced significant changes on the cell viability of the ATZ composites. However, the addition of Ta2O5 on the ZTA composite led to a poor performance, due to its verified hydrophobicity. The present study shows that optimal compositions of these composites can be achieved, with improved mechanical properties, hydrothermal degradation resistance and satisfactory biocompatibility.

Mestrado em Materiais e Dispositivos Biomédicos Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2018-01-17T10:59:14Z No. of bitstreams: 1 Development of zirconia composites_Sara Sequeira.pdf: 5601828 bytes, checksum: afd79c3d8d5b104d72ca6f2ba7f261f7 (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-17T10:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Development of zirconia composites_Sara Sequeira.pdf: 5601828 bytes, checksum: afd79c3d8d5b104d72ca6f2ba7f261f7 (MD5) Previous issue date: 2015

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 STELLA M GLACI REINKE.pdf: 3927224 bytes, checksum: 373236863b3ac97c702e89a859ee8077 (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Glass ionomer cement (GIC) is a widely used material in dentistry for providing both adhesion to dental tissues and anticariogenic activity. Previous studies have suggested that the incorporation of antimicrobials to GIC allows an increase in the longevity of restorations as well as an antibacterial activity against biofilm deposited on the restorations. In order to have a better incorporation of an antimicrobial to GIC, this study aims at evaluating a GIC containing chlorhexidine digluconate (Clx Dg)-loaded (meth)acrylic microparticles. In brief, it was carried out a laboratory study (1) to formulate and to evaluate Clx Dg-loaded (meth)acrylic microparticles for being added into a commercial GIC and (2) to investigate the cytotoxic and mechanical properties of this novel material. Microparticles were obtained by the non-aqueous emulsion/solvent evaporation method using Eudragit® S100 and RS100 as polymers and Clx Dg at 10 and 25%. The characterization was performed by morphological, thermal and spectroscopic methods and by evaluating the drug content and drug release. The two best formulations of microparticles were incorporated into a commercial GIC and resulted in two new experimental materials. The pure GIC was used as control. The biocompatibility of these materials was investigated using dental pulp cells and human gingival fibroblasts. In addition, the antimicrobial activity and the mechanical properties (resistance to abrasion, compressive strength, diametral tensile strength and flexural strength) were carried out. Clx Dg-loaded (meth)acrylic microparticles were successfully prepared. Micrometer-sized, heat-stable, and amorphous/non-crystalline formulations with high drug-loading efficiencies, effective antimicrobial activity, and a controlled release of the drug were obtained. The incorporation of Clx Dg-loaded (meth)acrylic microparticles into GIC provided antimicrobial properties to this material and did not increase its cytotoxicity. The mechanical properties demonstrated positive and negative changes after the microparticles incorporation. However these changes did not contraindicate the use of this new material. It was concluded that it was possible to obtain a GIC containing innovative Clx Dg-loaded (meth)acrylic microparticles that showed suitable features and performance. This new material has a promising potential for restorative procedures. However, additional clinical studies are required. O cimento de ionômero de vidro (CIV) é um material amplamente utilizado na Odontologia, por apresentar capacidade de adesão aos tecidos dentários e atividade anticariogênica. Estudos anteriores têm sugerido que a incorporação de antimicrobianos ao CIV permite um aumento na longevidade das restaurações, assim como uma ação antibacteriana frente ao biofilme dental depositado sobre as restaurações. Com o intuito de otimizar a incorporação do antimicrobiano ao CIV o presente estudo propõe-se a desenvolver, caracterizar e avaliar um CIV contendo micropartículas (met)acrílicas de digluconato de clorexidina (Clx Dg). Realizou-se um estudo laboratorial para (1) formular e avaliar micropartículas (met)acrílicas de Clx Dg para serem adicionadas em um CIV comercial e (2) investigar as propriedades citotóxicas e mecânicas desse novo material. As micropartículas foram obtidas pelo método de emulsão em meio não aquoso/evaporação do solvente a partir dos polímeros (Eudragit® S100 e RS100) e do Clx Dg a 10 e 25%. A caracterização dos materiais microparticulados foi feita por métodos morfológicos, térmicos e espectroscópicos, avaliação do teor e liberação do fármaco. As duas melhores formulações de micropartículas foram incorporadas em um CIV já comercializado, obtendo-se dois materiais experimentais além do CIV puro, considerado como controle. Estes materiais foram submetidos à análise de biocompatibilidade com células de polpa dental e fibroblastos gengivais humanos, a atividade antimicrobiana e a avaliação de propriedades mecânicas (resistência à abrasão, à compressão, à tração diametral e flexão). As micropartículas (met)acrílicas de Clx Dg foram preparadas com sucesso, apresentando características de: partículas de tamanho micrométrico, termoestáveis, amorfas/não-cristalinas, com alta eficiência de encapsulação do fármaco, atividade antimicrobiana comprovada, liberação lenta e controlada do fármaco. A incorporação das micropartículas (met)acrílicas de Clx Dg ao CIV acrescentou capacidade antimicrobiana ao material e não causou aumento da citotoxicidade do mesmo. As propriedades mecânicas sofreram alterações positivas e negativas após a incorporação das micropartículas, porém sem contraindicar o uso desse novo material. Conclui-se que foi possível desenvolver, caracterizar e avaliar o CIV contendo micropartículas (met)acrílicas inovadoras de Clx Dg, e que o mesmo apresentou características e desempenho satisfatórios. Esse novo material tem potencial promissor para procedimentos restauradores, necessitando a realização de estudos clínicos.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial A nano-hidroxiapatite (nanoHA) tem inúmeras aplicações em estratégias de reparação e regeneração do tecido ósseo. A maioria dos trabalhos publicados, a propósito do perfil biológico da nanoHA, baseia-se em filmes, compósitos, estruturas densas ou porosas, ou cimentos compostos por nanopartículas de HA. No entanto, existe um défice evidente em relação à avaliação biológica de nanopartículas isoladas de HA. Considerando a estreita associação entre os processos de angiogénese e osteogénese nos eventos de formação óssea, este estudo pretende abordar o perfil biológico das nanopartículas de HA em monoculturas e co-culturas de células osteoblásticas e endoteliais. No presente estudo, as nanopartículas de HA, sintetizadas por método hidrotermal, foram caracterizadas por XRD, análise FTIR e TEM. Os estudos biológicos in vitro foram realizados utilizando culturas isoladas e co-culturas de células osteoblásticas humanas MG-63 (103 cell cm-2) e células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMEC, 2x104 cell cm-2), em meio de cultura endotelial. As culturas foram mantidas por 14 dias na ausência (controlo) e na presença de nanopartículas em diferentes concentrações. As nanopartículas de HA (1-100 μg ml-1) foram adicionadas às células em cultura em dois momentos diferentes: ao dia 1 e ao dia 7. Para as partículas adicionadas ao dia 1: as culturas foram caracterizadas nos dias 2, 7 e 14; para as partículas adicionadas ao dia 7: as culturas foram avaliadas aos dias 8(7) e 14(7), para os padrões de viabilidade/proliferação celular (MTT) e de crescimento celular (CLSM), assim como para a internalização das partículas e a sua cinética dentro dos compartimentos celulares (TEM). Os resultados obtidos demonstraram que as monoculturas de células MG-63 e HDMEC, na ausência de nanopartículas, apresentaram alta viabilidade celular e o esperado padrão de crescimento celular. Para além disso, as co-culturas controlo apresentaram alta viabilidade celular e a formação de aglomerados de células osteoblásticas rodeadas por células endoteliais. A presença de nanopartículas de HA promoveu um aumento dose-dependente na viabilidade/proliferação celular dos osteoblastos, no entanto resultados opostos foram encontrados nas culturas de HDMEC. Já nas co-culturas o padrão de viabilidade/proliferação celular apresentou um vi ligeiro aumento. As partículas eram facilmente internalizadas por ambos os tipos celulares, contudo as células endoteliais apresentaram uma maior percentagem de vesículas intracelulares carregadas com nanopartículas. As co-culturas de células osteoblásticas e endoteliais apresentaram menor internalização de partículas, em comparação com as respectivas monoculturas. Os efeitos descritos, causados pela presença de nanopartículas de HA, foram mais significativos quando estas eram adicionadas no início da cultura. Os resultados obtidos sugerem que as nanopartículas de HA têm capacidade de modular o comportamento das células osteoblásticas e endoteliais, afectando também a interacção entre estes dois tipos celulares, apresentando-se como um biomaterial promissor para novas estratégias utilizadas pela engenharia de tecido ósseo. Nano-hydroxyapatite (nanoHA) has a variety of proposed applications in bone repair/regeneration strategies. Most of the published work regarding the biological profile of nanoHA relies on films, composite scaffolds, dense or porous bulks or cements manufactured with HA nanoparticles. A clear deficit exists on studies addressing the biological assessment of individual nanosized HA particles. Considering the close association of angiogenesis and osteogenesis in bone formation events, this study aims to address the biological profile of nanoHA particles on isolated and co-cultured osteoblast and endothelial cells. In the present study, nanoHA particles, sinthesized by a hydrothermal method, were characterized by X-ray diffraction analysis (XRD), Fourier transmission infrared spectroscopy (FTIR) and tansmission eletron microscopy (TEM). In vitro biological studies were performed using MG-63 osteoblast-like cells (103 cell cm-2) and human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC, 2x104 cell cm-2) cultured isolated or co-cultured in endothelium medium. Cultures were maintained for 14 days in the absence (control) and in the presence of different concentrations of nanoparticles. NanoHA particles (1-100 μg ml-1) were added to the seeded cells at two different moments: day 1 and at day 7. Nanoparticles added at day 1: cultures were characterized at days 2, 7 and 14; nanoparticles added at day 7: cultures were evaluated at days 8(7) and 14(7), for cell viability/proliferation (MTT assay), pattern of cell growth (confocal layser scanning microscopy; CLSM), particle internalization and kinetics within cell compartiments (TEM). Results showed that monocultures of MG-63 cells and HDMEC, maintained in the absence of nanoparticles, presented high viability and the expected pattern of cell growth. Also, control co-cultures exhibited high viability and the formation of clusters of osteoblastic cells surrounded by endothelial cells. The presence of nanoHA caused a dose-dependent increase in the viability/proliferation of osteoblast cells, but opposite results were found in HDMEC. Co-cultures showed a slight increase in the cell viability/proliferation. Particles were readily internalized by both MG-63 cells and HDMEC, but endothelial cells presented the higher percentage of intracellular vesicles loaded with nanoparticles. Co-cultured osteoblastic and endothelial cells exhibited less iv internalization of nanoparticles, compared to the respective monocultures. The described effects, caused by the presence of nanoHA particles, were more significant when those were added at the beginning of the culture. Results suggest that nanoHA particles modulate the behaviour of osteoblastic and endothelial cells and also affects the interaction between these two cell types, representing a promissing biomaterial for new strategies in bone tissue engineering.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcio Cristiano de Souza Rastelli.pdf: 5926309 bytes, checksum: 1a36673541f01b28c69af14ba60a3af8 (MD5) Previous issue date: 2012-12-14 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Desensitizing toothpastes that occlude dentinal tubules were shown to be effective in the treatment of dentinal hypersensitivity. The aim of this study was to develop and evaluate a desensitizing toothpaste containing hydroxyapatite nanoparticles. The in vitro study was performed in three steps: synthesis and characterization of hydroxyapatite nanoparticles, formulation and characterization of toothpastes and assessing the potential for occlusion of dentinal tubules. Hydroxyapatite nanoparticles were obtained by wet chemical synthesis at 37 º C, and from that it was developed the WCS nanoparticle hydroxyapatite and hydrothermal synthesis at 180 ° C (HS). The characterization was performed using scanning electron microscopy (SEM), microanalysis by energy dispersive spectroscopy, X-ray diffraction, spectroscopy in the infrared Fourier transform and micro-Raman, thermal analysis, and assessment of cytotoxicity. Four experimental toothpastes were formulated and compared to two commercially available ones. We carried out the characterization and quality control of these toothpastes by evaluating pH, consistency, density, analysis of loss on drying and incineration by SEM and EDS. The evaluation of the potential occlusion of dentinal tubules was performed using samples obtained from bovine teeth that were prepared to present exposure of the root dentin. 84 samples were used and divided according to the type of dentifrice used: Groups with negative control toothpaste without abrasive (DCNS), negative control toothpaste with abrasive (DCNC), experimental WCS (DEW), experimental HS (DEH), commercial toothpaste Colgate Sensitive Pro Relief™ (DCPA) and Sensodyne Fast Relief ™ toothpaste (DSRA). All samples were their own controls since the tests were performed before and after simulated toothbrushing. Tests of surface roughness, dentin permeability, X-ray diffraction, micro-Raman spectroscopy, atomic force microscopy and scanning electron microscopy and microanalysis by energy dispersive spectroscopy were performed. Characterization of hydroxyapatite nanoparticles showed that they were nanosized particles and presented chemical properties consistent with those of hydroxyapatite. These particles were not cytotoxic to human gingival fibroblasts when at low concentrations. The dentifrices showed adequate values of pH, consistency, density and loss on drying. The analysis of the residue showed that the toothpaste had the chemical components used in the formulations. Surface roughness was statistically different between DEW and DSRA group (p < 0.05), but no group showed a high value of surface roughness, which was demonstrated by atomic force microscopy. The dentin permeability was significantly reduced (p ˂ 0.05) for groups DEW, DEH and DSRA. The X-ray diffraction showed peaks for DEH crystallinity of greater intensity corresponding to calcium spectroscopy. The micro-Raman microanalysis and EDS showed that the toothpaste had the chemical components used in its formulation, being found in the same sample surfaces after brushing. The SEM images showed that there were variations on the dentin surface morphology, in which occlusion of dentinal tubules occured, being the DSRA the only group to show total occlusion. The experimental dentifrices showed potential for occlusion of dentinal tubules similar to those of commercially available produc ts. Dentifrícios dessensibilizantes que promovem a oclusão dos túbulos dentinários mostraram-se eficazes no tratamento da hipersensibilidade dentinária. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar dentifrícios dessensibilizantes contendo nanopartículas de hidroxiapatita. O estudo in vitro foi realizado em três etapas: síntese e caracterização das nanopartículas de hidroxiapatita; formulação e caracterização dos dentifrícios e avaliação do potencial da oclusão dos túbulos dentinários. A obtenção das nanopartículas de hidroxiapatita foi feita por meio da síntese química por via úmida a 37º C, com a qual se elaborou a nanopartícula de hidroxiapatita WCS e síntese hidrotérmica a 180º C (HS). A caracterização foi realizada por meio de microscopia eletrônica de varredura, microanálise por espectroscopia por dispersão de energia, difração de raio-X, espectroscopias na região do infravermelho com transformada de Fourier e micro-Raman, análise térmica, avaliação de citotoxicidade. Foram formulados quatro dentifrícios experimentais e comparados com dois comerciais. Realizou-se a caracterização e controle de qualidade destes dentifrícios por meio da avaliação do pH, da consistência, densidade, análise da perda por dessecação e incineração e por MEV e EDS. A avaliação do potencial de oclusão dos túbulos dentinários foi realizada usando-se amostras obtidas de dentes bovinos que foram preparadas para apresentarem exposição da dentina radicular. Foram usadas 84 amostras que foram divididas de acordo com o tipo de dentifrício utilizado: Grupos com dentifrício controle negativo sem abrasivo (DCNS), controle negativo com abrasivo (DCNC), experimental WCS (DEW), experimental HS (DEH), dentifrício comercial Colgate® Sensitive Pró Alívio™ (DCPA) e dentifrício comercial Sensodyne® Rápido Alívio™ (DSRA). Todas as amostras foram seus próprios controles já que foram realizados os testes antes e após escovação simulada. Foram realizados testes de rugosidade superficial, permeabilidade dentinária, difração de raio-X, espectroscopia micro-Raman, microscopia de força atômica e eletrônica de varredura e microanálise espectroscopia por dispersão de energia. A caracterização das nanopartículas de hidroxiapatita mostrou que se tratava de partículas nanométricas e com propriedades químicas compatíveis com hidroxiapatita. Estas partículas não foram citotóxicas a fibroblastos gengivais humanos quando em baixas concentrações. Os dentifrícios apresentaram valores adequados de pH, consistência, densidade e perda por dessecação. A análise dos resíduos demonstrou que os dentifrícios apresentaram os componentes químicos usados nas formulações. A rugosidade superficial foi diferente estatisticamente (p˂0,05) entre o grupo DEW e DSRA, porém nenhum grupo apresentou alto valor de rugosidade superficial, o que se comprovou com a microscopia de força atômica. A permeabilidade dentinária foi reduzida significativamente (p˂0,05) para os grupos DEW, DEH e DSRA. A difração de raio-X apresentou para o DEH os picos de maior intensidade de cristalinidade correspondentes ao cálcio. A espectroscopia micro-Raman e a microanálise por EDS mostraram que os dentifrícios apresentavam os componentes químicos usados em sua formulação, sendo os mesmo encontrados nas superfícies das amostras após a escovação. As imagens de MEV mostraram que houve variações morfológicas sobre a superfície dentinária, nas quais houve oclusão de túbulos dentinários, sendo o DSRA o único a apresentar oclusão total. Os dentifrícios experimentais apresentaram potencial de oclusão de túbulos dentinários semelhantes aos produtos comerciais.

Tese de mestrado. Mestrado em Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

A antibioticoterapia em cirurgias de terceiros molares inferiores inclusos e/ou impactados é um assunto controverso no meio odontológico. O objetivo do presente estudo foi elucidar a real necessidade de prescrição de antibióticos nestes tipos de cirurgias realizadas por três operadores com experiências clínicas distintas. Um especialista, uma doutoranda e um aluno do último ano da graduação realizaram 50 cirurgias cada um, todas com remoção de osso e alto grau de dificuldade. Antibióticos não foram prescritos nos períodos pré e pós-operatório. No período préoperatório, 2o e 7o dias pós-operatórios foram analisados os seguintes parâmetros: dor, edema, trismo, temperatura corpórea, níveis de proteína C-reativa e contagem de neutrófilos salivares. Durante a cirurgia foram analisados: pressão arterial sistólica, diastólica e média, oximetria, freqüência cardíaca, qualidade da anestesia, quantidade de anestésico local, sangramento, dificuldade e tempo de duração da cirurgia. No dia da retirada de pontos, 7o dia pós-cirúrgico, foi avaliada a qualidade de cicatrização e os voluntários relataram a avaliação global do período póscirúrgico. Não houve nenhum caso comprovado de alveolite ou outro tipo de infecção no local operado. O tempo de cirurgia do graduando e da doutoranda mostraram valores médios maiores que os do especialista (p

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Dissertação de mestrado em Patologia Experimental apresentada à Fac. de Medicina da Universidade de Coimbra O tecido adiposo, tal como o tecido ósseo, e derivado do mesenquima e contém estroma de suporte que pode ser facilmente isolado. Este estroma e uma fonte alternativa de células precursoras do mesenquima que possuem capacidade de renovação e diferenciação em diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos, osteoblastos, condrócitos e mioblastos. Estas células têm um comportamento semelhante ao das células mesenquimatosas presentes na medula óssea e, assim, apresentam muitas aplicações clínicas potenciais, nomeadamente relacionadas com terapêuticas celulares de regeneração do tecido mesodérmico. O trabalho desenvolvido no âmbito deste estudo teve como objectivo estudar o padrão de proliferação e diferenciação osteoblástica de células mesenquimatosas isoladas de tecido adiposo de rato na presença de purmorfamina (2-(1-Naphthoxy)-6-(4-morpholinoanilino)-9-cyclohexylpurina), composto recente que parece estimular a diferenciação osteoblástica de células mesenquimatosas e, também, de células da linhagem osteoblástica. Em paralelo, o comportamento celular foi também estudado na presença de dexametasona, um indutor osteogénico clássico em sistemas in vitro. As células mesenquimatosas foram isoladas do tecido adiposo de ratos Wistar e cultivadas na presença de ácido ascórbico (50 μg/ml), β-glicerofosfato (10 mM) e purmorfamina (1 – 3 μM) ou dexametasona (10 nM). O comportamento celular foi estudado pela avaliação da viabilidade/proliferação e de parametros de diferenciação osteoblastica, como a actividade da fosfatase alcalina e a capacidade de formação de uma matriz extracelular mineralizada. Foram utilizados métodos bioquímicos e histoquímicos e observação das culturas por microscopia de luz e microscopia electrónica de varrimento. A purmorfamina causou um aumento da proliferação celular e uma indução muito significativa da actividade de fosfatase alcalina, mas não se observou deposição mineral. As culturas mostraram a presença de uma camada de células alongadas e organizadas em zonas de maior densidade celular. A presença de dexametasona resultou numa diminuição significativa da taxa de proliferação celular, formação de agrupamentos celulares bem definidos que apresentaram reacção histoquímica intensa para a fosfatase alcalina e, alguns deles, presença de depósitos mineralizados de fosfato de cálcio. A purmorfamina parece actuar como agonista da via de sinalização “Hedgehog”, que tem um papel importante no desenvolvimento de muitos tecidos e órgãos, incluindo o tecido ósseo. Assim, a modulação desta via pode, potencialmente, revestir-se de interesse terapêutico. Também, a purmorfamina pode constituir uma ferramenta farmacológica adicional na elucidação dos mecanismos envolvidos na diferenciação do tecido ósseo. Adipose tissue, such as bone, is derived from the mesenchyma and contains stromal of support that can be easily isolated. This stroma is an alternative source of stem cells which has the capacity for renewal and differentiation into different cells types, including adipocytes, osteoblasts, chondrocytes and myoblasts. These cells have a behaviour similar to that of mesenchymal cells from the bone marrow and, thus, have many potential clinical applications, in particular related to cellular therapies for tissue regeneration. The aim of this work was to study the proliferation and osteoblastic differentiation of mesenquymal cells from rat adipose tissue in the presence of purmorphamine (2-(1-Naphthoxy)-6-(4-morpholinoanilino)-9-cyclohexylpurina), a recent compound that appears to stimulate the osteoblastic differentiation of mesenquymal cells and, also, cells of the osteoblastic lineage. In parallel, the cellular behaviour was also studied in the presence of dexamethasone, a classic in vitro osteogenic inducer. The mesenchymal cells were isolated from the adipose tissue of Wistar rats and cultured in the presence of ascorbic acid (50 μg/ml), β- glycerophosphate (10 mM) and purmorphamine (1 – 3 μM) or dexamethasone (10 nM). The cellular behaviour was assessed for cell viability/proliferation and osteoblastic parameters, such as alkaline phosphatase activity and ability to form a mineralized extracellular matrix, by biochemical and histochemical methods and observation by light and scanning electronic microscopy. Purmorphamine caused an increase of the cell proliferation and a significant induction of alkaline phosphatase activity, but mineral deposition was not observed. The cultures showed the presence of a layer of elongated cells organized in areas of higher density. The presence of dexamethasone resulted in a significant decrease of the cell growth rate, formation of well-defined cellular groupments which presented an intense staining for alkaline phosphatase and, some of then, the presence of calcium phosphate mineralized deposits.

Tese de Doutoramento. Engenharia Biomédica. Área de Especialização de Biomateriais. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012