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Rendimientos altos y estables son desafíos necesarios para sostener la demanda futura del cultivo en un contexto de cambio climático y declinación de los rendimientos promedios.Tanto la agricultura de precisión, como el mejoramiento genético, podrían reducir estas pérdidas de rendimiento por superficie de forma sostenible y sustentable. En este sentido, la adaptación a cambios moderados en el clima y de carácter transitorios, puede ser lograda seleccionando cultivares con periodos de floración y duración de ciclo apropiados. La plasticidad de la floración en un cultivo representa una estrategia de escape al estrés (hídrico-térmico, en adelante estrés), principalmente en ambientes donde la disponibilidad de agua en este periodo es incierta o variable. En soja múltiples factores genéticos interactúan entre sí y con el ambiente (principalmente fotoperiodo y temperatura), dando como resultado distintas longitudes de ciclo, adaptándose su cultivo a distintas regiones. De acuerdo a la información disponible, la etapa menos afectada por estrés es aquella comprendida entre el inicio de floración hasta el comienzo del llenado de grano, atribuido a la alta plasticidad de la planta para la formación de nuevas flores y frutos. Y el período de llenado de grano es considerada la etapa más crítica debido a su robusta relación positiva con el rendimiento. Numerosos trabajos sugieren que prolongar el período reproductivo junto al hábito de crecimiento indeterminado, podrían mantener el número de nudos, ramas, vainas, flores y frutos, dando estabilidad a los cultivares de soja, compensando la pérdida causada por algún estrés transitorio. En estudios preliminares en otras localidades en Argentina, se ha observado que algunos cultivares expresan períodos reproductivos más prolongados que el resto de los cultivares con la misma longitud de ciclo, e incluso, algunos de estos genotipos han mostrado mayor estabilidad en ensayos comparativos de rendimiento. Fil: Vicentin, Ignacio Gabriel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Entre Ríos. Estación Experimental Agropecuaria Paraná; Argentina Fil: Heinz, Ruth Amelia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Ghione, Celina Elena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Córdoba. Estación Experimental Agropecuaria Marcos Juárez; Argentina Fil: Cuatrin, A.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Entre Ríos. Estación Experimental Agropecuaria Paraná; Argentina Fil: Gilli, Javier Ramon. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Córdoba. Estación Experimental Agropecuaria Marcos Juárez; Argentina

Germin-like proteins (GLPs) are a large, diverse and ubiquitous family of plant glycoproteins belonging to the Cupin super family. These proteins have been widely studied because of their diverse roles in important plant processes, including defence. The novel sunflower gene HaGLP1 encodes the first germin-like protein characterized from the family Asteraceae. To analyse whether constitutive in vivo expression of the HaGLP1 gene may lead to disease tolerance, we developed transgenic Arabidopsis plants that were molecularly characterized and biologically assessed after inoculation with Sclerotinia sclerotiorum or Rhizoctonia solani. HaGLP1 expression in Arabidopsis plants conferred tolerance to S. sclerotiorum at the first stages of disease and interfered with R. solani infection, thus giving rise to significant protection against the latter. Furthermore, HaGLP1 expression in Arabidopsis plants elevated endogenous ROS levels. HaGLP1-induced tolerance does not appear to be related to a constitutive induction of the plant defence or the ROS-related genes examined here. In conclusion, our data suggest that HaGLP1 is an interesting candidate for the engineering of plants with increased fungal tolerance and that this gene could also be useful for the selection of naturally overexpressing sunflower genotypes for conventional breeding purposes. Fil: Berecochea, Valeria C.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina Fil: Almasia, Natalia Ines. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina Fil: Peluffo, Lucila. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina Fil: Nahirñak, Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina Fil: Hopp, Horacio Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina Fil: Paniego, Norma Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Heinz, Ruth Amelia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Vazquez Rovere, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Lia, Verónica Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

In order to saturate a sunflower genetic map and facilitate marker-assisted selection (MAS) breeding for stress response, it is necessary to enhance map saturation with molecular markers localized in linkage groups associated to genomic regions involved in these traits. This work describes the identification and characterization of 1,134 simple sequence repeat (SSR) containing expressed sequence tags (EST) from unigenes available databases. Twelve of these functional markers as well as 41 public SSR markers were successfully localized in linkage groups, thus contributing to the saturation of specific regions on a reference genetic-linkage-map derived from recombinant inbred lines (RIL) mapping population from the cross between PAC2 x RHA266 lines. The enriched map includes 547 markers (231 SSR, 9 EST-SSR, 3 insertions/deletions (InDel) and 304 amplified fragment length polymorphisms (AFLP) distributed in 17 linkage groups (LG), spanning genetic size to 1,942.3 cM and improving its mean density to 3.6 cM per locus. As consequence, no gaps longer than 13.2 cM remain uncovered throughout the entire map, which increases the feasibility of detecting genes or traits of agronomic importance in sunflower.

Polipéptidos relacionados con la interacción hospedante-patógeno en el sistema trigo-roya de la hoja Un problema central de la fitopatologia es esclarecer losmecanismos de defensa a las enfermedades. Se reconoció lapresencia de genes específicos que interactúan determinando eltipo de interacción. Los mecanismosmoleculares que determinansi una interacción es compatible o incompatible no han sido aúnsuficientemente dilucidados. Se postula que los mRNAs yproteinas especificos codificados por estos genes, seinducirían en una etapa temprana en el reconocimiento de ambosorganismos. El sistema trigo-roya de la hoja fue elegido como modelopara el estudio de relaciones hospedante-patógeno altamenteespecíficas. Se utilizaron dos lineas isogénicas de trigo (Triticum aestivum) y tres clones genéticamente relacionadosdel patógeno (Puccinia recondita tritici). Este material confondo genético común permite la identificación de polipéptidosy de mRNAs específicos inducidos a causa de la infección con elpatógeno. En primer lugar se caracterizaron los cambiospolipeptidicos inducidos a lo largo del proceso de infección através del marcado “in vivo“ con 35S-Metionina de proteínassintetizadas "de novo“. En segundo lugar se caracterizaron losmRNAs inducidos en las distintas interaccioneshospedante-patógeno a través de la síntesis "in vitro” depolipéptidos en un sistema libre de células. Se analizaron lospatrones electroforéticos de estos polipéptidos en gelesdesnaturalizantes de poliacrilamida y posterior fluorografia. Curvas de tiempo mostraron que los primeros cambiospolipeptidicos tanto "in vivo“ como “in vitro” se detectaronhacia el tercer día del proceso de infección. La comparación deseis interacciones caracterizadas y sus respectivos controlessin inocular permitió asignar la inducción o disminución dedeterminadas bandas polipeptidicas a interacciones entregenes/alelos del hospedante y genes del patógeno. En estecontexto se detectó: a) inducción específica tanto a nivel de RNA como deproteinas en interacciones compatibles (bandas de 85, 15 y 24kDa) e incompatibles (bandas de 39 y 21,5 kDa). b) disminución específica de polipéptidos "in vivo” (52 y 37 kDa) e “in vitro" (34 kDa). c) dos mRNAs (20,5 y 32,5 kDa) inducidos especificamente enlas interacciones que involucran a la raza F01independientemente del hospedante. Se concluye la existencia de asociaciones entre mRNAs yproteinas inducidas con interacciones compatibles comoincompatibles por lo que el reconocimiento específico para elsistema trigo-roya de la hoja podría estar determinado por unasu otras (o ambas) según los genes interactuantes. Se aislaronclones de cDNA diferenciales correspondientes a RNA mensajerosinducidos en el sistema compatible Gamma 1R-F01 hacia el dia 5del proceso de infección que codificarían para polipéptidosespecíficos de interacción o específicos de raza. Estos clonespodrán ser utilizados para llegar a aislar los genes queintervienen en el reconocimiento de hospedante y patógeno. Simultáneamente se identificó un marcador génicocorrespondiente a una secuencia codificante de una proteina dereserva (gliadina) que está ligada a alguno de los genes dereacción a roya de la hoja y que podría utilizarse como víaalternativa para aislar los genes de interés. Fil: Heinz, Ruth Amelia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agrarias presentada en la Universidad Nacional de Rosario en 2022 La soja es una planta anual con respuesta cuantitativa a días cortos, ampliamente cultivada en el mundo y uno de los principales cultivos en la Argentina por sus múltiples usos. En los últimos años el cambio climático ha condicionado la producción y estabilidad de los cultivos, principalmente por eventos transitorios de estrés hídrico y/o térmico. En este sentido, estudios previos sugieren que la adaptación a estos cambios, puede lograrse modificando el tiempo a floración y prolongando el período reproductivo y que existen en grupos de genotipos con igual duración de ciclo, algunos que se destacan con periodos reproductivos y/o sus diferentes fases prolongadas y con mayor estabilidad de rendimiento. Con el objetivo de identificar marcadores moleculares y genes asociados a diferentes longitudes de la fase días a floración y diferentes fases del periodo reproductivo en germoplasma de soja mediante el uso de mapeo asociativo, se utilizó un set de 94 genotipos de soja compuesto por cultivares y líneas experimentales de Argentina y germoplasma exótico, con diferente duración de ciclo y características agronómicas. Los ensayos se realizaron en condiciones de campo, en tres localidades y seis ciclos agrícolas. Los genotipos se agruparon de acuerdo a su duración de ciclo (Ciclo) y se estudiaron las variables días a floración (E-R1) y las fases desde inicio de floración a inicio de fructificación (R1-R3), días desde inicio de fructificación a pleno llenado de granos (R3-R6) y días desde inicio de fructificación a madurez fisiológica (R3-R7). Se seleccionaron los genotipos con E-R1 cortos (E-R1c) y R1-R3, R3-R6p y R3-R7 prolongados (R1-R3p, R3-R6p y R3-R7p). Se determinó la estructura poblacional con 14 marcadores SSR y se realizó una genotipificación a alta escala con marcadores DarTs y SNPs para identificar genes candidatos por mapeo asociativo. La búsqueda de genes candidatos se realizó en los genotipos que se seleccionaron por presentar E-R1c, R1-R3p, R3-R6p o R3-R7p o una combinación de éstas. Luego se seleccionaron los genes con procesos biológicos o anotaciones Gene Onthology (GO) coincidentes con genes descriptos previamente asociados a floración y periodo reproductivo en soja y A. thaliana, así como genes con distinta función, pero conteniendo marcadores asociados en su secuencia. Los resultados mostraron una importante variación fenotípica en la población estudiada, incluyendo la variación de los genotipos, los ambientes y su interacción significativas para Ciclo. Se agruparon los genotipos por Ciclo en cada localidad y se identificaron 37, 19 y 5 genotipos en Paraná, Marcos Juárez y Cerro Azul respectivamente, por poseer una o más de las características buscadas, cinco genotipos se destacaron por combinar E-R1c, R1-R3p, R3-R6p y R3-R7p y dos por combinar E-R1c, R1-R3p y R3-R6p. Se analizaron 7125 SNPs y 6465 DArTs y la estructura de la población que mejor ajustó fue K=2, que correspondió al origen y al grado de mejoramiento que presentó el germoplasma. El rango de selección de genes candidatos fue de 100 Kb a ambos lados de cada marcador seleccionado. Para un total de 209 marcadores seleccionados por estar asociados a E-R1c y/o R1-R3p, R3-R6p y R3-R7p, se identificaron 1252 genes candidatos que poseían GO iguales a los de los genes descriptos en estudios previos asociados a floración y periodo reproductivo, de los cuales 11 genes ya habían sido citados previamente y 31 genes contenían el marcador en su secuencia. Por otro lado, se identificaron 45 genes conteniendo los marcadores, con distinto GO a los descriptos en la bibliografía, de los cuales 3 estaban asociados a crecimiento, desarrollo y cambio de fases fenológicas. La separación del periodo reproductivo en fases permitió detectar variabilidad a lo largo del periodo reproductivo. Los genes candidatos se asociaron en forma individual o en diferentes combinaciones con las fases estudiadas y con los marcadores. Se comprobó la existencia dentro de germoplasma con similar Ciclo, de genotipos con floraciones anticipadas y fases prolongadas del periodos reproductivo que resulta de alto interés y puede ser explotada. Del gran número de genes identificados, 95 podrían seleccionarse para su validación y posterior estudio, lo que permitiría incorporarlos como herramienta en los programas de mejoramiento para acelerar la selección en busca de genotipos con estas características. Soybean is widely cultivated in the world and one of the main crops in Argentina. In recent years, climate change has conditioned crop production and stability, mainly due to temporal stress. Adaptation can be achieved by modifying flowering time and lengthening the reproductive period. With the aim of identifying molecular markers and genes associated with different lengths of days to flowering and in reproductive period phases through the use of association mapping, a set of 94 soybeans was used. The trials were carried out under field conditions, at three locations and six years. The genotypes were grouped according to their duration cycle (Cycle) and the following variables were analyzed: days from emergence to beginning bloom (E-R1), days from beginning bloom to beginning pod (R1-R3) days from beginning pod to full seed (R3-R6) and days from beginning pod to physiological maturity (R3-R7), selecting the genotypes with short E-R1 (E-R1c) and prolonged R1-R3, R3-R6 and R3-R7 (R1-R3p, R3-R6p and R3-R7p). Significant variation of the genotypes, the environments and their interaction for Cycle was observed. Genotypes were grouped by Cycle in each locality and 61 genotypes were identified with 1 or more of the traits sought. For the association mapping 7125 SNPs and 6465 DArTs were analyzed and the population structure determined with 14 SSR markers that best adjusted was K = 2. Candidate genes were selected in a range of 100 Kb at both sides of a selected marker. For a total of 209 markers associated with E-R1c, R1-R3p, R3-R6p and R3-R7p, 1252 candidate genes were identified, being only 11 of them previously cited. Splitting the reproductive period in different phases allowed the detection of variability through it. Candidate genes were associated individually or in different combinations with the traits and with the markers. It was verified the existence of genotypes with early blooms and or prolonged phases of the reproductive periods within germplasm with similar Cycle. Of the large number of genes identified, 95 could be selected for validation and subsequent study, which would allow their incorporation as a tool in breeding programs to accelerate the selection in search of genotypes with these characteristics. EEA Paraná Fil: Vicentin, Ignacio Gabriel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Paraná; Argentina

La roya más común en los girasoles cultivados y silvestres se encuentra en todos los países donde se cultiva girasol y ha causado graves pérdidas de rendimiento en Argentina, Canadá, Rusia, E.U.A. y Australia. La información obtenida a partir de monitoreos continuos de las zonas de producción de girasol con la intención de identificar las razas del patógeno presentes en las diferentes regiones y entender la dinámica producida a lo largo de los años, luego del uso de distintas metodologías de control, es una herramienta fundamental para definir las estrategias de mejoramiento. La sustitución de cultivares de polinización abierta susceptibles con híbridos que poseen resistencia a una o más razas ha disminuido considerablemente las pérdidas por roya. Sin embargo, a medida que se producen cambios en la población de roya y las razas capaces de atacar híbridos aumentan en frecuencia, las epidemias de roya se han presentado nuevamente. Existen hoy en día, numerosas fuentes de resistencia a roya identificadas en girasol, de diversos orígenes, pero solo unas pocas han sido extensivamente utilizadas, y sólo algunas de ellas han sido genéticamente caracterizadas. Además de dilucidar el control genético detrás de cada una de las fuentes de resistencia disponibles, y con el objetivo de poder hace un uso eficiente de estos genes, introgresarlos y apilarlos en germoplasma elite, es crítico conocer su ubicación genómica. Esto permitirá detectar marcadores ligados que faciliten su seguimiento a lo largo de cruzas y sus progenies derivadas. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del control genético de la resistencia a roya en girasol. Se condujo un estudio de la distribución del patógeno en las regiones donde se produce el cultivo y una detallada caracterización racial. Esto permite hacer uso de los aislamientos obtenidos como una herramienta de selección y de estudio de especificidades de los factores implicados en la resistencia. Además, se trabajó para determinar la herencia de la resistencia a roya en fuentes que todavía no han sido caracterizadas genéticamente y determinar su relación con otras fuentes descriptas. Mapear en el genoma de girasol genes previamente descriptos utilizando marcadores moleculares del tipo SSR, SNP y marcadores diseñados de novo para las regiones genómicas de interés fue unos de los objetivos de mayor importancia. Al mismo tiempo, se realizó la piramidización o desagregación de genes de resistencia con el objetivo de determinar así sus especificidades. Se condujeron trabajos de recolección y análisis de aislamientos del patógeno a nivel nacional. Dichos aislamiento fueron posteriormente evaluados con materiales diferenciales, siendo algunos de los mismos seleccionados para nuestros objetivos centrales. Con el fin de entender el control genético subyacente a la resistencia se produjeron poblaciones recombinantes a partir del cruzamiento con diferentes fuentes de resistencia. Utilizando la metodología de Análisis de Segregantes en Masa se pudo establecer de manera rápida y eficiente la localización de los factores de control del carácter en el genoma del cultivo. Para dos de estas fuentes, HAR6 y P386, materiales que mostraban ser de gran utilidad para los programas de mejoramiento a nivel global dado su perfil de resistencia, se continuó con un proceso de mapeo aún más detallado. Este trabajo implicó el diseño de nuevos marcadores que permitieran mejorar la saturación en las regiones de interés, teniendo en cuenta información de secuencia previamente generada. Se realizó también un estudio de alelismo entre el factor que gobierna la resistencia en P386 y el presente en HAR4. La información obtenida permitirá la piramidización de estos factores en una misma línea endocriada de girasol. De este modo, se logró establecer un mapa de las razas fisiológicas de roya prevalentes en nuestro país y realizar comparaciones con información histórica, así como también inferir sobre los posibles motivos de los cambios observados a través del tiempo. Se pudo establecer que el control genético de la resistencia en las fuentes utilizadas estaba conferido por un gen o factor dominante, y que en todos los casos se localizaban en el grupo de ligamiento 13 del mapa público de girasol. En particular para HAR6 y P386, se mapeo de manera más detallada los factores determinantes de sus resistencias, RHAR6 y Pu6, respectivamente, y se logró establecer su posición con respecto a sus marcadores flanqueantes. Esta información permitió, además de validar una estrategia de selección asistida por marcadores para este carácter, establecer herramientas para la eliminación del arrastre por ligamiento de las regiones adyacentes. En el caso de Pu6, se logró establecer su relación alélica con R4, de HAR4. El diseño de nuevos marcadores para lograr la saturación del grupo de ligamiento 13 se llevó a cabo mediante dos estrategias. La primera, basada en el diseño de nuevos marcadores microsatélites a partir de secuencias de una BAC localizada en la región de interés. Esto dió como resultado la obtención de 3 nuevos marcadores, uno de ellos, NidGi1, logró ser ubicado en los mapas de ligamiento desarrollados. La segunda estrategia estuvo basada en el diseño de cebadores degenerados con alta similitud a regiones aminoacídicas y nucleotídicas conservadas presentes en análogos de genes de resistencia. Mediante esta estrategia se logró generar productos de amplificación que, sin embargo, no mostraron polimorfismo para el material analizado. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento existente sobre la genética de la resistencia a roya. Esto permitirá el diseño de germoplasma utilizando una estrategia sostenible de control de la enfermedad. Además proporciona herramientas para la asistencia a los programas de mejoramiento en la definición de fuentes de tolerancia, estrategias de introgresión y piramidización de genes en materiales elite. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol. The most common rust in cultivated and wild sunflowers is present in all countries where this oil crop is grown and has caused severe yield losses in Argentina, Canada, Russia, USA and Australia. The information obtained from continuous monitoring of sunflower production areas with the aim of identifying rust races present in different regions and the understanding of the shifts produced over the years, after the utilization of several control methodologies, is a fundamental tool to define improvement strategies. The substitution of susceptible open pollination varieties with hybrids having resistance to one or more races has reduced the yield losses produced by rust attacks in an effective way. However, as there exist shifts in the rust populations and the races having virulence to the existing resistance genes increment their frequencies, rust breakouts were observed again. Up today, there exist several rust resistance sources developed from different origins, however only few of them were extensively deployed and only a few of them were genetically characterized. In addition to the elucidation of the genetic control in each one of the available resistance sources, and with the aim of have an efficient use of these genes, to introgress and piramidized them into elite germplasm, it is a critical to known their genomic position. This knowledge will allow the development of linked molecularmarkers in order to track those genetic factors in different crosses and through their derived progenies. The general objective of this work is to understand the genetic control behind the rust resistance in sunflower. The characterization of the pathogen distribution in the sunflower production areas and their race distribution was determined. The collection of isolates will permits the generation of tools for germplasm selection and the differentiation of the genetic factors involved in the different rust resistance phenotypes under analysis. Additionally, this work covered the genetic governance elucidation in the selected resistance sources and its relationship with other previously characterized ones. The localization of already descripted sunflower genes using molecular markers like SSRs, SNPs or de novo designed ones, based on the sequence of targeted genomic regions was one of the most important goals of this work. At the same time, the piramidization or separation of the linked resistance genes by recombination to understand their specificities was done. Isolates of the pathogen were obtained through the country. Those isolates were analyzed and characterized using a set of reference lines, and some of them were selected for further use in our work. Several recombinant sunflower populations obtained from different rust resistance sources were developed. In order to unravel the genetic control behind the resistance in each population a Bulk Segregant Analysis methodology was applied. This approach let us establish in an efficient way the localization of the genetic factors involved in the control of the resistance. A detailed mapping process was carried out in HAR6 and P386, two lines showing potential for global deployment in sunflower breeding programs because of their resistance pattern. This work implied the design of new molecular markers, using already generated DNA sequence information, to saturate the resistance target genomic regions. An allelic study was carried out among P386 and HAR4 to understand the relationship between the factors controlling their resistance. The information obtained would allow the piramidization these factors into a single sunflower line. The results of this study led to the establishment of a rust physiological race map for Argentina, and the comparison of this result with already available historic records to infer the possible reasons of the evolution patterns observed. The genetic control behind the resistance sources was established. In all the cases, the resistance was conferred by a single dominant gene or genetic factor, which was located in LG 13 of the public consensus sunflower map. In particular, the genetic factors present in HAR6 and P386, RHAR6 and Pu6 respectively, were precisely located between two highly linked markers. The information generated permit us to, in addition to validate marker assisted selection strategy for these traits, develop tools for linkage drag elimination during their introgression. Additionally, it was possible to determine the allelic relationship between Pu6 and R4, the genetic factor controlling the resistance in HAR4. The design of new markers to increase the resolution of the recombination map of LG13, was done following two different strategies. The first one, based on the development of new microsatellite markers through the analysis of the BAC sequence located on the targeted region. This yield three new molecular markers, one of these markers NidGi1, was successfully located in one of the recombination map. The second strategy, was based on the design of degenerated oligo nucleotides having high similarity with amino acidic and nucleotidic conserved regions found in resistance gene analogs. This strategy yielded amplification products that were not polymorphic among the genotypes under analysis. The results of this work contribute to the knowledge of the genetics behind the rust resistance in sunflower. This will permit the development of novel sunflower germplasm using a sustainable strategy for disease control. It will also provide tools for breeding programs in order to define sources of resistance to be used, an introgression strategy and the chance of piramidization of the responsible genes in elite material. Finally, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this PhD thesis contribute to the improvement of sunflower and promote the adoption of genomics in the different stages of the sunflower breeding process. Fil: Bulos, Mariano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis para obtener el grado de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2011 Desde el inicio de la utilización de variedades transgénicas, la superficie agrobiotecnológica ha aumentado exponencialmente, con un incremento del orden de 80 veces en solo 14 años, y su uso se ha expandido a más de veinte especies vegetales. Las ventajas obtenidas con estos cultivos transgénicos de primera generación incluyen: mejor control de insectos y malezas, mayor productividad, y una reducción del uso de agroquímicos. Los avances de la biotecnología en los últimos años permitirán, probablemente en un futuro muy cercano, el desarrollo de cultivos con características de interés para los consumidores, relacionadas con una mejora en la calidad nutritiva.. En este sentido las semillas constituyen un blanco ideal para este tipo de cultivos debido a sus propiedades de dormición, almacenamiento de nutrientes y la capacidad de germinar en condiciones limitantes de nutrientes. En este trabajo, se aislaron las regiones promotoras de tres genes específicos de semillas de girasol (Helianthus annuus L. HA89), que codifican para una proteína de transferencia de lípidos (HaAP10), una oleato desaturasa (HaFAD2-1) y una oleosina (HaOLE), las cuales fueron clonadas y caracterizadas “in silico”. Los fragmentos aislados de 964, 867 y 1838pb respectivamente, contienen en sus secuencias varios motivos específicos de semilla como elementos GCN4, motivos (AACA) y (ACTG), Prolamine-Box, E-Box, G-Box, sitos de unión SEF, Sh1 Box y elementos RY/G repetidos entre otros. A su vez, contienen motivos de respuesta a hormonas ABRE y GARE (ácido abscísico y giberélico) relacionados con desarrollo embrionario. Se realizaron análisis funcionales mediante la fusión de los promotores aislados al gen reportero GUS en plantas transgénicas de Arabidopsis y lechuga. No se observó actividad de la proteína reportera en ningún tejido vegetativo exceptuando los cotiledones de plántulas pequeñas. Al ser analizados a lo largo del desarrollo de la semilla, se observó tinción específica restringida a tejido embrionario. En los ensayos fluorométricos cuantitativos se observó actividad en estadios tardíos del desarrollo, similares a los patrones típicos de genes de reserva, siendo el HaFAD2-1 un promotor con una fuerte actividad especifica de semilla, con niveles similares a los del promotor constitutivo 35S. En este trabajo de tesis se confirmó que las regiones promotoras aisladas dirigen la expresión a semilla en forma específica y fuerte, con diferencias temporales, constituyendo, por lo tanto, importantes herramientas que podrán ser de utilidad en futuras aplicaciones biotecnológicas. The successful engineering of genetically modified (GM) crops has been increasing exponentially, and its use has been widely extended in more than 20 species. The advantages obtained with this first generation of transgenics include: herbicide and pathogen tolerance, increased productivity and reduction of agrochemical use. Second generation crops will soon bring to the consumers products with better nutritious properties. In this regard, seeds are natural storage organs that accumulate high levels of lipids and proteins and constitute ideal targets for expression of recombinant proteins to increase nutritional contents and to develop molecular farming strategies. Here, we report the isolation and functional characterization of three novel sunflower seed-specific promoters which enconded for a sunflower lipid transfer protein HaAP10, an oleate desaturase HaFAD2-1 and an oleosin HaOLE. The 5’ fragments of 964 bp, 867 bp and 1838 bp respectively, were isolated, cloned and sequenced. Bioinformatic analyses of these sequences allowed the identification of several cis-elements involved in seed-specific transacting factors such as GCN4 motif, AACA motif, ACGT element E-Boxes, SEF binding sites and Sh1 Box. Among them, it is worth mentioning that ABRE and GARE elements which are related to embryo or seed development, were also identified. Putative promoter regions of these three genes were cloned into expression vector, directing the expression of the GUS gene. Arabidopsis thaliana and Letucce plants were transformed with these constructions. No GUS activity was displayed in any vegetative tissue. Although, promoter activity at different seed developmental stages showed GUS expression in embryos and mature seeds. Quantitative fluorometric assays showed activity on late seed developmental stage, similar to seed storage protein patterns, being the HaFAD2-1 a strong specific seed promoter with similar expression level to the 35S constitutive promoter. In this thesis we confirmed that the isolated regions are strong specific seed promoters, with distinct temporal expression patterns. These promoters represent potencial biotechnological tools that may be useful for future biotechnological applications. Instituto de Biotecnología Fil: Zavallo, Diego. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina.

El objetivo de esta tesis fue contribuir a la dilucidación de los mecanismos moleculares y genéticos que participan en la expresión de la dormición de semillas de cereales, utilizando Sorghum bicolor (L.)Moench como sistema modelo. Para ello se utilizaron dos aproximaciones complementarias: la identificación de QTL para el carácter dormición y la evaluación de la ocurrencia de interacciones in vitro entre componentes de la señalización del ácido abscísico (ABA)y el catabolismo de las giberelinas (GAs), candidatos a tener un rol importante durante la expresión de la dormición en granos de sorgo inmaduros (i.e. antes de madurez fisiológica). Los resultados obtenidos permitieron identificar tres QTL (qDOR-5; qDOR-9 y qDOR-10)que explican una proporción de la variabilidad que se observa en el patrón de expresión de dormición de granos de sorgo maduros (i.e. después de madurez fisiológica). Un análisis in silico de las secuencias abarcadas por estos QTL mostró que ninguno ellos incluye genes considerados como candidatos para dormición de sorgo. En ese sentido, esta tesis aportó nuevas regiones genómicas que contienen genes hasta ahora desconocidos, que serían importantes en la expresión del carácter dormición en granos maduros. Por otra parte, los análisis de unión in vitro realizados mostraron que las proteínas SbABI4 y SbABI5 (componentes de la señalización del ABA)pueden interactuar de manera específica con el ABRC (complejo de respuesta al ABA)del promotor del gen SbGA2ox3, responsable de la degradación de giberelinas activas. Este mecanismo de cross-talk ABA-GAs podría ser uno de los responsables del mantenimiento de la dormición en cariopses inmaduros resistentes al brotado pre-cosecha. Más aún, el ABRC del promotor de SbGA2ox3, involucrado en las interacciones, se encontró además en los promotores de genes GA2ox de otras especies monocotiledóneas como Brachypodium y arroz (Oryza sativa), pero no así en las dicotiledóneas analizadas, sugiriendo que el cross-talk ABA-GAs podría tener lugar en otras especies además de sorgo. Los resultados de esta tesis en forma conjunta aportaron nuevas evidencias acerca del rol preponderante que tienen ciertas regiones del genoma o genes puntuales en la expresión de la dormición tanto en granos maduros como inmaduros de sorgo granífero.

Tesis para obtener el grado de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, presentada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires en 2014 El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol. Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding. Instituto de Biotecnología Fil: Moschen, Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Tesina para obtener el grado de Magister Scientiae en Biotecnología, de la Universidad de Buenos Aires, en 2011 El género Calibrachoa, de considerable importancia como cultivo ornamental, debido a la variabilidad y vistosidad de sus flores, pertenece a la familia Solanaceae. Históricamente, las especies de Calibrachoa eran incluidas en el género Petunia, hasta 1985 cuando Wijsman y de Jong reconocen la existencia de los 2 géneros diferentes. En Argentina se encuentran 13 especies nativas, su centro de distribución se halla en la mesopotamia, excepto, C. parviflora que está distribuida en gran parte del país. Dentro del marco del proyecto Proyecto Nacional de Hortalizas, Flores y Aromáticas (PNHFA) 65531 de INTA se está trabajando en el mejoramiento de estas especies a fin de obtener variedades (inter e intraespecíficas) competitivas en el mercado florícola. Por lo tanto, el conocimiento de la base genética disponible, generado por los marcadores moleculares, resulta una valiosa herramienta a fin de lograr dichos objetivos. En el presente trabajo se pusieron a punto 13 iniciadores ISSR con las 13 especies nativas del género con el propósito de contar con los protocolos optimizados para el análisis por especie. Se analizaron, además, 35 individuos de una colección de Calibrachoa caesia del Instituto de Floricultura, pertenecientes a 5 departamentos de la provincia de Misiones. La extracción y purificación del ADN total se llevó a cabo siguiendo el método de CTAB modificado. Las reacciones de amplificación generaron un total de 701 loci, 98% polimórficos, con un promedio de aproximadamente 54 loci por iniciador. Los porcentajes de polimorfismo variaron del 100% para los iniciadores 5’GA, 5’CA, 3’TC, 3’CAC y 3’TG, hasta un 91,11% para 3’AC. Los valores máximos de Resolving power (Rp) (23,20 y 22,34) fueron para los iniciadores 5’GACA y 5’GA, respectivamente, mientras que los menores se encontraron en los iniciadores 3’AG (10,29) y 3’TG (10,51). Los mayores valores promedio de los índices de Shannon y diversidad genética (0,367 y 0,231, respectivamente) fueron para el iniciador 5’CT y los menores (0,196 y 0,105) para 3’TG, mientras que el Marker Index osciló entre 11,70 para los iniciadores 5’GACA y 3’GGG y 5,87 para 3’TG. En resumen, los iniciadores más informativos, con un 100% de polimorfismo resultaron ser 5’GACA, 5’GA, 5’CA y 5’CT, y los anclados en 3’: 3’CAC, 3’TC y 3’TG, mientras que los menos informativos fueron 3’AC y 3’CAG, con porcentajes de polimorfismo menores al 95%. El dendrograma generado mediante la aplicación del coeficiente de similitud Simple Matching (SM) y el agrupamiento UPGMA revela una alta similitud entre todos los individuos analizados (0,7665). Se llevó a cabo, además, un análisis de la estructura y variación de las poblaciones de Oberá, Guaraní y San Ignacio. Los resultados de los estadísticos calculados muestran la misma tendencia que para la colección total. El análisis molecular de la varianza mostró que la mayor variación genética (93,59%) ocurre dentro de las poblaciones, mientras que la varianza entre las 3 poblaciones analizadas fue del 6,41%, el índice de fijación (Fst) obtenido fue del 0,06409, indicando que existe una diferenciación media-baja entre las poblaciones. Los resultados obtenidos reflejan la alta sensibilidad de los marcadores ISSR, que permitieron caracterizar molecularmente a todos y cada uno de los individuos analizados, además de agruparlos por especie, abriendo una perspectiva muy promisoria para la utilización de datos moleculares en la identificación varietal para su aplicación a programas de mejoramiento llevados a cabo en el Instituto. Instituto de Floricultura Fil: Perez De La Torre, Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Floricultura; Argentina

Tesis para obtener el grado de Doctora en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2006 El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo Sunflower is one of the most important oil crops worldwide regarding its production volume and composition in unsaturated fatty acids. However due to international price conditions and productivity respect to other crops, sunflower production is progressively expanding to arid regions worldwide. Consequently, abiotic stresses as drought, low temperatures and salinity arise as main constrains nowadays. Sunflower is considered a medium-high tolerant plant crop to low temperatures in the radial zone and sensitive to saline environment. Compared to other crops such as rice, maize, soybean, tomato, wheat, potato and barley genetic and genomic sunflower knowledge was limited until the onset of the present decade. However, in parallel to the advance of this thesis (last five years), different projects aimed to the genome analysis of cultivated sunflower and its related wild species, resulted in a significant increase of the number of available expressed and genome sequences in public databases. The objective of this work was to develop tools for structural and functional analysis of cultivated sunflower through the development of a model organ-specific ESTs ("expressed sequence tags") database, the creation and actualization of a bioinformatics platform to characterize transcriptional profiles of the represented genes in response to abiotic stress conditions with the aim to identify novel genes as a source of functional molecular markers associated to important traits, under the scope of an alternative, cost-effective strategy to high-throughput sequencing projects. In the first stage of this work a low scale sequencing strategy based on suppressed subtracted hybridization method was evaluated for the construction of organ- specific cDNA libraries in order to identify differentially expressed genes in sunflower Differential organ-specific ESTs were generated from leaf, stem, root and flower bud at two developmental stages (R1 and R4). Organ-specificity ranged from 75 to 100% of non-redundant sequences in the different cDNA libraries. Sequence redundancy varied according to the target and driver cDNA used for each library. The R4 flower cDNA library was the less redundant library with 62% of unique sequences. Bioinformatics analysis was achieved through the development of BioPipeline®, a bioinformatic tool for sequence quality analysis, contaminant sequence removal and sequence assembly and automatic annotation based on the utilization of free available software as Phred/Phrap, CAP3 and BLAST algorithms using a local server installed at the Institute of Biotechnology, INTA01. Processed sequences were deposited for public distribution in the dbEST database at NCBI. Biological information related to these sequences was locally stored using an ACeDB-based relational database as a laboratory information management system. Out of a total of 919 sequences that were edited and annotated, 318 were non redundant sequences. Comparison against sequences in public databases showed that 60% of non redundant sequences showed significant similarity to known sequences. The number of predicted novel genes varied among the different cDNA libraries, ranging from 56% in the R4 flower to 16 % in the R1 flower bud library. Comparison with sunflower ESTs on public databases showed that 197 of non- redundant sequences (60%) did not exhibit significant similarity to previously reported sunflower ESTs. This approach helped to successfully isolate 33 newly reported unique sequences for sunflower putatively related to responses to biotic and/or abiotic stresses. Application of suppressed subtracted hybridization technology not only enabled the cost effective isolation of differentially expressed sequences but it also allowed the identification of novel sequences in sunflower from a relative small number of analyzed sequences when compared to major sequencing projects. In a second stage, functional genomic studies were performed using microarray technology. A cDNA glass slide chip containing the 318 organ-specific unigenes was constructed in order to evaluate the expression profile under cold and salinity stress conditions. Three biological leaf samples from treated plants, exposed either to low temperatures or watered with NaCl solution, as well as control plants grew under standard condition, were evaluated by hybridization of fluorescence labeled treated and control RNA to target genes. Transcriptional analysis allowed the detection of three groups of genes well differentiated in their expression profiles during the exploratory analysis. One group composed by 126 genes did not show variation along treatments; a second group composed by 112 genes showed evidence of up-regulation under abiotic stress (cold or salinity), whereas a SUB- regulation in both treatments was observed in the 49 genes belonging to a third group. During the second phase of this analysis, 80 candidate genes were identified according to the p-value obtained by classical ANOVA and their peripheral location in the PCA analysis of the gene matrix. Seven genes were experimentally validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) being the transcriptional patterns derived from the two methods highly similar in all cases. Differences in genes expression were analyzed according to the differential organ-specific cDNA library from which they were isolated. While differential leaf library sequences showed the majority of genes sub-regulated (most of them corresponding to photosynthesis or general metabolism related genes), R4 flower developmental stage and stem libraries showed a larger number of up-regulated genes. Considering that transcriptional changes in response to salt and cold stresses were evaluated in leaf tissue, these results confirmed the efficiency of SSH technique in the generation of the differential organ specific libraries and explained the large transcription change / transcription unchanged ratio detected in these assays. Within the 80 candidate a large number of evaluated sequences (48) were either up-regulated or sub-regulated under both abiotic stresses, thus supporting common regulatory mechanisms and general responses to low temperature and salinity. Interestingly 17 sequences were specifically up regulated and 12 were specifically sub-regulated in one stress but not in the other. These genes are potentially involved in different regulatory mechanisms including transcription / translation / protein degradation / protein folding or correspond to genes involved in ROS production or ROS-scavenging and some of them (12) did not show similarity to reported gene products. Only three of the evaluated sequences in this work showed an inverted transcriptional pattern under cold and salinity stress, including one with similarity to a LTP transcript. The information obtained from this EST library characterization not only contributed as a major source of knowledge about candidate genes involved in the mechanisms of abiotic stress responses in sunflower that can be incorporated in future complementary gene studies in model or sunflower transgenic plants but also allows the detection of new putative functional markers as a key tool for marker assisted selection in sunflower. Instituto de Biotecnología Fil: Fernandez, Paula Del Carmen. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina.