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Biological degradation of mycotoxins is an emerging strategy for detoxification of agricultural commodities. In particular, enzymatic degradation of aflatoxin B1 (AFB1), the most harmful among the mycotoxin known which may occur as contaminant of most of food and feed, has lately raised considerable scientific interest. Ligninolytic enzymes, such as laccase and peroxidise, from white-rot fungi have been proven to be able to break the highly stable molecule of AFB1. However, the high cost of production and purification of these enzymes have limited their implementation into practical technologies aimed at reduction of aflatoxin contamination in the food and feed chains. Among the white-rot fungi there are also cultivable edible mushrooms, such as Pleurotus spp. Every year tons of spent mushroom substrate (SMS) are produced as a by-product of mushroom cultivation and disposed at a cost for farmers. However, SMS may still be a source of bioactive compounds, including ligninolytic enzymes potentially useful for degradation of aflatoxin. We investigated the AFB1-degradative activity of a crude extract (CE) of SMS and undertook a study for characterization of enzyme content and stability of the extracts. CE of SMS was obtained by an extraction buffer (sodium phosphate buffer 0.1 M, pH 7.3) and the extract was incubated with 1 ?g/ml of AFB1 at 25 °C, under continuous shaking at 120 rpm for 1, 3 and 7 days; then the aflatoxin content was determined by ultra performance liquid chromatography (UPLC). After 1 day of incubation, the CE was able to degrade more than 50% of AFB1 and after 3 and 7 days of incubation the percentage of degradation reached the values of 75% and 90%, respectively. The CE contained a high level of laccase activity, quantified in 4 Units per gram of SMS dry weight (U/g DW) and low level of Mn-peroxidase (0.4 U/g DW), as determined by spectrophotometric assays. The enzymatic activity of the CE had its optimum at temperature ranging between 5 and 25 °C and at pH 4, and it was stable at +4 °C for about 60 days. Heat treatment at 100 °C for 10 minutes completely destroyed the degradative activity of CE, and freeze drying resulted in a decrease by 35% of the laccase activity. Based on these preliminary results, SMS proved to be a suitable source of aflatoxin-degrading enzymes and the use of SMS and/or their CE for detoxification of aflatoxin-contaminated commodities, particularly those intended for feed, appears as a coinceivable technology for aflatoxin-free feed production. Further research is needed to improve the stability of SMS extracts and to implement their use in the pipeline of feed processing.

Aflatoxin B1 (AFB1) is the most harmful mycotoxin produced mainly by filamentous fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus, which can occur as natural contaminants of many agricultural commodities, including maize. Several approaches have been experimented for the removal of aflatoxin from contaminated food and feed, including microbial degradation which, however, has not been so far implemented into practical technologies due to concerns on the quality and safety of the decontaminated materials. The aim of this study was to investigate the capability of the edible and cultivated mushroom Pleurotus eryngii (king oyster mushroom) to degrade AFB1. To this purpouse, nine isolates of P. eryngii were grown on one liquid and one agar medium supplemented with 500 ng/ml of AFB1. After 30 days of growth at 30 ? 1 °C both culture media were processed and analyzed for AFB1 by ultra performance liquid chromatography (UPLC/FLD). In the liquid medium (malt extract broth) all the isolates completely detoxified AFB1. In the solid medium (malt extract-agar supplemented with corn flour and wheat, MEASM) the detoxification ranged from 65 to 84%. In the perspective of developing a technology for bioconversion of aflatoxin-contaminated cereals into added-value feeds, we carried out a pilot study at a laboratory-scale on degradation of AFB1 incorporated in a mushroom cultivation substrate similar to that used in mushroom farms. One strain of P. eryngii (ITEM 13681) was able to bioconvert up to 86% of the AFB1 initially contained in the substrate in 28 days. This value did not change significantly until the maturation of fruit bodies, 42 day post inoculation. The presence of 25% aflatoxin-contaminated maize in the mushroom substrate did not result in a significant reduction of either biological efficiency or yield of the mushroom cultivation. Finally, the analysis of mature fruit bodies did not reveal the presence of detectable amounts of AFB1 or its metabolite aflatoxicol, thus ruling out translocation or "carry-over" of AFB1 through the fungal thallus. These findings make a contribution towards the development of a novel technology for remediation of AFB1-contaminated corn through the exploitation of the degradative capability of P. eryngii.

Pleurotus eryngii (DC) Quél., comunemente noto con il nome di "fungo cardoncello", oltre ad essere un fungo edule molto apprezzato per le caratteristiche organolettiche e per il valore nutritivo, viene anche studiato per la capacità di produrre enzimi ligninolitici che hanno un elevato interesse biotecnologico. Il sistema enzimatico ligninolitico di P. eryngii, costituito dagli enzimi laccasi, lignino-perossidasi e Mn-perossidasi, ha un ruolo fondamentale nella demolizione della lignina in composti a basso peso molecolare. Poiché tali enzimi non hanno specificità di substrato, possono trovare impiego nella biodegradazione di molecole aromatiche complesse e di composti recalcitranti nell'ambito di applicazioni biotecnologiche come la decolorazione di coloranti sintetici e il biorisanamento ambientale da inquinanti chimici. Inoltre, alcuni recenti studi indicano che gli enzimi laccasi e Mn-perossidasi sono anche in grado di degradare l'aflatossina B1 (AfB1), una micotossina prodotta da funghi del genere Aspergillus nel corso di processi di ammuffimento di prodotti agricoli (specialmente mais) e la cui assunzione tramite alimenti contaminati può causare gravi patologie nell'uomo e in specie zootecniche. L'obiettivo di questo studio è stato quello di valutare la capacità degradativa dell'AfB1 da parte di diversi ceppi di P.eryngii. L'analisi cromatografica mediante Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) dei filtrati colturali di 9 ceppi di P. eryngii coltivati in un substrato liquido a base di estratto di malto (MEB) con l'aggiunta di 500 ng/ml di AfB1 ha evidenziato la totale scomparsa dell'AfB1 dal brodo di coltura dopo 30 giorni. Gli stessi isolati, coltivati su substrato agarizzato a base di estratto di malto e contenente paglia di grano e farina di mais (MEASM), hanno mostrato una capacità detossificante compresa tra 65% e 84%, Un ceppo di P.eryngii, selezionato tra quelli più dotati di capacità degradativa, è stato infine coltivato su un substrato idoneo alla produzione dei carpofori e costituito da paglia di grano (50%), mais contaminato con Afb1 (128 ng/g, 25%), scarti della lavorazione della barbabietola da zucchero (12,5%) e favino (12,5%). Anche su questo substrato è stata osservata una detossificazione dell'86% dell'AfB1 dopo 28 giorni dall'inoculazione del fungo, in accordo con i risultati ottenuti in vitro. Nei corpi fruttiferi non è stata rilevata la presenza di AfB1, escludendo quindi un possibile trasporto della tossina nella parte edibile del fungo. L'efficienza biologica e la resa produttiva di carpofori non hanno mostrato differenze significative rispetto al controllo. I risultati di questo studio aprono possibilità di sviluppo di tecnologie per la conversione e la valorizzazione di prodotti agricoli contaminati con AfB1, che vengono attualmente distrutti e che potrebbero invece destinarsi alla produzione di mangimi ad uso zootecnico. Ulteriori studi sono in corso per identificare i prodotti di degradazione dell'AfB1 e chiarire i meccanismi di detossificazione.

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin denoted by a nephrotoxic activity contaminating several foodstuffs. Nowadays, the biological systems for OTA degradation to the less toxic OT? aroused great interest by the scientific community. In the present study, bacteria able to biodegrade OTA were isolated from soil samples collected in OTA-contaminated vineyards. Soil samples were collected from five vineyards of Negroamaro and Primitivo grape cultivars in Salento (Southern Italy). They were cultured in appropriate media added with OTA, mycotoxin degradation was determined by HPLC/FLC analysis and bacterial colonies were isolated by plating. Clonal relationships between isolates was assessed by using an automated rep-PCR system and then each strain was identified by 16S rRNA gene sequencing. A total of 225 bacterial isolates were able to convert OTA in OT?. The molecular analysis of the above isolates showed the presence of 27 different strains (rep-PCR profiles). The sequence analysis of the 16S-rRNA gene indicated that they belonged to five bacterial genera: Pseudomonas, Leclercia, Pantoea, Enterobacter and Acinetobacter. Additional assessment of OTA-degrading capacity of the 27 strains indicated that only the Acinetobacter calcoaceticus strain 396.1 and the A. sp. strain neg1 conserved the above property: both strains were further studied thus showing that they were able to convert 82% and 91% OTA into OT? in 6 days at 24°C, respectively. The occurrence of OT?, as the sole OTA-degradation product was established by LC-MS/MS.This is the first description on OTA biodegradation under aerobic conditions and moderate temperature by bacterial strains from agricultural soils. These microorganisms might be used to detoxify OTA contaminated feed and could be a resource for the development of a new enzymatic detoxification system.

Attività 3.2.2.c - Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento - (ISPA-CNR, IBBE-CNR) Tutte le read prodotte dal sequenziamento massivo del trascrittoma del ceppo batterico di Acinetobacter ITEM 17016, ai tempi di crescita di 6 e 12 ore, selezionati in base ad analisi di correlazione, (in assenza e in presenza della tossina OTA e in triplicato), sono state analizzate con il software allo stato dell'arte e in accordo al seguente protocollo: -Verifica della qualità delle reads mediante il programma FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) e rimozione delle regioni terminali con basso punteggio di qualità (Q < 25) attraverso il software trim_galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/); -Allineamento delle reads sui contig del genoma di riferimento mediante il software GSNAP (con parametro -N, per nuovi siti di splicing, disattivato) (http://research-pub.gene.com/gmap/); -Conversione degli allineamenti dal formato SAM a quello binario BAM tramite il pacchetto SAMtools (http://www.htslib.org/); -Quantificazione dei trascritti e analisi differenziale dell'espressione genica mediante il pacchetto cufflinks (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). L'intera analisi è stata automatizzata con appositi script in linguaggio di programmazione python. Dalla suddetta analisi è stata ottenuta una lista di 111 e 88 geni differenzialmente espressi in presenza di OTA rispettivamente dopo 6 e 12 ore di coltura. Tra questi, mediante analisi condotte su UniProt (www.uniprot.org), sono stati individuati 6 geni codificanti per proteine con attività enzimatiche di peptidasi e idrolasi, che potrebbero essere coinvolti nella degradazione dell'OTA in OTalpha e fenilalanina. Le liste di geni differenzialmente espressi sono state sottoposte ad analisi di arricchimento rispetto ai termini di Gene Ontology utilizzando il tool Bingo, un plugin del software open source Cytoscape (http://www.cytoscape.org). La suddetta analisi ha rivelato l'over-espressione di 34 e 56 pathways rispettivamente nei batteri cresciuti in presenza di OTA per 6 e 12 ore. Tra i pathways che risultano alterati alle 6 ore compaiono i processi di risposta agli stimoli esterni, l'attività peptidasica e il metabolismo degli amminoacidi e delle proteine (Fig. 3.2.2.c1). Tra i pathways disregolati alle 12 ore compaiono le attività relative al catabolismo della fenilalanina e le attività di ossidoriduzione. Questi risultati suggeriscono che inizialmente la presenza di OTA nel mezzo di coltura sia percepita dal batterio come condizione di stress, e che in seguito esso si adatti a questa condizione grazie all'espressione di una serie di geni di risposta allo stress. Inoltre, i risultati dimostrano che la degradazione dell'ocratossina avviene grazie all'attività di una o più peptidasi con il rilascio di fenilalanina che viene subito utilizzata dal batterio grazie all'attivazione degli enzimi coinvolti nel suo catabolismo. Attività 3.2.3.a - Espressione biotecnologica del gene/i identificati - (ISPA-CNR) A seguito dei risultati ottenuti nel precedente periodo di rendicontazione, i 3 geni CPA1, CPA2 e CPA3 di Acinetobacter sp. neg1 sono stati selezionati per la loro elevata similarità con quello codificante una carbossipeptidasi A (CPA) in Bacillus amyloliquefaciens (in grado di degradare l'ocratossina). I tre suddetti geni sono stati inseriti nel vettore plasmidico di espressione pET28a ed i tre plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per rendere competenti le celluledi E. coli Nel presente periodo di rendicontazione, i risultati ottenuti nella Task 3.2.2 hanno evidenziato la presenza nel genoma Acinetobacter sp. neg1 di altre tre differenti sequenze (denominate PJ1852, PJ2037 e PJ2954) codificanti per delle carbossipeptidasi potenzialmente coinvolte nella degradazione dell'OTA. Su di esse sono state costruite tre coppie di primer allo scopo di poterle amplificare mediante PCR. I tre geni amplificati sono stati separatamente purificati da buffer e primers residui e sono stati tagliati con gli enzimi di restrizione NcoI e XhoI. Le reazioni sono state incubate 4 ore a 37°C. Gli inserti, purificati da buffer ed enzimi residui, sono stati clonati all'interno del vettore plasmidico pET28a ed i plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per trasformare cellule di E. coli DH5? rese competenti con cloruro di calcio che, dopo la trasformazione sono state applicate su piastre di LB addizionate con kanamicina (50 ?g/mL). Un clone per ciascuno dei sei geni clonati è stato scelto e l'inserto clonato è stato oggetto di sequenziamento nucleotidico il quale ha confermato per tutti e sei i geni clonati la perfetta concordanza tra le sequenze ottenute e quelle delle stesse porzioni genomiche incluse nella sequenza completa del genoma di Acinetobacter sp. neg1, depositata in banca dati.Il DNA plasmidico con i tre geni (PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di E. coli BL21. Attività 3.2.3.b - Selezione e uso biotecnologico degli enzimi identificati - (ISPA-CNR) Si è quindi provveduto all'espressione in sistema eterologo dei geni ricombinanti e a tale scopo , sono stati condotti esperimenti d'induzione con IPTG dell'espressione dei geni CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954 di Acinetobacter neg1 in E. coli BL21. Nel plasmide utilizzato come vettore di espressione è, infatti, presente un promotore proveniente dal fago T7. Si tratta di un promotore molto efficiente che, tuttavia, per funzionare ha bisogno della RNA polimerasi virale, non essendo riconosciuto dall'analoga polimerasi batterica. Per questo motivo, utilizzando le tecniche dell'ingegneria genetica, nel genoma batterico è stato integrato il gene codificante l'enzima virale. L'espressione di questo gene è però a sua volta controllata e può essere attivata solo dall'aggiunta di IPTG (isopropil-?-D-1-tiogalattopiranoside). Una caratteristica importante del suddetto vettore plasmidico è il fatto che a valle delle sequenze geniche clonate vi è un blocco di 18 nucleotidi codificante per un peptide costituito da 6 istidine. Tenendo conto del loro modulo di lettura, è quindi possibile produrre una CPA contenente, fusa all'estremità C-terminale, la coda di istidine, elemento che facilita enormemente la purificazione della proteina ricombinante. Per ottenere la produzione delle proteine eterologhe in E. coli BL21 sono state testate diverse concentrazioni di IPTG, tempi e condizioni di incubazione Nelle condizioni testate non si è ottenuta la produzione delle proteine desiderata, probabilmente dovuto alla tossicità della proteina per l'organismo ospite e/o a una differenza nel codon usage tra le due specie (i.e.: Acinetobacter sp. neg1 e E. coli). Per cercare di risolvere le difficoltà nella produzione delle proteine di interesse, il DNA plasmidico con i sei geni (CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di due particolari ceppi di E. coli BL21: i) BL21(DE3) pLysE. Questo ceppo fornisce un maggiore controllo della T7 RNA polimerasi, che è necessario quando la proteina ricombinante da esprimere è tossica. ii) BL21-CodonPlus-RIL. Questo ceppo contiene geni che codificano per tRNA che riconoscono i codoni rari AGA e AGG per arginina, il codone AUA per isoleucina, e il codone CUA per leucina. L'induzione delle cellule BL21(DE3) pLysE non a prodotto le proteine attese, mentre con l'induzione delle cellule BL21-CodonPlus-RIL sono state prodotte le proteine Cpa1 e PJ1852. Questo dato evidenzia come la mancata espressione di alcuni, se non di tutti i geni clonati, sia probabilmente dovuta a una differenza nell'uso dei codoni tra Acinetobacter sp. e (E. coli) .Infatti , quando un gene clonato (Acinetobacter sp.) utilizza codoni ai quali la cellula ospite (E. coli) ricorre raramente, si verifica un'incompatibilità cellulare che può interferire con una traduzione efficiente, poiché può accadere che la cellula ospite non produca a sufficienza i tRNA che riconoscono i suddetti codoni di impiego raro e la produzione della proteina risulta conseguentemente inferiore alle aspettative o addirittura assente. L'efficacia degli enzimi di Acinetobacter sp. neg1 prodotti da E. coli nella degradazione dell'ocratossina A è stata testata in saggi in vitro. I ceppi di BL21-CodonPlus-RIL contenenti i geni CPA1 e PJ1852 sono stati indotti con 2 mM di IPTG, 4 ore a 30°C in 10 mL di LB+Kanamicina+Cloramfenicolo. Trascorso il tempo di incubazione, il surnatante è stato recuperato e le cellule sono state risospese in 10 mL di buffer TS (Tris 0.25M, NaCl 1.37M, KCl 0.027M) e lisate utilizzando una French press (3 passaggi a 1700 psi). Il lisato cellulare e il surnatante sono stati aggiunti con 1 ?g/mL di OTA e incubati a temperatura ambiente overnight. Le cellule di BL21-CodonPlus-RIL non trasformate e il mezzo di coltura senza inoculo sono stati usati come controllo. il surnatante delle cellule indotte non ha prodotto degradazione dell'OTA A, probabilmente perché proteina non è secreta nel mezzo. Infatti, l'analisi elettroforetica del precipitato delle proteine totali presenti nel surnatante ha confermato questa ipotesi.

Fusarium Head Blight (FHB) represents one of the most economically worldwide devasting disease of of durum wheat, causing significant reduction of grain yield and quality. FHB of wheat is caused by a complex of species belonging mostly to Fusarium genus. Many of these species can produce a wide range of mycotoxins that can be accumulated in wheat kernels at maturity, among which the trichotecene, strong protein inhibitors, are the most common. Moreover, each species of Fusarium involved in the FHB is provided of its own specific profile. The species can vary in the different geographical areas because they can be influenced from the changing environmental conditions. One-hundred-four samples of durum wheat were collected in Italy in 2013 and 2014 and analyzed for the occurrence of trichothecenes by Ultra-Performance Liquid Chromatography/Photodiode-Array Detector and zearalenone (ZEA) by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection. The Fusarium species isolated from the kernels were first identified based on their morphological features and therefore confirmed by sequencing calmodulin and elongation factor 1? genes. The Fusarium mycotoxin detection varied in 2013 compared to 2014 and also according with geographical areas. Deoxynivalenol (DON) was detected at a relevant levels only in the samples collected in Central and Northern Italy, with higher concentrations and incidence in 2014 compared 2013. On the other hand, the T-2 and HT-2 toxins and ZEA occurred at higher levels in samples collected in Southern Italy than in Central Italy and Northern Italy, and in 2014 the level of contamination was higher than in 2013. These latter data are also reason of the highest concern since 18 out of 20 wheat samples in both 2013 and 2014 (range, 100-335 and 155-486 ppb, respectively) were over the recommended limits suggested by the European Union for the sum of T-2 and HT-2 toxins in the wheat kernels. The mycotoxin contamination that occurred in the kernels was also reflected in the spectrum of Fusarium species isolated and identified. Fusarium graminearum sensu stricto was the most occurring species when the DON occurred at high levels and F. langsethiae was the species isolated frequently when T-2 and HT-2 toxins were detected. These data showed that a real mycotoxin risk related to Fusarium mycotoxins does exist along the whole Italy, but they vary according with the geographical areas and year of sampling.

I cereali e i prodotti a base di cereali costituiscono la maggiore fonte di esposizione dell'uomo alle tossine T-2 e HT-2, metaboliti tossici prodotti da funghi del genere Fusarium. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l'effetto del processo di decorticazione sul contenuto delle tossine T-2 e HT-2 nella granella e nelle frazioni di macinazione del frumento duro. Le analisi chimiche hanno evidenziato un'efficace azione del processo di decorticazione nel ridurre i livelli di tossine T-2 e HT-2 nella granella e nelle principali frazioni di scarto di macinazione ad elevato valore nutritivo (crusca e farinetta), suggerendo una distribuzione delle due micotossine limitata ai tegumenti esterni delle cariossidi. I livelli di contaminazione nelle semole setacciate ottenute sia dai campioni decorticati, sia tal quali, sono risultati trascurabili.

Fusarium head blight (FHB) of wheat is a disease caused mainly from fungi of the genus Fusarium and Microdochium nivale that, under favourable environmental conditions, can colonize plants during the production cycle and cause serious damages in terms of yields and quality of harvested grains. Deoxynivalenol (DON), a trichothecene mycotoxin produced by Fusarium culmorum and F. graminearum that can contaminate wheat causing haematic and anorexic syndromes and neurotoxic and immunotoxic effects in mammals, is often associated with FHB disesase. Strategies for FHB control include the use of good agronomic practices (GAP), resistant varieties and effective fungicides. Prothioconazole is a triazolinthione fungicide with ideal systemic properties providing protective, curative and long lasting activity. In order to evaluate the effectiveness of prothioconazole-based treatments against FHB disease severity, grain yields and the consequent accumulation of DON in wheat kernels, several field experiments have been performed during four consecutive growing seasons (from 2004 to 2008) in the North of Italy. Fungicide treatments were carried out on different cultivars of soft wheat (Blasco and Serio) and durum wheat (Saragolla and San Carlo) after artificial inoculation with a mixture of toxigenic F. graminearum and F. culmorum strains. The application of fungicides containing prothioconazole at the beginning of anthesis (BBCH 61) resulted in a consistent reduction of FHB disease severity (by between 50 and 70%), a strong reduction of DON levels in wheat kernels (by between 40 and 90%), and an increasing of wheat yields ranging from 0.5 to 6.0 t ha-1 (average value 2.0 t ha-1), as compared to the untreated/inoculated control and to treatments with fungicides containing tebuconazole and cyproconazole plus prochloraz. These results show that the application of fungicides containing prothioconazole provide a strong reduction of the FHB disease, allowing both an increase in grain yields and a considerable reduction of DON content in the wheat kernels.

Prothioconazole is a new broad spectrum fungicide belonging to the new chemical class of triazolinthiones. It exhibits ideal systemic properties providing protective, curative and long lasting activity. Prothioconazole has been showed to provide an outstanding control of the major fungal diseases in cereals, mainly those caused by Fusarium species. Fusarium Head Blight (FHB) is a worldwide disease of wheat caused by various fungi including Microdochium nivale and different Fusarium species (mainly F. graminearum and F. culmorum). It has been shown that the most common contaminant associated with FHB infected grains is deoxynivalenol (DON), a trichothecene mycotoxin primarily produced by F. graminearum and F. culmorum. During the 2004-05, 2005-06 and 2006-07 growing seasons, we carried out several field experiments in the North of Italy in order to evaluate the effect of Prothioconazole as a foliar application on FHB development, grain yields and DON accumulation in different cultivars of soft and durum wheat after artificial inoculation with a mixture of F. graminearum and F. culmorum. Treatments at the beginning of anthesis (BBCH 61) significantly reduced both FHB disease severity (up to 70%) and DON content (up to 90%) in the grain as compared to the inoculated control. Yields (tonne/ha) were higher in plots subjected to Prothioconazole treatments. Our findings show that the application of fungicides containing Prothioconazole provides a strong reduction of FHB disease caused by F. graminearum and F. culmorum, allowing an increase in grain yields and a considerable reduction of DON content in wheat kernels.

Nelle annate agrarie 2005-06 e 2006-07 è stata saggiata su frumento duro e tenero l’attività di alcuni fungicidi IBS (tebuconazole, epoxiconazole, prothioconazole, metconazole, prothioconazole+tebuconazole, epoxiconazole+prochloraz, cyproconazole+prochloraz e propi- conazole+ prochloraz), applicati ad inizio fioritura (GS 60-61), verso Fusarium graminearum e F. culmorum due dei principali agenti causali della “fusariosi della spiga”. Tutti i fungicidi hanno ridotto l’incidenza e la gravità della malattia con una efficacia media, variabile per la prima dal 51% al 69% e per la seconda dal 44 al 63%, e la percentuale di cariossidi infette con un’efficacia media compresa tra il 27% (epoxiconazole) ed il 58% (prothioconazole+tebuconazole). I medesimi fungicidi hanno, inoltre, garantito significativi incrementi medi di produzione (0,6-1,0 t/ha) e ridotto mediamente i livelli di deossinivalenolo (DON) nelle cariossidi da un minimo del 39% (epoxiconazole) ad un massimo dell’89% (propiconazole+prochloraz).

L’esperienza condotta ha fornito informazioni di interesse per le diverse figure professionali coinvolte nel gruppo di lavoro e più in generale per i diversi operatori della filiera cerealicola. Per quanto concerne in particolare i costitutori, si sono potute evidenziare valide fonti di resistenza da affiancarea quelle più note. Sarà quindi possibile inserire scientemente nei programmi di incrocio ulteriore germoplasma dotato di maggiori potenzialità agronomiche, rispetto a varietà esotiche (ad esempio Sumai 3) che associano ai pregi gati alla resistenza a FHB molteplici altre caratteristiche negative (ad esempio sensibilità ad altre fitopatie). La metodica messa a punto ha inoltre confermato la possibilitàdi effettuare uno screening per resistenza a FHB su di un elevato numero di genotipi, con adeguata riproducibilità dei risultati negli anni. Ne deriva l’opportunità di lavorare con continuità a un’attivitàdi selezione che trova nella discontinuità dell’infezione naturale un fattore limitante l’efficacia del breeding. Per la ricerca di base si rendono disponibili ulteriori genotipi, le cui caratteristiche di resistenza attiva potranno essere indagate in studi di metabolomica e genomica, allo scopo di cquisire conoscenze fruibili in programmi di selezione assistita (MAS), per l’ accumulo di fattori utili in germoplasma coltivabile. La caratterizzazione effettuata su varietà di interesse commerciale offre agli operatori di filiera indicazioni per integrare le conoscenze disponibili, in particolare laddove la scelta varietale assume una valenza strategica nel piano colturale. In tal senso si pensi agli agricoltori che si trovano a produrre in condizioni di elevato rischio d’infezione (ad esempio dopo mais, semina su sodo e ambienti a elevata frequenza di FHB) o che devono comunque puntare all’ottenimento di livelli particolarmente contenuti della contaminazione da DON (ad esempio prodotti per l’infanzia). In conclusione, va rimarcato che le positive sinergie create all’interno del gruppo di lavoro consentiranno la prosecuzione dell’iniziativa, con l’intento di fornire utili contributi e aggiornamenti alla filiera cerealicola nazionale.

La fusariosi della spiga del frumento rappresenta una delle principali fonti di contaminazione da micotossine, in particolare da deossinivalenolo (DON), e quindi una problematica di rilievo anche in termini di sicurezza alimentare. Di interesse pratico potrebbe essere il modello di previsione del rischio agronomico in quanto permetterebbe di agire durante la coltivazione per contenere e stimare il livello di contaminazione da DON.

Fusarium langsethiae, formally described as a new species over a decade ago, has been identified as the main producer of HT-2 (HT2) and T-2 (T2) toxins in Europe in small cereal grains. Mycotoxin contamination caused by this Fusarium species can represent a food safety hazard that deserves further attention. In the present work, the mycotoxin profile in wheat cultures of F. langsethiae is presented with particular reference to the production of major type-A trichothecenes and their glucosyl derivatives. F. langsethiae isolates, representative of the major Italian wheat cultivation areas, were tested for the production of T2, HT2, diacetoxyscirpenol (DAS) and neosolaniol (NEO), and relevant glucosyl derivatives. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used for the identification and chemical characterization of these metabolites. F. langsethiae isolates under investigation resulted to be potent producers of T2, HT2 and NEO. Furthermore, a well-defined set of isolates, all originating from Central Italy, produced also DAS. All isolates were found to be able to produce HT2 glucosyl derivatives, whereas only traces of T2 glucoside were detected in one sample. Furthermore, two mono-glucosyl derivatives of NEO and one mono-glucoside derivative of DAS were identified and characterized. The screening for the presence/absence of glucosylated trichothecenes in analyzed fungal extracts revealed a general co-occurrence of these derivatives with the parent toxin at levels that could be roughly estimated to account up to 37% of the relevant unconjugated toxin. This is the first report of the production of glucosylated trichothecenes by F. langsethiae cultured on small grains.

The presence of glucoside derivatives of T-2 and HT-2 toxins (type A trichothecene mycotoxins) in naturally contaminated wheat and oats is reported for the first time. The use of advanced high-resolution mass spectrometry based on Orbitrap technology allowed to obtain molecular structure details by measuring exact masses of main characteristic fragments, with mass accuracy lower than 2.8 ppm (absolute value). A monoglucoside derivative of T-2 toxin and two monoglucoside derivatives of HT-2 toxin were identified and characterized. The analysis of their fragmentation patterns provided evidence for glucosylation at C-3 position for T-2 toxin and at C-3 or C-4 position for HT-2 toxin. A screening for the presence of these new masked forms of mycotoxins was carried out on a set of naturally contaminated wheat and oats samples. On the basis of peak area ratio between glucoside derivatives and free T-2 and HT-2 toxins, the presence of glucoside derivatives was more likely in wheat than in oats samples. The present work confirms the widespread occurrence of trichothecene glucosides in cereal grains naturally contaminated with the relevant unconjugated toxins, thus suggesting the importance of developing suitable analytical methods for their detection. Besides toxicity studies, tracking down these new masked forms of trichothecenes along the food/feed chain would enable to collect information on their relevance in human/animal exposure to mycotoxin risk.