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ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund und Ziele: Der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) - Chloridkanal interagiert in komplexer Weise mit dem epithelialen Natriumkanal (ENaC). Dieser kann die Expression von CFTR steigern. Andererseits scheint CFTR die ENaC-Funktion zu hemmen. Der Fortfall dieser Hemmwirkung ist möglicherweise an der Pathophysiologie der zystischen Fibrose beteiligt, die durch Mutationen von CFTR verursacht wird. ENaC ist ein heterotrimerer Kanal und besteht üblicherweise aus den drei Untereinheiten α, β und γ (αβγ-hENaC). Beim Menschen, nicht aber bei Maus und Ratte, gibt es zusätzlich eine δ-Untereinheit, die funktionell die α-Untereinheit ersetzen kann, so dass der Kanal auch als δβγ-hENaC vorliegen kann. Die δ-Untereinheit, deren physiologische Rolle noch weitgehend unklar ist, verändert in vitro die Kanalfunktion. Bisher ist nicht bekannt, ob die δ-Untereinheit auch die funktionelle Interaktion zwischen ENaC mit CFTR beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Effekte von CFTR auf δβγ-hENaC zu untersuchen. Methoden: δβγ-hENaC und CFTR wurden jeweils alleine und zusammen in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die Amilorid (100µM) sensitiven Ströme (ΔIami) von δβγ-hENaC wurden mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen. Für die Bestimmung der mittleren Offenwahrscheinlichkeit (Po) von δβγ-hENaC wurde eine mutierte β-Untereinheit verwendet (βS520C-ENaC). Diese erlaubt es, die Offenwahrscheinlichkeit des Kanals durch Zugabe eines Sulfhydrylreagenzes auf nahezu eins anzuheben und damit die Ausgangsoffenwahrscheinlichkeit abzuschätzen. Mit Hilfe eines Chemilumineszenzverfahrens und der Verwendung einer mit einem FLAG-Epitop markierten β-Untereinheit erfolgte die Quantifizierung der Expression von δβγ-hENaC an der Zelloberfläche. Nach der Aktivierung von CFTR mit IBMX (1mM) und Forskolin (1µM) wurde durch Zugabe des CFTR-Inhibitors CFTR(Inh)-172 (5µM) die CFTR-vermittelte Ganzzellstromkomponente (ΔICFTR172) ermittelt. Ergebnisse: Eine Koexpression von δβγ-hENaC und CFTR führte zu einer Steigerung der CFTR-vermittelten Ströme um ca. 70% verglichen mit Oozyten, die CFTR alleine exprimierten. Dagegen bewirkte diese Koexpression ohne CFTR-Aktivierung eine Reduzierung der amiloridsensitiven ENaC-Ströme um etwa 50% im Vergleich zu Oozyten, die δβγ-hENaC alleine exprimierten. Eine Applikation von IBMX und Forskolin erhöhte ΔIami sowohl in An- als auch Abwesenheit von CFTR um etwa 50%. Die Aktivierbarkeit von ENaC durch Proteasen ist ein charakteristisches Merkmal dieses Kanals und wird möglicherweise durch CFTR beeinflusst. Die proteolytische Aktivierung von δβγ-hENaC durch Chymotrypsin (2µg/ml) stimulierte ΔIami um den Faktor 2,9 in Abwesenheit und um den Faktor 2,4 in Anwesenheit von CFTR. Versuche mit der Mutante βS520C-hENaC ergaben für δβS520Cγ-hENaC eine mittlere Offenwahrscheinlichkeit von ungefähr 0,5 in Anwesenheit und etwa 0,4 in Abwesenheit von CFTR. Durch CFTR-Koexpression war das Chemilumineszenzsignal von δβγ-hENaC signifikant um 25% vermindert. Schlussfolgerungen: δβγ-hENaC bewirkt ähnlich wie αβγ-hENaC eine Stimulation von CFTR. Inaktiver CFTR hingegen hemmt δβγ-hENaC. Im Gegensatz zu αβγ-hENaC wird δβγ-hENaC nicht durch eine CFTR-Aktivierung gehemmt. Der inhibitorische Effekt auf ΔIami bei einer Koexpression mit CFTR ist zu fast gleichen Teilen durch eine Reduzierung der mittleren Offenwahrscheinlichkeit Po und einer verminderten Oberflächenexpression von δβγ-hENaC verursacht. Passend dazu ist der relative stimulatorische Effekt auf δβγ-hENaC durch Chymotrypsin größer in An- als in Abwesenheit von CFTR. Dies lässt vermuten, dass CFTR die proteolytische Aktivierung von δβγ-hENaC durch endogene Proteasen herabsetzt. δβγ-hENaC kann im Vergleich zu αβγ-hENaC durch eine etwa 15 minütige Applikation von IBMX und Forskolin stimuliert werden. Zusammenfassend lässt sich vermuten, dass CFTR die Funktionen von δβγ- und αβγ-hENaC unterschiedlich beeinflusst, was im Hinblick auf eine Gewebe spezifische Regulation der ENaC-Aktivität relevant sein könnte.

Christianus Hörner