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The current study investigates the neurotrophic effects of Clostridium botulinum C3 transferase (C3bot) on highly purified, glia-free, GABAergic, and glutamatergic neurons. Incubation with nanomolar concentrations of C3bot promotes dendrite formation as well as dendritic and axonal outgrowth in rat GABAergic neurons. A comparison of C3bot effects on sorted mouse GABAergic and glutamatergic neurons obtained from newly established NexCre;Ai9xVGAT Venus mice revealed a higher sensitivity of GABAergic cells to axonotrophic and dendritic effects of C3bot in terms of process length and branch formation. Protein biochemical analysis of known C3bot binding partners revealed comparable amounts of β1 integrin in both cell types but a higher expression of vimentin in GABAergic neurons. Accordingly, binding of C3bot to GABAergic neurons was stronger than binding to glutamatergic neurons. A combinatory treatment of glutamatergic neurons with C3bot and vimentin raised the amount of bound C3bot to levels comparable to the ones in GABAergic neurons, thereby confirming the specificity of effects. Overall, different surface vimentin levels between GABAergic and glutamatergic neurons exist that mediate neurotrophic C3bot effects.

In den vorgestellten Studien wurde der Einfluss von C3 Proteinen auf die Morphologie und Funktion von Neuronen und glialen Zellen des ZNS untersucht. Im Zentrum der Untersuchungen standen dabei enzymvermittelte sowie enzymunabhängige Effekte. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Clostridium botulinum C3 Protein (C3bot) neben der bekannten ADP- Ribosyltransferase Aktivität eine zusätzliche neurotrophe Aktivität aufweist, die nicht enzymatisch vermittelt ist. An murinen hippocampalen Primärkulturen konnte durch enzymkompetentes C3 Protein die Länge und die Anzahl von axonalen und dendritischen Verzweigungen gesteigert werden. Durch die Herstellung verschiedener überlappender Peptidfragmente aus der Gesamtsequenz von C3bot wurde ein Bereich innerhalb der Aminosäuren 154-182 identifiziert, der vergleichbare neurotrophe Effekte aufwies, die jedoch nicht auf einer enzymatischen Inaktivierung von Rho beruhten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte strukturelle Komplexität hippocampaler Neurone auch von einer vermehrt ausgebildeten Anzahl synaptischer Kontakte begleitet wurde. An organotypischen Kultursystemen konnten die an dissoziierten Zellen beobachteten Effekte bestätigt und ergänzt werden. An Hirnschnitten des entorhinalen Cortex der Maus wurde sowohl durch C3bot als auch durch enzymdefizientes C3bot154-182 das Wiederauswachsen von Axonen gesteigert. An einem hippocampal-entorhinalen Läsionsmodell konnte zudem eine verbesserte Reinnervierung von hippocampalen Zielgebieten durch Axone des entorhinalen Tractus perforans dargestellt werden. An Astrozytenkulturen konnten ausschließlich durch enzymkompetentes C3bot bzw. durch Hemmung von Rho nachgeschalteten Signalwegen fördernde Effekte auf die zelluläre Fortsatzbildung und die Migrationsgeschwindigkeit beim Wundverschluss als Modell für gliale Narbenbildung festgestellt werden. Weiterhin wiesen mit C3bot behandelte Astrozyten eine erhöhte Glutamataufnahme auf, die auf einer Rho/NFkB-abhängig induzierten Expression des glialen Glutamat-Transporters GLT-1 beruhte. Gleichzeitig wurde die Fähigkeit von Astrozyten gesteigert, vermehrt vesikulär gespeichertes Glutamat exozytotisch freizusetzen. An kultivierter Mikroglia konnte durch C3bot, ebenfalls ausschließlich enzymgebunden, eine proinflammatorische Antwort hervorgerufen werden. Eine deutliche morphologische Aktivierung wurde begleitet von der vermehrten Freisetzung von charakteristischen Mediatoren wie NO, TNF-alpha und weiteren proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen. Insgesamt liefern die Ergebnisse einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der zentralen Bedeutung von Rho GTPasen für morphogenetische und funktionelle Mechanismen in Neuronen und glialen Zellen. Weiterhin konnte ein Peptid aus der Sequenz von C3bot identifiziert werden, das ein hohes Potential zur Förderung neuronaler Regeneration aufweisen dürfte., The present studies investigated the influence of C3 proteins on morphological and functional parameters of neurons and glial cells of the CNS. Both enzyme- dependent as well as enzyme-independent effects were looked at. We could show for the first time that Clostridium botulinum C3 protein (C3bot) in addition to its well known ADP-ribosyltransferase activity harbors a neurotrophic activity not executed by its enzymatical mode of action. Enzyme-competent C3bot increased axonal and dendritic outgrowth of cultured hippocampal neurons. By generating overlapping peptidic fragments from C3bot we were able to identify a region spanning the amino acids 154-182 (C3bot154-182) that exhibited comparable neurotrophic effects to full length C3bot. However, these effects did not rely on enzymatic inactivation of Rho proteins. Furthermore, we demonstrated that the observed improved morphological complexity was accompanied by an increased number of synaptic contacts. Using organotypical brain slice cultures we could show that incubation with C3bot154-182 resulted in a promoted axonal outgrowth and reinnervation of hippocampal target regions by entorhinal cortex fibers after lesion. Using murine astrocyte cultures we showed that increased process outgrowth and in vitro scar formation strictly relied on enzymatical inactivation of Rho proteins by C3bot or inhibition of Rho-downstream targets. Moreover, astrocytes incubated with C3bot exhibited a higher glutamate uptake capacity than control cells, mediated by an Rho/NFkB- dependent upregulation of the glutamate transporter GLT-1. At the same time exocytotic release of glutamate was promoted in astrocytes treated with C3bot. Using primary cultures of murine microglia we were able to show that incubation with C3bot resulted in microglia activation characterized by morphological alterations and an increased release of pro-inflammatory mediators such as nitric oxide, TNF-a and other cyto- and chemokines. In conclusion, these data represent an essential contribution towards a better understanding of the central role of Rho proteins in the regulation of morphological and functional processes. In addition to that we were able to identify a peptidic fragment derived from C3bot that exhibits a high potential to foster neuronal regeneration.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 durch heterotrimere G-Proteine untersucht. In der humanen neuroendokrinen Zellinie BON werden VMAT1 und VMAT2 exprimiert. Sie colokalisieren in diesen Zellen mit der a-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins Go2 vorwiegend auf großen elektronendichten Vesikeln, den LDCVs. Die Aktivität beider Transporter unterliegt einer Regulation durch Gao2. Nach Aktivierung des G-Proteins kommt es zu einer Hemmung der vesikulären Monoaminaufnahme. Die Aktivität von VMAT2 wird dabei empfindlicher reguliert als die Aktivität von VMAT1. In Primärkulturen von Rapheneuronen der Ratte wird VMAT2 als neuronale Variante des Transporters exprimiert. VMAT2 lokalisiert in diesen Neuronen überwiegend auf kleinen synaptischen Vesikeln, den SSVs. Hier kommt es zu einer Colokalisation mit Gao2 auf diesem Vesikeltyp. Auch in Rapheneuronen wird die Aktivität von VMAT2 durch diese G-Protein Untereinheit gehemmt. Elektronenmikroskopische Befunde belegen die Lokalisation von VMAT2 und Gao2 auf SSVs von serotonergen Axonterminalen im präfrontalen Cortex der Ratte. An einer Präparation synaptischer Vesikel aus diesem Gehirnbereich konnte ebenfalls eine Hemmung der Transportaktivität von VMAT2 durch Gao2 nachgewiesen werden. Auch in Thrombozyten der Maus unterliegt die vesikuläre Serotoninaufnahme einer Hemmung durch ein heterotrimeres G-Protein. In chronisch entleerten Vesikeln aus Mäusen, in denen das Gen für die periphere Tryptophanhydroxylase deletionsmutiert vorlag, konnte zunächst keine Hemmung der Serotoninaufnahme durch heterotrimere G-Proteine beobachtet werden. Nach Vorbeladung der Vesikel mit Serotonin war dies jedoch der Fall. Die Aktivierung des G-Proteins wird somit sehr wahrscheinlich über den Füllungszustand der Vesikel gesteuert., In this study we investigated the regulation of the activity of the vesicular monoamine transporters VMAT1 and VMAT2 by heterotrimeric G-proteins. In the human neuroendocrine cell line BON both transporters are expressed. They colocalize in these cells with the a-subunit of the heterotrimeric G-protein Go2 predominantely on Large Dense Core Vesicles (LDCVs). The activity of both VMAT1 and VMAT2 is regulated by Gao2. G-protein activation results in a down-regulation of vesicular monoamine uptake. VMAT2 appears to be more sensitive towards the observed G-protein regulation than VMAT1. Serotonergic raphe neurons in primary culture express VMAT2 as the neuronal form of the transporter. In these neurons VMAT2 predominantely localizes to Small Synaptic Vesicles (SSVs). Here, VMAT2 colocalizes with Gao2 on SSVs. In these neurons Gao2-dependent down-regulation of VMAT2 activity was observed, too. Immunoelectron microscopic analysis confirmed a localization of VMAT2 and Gao2 on SSVs from serotonergic terminals in the rat prefrontal cortex. In addition, Gao2-dependent regulation of VMAT2 activity could also be demonstrated when using a crude synaptic vesicle preparation of this brain area. Even in platelets obtained from mice the vesicular serotonin uptake is down-regulated by heterotrimeric G-proteins. In serotonin-depleted platelets from peripheral tryptophane-hydroxylase knockout mice no G-protein-dependent down-regulation of monoamine uptake was observed. After preincubation of the platelets with serotonin, the G-protein regulation was restored. Therefore, the vesicular transmitter content appears to be a likely factor of G-protein activation in platelets.