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Of the various potassium channel families, the two-pore domain potassium channel family, K2P, is the latest to be discovered at IPMC. These channels are responsible for the so-called "background" currents which maintains negative membrane potential thus reducing cell excitability. Many physiological functions depend on these channels (transmission of nervous messages, cardiac function, renal homeostasis, development, etc.). They have been implicated in several physiopathological conditions (depression, pain, migraine, etc.) and therefore they represent important pharmacological targets in therapeutic research.The K2P channel family consists of 15 different subunits classified into 6 groups based on their sequence homology and some of their biophysical and pharmacological properties. Homomeric K2P channels are dimers composed of two identical subunits. In addition to the 15 homomeric K2P channels (TREK1, TREK2, TRAAK, THIK1, THIK2, TWIK1, TWIK2, TWIK3, TALK1, TALK2, TASK2, TASK1, TASK2, TASK5, TRESK) heteromeric channels, formed of two different subunits, have recently been reported (THIK1/THIK2, TREK1/TREK2…). Then heteromerization allows new regulations and widen the spectrum of possible therapeutic targets. For basic research, it opens new possibilities for studying these channels.During my thesis, I was interested in the heteromerization properties of the TALK1, TALK2 and TASK2 subunits which compose the TALK channels group. By using in situ “proximity ligation assay” (PLA) and dominant negative constructs of TALK channels, I was able to demonstrate heteromerization in this subfamily (TALK1/TALK2, TALK1/TASK2 and TALK2/TASK2). Construction of tandems and chimeras of these channels allowed us to study the cellular distribution and the biophysical and pharmacological properties of the TALK-containing heteromers in mammalian cells and in xenopus oocytes. Interestingly, heteromeric TALK channels exhibit different properties than homomeric channels of the same group. These “new channels” provide greater functional diversity and therefore further possibilities for the regulation of the physiological functions influenced by these channels.; Parmi les différentes familles de canaux potassiques, la famille des canaux à deux domaines pore, K2P, est la dernière à avoir été découverte à l’IPMC. Ces canaux sont responsables des courants dits « de fond » qui maintiennent le potentiel membranaire négatif réduisant ainsi l’excitabilité cellulaire. Les fonctions physiologiques qui dépendent de ces canaux sont nombreuses (transmission des messages nerveux, fonction cardiaque, homéostasie rénale, développement…). Ils ont été impliqués dans plusieurs conditions physiopathologiques (dépression, douleur, migraine…) et de ce fait, ils représentent des cibles pharmacologiques importantes en recherche thérapeutique.La famille des canaux K2P compte 15 sous-unités différentes classées dans 6 groupes en fonction de leur homologie de séquences et de quelques-unes de leurs propriétés biophysique et pharmacologique. Les canaux K2P homomériques se présentent sous la forme de dimères composés de deux sous-unités identiques. En plus des 15 canaux K2P homomériques (TREK1, TREK2, TRAAK, THIK1, THIK2, TWIK1, TWIK2, TWIK3, TALK1, TALK2, TASK2, TASK1, TASK2, TASK5, TRESK) des canaux hétéromériques, formés de deux sous-unités différentes, ont récemment été rapportés (THIK1/THIK2 ; TREK1/TREK2…). Ces possibilités d’hétéromérisation permettent de nouvelles régulations des fonctions physiologiques et élargissent le spectre des cibles thérapeutiques possibles. Pour la recherche fondamentale ils ouvrent de nouvelles possibilités d’étude de ces canaux.Durant mes travaux de thèse, je me suis intéressée aux propriétés d’hétéromérisation des sous-unités TALK1, TALK2 et TASK2 qui composent le groupe des canaux de type TALK. Grâce à l’utilisation des techniques de « ligation de proximité » in situ (PLA) et de dominant négatifs des canaux TALK, j’ai pu mettre en évidence les capacités d’hétéromérisation dans cette sous-famille (TALK1/TALK2 ; TALK1/TASK2 et TALK2/TASK2). Des interactions entre les canaux TALK et d’autres sous-unités des canaux K2P ont également été trouvées qui devront être confirmées et approfondies (TALK1/THIK2). La construction de tandem et de chimères de ces canaux m’a aussi permis d’étudier la distribution cellulaire et les propriétés biophysiques et pharmacologiques des hétéromères dans les cellules de mammifères et dans les ovocytes de xénopes. De manière intéressante, les canaux TALK hétéromériques présentent des propriétés différentes des canaux homomériques du même groupe. Ces « nouveaux canaux » apportent une plus grande diversité fonctionnelle et donc des possibilités de régulation différentes des fonctions physiologiques influencées par ces canaux.

Maintenance of a negative resting membrane potential underlies the basis of neuronal excitability. This negative potential is generated by a potassium leak current mediated by two-pore-domain potassium channels (K2P). Over the years, they have been shown to be involved in many physiological and pathophysiological mechanisms such as depression, neuroprotection, anesthesia, migraine and pain perception. Heteromultimerization is a mechanism commonly used to increase the functional diversity of protein complexes. For example, with 15 genes classified in 6 subfamilies, the K2P channel family can potentially generates 120 combinations and, in theory, each of them would show different functional properties. Here, we first investigated the ability of the members from the same K2P subfamily (TREK subfamily) to assemble and form functional heteromeric channels with novel properties. Using single molecule pulldown (SiMPull) from HEK cell lysates, subunit counting in the plasma membrane of living cells and opto-pharmacology, we show that the TREK channel members TREK1, TREK2, and TRAAK readily co-assemble. We functionally characterized the heterodimers and found that all combinations form outwardly rectifying potassium-selective channels but with variable voltage sensitivity and pH regulation. Having found that heteromerization is possible within the same subfamily we wonder if it can happen between members from different subfamilies with lower sequence homology and what could be the pathophysiological consequences. We found that TREK1 and TREK2 are able to heterodimerize with the distantly-related TRESK, a two-pore-domain K+ channel implicated in migraine. Notably, in humans, TRESK-MT, a 2 bp frameshift mutation (F139WfsX24), which induced the formation of TRESK-MT1 a dominant negative for TRESK, was found to perfectly segregate with typical migraine in a large pedigree. Strikingly, we found that the 2 bp frameshift mutation induced an alternative translation initiation (fsATI) which leads to the translation of a second TRESK fragment, termed TRESK-MT2. We show that by co-assembling with and inhibiting TREK1 and TREK2, TRESK-MT2 increases trigeminal sensory neuron excitability, a key component of migraine induction, leading to a migraine-like phenotype. Together these findings demonstrate that K2P heteromerization is not rare and needs to be considered to understand their pathophysiological functions and that genetic analysis of disease-related mutations should consider fsATI as a distinct class of mutations., Le maintien d'un potentiel de membrane de repos négatif est à la base de l'excitabilité neuronale. Ce potentiel négatif est généré par un courant de fuite de potassium induit par les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P). Ils se sont révélés impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques tels que la dépression, la neuroprotection contre les ischémies, l'anesthésie, la migraine et la perception de la douleur. L'hétéromultimérisation est un mécanisme couramment utilisé dans la nature pour augmenter la diversité fonctionnelle des complexes protéiques. Par exemple, avec 15 gènes classés en 6 sous-familles, les canaux K2P pourraient générer 120 combinaisons et, en théorie, chacune d’elles possèderait des caractéristiques bien distinctes. Ici, nous avons d’abord étudié la capacité des membres de la même sous-famille K2P (sous-famille TREK) à s’assembler pour former des hétéromères fonctionnels dotés de nouvelles propriétés. En alliant l’optopharmacologie, une technique de précipitation de molécules uniques (SiMPull) et une technique de co-localisation à l’échelle de la molécule unique à la membrane plasmique, nous avons déterminé l’existence ainsi que la stœchiométrie des complexes créés entre TREK1, TREK2 et TRAAK. Nous avons caractérisé fonctionnellement les hétérodimères et avons constaté qu'ils formaient tous des canaux sélectifs au potassium rectifiant vers l'extérieur avec une sensibilité à la tension et aux pH variables. Ayant constaté que l’hétéromérisation est possible dans la même sous-famille, nous nous demandons si cela peut être fait entre membres de familles différentes et quelles pourraient en être les conséquences pathophysiologiques. Nous avons trouvé que TREK1 et TREK2 sont capable d’hétéromériser avec le canal plus distant TRESK, un canal K2P impliqué dans la migraine. Chez l'homme, la mutation TRESK-MT, une délétion de 2 paires de base (F139WfsX24) qui induit la formation de TRESK-MT1, un dominant négatif de TRESK, a été corrélé à la migraine. De manière surprenante, nous avons découvert que cette délétion induit un site alternatif de traduction (fsATI), menant à la formation d’un second fragment de TRESK, TRESK-MT2 qui s’assemble spécifiquement avec TREK1 et TREK2. Cet assemblage induit l’extinction des courants TREK, ce qui va augmenter l’excitabilité des neurones trijumeaux, une composante clé dans l’induction de la migraine, à l’origine du phénotype migraineux observé. Ensemble, ces résultats démontrent que l’hétéromérisation des canaux K2P n’est pas rare et doit être considérée pour comprendre leurs fonctions pathophysiologiques. Enfin, les analyses génétiques des mutations liées à des pathologies devraient désormais prendre en compte les fsATI.

Maintenance of a negative resting membrane potential underlies the basis of neuronal excitability. This negative potential is generated by a potassium leak current mediated by two-pore-domain potassium channels (K2P). Over the years, they have been shown to be involved in many physiological and pathophysiological mechanisms such as depression, neuroprotection, anesthesia, migraine and pain perception. Heteromultimerization is a mechanism commonly used to increase the functional diversity of protein complexes. For example, with 15 genes classified in 6 subfamilies, the K2P channel family can potentially generates 120 combinations and, in theory, each of them would show different functional properties. Here, we first investigated the ability of the members from the same K2P subfamily (TREK subfamily) to assemble and form functional heteromeric channels with novel properties. Using single molecule pulldown (SiMPull) from HEK cell lysates, subunit counting in the plasma membrane of living cells and opto-pharmacology, we show that the TREK channel members TREK1, TREK2, and TRAAK readily co-assemble. We functionally characterized the heterodimers and found that all combinations form outwardly rectifying potassium-selective channels but with variable voltage sensitivity and pH regulation. Having found that heteromerization is possible within the same subfamily we wonder if it can happen between members from different subfamilies with lower sequence homology and what could be the pathophysiological consequences. We found that TREK1 and TREK2 are able to heterodimerize with the distantly-related TRESK, a two-pore-domain K+ channel implicated in migraine. Notably, in humans, TRESK-MT, a 2 bp frameshift mutation (F139WfsX24), which induced the formation of TRESK-MT1 a dominant negative for TRESK, was found to perfectly segregate with typical migraine in a large pedigree. Strikingly, we found that the 2 bp frameshift mutation induced an alternative translation initiation (fsATI) which leads to the translation of a second TRESK fragment, termed TRESK-MT2. We show that by co-assembling with and inhibiting TREK1 and TREK2, TRESK-MT2 increases trigeminal sensory neuron excitability, a key component of migraine induction, leading to a migraine-like phenotype. Together these findings demonstrate that K2P heteromerization is not rare and needs to be considered to understand their pathophysiological functions and that genetic analysis of disease-related mutations should consider fsATI as a distinct class of mutations.; Le maintien d'un potentiel de membrane de repos négatif est à la base de l'excitabilité neuronale. Ce potentiel négatif est généré par un courant de fuite de potassium induit par les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P). Ils se sont révélés impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques tels que la dépression, la neuroprotection contre les ischémies, l'anesthésie, la migraine et la perception de la douleur. L'hétéromultimérisation est un mécanisme couramment utilisé dans la nature pour augmenter la diversité fonctionnelle des complexes protéiques. Par exemple, avec 15 gènes classés en 6 sous-familles, les canaux K2P pourraient générer 120 combinaisons et, en théorie, chacune d’elles possèderait des caractéristiques bien distinctes. Ici, nous avons d’abord étudié la capacité des membres de la même sous-famille K2P (sous-famille TREK) à s’assembler pour former des hétéromères fonctionnels dotés de nouvelles propriétés. En alliant l’optopharmacologie, une technique de précipitation de molécules uniques (SiMPull) et une technique de co-localisation à l’échelle de la molécule unique à la membrane plasmique, nous avons déterminé l’existence ainsi que la stœchiométrie des complexes créés entre TREK1, TREK2 et TRAAK. Nous avons caractérisé fonctionnellement les hétérodimères et avons constaté qu'ils formaient tous des canaux sélectifs au potassium rectifiant vers l'extérieur avec une sensibilité à la tension et aux pH variables. Ayant constaté que l’hétéromérisation est possible dans la même sous-famille, nous nous demandons si cela peut être fait entre membres de familles différentes et quelles pourraient en être les conséquences pathophysiologiques. Nous avons trouvé que TREK1 et TREK2 sont capable d’hétéromériser avec le canal plus distant TRESK, un canal K2P impliqué dans la migraine. Chez l'homme, la mutation TRESK-MT, une délétion de 2 paires de base (F139WfsX24) qui induit la formation de TRESK-MT1, un dominant négatif de TRESK, a été corrélé à la migraine. De manière surprenante, nous avons découvert que cette délétion induit un site alternatif de traduction (fsATI), menant à la formation d’un second fragment de TRESK, TRESK-MT2 qui s’assemble spécifiquement avec TREK1 et TREK2. Cet assemblage induit l’extinction des courants TREK, ce qui va augmenter l’excitabilité des neurones trijumeaux, une composante clé dans l’induction de la migraine, à l’origine du phénotype migraineux observé. Ensemble, ces résultats démontrent que l’hétéromérisation des canaux K2P n’est pas rare et doit être considérée pour comprendre leurs fonctions pathophysiologiques. Enfin, les analyses génétiques des mutations liées à des pathologies devraient désormais prendre en compte les fsATI.

The serotonin 5-HT2A and glutamate mGlu2 receptors keep on attracting particular attention given their implication in psychosis associated with schizophrenia and in the mechanism of action of atypical antipsychotics and of a new class of antipsychotics, respectively. Though atypical antipsychotics, targeting 5-HT2A receptor, are efficient against positive symptoms, these drugs do not act against negative, cognitive symptoms and display many side effects. Since the 90’s, new classes of antipsychotics triggering glutamatergic system, in particular mGlu2 receptor, have been developed. Their clinical trials have shown efficacy only in patients who have not been previously treated with atypical antipsychotics. This suggests a strong interaction between 5-HT2A and mGlu2 receptors in the mechanism of action of both classes of antipsychotics. Moreover, a large body of evidence indicates the presence, in prefontal cortex, of 5-HT2A/mGlu2 heteromer that is important for the response to hallucinogens and antipsychotics targeting one receptor or the other. Thus, in view of the importance of the phosphorylation profile adopted by G-protein coupled receptor (GPCR) on their activity, I characterized the impact of 5-HT2A receptor co-expression on the phosphorylation profile of mGlu2 receptor in response to various stimulations. Among the five identified phosphorylated residues, the phosphorylation of Ser843 increases upon mGlu2 receptor stimulation only when the 5-HT2A receptor is co-expressed. A new antibody against the phosphorylated form of Ser843 confirmed these results in HEK-293 cells and in mouse prefrontal cortex, area where both receptors are co-expressed. Functional studies demonstrated that Ser843 phosphorylation is necessary to enhance Gi/o signaling of mGlu2 receptor and constitutes a functional crosstalk between 5-HT2A and mGlu2 receptor since 5-HT2A receptor agonists also stimulate Ser843 phosphorylation. Collectively, my thesis findings identify mGlu2 receptor phosphorylation at Ser843 as a key molecular event of the functional crosstalk with 5-HT2A receptor that might be critical to understand the mechanism of action of atypical and potential future antipsychotics treatments.; Les récepteurs 5-HT2A de la sérotonine et mGlu2 du glutamate suscitent un grand intérêt vu la dérégulation des deux récepteurs observée dans la schizophrénie et leur statut de cibles des antipsychotiques dits atypiques et de nouvelle génération, respectivement. Même si les antipsychotiques atypiques ciblant le récepteur 5-HT2A ont montré une efficacité contre les symptômes positifs, leur effet reste très limité contre les symptômes négatifs et cognitifs, et leurs effets secondaires nombreux. Depuis les années 1990, une nouvelle classe d’antipsychotiques ciblant le système glutamatergique, en particulier le récepteur mGlu2, est en développement. Les tests cliniques n’ont montré leur efficacité que pour les patients n’ayant pas été traités auparavant par des antipsychotiques atypiques. Ceci suggère une interaction fonctionnelle forte entre les récepteurs 5-HT2A et mGlu2 dans le mode d’action de ces deux classes d’antipsychotiques. De plus, plusieurs études ont démontré l’existence d’un hétéromère des deux récepteurs dans le cortex préfrontal qui semble important pour la réponse aux hallucinogènes et aux antipsychotiques ciblant l’un ou l’autre récepteur. Ainsi, étant donné l’impact du profil de phosphorylation adopté par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sur leur fonction, j’ai caractérisé au cours de ma thèse l’impact de la co-expression du récepteur 5-HT2A sur le profil de phosphorylation du récepteur mGlu2 en réponse à différentes stimulations. Parmi les 5 sites de phosphorylation identifiés, la phosphorylation de la Ser843 est potentialisée en réponse à la stimulation par un agoniste du récepteur mGlu2 uniquement lorsque le récepteur 5-HT2A est co-exprimé. Ces résultats ont été validés grâce à la génération d’un nouvel anticorps dirigé spécifiquement contre la forme phosphorylée de la Ser843 sur culture cellulaire HEK-293 et in vivo dans le cortex préfrontal de souris, région où les deux récepteurs sont co-exprimés. Des études fonctionnelles ont démontré que la phosphorylation de la Ser843 est nécessaire à la potentialisation de l’activité Gi/o du récepteur mGlu2 en réponse à ses agonistes et constitue un cross-talk fonctionnel entre les deux récepteurs puisque les agonistes du récepteur 5-HT2A stimulent également la phosphorylation de la Ser843 du récepteur mGlu2. Ainsi, mes résultats de thèse ont permis d’identifier la phosphorylation du récepteur mGlu2 sur la Ser843 comme un événement moléculaire clé du cross-talk fonctionnel avec le récepteur 5-HT2A et apporte un élément important dans la compréhension du mode d’action des antipsychotiques atypiques et de nouvelle génération.

The serotonin 5-HT2A and glutamate mGlu2 receptors keep on attracting particular attention given their implication in psychosis associated with schizophrenia and in the mechanism of action of atypical antipsychotics and of a new class of antipsychotics, respectively. Though atypical antipsychotics, targeting 5-HT2A receptor, are efficient against positive symptoms, these drugs do not act against negative, cognitive symptoms and display many side effects. Since the 90’s, new classes of antipsychotics triggering glutamatergic system, in particular mGlu2 receptor, have been developed. Their clinical trials have shown efficacy only in patients who have not been previously treated with atypical antipsychotics. This suggests a strong interaction between 5-HT2A and mGlu2 receptors in the mechanism of action of both classes of antipsychotics. Moreover, a large body of evidence indicates the presence, in prefontal cortex, of 5-HT2A/mGlu2 heteromer that is important for the response to hallucinogens and antipsychotics targeting one receptor or the other. Thus, in view of the importance of the phosphorylation profile adopted by G-protein coupled receptor (GPCR) on their activity, I characterized the impact of 5-HT2A receptor co-expression on the phosphorylation profile of mGlu2 receptor in response to various stimulations. Among the five identified phosphorylated residues, the phosphorylation of Ser843 increases upon mGlu2 receptor stimulation only when the 5-HT2A receptor is co-expressed. A new antibody against the phosphorylated form of Ser843 confirmed these results in HEK-293 cells and in mouse prefrontal cortex, area where both receptors are co-expressed. Functional studies demonstrated that Ser843 phosphorylation is necessary to enhance Gi/o signaling of mGlu2 receptor and constitutes a functional crosstalk between 5-HT2A and mGlu2 receptor since 5-HT2A receptor agonists also stimulate Ser843 phosphorylation. Collectively, my thesis findings identify mGlu2 receptor phosphorylation at Ser843 as a key molecular event of the functional crosstalk with 5-HT2A receptor that might be critical to understand the mechanism of action of atypical and potential future antipsychotics treatments.; Les récepteurs 5-HT2A de la sérotonine et mGlu2 du glutamate suscitent un grand intérêt vu la dérégulation des deux récepteurs observée dans la schizophrénie et leur statut de cibles des antipsychotiques dits atypiques et de nouvelle génération, respectivement. Même si les antipsychotiques atypiques ciblant le récepteur 5-HT2A ont montré une efficacité contre les symptômes positifs, leur effet reste très limité contre les symptômes négatifs et cognitifs, et leurs effets secondaires nombreux. Depuis les années 1990, une nouvelle classe d’antipsychotiques ciblant le système glutamatergique, en particulier le récepteur mGlu2, est en développement. Les tests cliniques n’ont montré leur efficacité que pour les patients n’ayant pas été traités auparavant par des antipsychotiques atypiques. Ceci suggère une interaction fonctionnelle forte entre les récepteurs 5-HT2A et mGlu2 dans le mode d’action de ces deux classes d’antipsychotiques. De plus, plusieurs études ont démontré l’existence d’un hétéromère des deux récepteurs dans le cortex préfrontal qui semble important pour la réponse aux hallucinogènes et aux antipsychotiques ciblant l’un ou l’autre récepteur. Ainsi, étant donné l’impact du profil de phosphorylation adopté par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sur leur fonction, j’ai caractérisé au cours de ma thèse l’impact de la co-expression du récepteur 5-HT2A sur le profil de phosphorylation du récepteur mGlu2 en réponse à différentes stimulations. Parmi les 5 sites de phosphorylation identifiés, la phosphorylation de la Ser843 est potentialisée en réponse à la stimulation par un agoniste du récepteur mGlu2 uniquement lorsque le récepteur 5-HT2A est co-exprimé. Ces résultats ont été validés grâce à la génération d’un nouvel anticorps dirigé spécifiquement contre la forme phosphorylée de la Ser843 sur culture cellulaire HEK-293 et in vivo dans le cortex préfrontal de souris, région où les deux récepteurs sont co-exprimés. Des études fonctionnelles ont démontré que la phosphorylation de la Ser843 est nécessaire à la potentialisation de l’activité Gi/o du récepteur mGlu2 en réponse à ses agonistes et constitue un cross-talk fonctionnel entre les deux récepteurs puisque les agonistes du récepteur 5-HT2A stimulent également la phosphorylation de la Ser843 du récepteur mGlu2. Ainsi, mes résultats de thèse ont permis d’identifier la phosphorylation du récepteur mGlu2 sur la Ser843 comme un événement moléculaire clé du cross-talk fonctionnel avec le récepteur 5-HT2A et apporte un élément important dans la compréhension du mode d’action des antipsychotiques atypiques et de nouvelle génération.

Potassium channels are highly conserved among organisms, from plants to humans, where they are involved in several functions. Among them, the two pore domain potassium channels or K2P channels are dimers that produce background channels to control membrane resting potential and thus cell excitability. They are involved in physiological functions and diseases such as breathing, nociception or depression. They are now more and more considered as important therapeutic targets for the development of new drugs targeting these diseases. Structure-function relationship of ion channels is an important feature for the drug design but we only know little about mechanisms and regulations that control the activity of K2P channels.During my PhD, we showed that K2P channels and particularly subunits of THIK and TREK subfamilies channels can also form functional heterodimers with other subunits of the same subfamily. We first proved that subunits physically interact combining biochemistry, immunocytochemistry, FRET and electrophysiology. Interestingly, heterodimers display specific conductances, regulations and pharmacology compared to homodimers.These studies showed that the diversity and number of K2P channel conductances are larger than expected. In conclusion, mixing among subunits from the same subfamily form new channels with unique properties and so new therapeutic targets; Les canaux ioniques sont exprimés dans tous les types cellulaires, des plantes à l’Homme, où ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques. Parmi ces canaux, les canaux potassiques à deux domaines pore ou K2P forment des dimères qui produisent des courants de fond, contrôlant le potentiel de repos de la membrane et ainsi l’excitabilité cellulaire. De ce fait, ils jouent un rôle dans de nombreuses fonctions physiologiques et pathophysiologiques telles que la respiration, la nociception ou la dépression et sont de plus en plus considérés comme des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement de ces pathologies. La structure de ces canaux est une caractéristique importante à considérer pour le développement de nouveaux médicaments mais les mécanismes et les régulations qui contrôlent leur activité sont peu connus.Durant mon doctorat, nous avons démontré que les canaux K2P, en particulier les sous-familles THIK et TREK, peuvent s’assembler avec un autre canal de la même sous-famille pour former un hétérodimère fonctionnel. Nous avons tout d’abord prouvé que les canaux interagissent physiquement en combinant biochimie, immunocytochimie, FRET ainsi que l’électrophysiologie. De manière intéressante, les hétérodimères ont des conductances, des régulations et une sensibilité aux agents pharmacologiques différentes de celles des canaux homodimères.Ces études montrent que la famille des canaux K2P est plus étendue et diversifiée que ce qu’il avait été attendu. La combinaison de ces canaux au sein de la même sous-famille permet de créer de nouveaux canaux fonctionnels aux propriétés originales et donc de nouvelles cibles thérapeutiques

Two pore potassium channel play a key role in the answers of cells of intra and extracellular signals. I have focus my PhD on the study of sub family TREK (TREK-1, TREK-2 and TRAAK). They involved in the nociception, the depression and the neuroprotection. The activity of this channels is finely tuned by several stimuli i) physicals agents like temperature and mechanical stree, ii) chemicals agents like intra and extracellular pH and phospholipids, iii) pharmacological agents like volatile anesthetics, and iv) neurotransmitters via the G protein–coupled receptor. During my PhD I have worked on two new regulation of this channel and are capacity to make heterodimer. In a first time I discovers that TREK-1 interacted with the phospholipase D2 that permit the local production of phosphatidic acid (PA). This made a PA rich microenvironment, this last will tonicaly potentiate the basal activity of the channel. This mechanism explain have a second massager can specifically regulate a channel and how TREK-1 is sensitive to ethanol. In a second time I have work on the heteromerisation of the sub family TREK. With the single molecule technics we have shown that TREK-1, TREK-2 and TRAAK can heterodimerize. This mechanism increase the functional diversity of the family. To finish I have study the action of the toxin mycolacton on the TRAAK channel. We have shown that the mycolacton induce the hyperpolarization of nociceptive nerfs. This is due to the activation of TRAAK channel by the toxin via the angiotensin 2 receptor type II. Next I have shown that the mycolacton induce a non-canonical pathway. This is independent of G-proteins and spatially restricted by a direct interaction between TRAAK and AT2R; Les canaux potassiques à deux domaines pore sont impliqués dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques. Lors de ma thèse je me suis intéressé à la sous famille TREK dont les membres, TREK-1, TREK-2 et TRAAK jouent un rôle dans la nociception, la dépression et la neuroprotection. Leur activité est finement régulée par des stimuli physicochimiques (Température, étirement, pH), pharmacologiques (anesthésiques volatils, fluxétine,…) et physiologiques (GPCR). Lors de ma thèse je me suis intéressé à deux nouveaux modes de régulation de ces canaux ainsi qu'à leur diversité combinatoire. Tout d'abord j'ai mis en évidence que la phospholipase D2, en interagissant avec TREK1, produit un microenvironnement riche en acide phosphatique qui va potentialiser le canal. Cette régulation explique comment un second messager peut spécifiquement réguler un canal ainsi que la sensibilité de TREK-1 à l'alcool. La seconde étude a porté sur l'hétérodimérisation des membres de la sous-famille TREK. Nous avons mis en évidence grâce à des techniques en molécule unique que les sous-unités TREK-1, TREK-2 et TRAAK peuvent hétérodimériser entre elles. Elles forment ainsi des canaux avec de nouvelles propriétés comme une sensibilité particulière au pH. Enfin j'ai étudié le mécanisme d'action d'une toxine, la mycolactone, sur le canal TRAAK. Nous avons montré que cette toxine est impliquée dans le l'hyperpolarisation des fibres nociceptives induisant une analgésie. Cela étant dû à l'activation du canal TRAAK via le récepteur à l'angiotensine II de type 2. La seconde partie du projet a consisté à caractériser la voie de signalisation non canonique induite par la mycolactone

Cardiac connexin 43 (Cx43), Cx40 and Cx45 are co-expressed at distinct ratios in myocytes. This pattern is considered a key factor in regulating the gap junction channels composition, properties and function and remains poorly understood. This work aims to correlate gap junction function with the connexin composition of the channels at accurate ratios Cx43:Cx40 and Cx43:Cx45. Rat liver epithelial cells that endogenously express Cx43 were stably transfected to induce expression of accurate levels of Cx40 or Cx45 that may be present in various areas of the heart (e.g. atria and ventricular conduction system). Induction of Cx40 does not increase the amounts of junctional connexins (Cx43 and Cx40), whereas induction of Cx45 increases the amounts of junctional connexins (Cx43 and Cx45). Interestingly, the non-junctional fraction of Cx43 remains unaffected upon induction of Cx40 and Cx45. Co-immunoprecipitation studies show low level of Cx40/Cx43 heteromerisation and undetectable Cx45/Cx43 heteromerisation. Functional characterisation shows that induction of Cx40 and Cx45 decreases Lucifer Yellow transfer. Electrical coupling is decreased by Cx45 induction, whereas it is decreased at low induction of Cx40 and increased at high induction. These data indicate a fine regulation of the gap junction channel make-up in function of the type and the ratio of co-expressed Cxs that specifically regulates chemical and electrical coupling. This reflects specific gap junction function in regulating impulse propagation in the healthy heart, and a pro-arrhythmic potential of connexin remodelling in the diseased heart.

Le récepteur de chimiokine CXCR3 est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) exprimé, entre autre, sur les cellules T activées lors d’une réponse immune. CXCR3 est activé par trois ligands inductibles par l’interféron-γ (CXCL9, 10, 11) et, plus récemment, il a été découvert que CXCL4 liait CXCR3. Nous savons que CXCR3 joue un rôle dans la chimiotaxie des leucocytes, mais peu d’attention a été portée sur la signalisation biaisée induite par ces quatre ligands. Alors que l’homodimérisation entre récepteurs de chimiokine est un concept grandement observé, l’hétéromérisation entre deux récepteurs reste un domaine de recherche active. La signalisation biaisée et l’hétéromérisation ont été testées grâce à la technique de bioluminescene resonance energy transfer (BRET) dans des cellules HEK293E. Nous présentons une caractérisation pharmacologique des quatre ligands de CXCR3 et démontrons l’hétéromérisation de CXCR3 avec CXCR4 et avec CXCR7. Nos résultats suggèrent que les ligands de CXCR3 n’agissent pas de manière redondante., The chemokine receptor CXCR3 is a G-protein-coupled receptor (GPCR) rapidly induced on naïve T cells upon activation. CXCR3 is activated by three interferon-γ inducible ligands (CXCL9, 10, 11) and, more recently, CXCL4 has been discovered as a functional ligand for CXCR3. It is known that CXCR3 acts as a chemotactic receptor, but limited attention has been directed to the biased signaling induced by all four ligands. Chemokine receptor homodimerization is now a widely accepted concept, but the extent to which heterodimerization is prevalent remain matter of active research. In this work, biased signalling and heterodimerization were assessed with bioluminescence resonance energy transfer (BRET) in HEK293E cells. We present pharmacological characterization of all four ligands of CXCR3 and heterodimerization of CXCR3 with CXCR4 or CXCR7. Our results suggest that CXCR3 ligands are not redundant and that CXCR3 heterodimerizes with CXCR4 and with CXCR7.

International audience; A functional Shaker potassium channel requires assembly of four α-subunits encoded by a single gene or various genes from the Shaker family. In Arabidopsis thaliana, AtKC1, a Shaker α-subunit that is silent when expressed alone, has been shown to regulate the activity of AKT1 by forming heteromeric AtKC1-AKT1 channels. Here, we investigated whether AtKC1 is a general regulator of channel activity. Co-expression in Xenopus oocytes of a dominant negative (pore-mutated) AtKC1 subunit with the inward Shaker channel subunits KAT1, KAT2 or AKT2, or the outward subunits SKOR or GORK, revealed that the three inward subunits functionally interact with AtKC1 while the outward ones cannot. Localization experiments in plant protoplasts showed that KAT2 was able to re-locate AtKC1 fused to GFP from endomembranes to the plasma membrane, indicating that heteromeric AtKC1-KAT2 channels are efficiently targeted to the plasma membrane. Functional properties of heteromeric channels involving AtKC1 and KAT1, KAT2 or AKT2 were analysed by voltage clamp after co-expression of the respective subunits in Xenopus oocytes. AtKC1 behaved as a regulatory subunit within the heterotetrameric channel, reducing the macroscopic conductance and negatively shifting the channel activation potential. Expression studies showed that AtKC1 and its identified Shaker partners have overlapping expression patterns, supporting the hypothesis of a general regulation of inward channel activity by AtKC1 in planta. Lastly, AtKC1 disruption appeared to reduce plant biomass production, showing that AtKC1-mediated channel activity regulation is required for normal plant growth.

Les canaux potassiques de la famille Shaker dominent la conductance potassique de la membrane plasmique (MP) végétale et conduisent les flux massifs de potassium (K+) requis pour la croissance et le développement de la plante. Ces canaux ont une structure homo- ou hétéromérique associant 4 sous-unités Shaker. Chez Arabidopsis thaliana, la sous-unité Shaker AtKC1 est associée au réticulum endoplasmique (RE) et ne forme pas de structure homomérique fonctionnelle adressée à la MP. Par contre, co-exprimée avec la sous-unité Shaker AKT1, elle forme des canaux hétéromériques, adressés à la MP et pourvus de nouvelles propriétés fonctionnelles. Le premier objectif de ce travail a été de montrer, par co-expression dans l'ovocyte de xénope de diverses sous-unités Shaker avec une sous-unité mutante dn-atkc1 dotée d'un comportement dominant négatif, qu'AtKC1 est également capable de former des canaux hétéromériques fonctionnels avec des sous-unités Shaker autres qu'AKT1. AKT2, KAT1 et KAT2 ont ainsi été identifiés comme des sous-unités interagissant avec AtKC1 pour former des canaux hétéromériques. D'autre part, l'utilisation d'une sous-unité AtKC1 fusionnée à la GFP a révélé qu'en présence de KAT2, AtKC1 est adressé du RE à la MP. Les patrons d'expression d'AtKC1, AKT1, AKT2, KAT1 et de KAT2 se recouvrent dans certains tissus et types cellulaires, au moins lorsque la plante est exposée à un stress salin ou à une humidité relative (HR) proche de 100 %, ce qui appuie l'hypothèse de la formation de canaux hétéromériques in planta. Au niveau de la plante entière, la disruption du gène AtKC1 par l'insertion d'un ADN-T affecte fortement la croissance de la plante, de manière particulièrement prononcée en présence d'une HR saturante. Dans ces conditions de HR, la composition du liquide de guttation est fortement affectée chez le mutant atkc1, suggérant un rôle d'AtKC1 dans la récupération des ions à partir de la sève xylémienne par les hydathodes lors du processus de guttation. Enfin, l'expression dans l'ovocyte de deux homologues d'AtKC1 identifiés chez le riz, OsK1.1 et OsK1.2, s'est traduite par l'apparition de courants potassiques entrants, indiquant que chacune de ces sous-unités est capable de former des canaux homomériques fonctionnels adressés à la MP. L'étude de la localisation subcellulaire d'une construction chimérique associant le domaine membranaire d'AtKC1 à la région cytoplasmique C-terminale de KAT2 a révélé que la rétention d'AtKC1 dans le RE implique sa région C-terminale. L'introduction de motifs d'export ainsi que la mutation de motifs de rétention potentiels chez AtKC1, identifiés par alignement avec les homologues d'AtKC1 chez le riz et d'autres espèces, n'ont pas eu pour conséquence de modifier la localisation subcellulaire d'AtKC1, suggérant l'implication de motifs non identifiés à ce jour ou l'existence d'une interaction complexe des motifs de rétention et d'export.