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A strain of the protozoan ciliate Tetrahymena thermophila adapted to increasing Pb(II) concentrations over two years has shown that one of the resistance mechanisms to this extreme metal stress is the lead biomineralization to chloropyromorphite, one of the most stable minerals in the earth's crust. Several techniques such as microanalysis coupled to transmission and scanning electron microscopy (X-Ray Energy Disperse Spectroscopy), fluorescence microscopy and X-ray power diffraction analysis have revealed the presence of chloropyromorphite as crystalline aggregates of nano-globular structure, together with the presence of other secondary lead minerals. This is the first time that the existence of this type of biomineralization in a ciliate protozoan is described. The Pb(II) bioremediation capacity of this strain has shown that it can remove >90 % of the toxic soluble lead from the medium. A quantitative proteomic analysis of this strain has revealed the main molecular-physiological elements involved in adaptation to Pb(II) stress: increased activity of proteolytic systems against lead proteotoxicity, occurrence of metallothioneins to immobilize Pb(II) ions, antioxidant enzymes to mitigate oxidative stress, and an intense vesicular trafficking presumably involved in the formation of vacuoles where pyromorphite accumulates and is subsequently excreted, together with an enhanced energy metabolism. As a conclusion, all these results have been compiled into an integrated model that could explain the eukaryotic cellular response to extreme lead stress., Ministerio de Ciencia y Competitividad, Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

Among the epigenetic mechanisms based on non-coding RNA are microRNAs (miRNAs) that are involved in the post-transcriptional regulation of mRNAs. In many organisms, the expression of genes involved in the cellular response to biotic or abiotic stress depends on the regulation, generally inhibitory, performed by miRNAs. For the first time in the eukaryotic microorganism (ciliate-model) Tetrahymena thermophila, miRNAs involved in the posttranscriptional regulation of transcripts linked to the response to cadmium have been isolated and analyzed. Forty de novo miRNAs (we named tte-miRNAs) have been isolated from control and Cd-treated populations (1 or 24 h exposures). An exhaustive comparative analysis of the features of these mature tte-miRNAs and their precursor sequences (pre-tte-miRNAs) confirms that they are true miRNAs. In addition to the three types of miRNA isoforms previously described in other organisms, two new types are also described among the ttemiRNAs studied. A certain percentage of the pre-tte-miRNA sequences are in introns from genes with many introns, and have been defined as 5′, 3′-tailed mirtrons. A qRT-PCR analysis of selected tte-miRNAs together with some of their targets has validated them. Cd is one of the most toxic metals for the cell, which must defend itself against its toxicity by various mechanisms, such as expulsion by membrane pumps, chelation by metallothioneins, among others. Like other toxic metals, Cd also causes a well-known series of cellular effects such as intense proteotoxicity. Many of the targets that are regulated by the tte-miRNAs are transcripts encoding proteins that fit into these defense mechanisms and toxic metal effects., Ministerio de Economía y Competitividad (España), Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

CRUE-CSIC (Acuerdos Transformativos 2022), A comparative analysis of toxicities of both arsenic forms (arsenite and arsenate) in the model eukaryotic microorganism Tetrahymena thermophila (ciliate protozoa) has shown the presence of various detoxification mechanisms and cellular effects comparable to those of animal cells under arsenic stress. In the wild type strain SB1969 arsenate is almost 2.5 times more toxic than arsenite. According to the concentration addition model used in binary metallic mixtures their toxicities show an additive effect. Using fluorescent assays and flow cytometry, it has been detected that As(V) generates elevated levels of ROS/RNS compared to As(III). Both produce the same levels of superoxide anion, but As(V) also causes greater increases in hydrogen peroxide and peroxynitrite. The mitochondrial membrane potential is affected by both As(V) and As(III), and electron microscopy has also revealed that mitochondria are the main target of both arsenic ionic forms. Fusion/fission and swelling mitochondrial and mitophagy, together with macroautophagy, vacuolization and mucocyst extruction are mainly associated to As(V) toxicity, while As(III) induces an extensive lipid metabolism dysfunction (adipotropic effect). Quantitative RT-PCR analysis of some genes encoding antioxidant proteins or enzymes has shown that glutathione and thioredoxin metabolisms are involved in the response to arsenic stress. Likewise, the function of metallothioneins seems to be crucial in arsenic detoxification processes, after using both metallothionein knockout and knockdown strains and cells overexpressing metallothionein genes from this ciliate. The analysis of the differential toxicity of As(III) and As(V) shown in this study provides cytological and molecular tools to be used as biomarkers for each of the two arsenic ionic forms., Ministerio de Economía y Competitividad (España), Depto. de Biodiversidad, Ecología y Evolución, Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

El proyecto de innovación tiene como principal objetivo implementar la metodología de enseñanza-aprendizaje blended learning en las clases prácticas de la asignatura “Biología de la contaminación” (Grado en Biología UCM, cuarto curso) creando una colección de laboratorios virtuales en sinergia con las sesiones de docencia práctica presencial. De esta forma la colección de recursos digitales que reune este proyecto complementará la formación que reciben los alumnos en las clases prácticas de laboratorio de la asignatura, y permitirá adaptar las prácticas a un formato de educación online o semipresencial en el contexto de situaciones similares a la actual crisis sanitaria derivada de la COVID-19.

In this mini-review, the potential of using microorganisms to design biosensors for detecting environmental pollutants is analyzed and discussed. A distinction is made between a classical biosensor (CB) and a whole-cell biosensor (WCB), emphasizing their structural components and the possibility of using whole microorganisms as their bioreceptor elements. The advantages and disadvantages of using prokaryotic microorganisms as opposed to eukaryotic microorganisms are described. Likewise, the advantages of using protozoa ciliates) over other eukaryotic microorganisms are also shown. We analyze the current bibliography on biosensors built on microorganisms as bioreceptors of pollutant molecules, such as inorganic (metal (loid)s) or organic (xenobiotics). New trends, such as the prokaryotic riboswitches, microbial two-component systems where the pollutant can be simultaneously detected and bioremediated, along with advances in synthetic biology, are shown as promising tools in the design of environmental biosensors.

Metallothioneins (MT) are multi-stress proteins mainly involved in metal detoxification. MT gene expression is normally induced by a broad variety of stimulus and its gene expression regulation mainly occurs at a transcriptional level. Conserved motifs in the Tetrahymena thermophila MT promoters have been described. These motifs show a consensus sequence very similar to AP-1 sites, and bZIP type transcription factors might participate in the MT gene expression regulation. In this research work, we characterize four AP-1 transcription factors in each of four different analyzed Tetrahymena species, detecting a high conservation among them. Each AP-1 molecule has its counterpart in the other three Tetrahymena species. A comparative qRT-PCR analysis of these AP-1 genes have been carried out in different T. thermophila strains (including metal-adapted, knockout and/or knockdown strains among others), and under different metal-stress conditions (1 or 24 h Cd2+, Cu2+, or Pb2+ treatments). The possible interaction of these transcription factors with the conserved AP-1 motifs present in MT promoters has been corroborated by protein-DNA interaction experiments. Certain connection between the expression patterns of the bZIP and MT genes seems to exist. For the first time, and based on our findings, a possible gene expression regulation model including both AP-1 transcription factors and MT genes from the ciliate T. thermophila has been elaborated., Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD), Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

Algunos metales son esenciales en múltiples procesos biológicos pero otros, sin embargo,se incluyen entre los contaminantes más abundantes y persistentes del planeta, llegando a serconsiderados como prioritarios. Los seres vivos han desarrollado una serie de mecanismos deresistencia frente a estos contaminantes, entre los que se encuentran el secuestro intracelularo la bioacumulación de los cationes metálicos mediante diversas moléculas queladoras, talescomo: las fitoquelatinas, las metalotioneínas o el glutatión.Las metalotioneínas (MTs) constituyen una superfamilia de proteínas citosólicas de bajopeso molecular, capaces de quelar metales pesados a través de sus numerosos residuos decisteína. Se han descrito MTs en multitud de organismos diferentes: vertebrados (incluyendo elser humano), invertebrados, plantas y microorganismos eucariotas o procariotas, existiendoentre ellas una gran heterogeneidad estructural y funcional. Las MTs del ciliado Tetrahymena(incluidas en la familia 7) muestran un especial interés ya que presentan características únicasfrente a las MTs clásicas descritas en otros organismos, tales como su mayor longitud ycontenido total en residuos de cisteínas así como su mayor capacidad de quelación de metal..., Some metals are essential for multiple biological processes but others are classified amongthe most abundant and persistent pollutants of the planet, being considered as prioritycontaminants. Organisms have evolved different mechanisms to protect themselves from toxicmetals. Among them, one of the most common mechanisms in organisms is thebioaccumulation of metallic cations through different types of chelating molecules, such as:phytochelatins, metallothioneins or glutathione.Metallothioneins (MT) constitute a superfamily of small cytosolic proteins which can bindmetals through their numerous cysteine residues. MTs have been described in vertebrates(including the human being), invertebrates, plants, eukaryotic and prokaryoticmicroorganisms, existing among them a high structural and functional heterogeneity. Inparticular, Tetrahymena MTs (family 7) have a special interest as they have some uniquefeatures comparing to classic MTs: they are..

In the present review, we discussed the concept of metallothionein (MT) and analyzed the structural and functional diversity of microbial MTs, grouping them into three main groups; bacteria, fungi, and protists. Structural diversity is analyzed based on the primary, secondary, and/or tertiary structure of the proteins. Their ability to bind different metals is also analyzed in each microbial group. An in silico and phylogenetic analysis of MT sequences from the main microbial groups has been carried out. The wide functional diversity of these proteins and the regulation of the MT gene expression are also discussed. The presence of several paralog genes in many microorganisms provides a coordinated and multiple response against different types of environmental stressors. Likewise, the main possible biotechnological applications of these proteins are explored, such as molecular tools to design biosensors for evaluating metal contamination and in metal bioremediation.

Metallothioneins (MT) constitute a superfamily of small cytosolic proteins that are able to bind metal cations through numerous cysteine (Cys) residues. Like other organisms the ciliate Tetrahymena thermophila presents several MT isoforms, which have been classified into two subfamilies (Cd- and Cu-metallothioneins). The main aim of this study was to examine the specific functions and transcriptional regulation of the five MT isoforms present in T. thermophila, by using several strains of this ciliate. After a laboratory evolution experiment over more than two years, three different T. thermophila strains adapted to extreme metal stress (Cd2+, Cu2+ or Pb2+) were obtained. In addition, three knockout and/or knockdown strains for different metallothionein (MT) genes were generated. These strains were then analyzed for expression of the individual MT isoforms. Our results provide a strong basis for assigning differential roles to the set of MT isoforms. MTT1 appears to have a key role in adaptation to Cd. In contrast, MTT2/4 are crucial for Cu-adaptation and MTT5 appears to be important for Pb-adaptation and might be considered as an “alarm” MT gene for responding to metal stress. Moreover, results indicate that likely a coordinated transcriptional regulation exists between the MT genes, particularly among MTT1, MTT5 and MTT2/4. MTT5 appears to be an essential gene, a first such report in any organism of an essential MT gene., Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), NIH, Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD), Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

Algunos metales son esenciales en múltiples procesos biológicos pero otros, sin embargo,se incluyen entre los contaminantes más abundantes y persistentes del planeta, llegando a serconsiderados como prioritarios. Los seres vivos han desarrollado una serie de mecanismos deresistencia frente a estos contaminantes, entre los que se encuentran el secuestro intracelularo la bioacumulación de los cationes metálicos mediante diversas moléculas queladoras, talescomo: las fitoquelatinas, las metalotioneínas o el glutatión.Las metalotioneínas (MTs) constituyen una superfamilia de proteínas citosólicas de bajopeso molecular, capaces de quelar metales pesados a través de sus numerosos residuos decisteína. Se han descrito MTs en multitud de organismos diferentes: vertebrados (incluyendo elser humano), invertebrados, plantas y microorganismos eucariotas o procariotas, existiendoentre ellas una gran heterogeneidad estructural y funcional. Las MTs del ciliado Tetrahymena(incluidas en la familia 7) muestran un especial interés ya que presentan características únicasfrente a las MTs clásicas descritas en otros organismos, tales como su mayor longitud ycontenido total en residuos de cisteínas así como su mayor capacidad de quelación de metal...

The metal binding preference of metallothioneins (MTs) groups them in two extreme subsets, the Zn/Cd- and the Cu-thioneins. Ciliates harbor the largest MT gene/protein family reported so far, in-cluding 5 paralogs that exhibit relatively low sequence similarity, excepting MTT2 and MTT4. In Tet-rahymena thermophila, three MTs (MTT1, MTT3 and MTT5) were considered Cd-thioneins and two (MTT2 and MTT4) Cu-thioneins, according to gene expression inducibility and phylogenetic analysis. In this study, the metal-binding abilities of the five MTT proteins were characterized, to obtain information about the folding and stability of their cognate- and non-cognate metal complexes, and to characterize the T. thermophila MT system at protein level. Hence, the five MTTs were recombinantly synthesized as Zn2+-, Cd2+- or Cu+-complexes, which were analyzed by electrospray mass spectrometry (ESI-MS), circular dichroism (CD), and UV-vis spectrophotometry. Among the Cd-thioneins, MTT1 and MTT5 were optimal for Cd2+ coordination, yielding unique Cd17- and Cd8- complexes, respectively. When binding Zn2+, they rendered a mixture of Zn-species. Only MTT5 was capable to coordinate Cu+, although yielding heteronuclear Zn-, Cu-species or highly unstable Cu-homometallic species. MTT3 exhibited poor binding abilities both for Cd2+ and for Cu+, and although not optimally, it yielded the best result when coordinating Zn2+. The two Cu-thioneins, MTT2 and MTT4 isoforms formed homometallic Cu-complexes (major Cu20-MTT) upon synthesis in Cu-supplemented hosts. Contrarily, they were unable to fold into stable Cd-complexes, while Zn-MTT species were only recovered for MTT4 (major Zn10-MTT4). Thus, the metal binding preferences of the five T. thermophila MTs correlate well with their previous classification as Cd- and Cu-thioneins, and globally, they can be classified from Zn/Cd- to Cu-thioneins according to the gradation: MTT1>MTT5>MTT3>MTT4>MTT2. The main mechanisms underlying the evolution and special, Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

This review analyzes the advantages and disadvantages of using eukaryotic microorganisms to design whole-cell biosensors (WCBs) for monitoring environmental heavy metal pollution in soil or aquatic habitats. Basic considerations for designing a eukaryotic WCB are also shown. A comparative analysis of the promoter genes used to design WCBs is carried out, and the sensitivity and reproducibility of the main reporter genes used is also reviewed. Three main eukaryotic taxonomic groups are considered: yeasts, microalgae, and ciliated protozoa. Models that have been widely analyzed as potential WCBs are the Saccharomyces cerevisiae model among yeasts, the Tetrahymena thermophila model for ciliates and Chlamydomonas model for microalgae. The advantages and disadvantages of each microbial group are discussed, and a ranking of sensitivity to the same type of metal pollutant from reported eukaryotic WCBs is also shown. General conclusions and possible future developments of eukaryotic WCBs are reported., Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Depto. de Genética, Fisiología y Microbiología, Fac. de Ciencias Biológicas, TRUE, pub

El estrés oxidativo se define como el estado celular de desequilibrio entre moléculas oxidantes y antioxidantes. Esta definición se basa en la hipótesis Redox que se desarrolla en cuatro postulados: 1)Todo sistema vivo presenta elementos redox que son moléculas ricas en residuos de cisteína y que toman parte en los procesos de señalización celular, tráfico de macromoléculas y regulación fisiológica. 2)Estos elementos se coordinan mediante circuitos redox, que tienen nodos comunes como el glutatión (GSH) o la tiorredoxina (Trx). 3)Estas moléculas se localizan en diferentes compartimentos y son activadas por diferentes rutas de señalización. 4)El estrés oxidativo se origina como consecuencia de un mal funcionamiento de estos circuitos redox, que a su vez puede ser provocado por la interacción de moléculas oxidantes con algún grupo tiol antioxidante, por una alteración de los procesos de transferencia electrónica o la interrupción de los mecanismos de control de estos circuitos.Las células poseen diferentes defensas antioxidantes clasificadas en enzimáticas y no enzimáticas. En la categoría de no enzimáticas se incluye el glutatión, la tiorredoxina, las vitaminas, los pigmentos carotenoides, las metalotioneínas, las fitoquelatinas y otras moléculas ricas en cisteínas. Los sistemas enzimáticos incluyen enzimas que trabajan conjuntamente contra los radicales libres de oxígeno (ROS) e incluyen superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa, glutatión reductasa y tiorredoxina reductasa, entre otras.En nuestro trabajo hemos analizado el comportamiento de tres sistemas antioxidantes frente a diferentes productores de estrés oxidativo como son los metales, el paraquat (un herbicida), la menadiona y diversas condiciones ambientales. Los sistemas antioxidantes analizados son: el del glutatión-glutatión reductasa, la tiorredoxina-tiorredoxina reductasa y el del tripanotión/tripanotión reductasa. Nos propusimos como objetivos:1)1)Conocer la importancia del glutatión en la respuesta f

El estrés oxidativo se define como el estado celular de desequilibrio entre moléculas oxidantes y antioxidantes. Esta definición se basa en la hipótesis Redox que se desarrolla en cuatro postulados: 1)Todo sistema vivo presenta elementos redox que son moléculas ricas en residuos de cisteína y que toman parte en los procesos de señalización celular, tráfico de macromoléculas y regulación fisiológica. 2)Estos elementos se coordinan mediante circuitos redox, que tienen nodos comunes como el glutatión (GSH) o la tiorredoxina (Trx). 3)Estas moléculas se localizan en diferentes compartimentos y son activadas por diferentes rutas de señalización. 4)El estrés oxidativo se origina como consecuencia de un mal funcionamiento de estos circuitos redox, que a su vez puede ser provocado por la interacción de moléculas oxidantes con algún grupo tiol antioxidante, por una alteración de los procesos de transferencia electrónica o la interrupción de los mecanismos de control de estos circuitos.Las células poseen diferentes defensas antioxidantes clasificadas en enzimáticas y no enzimáticas. En la categoría de no enzimáticas se incluye el glutatión, la tiorredoxina, las vitaminas, los pigmentos carotenoides, las metalotioneínas, las fitoquelatinas y otras moléculas ricas en cisteínas. Los sistemas enzimáticos incluyen enzimas que trabajan conjuntamente contra los radicales libres de oxígeno (ROS) e incluyen superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa, glutatión reductasa y tiorredoxina reductasa, entre otras.En nuestro trabajo hemos analizado el comportamiento de tres sistemas antioxidantes frente a diferentes productores de estrés oxidativo como son los metales, el paraquat (un herbicida), la menadiona y diversas condiciones ambientales. Los sistemas antioxidantes analizados son: el del glutatión-glutatión reductasa, la tiorredoxina-tiorredoxina reductasa y el del tripanotión/tripanotión reductasa. Nos propusimos como objetivos:1)1)Conocer la importancia del glutatión en la respuesta f

La evaluación de la contaminación por metales pesados se debe realizar en base a parámetros como la biodisponibilidad de metales, su toxicidad y genotoxicidad. Para ello se utilizan los llamado biosensores celulares, y los ciliados, como microorganismos eucariotas móviles y sin pared celular, constituyen una excelente herramienta para ello. Aunque T. thermophila presenta un gen codificante (TtPCS) para una proteína homóloga a fitoquelatín sintasas, la ausencia de fitoquelatinas en este ciliado, demostrada en este trabajo, hace pensar que el principal mecanismo de resistencia a metales pesados (bioacumulación) en T. thermophila, consiste en la inmovilización de los cationes metálicos en el citoplasma por metalotioneínas (MTs), cuya síntesis se induce rápidamente cuando la célula es expuesta a metales y otras condiciones de estrés celular. Actualmente se conocen once MTs en distintas especies del género Tetrahymena, y de acuerdo a sus características estructurales, filogenéticas y el patrón de expresión de los genes que las codifican, las hemos agrupado en dos subfamilias distintas: 7a (Cd-MTs) y 7b (Cu-MTs). Las Cd-MTs de Tetrahymena comparten una marcada estructura modular, que podría haber contribuido al inusual tamaño de estas MTs, superior respecto a las MTs del resto de organismos. Aprovechando la gran capacidad de respuesta a metales de los promotores de MTT1 y MTT5 de T. thermophila hemos construido dos biosensores celulares, que bajo control de estos promotores sobreexpresan el gen de la luciferasa eucariota (lucFF) cuando la célula es expuesta a distintos metales pesados. Las cepas MTT1Luc y MTT5Luc representan los biosensores eucariotas capaces de detectar las menores concentraciones de metales pesados no esenciales (Cd, Pb, As, Hg), con una sensibilidad de detección de 5-50 nM dependiendo del metal. Además, los biosensores construidos son capaces de detectar la presencia de metales pesados en forma biodisponible en distintas muestras ambientales de origen

La evaluación de la contaminación por metales pesados se debe realizar en base a parámetros como la biodisponibilidad de metales, su toxicidad y genotoxicidad. Para ello se utilizan los llamado biosensores celulares, y los ciliados, como microorganismos eucariotas móviles y sin pared celular, constituyen una excelente herramienta para ello. Aunque T. thermophila presenta un gen codificante (TtPCS) para una proteína homóloga a fitoquelatín sintasas, la ausencia de fitoquelatinas en este ciliado, demostrada en este trabajo, hace pensar que el principal mecanismo de resistencia a metales pesados (bioacumulación) en T. thermophila, consiste en la inmovilización de los cationes metálicos en el citoplasma por metalotioneínas (MTs), cuya síntesis se induce rápidamente cuando la célula es expuesta a metales y otras condiciones de estrés celular. Actualmente se conocen once MTs en distintas especies del género Tetrahymena, y de acuerdo a sus características estructurales, filogenéticas y el patrón de expresión de los genes que las codifican, las hemos agrupado en dos subfamilias distintas: 7a (Cd-MTs) y 7b (Cu-MTs). Las Cd-MTs de Tetrahymena comparten una marcada estructura modular, que podría haber contribuido al inusual tamaño de estas MTs, superior respecto a las MTs del resto de organismos. Aprovechando la gran capacidad de respuesta a metales de los promotores de MTT1 y MTT5 de T. thermophila hemos construido dos biosensores celulares, que bajo control de estos promotores sobreexpresan el gen de la luciferasa eucariota (lucFF) cuando la célula es expuesta a distintos metales pesados. Las cepas MTT1Luc y MTT5Luc representan los biosensores eucariotas capaces de detectar las menores concentraciones de metales pesados no esenciales (Cd, Pb, As, Hg), con una sensibilidad de detección de 5-50 nM dependiendo del metal. Además, los biosensores construidos son capaces de detectar la presencia de metales pesados en forma biodisponible en distintas muestras ambientales de origen

Esta tesis representa diferentes aproximaciones moleculares para el estudio y búsqueda de genes específicos de enquistamiento en el ciliado colpoda inflata: aislamiento y posterior clonación de bandas especificas de arnm. Experimentos de sustracción y aislamiento de bandas diferenciales obtenidas del estudio de polimorfismos con cebadores arbitrarios. Finalmente, se obtuvo una sonda especifica a partir de un transcrito obtenido de adnc de la población quística que, aunque presente en todas las poblaciones de adnc estudiadas (vegetativos, prequisticos de 12 h, 18h, y 24 h) se acumula especialmente en el estado diferenciado o quiste de resistencia. Se presenta la secuencia obtenida de esta sonda y se discuten posibles interpretaciones sobre sus mecanismos de acumulación

El estudio de este proceso de diferenciación celular (enquistamiento), fue abordado a distintos niveles: 1- naturaleza del adn macronuclear vegetativo y quistico, por electroforesis convencional y electroforesis de campo pulsado. 2- cambios en el patrón de metilación durante el enquistamiento, utilizando endonucleasas de restricción y el inhibidor 5-azacitidina. 3- análisis estructural del macronucleo y cromatina por microscopia electrónica de transmisión (tem), microscopia confocal y citometria de flujo. Con los datos obtenidos, concluimos: 1-el adn macronuclear esta organizado por moléculas de tamaño subcromosomico, solo visualizables por electroforesis de campo pulsado, donde los genes ribosómicos se localizan en una banda discreta dentro del patrón electroforetico. El patrón electroforetico de colpoda inflata, es similar al de paramecium (población heterogénea y continua de moléculas de amplio rango de tamaños) y se aleja del mostrado por tetrahymena sp. Sin embargo, el tamaño promedio de las moléculas macronucleares es similar al de tetrahymena. 2- el genoma macronuclear parece presentar 5-metilcitosina y no 6-metiladenina. La desmetilacion de determinadas secuencias del adn macronuclear, supondría un mecanismo de apertura de los genes involucrados en el enquistamiento. Además, existiría una metilación selectiva de genes ribosomales macronucleares. 3- la cromatina macronuclear vegetativa es de naturaleza nucleosomal y esta constituida por numerosos cuerpos discretos de cromatina condensada. Presenta un nucleolo compuesto constituido por varias masas nucleolares, que en el enquistamiento se fusionan, originando una única masa nucleolar. También en el enquistamiento se produce una perdida de adn macronuclear en forma de cuerpo de extrusión, como un mecanismo para mantener la razón núcleo/citoplasma. Por otro lado, hemos observado fenómenos de oligotenia en la cromatina vegetativa. La cromatina macronuclear quistita esta constituida por cuerpos de estructura polig

El estudio de este proceso de diferenciación celular (enquistamiento), fue abordado a distintos niveles: 1- naturaleza del adn macronuclear vegetativo y quistico, por electroforesis convencional y electroforesis de campo pulsado. 2- cambios en el patrón de metilación durante el enquistamiento, utilizando endonucleasas de restricción y el inhibidor 5-azacitidina. 3- análisis estructural del macronucleo y cromatina por microscopia electrónica de transmisión (tem), microscopia confocal y citometria de flujo. Con los datos obtenidos, concluimos: 1-el adn macronuclear esta organizado por moléculas de tamaño subcromosomico, solo visualizables por electroforesis de campo pulsado, donde los genes ribosómicos se localizan en una banda discreta dentro del patrón electroforetico. El patrón electroforetico de colpoda inflata, es similar al de paramecium (población heterogénea y continua de moléculas de amplio rango de tamaños) y se aleja del mostrado por tetrahymena sp. Sin embargo, el tamaño promedio de las moléculas macronucleares es similar al de tetrahymena. 2- el genoma macronuclear parece presentar 5-metilcitosina y no 6-metiladenina. La desmetilacion de determinadas secuencias del adn macronuclear, supondría un mecanismo de apertura de los genes involucrados en el enquistamiento. Además, existiría una metilación selectiva de genes ribosomales macronucleares. 3- la cromatina macronuclear vegetativa es de naturaleza nucleosomal y esta constituida por numerosos cuerpos discretos de cromatina condensada. Presenta un nucleolo compuesto constituido por varias masas nucleolares, que en el enquistamiento se fusionan, originando una única masa nucleolar. También en el enquistamiento se produce una perdida de adn macronuclear en forma de cuerpo de extrusión, como un mecanismo para mantener la razón núcleo/citoplasma. Por otro lado, hemos observado fenómenos de oligotenia en la cromatina vegetativa. La cromatina macronuclear quistita esta constituida por cuerpos de estructura polig

Esta tesis representa diferentes aproximaciones moleculares para el estudio y búsqueda de genes específicos de enquistamiento en el ciliado colpoda inflata: aislamiento y posterior clonación de bandas especificas de arnm. Experimentos de sustracción y aislamiento de bandas diferenciales obtenidas del estudio de polimorfismos con cebadores arbitrarios. Finalmente, se obtuvo una sonda especifica a partir de un transcrito obtenido de adnc de la población quística que, aunque presente en todas las poblaciones de adnc estudiadas (vegetativos, prequisticos de 12 h, 18h, y 24 h) se acumula especialmente en el estado diferenciado o quiste de resistencia. Se presenta la secuencia obtenida de esta sonda y se discuten posibles interpretaciones sobre sus mecanismos de acumulación