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Trabajo presentado al: European Society of Veterinary Pathology. Atenas (Grecia), 7-10 septiembre.2022.

Trabajo presentado al: 73rd Annual Meeting of the European Federation of Animal Science (EAAP), p. 168. Oporto (Portugal), 5-9 de septiembre del 2022.

Marine mammals, regarded as sentinels of aquatic ecosystem health, are exposed to different pathogens and parasites under natural conditions. We surveyed live South American fur seals Arctocephalus australis and South American sea lions Otaria flavescens in Uruguay for Leptospira spp., canine distemper virus (CDV), Mycobacterium spp., Toxoplasma gondii, and Neospora caninum. Samples were collected from 2007 to 2013. The seroprevalence of Leptospira spp. was 37.6% positive, 50.9% negative, and 11.5% suspect for A. australis (n = 61) while for O. flavescens (n = 12) it was 67% positive, 25% negative, and 8% suspect. CDV RNA was not detected in any of the analyzed samples. Most animals tested seropositive to tuberculosis antigens by WiZo ELISA (A. australis: 29/30; O. flavescens: 20/20); reactivity varied with a novel ELISA test (antigens MPB70, MPB83, ESAT6 and MPB59). Seroprevalence against N. caninum and T. gondii was 6.7 and 13.3% positive for O. flavescens and 0 and 2.2% positive for A. australis respectively. To evaluate possible sources of infection for pinnipeds, wild rats Rattus rattus and semi-feral cats Felis catus were also tested for Leptospira spp. and T. gondii respectively. Water samples tested for Leptospira revealed saprofitic L. bioflexa. Pathogenic Leptospira were detected in the kidneys of 2 rats, and cats tested positive for T. gondii (100%). These results represent a substantial contribution to the study of the health status of wild pinnipeds in Uruguay., CSIC (Council for Scientific Research) of the Universidad de la Republica.

Trabajo presentado a la: XXXIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Lugo. O15. 15-17 junio.

Trabajo presentado al: 6th International Meeting on Apicomplexan Parasites in Farm Animals. P-33. Berna (Suiza), 5-7 de octubre., This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (PID2019- 104713RB-C22).

Trabajo presentado al: 7th EAAP International Symposium on Energy and Protein Metabolism and Nutrition (ISEP 2022). In: Animal Science Proceedings. Vol. 13 (3), p. 402. Granada (Spain). 12-15 septiembre., Alba Martín gratefully acknowledges receipt of a pre-doctoral grant (PRE2019-089288) from Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, ‘‘El FSE invierte en tu futuro”). This work was funded by MilkQua proyect PRIMA Section 2 Multitopics Call 2018 - Proyectos Intramurales CSIC (201940E115).

Trabajo presentado a la: XXXIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Lugo. O26. 15-17 junio.

Trabajo presentado a la: XXXIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Lugo. O19. 15-17 junio.

Trabajo presentado a la: XXXIII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Lugo. O31. 15-17 junio.

13 páginas, 11 figuras. The recognition of lesions of the mammary gland in small ruminants is a useful diagnostic procedure that can aid in the identification of several udder diseases. This article reviews the main pathological lesions in this organ in sheep and goats. Mastitis is, by far, the most commonly diagnosed change. Acute clinical mastitis is associated with bacterial infections, mainly Staphylococcus aureus or Mannheimia haemolytica. Lesions related to subclinical and chronic mastitis are also described, either as localized cases or as a part of systemic diseases such as contagious agalactia, maedi-visna or tuberculosis. Neoplasia is rare in the mammary gland of sheep and goats with sporadic mammary adenocarcinomas most commonly reported. Teat lesions, including those due to trauma, orf virus infection or papillomas, are predisposing factors for the subsequent development of mastitis.

Trabajo presentado al: 6th International Meeting on Apicomplexan Parasites in Farm Animals. O-30. Berna (Suiza), 5-7 de octubre.

Trabajo presentado a la: XXXII Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). 1 octubre. Congreso virtual.

Trabajo presentado al: 7th European Veterinary Immunology Workshop. Livestreaming. 29-31 agosto.

Publication, JRP-TOXOSOURCES

Trabajo presentado al: 4th ESVP, ECVP and ESTP Cutting Edge Pathology Congress. p. 144. 15-17 septiembre. Virtual meeting., This work has been funded by the research projects AGL 2015-66540-C2-1-R, RTI2018-099496-B-I00, LE259P18 and RTA 2017-00089-00-00

Trabajo presentado al: XXXI Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). IV Sesión, comunicación 04.4, pp. 42. Puerto de la Cruz, Tenerife, 12-14 junio de 2019., El objetivo de este estudio ha sido investigar la recrudescencia y la transmisión vertical en ovejas infectadas con Neospora caninum. Para ello, 13 ovejas infectadas, sincronizadas y monitorizadas serológicamente durante la gestación fueron sacrificadas tras la detección de un incremento de anticuerpos. Dos ovejas no infectadas fueron utilizadas como control. Se estudiaron las lesiones microscópicas en muestras fetales (encéfalo, hígado, pulmón, músculo esquelético y músculo cardiaco) y maternas (placentomas). Se detectó la presencia del parásito en 3 placentomas por animal y en tejidos fetales mediante PCR. Además, se caracterizó la respuesta inmunitaria en la placenta mediante inmunohistoquímica (CD4, CD8, CD21, CD3 y CMH-II) y qPCR (IFNγ, IL10, IL4, TNF, IL12, IL2, TGFβ e IL18). Se detectó un incremento en los niveles de anticuerpos y transmisión fetal entre los días 80 y 120 de gestación en 10 y 11 ovejas respectivamente, así como muerte fetal en 3 de ellas. Nueve de las 13 ovejas infectadas mostraron lesiones en placenta, formadas por focos de necrosis e infiltración de células mononucleares. Se detectaron lesiones en el 75% de los fetos estudiados (n=26) caracterizadas por necrosis en hígado, miositis en músculo esquelético y focos de gliosis con y sin necrosis central en encéfalo con presencia de quistes parasitarios. Se detectó ADN parasitario en el 60% de los fetos y en el 53% de las placentas. En cuanto a la respuesta inmunitaria en la placenta, la caracterización inmunohistoquímica demostró una mayor presencia de linfocitos T CD3+ (CD4/CD8, El trabajo ha sido financiado por el proyecto INIA RTA2014-00013.

Trabajo presentado al: Annual Conference of European College of Small Ruminant Healt Management (ECSRHM). Warsaw, Poland, 11 mayo, 2019., The present study was supported by INIA RTA2014-00013 grant.

Trabajo presentado al: 5th International Meeting on Apicomplexan Parasites in Farm Animals. ApiCOWplexa. Abstract book, P33. Berlín (Alemania), 2-4 octubre 2019.

Trabajo presentado al: . XXXI Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Libro de resúmenes, comunicación O4.3, pp. 41. Puerto de la Cruz, Tenerife, 12-14 junio de 2019., La toxoplasmosis es una de las principales enfermedades abortivas del ganado ovino que además supone un grave riesgo para la salud pública dado su carácter zoonótico. Los aislados del protozoo causante de esta enfermedad, Toxoplasma gondii, se han clasificado clásicamente en tres grupos de acuerdo a diversos marcadores moleculares y a su virulencia en modelos murinos. A pesar de ser un parásito conocido hace más de cien años y de que recientemente se están describiendo nuevos aislados que no encajan en los grupos tradicionalmente descritos asociados a una mayor virulencia en personas, aún se desconoce si los resultados observados en modelos experimentales en ratones se pueden extrapolar a otras especies. En este estudio se comparan los resultados obtenidos tanto en modelos in vitro como en infecciones experimentales en ratón y oveja con el fin de averiguar si estos son extrapolables entre los diferentes modelos. Para ello se han estudiado dos aislados: TgM49, aislado tipo II de referencia y uso común en laboratorios, y el TgSp1, también de tipo II pero obtenido recientemente y con un bajo número de pases en laboratorio. El aislado TgM49 mostro una alta virulencia tanto en cultivos in vitro como en los modelos murino gestante y no gestante, mientras el comportamiento del aislado TgSp1 en cultivo celular, donde predominaba la formación de quistes sobre la lisis celular, y en modelo murino, con escasa mortalidad, indicaron una virulencia baja. Sin embargo, al infectar ovejas gestantes no se observó diferencia, en cuanto a mortalidad fetal o carga parasitaria, entre los aislados, comportándose ambos con una virulencia elevada. Este estudio muestra que hay que tener cautela a extrapolar los resultados obtenidos in vitro o en modelos murinos otros modelos, como el ovino, al menos en cuanto a la virulencia del parásito se refiere., Este trabajo ha sido financiado por el proyecto de investigación AGL2016-75935-C2

Trabajo presentado al: XXXI Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). Libro de Resúmenes, I Sesión de Poster, P 33, pp. 83. Puerto de la Cruz, Tenerife, 12-14 junio de 2019

Comunicación oral presentada a la: XXX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). San Pedro del Pinatar, Murcia, 13-15 junio 2018., En noviembre de 2017 se remitió para la necropsia una coneja, cruce industrial, adulta (3 años). La lesión macroscópica más significativa se observó en la arteria aorta, arteria pulmonar y carótidas que aparecían como tubos rígidos y de color blanquecino. También se encontraban afectadas las arterias de las extremidades posteriores y en los riñones se observaron pequeños focos blanquecinos en la unión córtico-medular. Microscópicamente en la aorta ascendente, aorta abdominal, carótidas y arteria pulmonar se observó calcificación de fibras elásticas, focos de metaplasia cartilaginosa, ósea y formación de médula ósea. Las arterias musculares (coronarias, arqueadas renales, hepáticas, mesentéricas, uterinas, ováricas y de la musculatura esquelética) mostraban calcificaciones en la capa media. También se observaron calcificaciones focales en túbulos renales, esclerótica y cartílagos bronquiales. En la mucosa gástrica las glándulas aparecían atróficas por la presencia de amiloide. En conejas reproductoras la calcificación de la aorta es una lesión relativamente frecuente asociada a hipervitaminosis D, administración excesiva de suplementos minerales o lesión renal crónica. La edad también parece ser un factor de riesgo, siendo más frecuente en conejas con más de 2 años. Sin embargo, la metaplasia cartilaginosa y ósea con formación de médula ósea de arterias elásticas son alteraciones menos frecuentes. Aunque su patogenia aún no es clara, se ha sugerido que tanto células indiferenciadas de la capa media del vaso o los propios miocitos, células con gran plasticidad fenotípica, favorecen la formación de estos tejidos conectivos, más como resultado de la lesión previa que como una respuesta adaptativa. La calcificación arterial provoca hipertensión e insuficiencia cardíaca que unida a la pérdida de función gástrica (por amiloidosis) favoreció probablemente el estado de anorexia y emaciación del animal.

Trabajo presentado al: 14th International Colloquium on Paratuberculosis. Riviera Maya, México, 4-8 junio 2018.

Comunicación oral presentada a la: XXX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). San Pedro del Pinatar, Murcia, 13-15 junio 2018., En enero de 2018 se remitió para la necropsia una gata castrada, de raza Común Europeo, de 21 meses de edad, que fue remitida a una clínica veterinaria con palidez de mucosas, vómitos y mala condición corporal (2/5). El hematocrito (6,37%), hemoglobina (2,58 g/dl), número de glóbulos rojos (0,7x106 /mm3 ) y plaquetas (36x103 /mm3 ) eran muy inferiores a los normales, al contrario que los leucocitos (13,27x103 /mm3 ), linfocitos (6,8x103 /mm3 ), bilirrubina total (3,4 mg/dl) y transaminasas. Mediante ecografía se observó esplenomegalia. Dicho animal, negativo serológicamente a los virus de la inmunodeficiencia y leucemia felinas, falleció a las 8 horas de su ingreso en la clínica. En la necropsia se comprobó ictericia y hepatomegalia (“hígado azafranado”), esplenomegalia, con fractura esplénica, y hemoperitoneo. Los nódulos linfáticos gástricos, poplíteos e inguinales se encontraban aumentados de tamaño y la médula ósea tenía un color rojo y consistencia dura. En meninges y pulmón se observaron petequias y en el corazón hidropericardias con flóculos de fibrina. Microscópicamente en hígado, bazo, médula ósea y nódulos linfáticos destacaban infiltrados difusos de células voluminosas, esféricas, con núcleo redondo, cromatina finamente granular, nucléolo prominente y citoplasma relativamente abundante y basófilo. Eran frecuentes las mitosis, así como los fenómenos de apoptosis. Dichas células eran CD3 positivas y CD20 negativas. En la médula ósea el tejido hematopoyético aparecía sustituido por tejido fibroso (mieloesclerosis) y en el hígado (con colestasis y necrosis hepática centrolobulillar) y bazo se observó hematopoyesis extramedular. La mieloesclerosis es un proceso progresivo que suele estar asociado a esplenomegalia y hematopoyesis extramedular. La forma primaria es rara y la secundaria se ha relacionado con infecciones víricas o exposición a tóxicos que causan mielosupresión. En animales la leucemia linfoblástica de células T es un proceso rápido que cursa con anemia, trombocitopenia, fallo de la médula ósea y hepatoesplenomegalia.

5 páginas.-Trabajo presentado al: XLIII Congreso Nacional y XIX Internacional de La Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia (SEOC). Zaragoza, 19-21 septiembre 2018., La toxoplasmosis es una de las principales enfermedades infecciosas responsables de fallo reproductivo en el ganado ovino. Sin embargo, y a pesar de su importancia, no existen estudios que estimen el coste real que un brote de esta enfermedad puede tener en un rebaño, sobre todo de producción láctea, Por ello, en el presente trabajo se han calculado las pérdidas económicas de un brote de toxoplasmosis en una granja de ovino de producción lechera en manejo intensivo, que utiliza el programa G10 (MSD Animal Health®) para la gestión de todos los datos productivos y reproductivos. En febrero de 2017 abortaron 30 corderas durante el último tercio de gestación. Las pérdidas económicas se calcularon mediante la valoración de los lechazos no vendidos, la leche no ordeñada, la alimentación no amortizada en gestación y el diagnóstico veterinario. Teniendo en cuenta los costes y beneficios económicos en el momento del brote, éste supuso para el ganadero unas pérdidas económicas de 4393,2 euros (146,4€/aborto).

Comunicación oral presentada a la: XXX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). San Pedro del Pinatar, Murcia, 13-15 junio 2018., Los neutrófilos juegan un papel crucial en la eliminación de agentes patógenos durante la respuesta inmunitaria innata gracias a su capacidad fagocítica y a la producción de especies reactivas del oxígeno. Además, con el fin de eliminar agentes patógenos, los neutrófilos son capaces de generar unas fibras extracelulares compuestas por ADN, péptidos antimicrobianos, enzimas e histonas llamadas “trampas extracelulares de neutrófilos” (NETs). El estudio in vitro de dichas NETs se lleva a cabo a partir de neutrófilos de sangre periférica. No existe un consenso para el aislamiento de neutrófilos en pequeños rumiantes, existiendo diversas metodologías en la bibliografía. En el presente estudio se utilizaron dos gradientes de densidad (Lymphoprep™ y Percoll®) con diferentes concentraciones y combinaciones de las mismas, así como diferentes velocidades de centrifugación. La pureza del aislamiento se comprobó mediante tinción con “Diff-quick2. El uso de Lymphoprep™ permitió el aislamiento de poblaciones de neutrófilos con una pureza del 90% y una viabilidad del 98% mientras que con el Percoll® se aislaban tanto células mononucleares como neutrófilos y además el número de células era insuficiente para estimar su pureza. Para valorar la producción de NETs in vitro, se llevó a cabo su visualización microscópica empleando el marcador fluorescente DAPI y su cuantificación mediante la técnica fluorimétrica Quant-iT PicoGreen®, a partir de neutrófilos aislados de sangre de ovejas y cabras vacunadas y no vacunadas frente a Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map) tras su incubación con Staphylococcus aureus, Corynebacterium pseudotuberculosis, Map y Mycobacterium bovis. Se lograron visualizar NETs tras la infección con los diferentes agentes. Su cuantificación no arrojó diferencias significativas entre los animales vacunados y sin vacunar en ambas especies ni entre las distintas bacterias empleadas. Aunque se trata de un estudio preliminar, estos resultados sugerirían que la vacunación frente a Map no influiría en la respuesta de los neutrófilos frente a estos agentes.

Trabajo presentado al: 14th International Colloquium on Paratuberculosis. Riviera Maya, México, 4-8 junio 2018.

Comunicación oral presentada a la: XXX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). San Pedro del Pinatar, Murcia, 13-15 junio 2018., La forma aguda de la toxoplasmosis es una presentación clínica poco conocida que se ha descrito recientemente en infecciones experimentales de ovejas gestantes con Toxoplasma gondii en la que el aborto tiene lugar entre los 7 y los 14 días post-infección en ausencia del parásito en el feto o placenta, por lo que, en condiciones naturales, su diagnóstico es difícil. Hasta el momento, se han descrito casos esporádicos en los que la principal lesión encontrada ha sido la leucomalacia multifocal en el encéfalo de los fetos afectados. En este trabajo, se pretende realizar un estudio detallado de las lesiones encontradas en el sistema nervioso central de 28 abortos ovinos ocurridos en la fase aguda de la toxoplasmosis. Se llevó a cabo su caracterización en cuanto a localización, extensión y modificaciones de las poblaciones celulares (astrocitos, oligodendrocitos y microglia) asociadas mediante métodos histológicos convencionales e inmunohistoquímicos y análisis digital de imagen. La inmunotinción de la proteína precursora del β-amiloide permitió identificar áreas de leucomalacia fetal en un número mayor de secciones que la tinción con HE. Prácticamente la totalidad de las 4 secciones estudiadas en cada encéfalo, realizadas a nivel del cuerpo calloso, capsula interna, mesencéfalo y cerebelo presentaron leucomalacia y la extensión del área afectada llegó a alcanzar el 30% en algunas muestras. En cuanto a las poblaciones celulares, , un primer análisis de imagen llevado a cabo a pocos aumentos (x4) no mostró diferencias significativas entre animales infectados y no infectados. En un segundo análisis se empleó una técnica de doble tinción inmunohistoquímica que permitió visualizar simultáneamente la leucomalacia y las distintas poblaciones celulares. Las lesiones fueron analizadas a 200x, demostrándose una mayor cantidad de microglía y una evidente pérdida de oligodendrocitos en la lesión, así como una moderada astrocitosis en la zona adyacente, respecto a las mismas áreas de muestras de animales sanos. En cuanto al neuropilo adyacente a la lesión se observó astrocitosis, y un menor número de oligodendrocitos, al igual que en las zonas de lesión, respecto a los controles sanos. El presente trabajo ha permitido caracterizar las lesiones observadas en encéfalos fetales procedentes de abortos durante la fase aguda de la infección por T. gondii y pone de manifiesto que las células de la glía sufren variaciones asociadas a la lesión, Este trabajo ha sido financiado por los proyectos de Investigación AGL2016-75935-C2-2-R y LE080U16

Comunicación oral presentada a la: XXX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria (SEAPV). San Pedro del Pinatar, Murcia, 13-15 junio 2018., La neosporosis, asociada a la infección por N. caninum, es una enfermedad de gran importancia en el ganado vacuno y que clásicamente se ha considerado poco relevante en la especie ovina aunque, recientes trabajos, hacen que sea necesario reconsiderar su importancia. Un estudio encaminado a valorar la trasmisión vertical de la neosporosis en ovejas infectadas naturalmente reveló que, en ganado ovino, este parásito presenta una transmisión endógena muy eficiente. Además, el seguimiento de estas ovejas demostró que, al igual que ocurre en el ganado vacuno, los animales infectados pueden abortar, o transmitir el parásito a al feto, en sucesivas gestaciones. Es más, aquellas corderas infectadas congénitamente pueden a su vez transmitir la enfermedad a su descendencia. Esta enfermedad se asocia a fallo reproductivo que puede aparecer en forma de aborto o, más frecuentemente, como mortinatos o nacimiento de corderos débiles y muerte perinatal. El examen histológico de los fetos o corderos afectados muestra generalmente una gliosis multifocal leve acompañada de congestión y leucomalacia en grado variable. La presencia de quistes intracelulares parasitarios es frecuente y puede detectarse en tinciones teñidas con HE, aunque el marcaje inmunohistoquímico facilita su identificación. Recientemente, dentro de un estudio encaminado a valorar la frecuencia de abortos por toxoplasmosis, en cinco rebaños se ha diagnosticado neosporosis como principal causa de aborto, estando afectadas tanto razas cárnicas como lecheras y sistemas de producción intensivo y extensivo. Los fetos estudiados presentaban una encefalitis multifocal no purulenta leve y la presencia del parásito se confirmó mediante detección inmunohistoquímica y amplificación de ácidos nucleicos. El estudio serológico de los rebaños afectados mostró que, en el momento de diagnosticarse el aborto, más de un tercio de las ovejas del rebaño estaban infectadas. Los resultados de estos estudios muestran que la neosporosis ovina puede ser una enfermedad reproductiva relevante, con una alta tasa de trasmisión endógena y debe ser incluida en el diagnóstico diferencial de los abortos ovinos.

Trabajo presentado al: 9th International Sheep Veterinary Congress. (Harrowgate, Inglaterra (RU), 22-26 mayo 2017).

1 página.--Trabajo presentado al: XXIX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Póster: 8. Página 74. 14-16 de junio de 2017. Cáceres (España)., Este trabajo ha sido financiado por los proyectos de Investigación AGL2016-75935-C2-2-R y LE080U16

1 página.--Trabajo presentado al: XXIX Reunión de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Veterinaria. Póster 19, pág. 85. 14-16 de junio de 2017. Cáceres (España)., Este trabajo ha sido financiado por los Proyectos de Investigación AGL 2015-66540-C2-1-R, AGL2016-75935-C2-2-R y LE080U16.

Trabajo presentado al International meeting Apicowplexa. Apicomplexa in farm animals. 25 al 28 de octubre del 2012. Lisboa (Portugal)., Bovine besnoitiosis, caused by Besnoitia besnoiti, is a chronic and debilitating disease. The most characteristic clinical signs of chronic besnoitiosis are visible tissue cysts in the scleral conjunctiva and the vagina, thickened skin, and a generally poor body condition. However, many seropositive animals remain subclinically infected, and the role that these animals play in spreading the disease is not known. The aim of the present study was to assess the serological status, tissue distribution, and parasite load of subclinically infected animals. Histopathological, immunohistochemical and molecular analyses were performed using several tissues from the respiratory and reproductive systems, in addition to other internal organs and skin, from six cows that had exhibited scleral cysts and specific antibodies in the past but did not show any clinical signs at the time of slaughter. Tissue cysts were located primarily in the upper respiratory tract, i.e., the rhinarium and larynx/pharynx, were found in 4 cows. The next most common cyst locations were the distal genital tract (vulva/vagina) and the skin of the neck, found in 3 and 2 cows, respectively, out of the 4 cows showing cysts in the respiratory tract. We were unable to detect any parasite in the remaining 2 cows. Tissue cysts were located in the conjunctive tissue, and in two cows, these cysts were associated with a non-purulent inflammatory infiltrate consisting primarily of T lymphocytes. The correlation between the histopathological results and PCR was very good, although the latter was moderately more sensitive. The parasite burden, estimated based on the number of cysts and the quantitative real time-PCR results, was very low. It is noteworthy that the only animal that showed a recent increase in seropositivity showed the highest burden and the most conspicuous inflammatory reaction against the cysts. In conclusion, although these cows no longer displayed any visible signs of besnoitiosis, they remained infected and therefore may still be able to transmit the parasite.

Background Bovine besnoitiosis, caused by the protozoan Besnoitia besnoiti, reduces productivity and fertility of affected herds. Besnoitiosis continues to expand in Europe and no effective control tools are currently available. Experimental models are urgently needed. Herein, we describe for the first time the kinetics of standardised in vitro models for the B. besnoiti lytic cycle. This will aid to study the pathogenesis of the disease, in the screening for vaccine targets and drugs potentially useful for the treatment of besnoitiosis. Methods We compared invasion and proliferation of one B. tarandi (from Finland) and seven B. besnoiti isolates (Bb-Spain1, Bb-Spain2, Bb-Israel, Bb-Evora03, Bb-Ger1, Bb-France, Bb-Italy2) in MARC-145 cell culture. Host cell invasion was studied at 4, 6, 8 and 24 h post infection (hpi), and proliferation characteristics were compared at 24, 48, 72, 96, 120, and 144 hpi. Results In Besnoitia spp., the key parameters that determine the sequential adhesion-invasion, proliferation and egress steps are clearly distinct from those in the related apicomplexans Toxoplasma gondii and Neospora caninum. Besnoitia spp. host cell invasion is a rather slow process, since only 50 % of parasites were found intracellular after 3–6 h of exposure to host cells, and invasion still took place after 24 h. Invasion efficacy was significantly higher for Bb-France, Bb-Evora03 and Bb-Israel. In addition, the time span for endodyogeny to take place was as long as 18–35 h. Bb-Israel and B. tarandi isolates were most prolific, as determined by the tachyzoite yield at 72 hpi. The total tachyzoite yield could not be predicted neither by invasion-related parameters (velocity and half time invasion) nor by proliferation parameters (lag phase and doubling time (dT)). The lytic cycle of Besnoitia was asynchronous as evidenced by the presence of three different plaque-forming tachyzoite categories (lysis plaques, large and small parasitophorous vacuoles). Conclusions This study provides first insights into the lytic cycle of B. besnoiti isolates and a standardised in vitro model that allows screening of drug candidates for the treatment of besnoitiosis.

Bovine besnoitiosis caused by Besnoitia besnoiti is a chronic and debilitating disease. The most characteristic clinical signs of chronic besnoitiosis are visible tissue cysts in the scleral conjunctiva and the vagina, thickened skin and a generally poor body condition. However, many seropositive animals remain subclinically infected, and the role that these animals may play in spreading the disease is not known. The aim of the present study was to assess the intra-organ parasite distribution, the parasite load and the parasite-associated lesions in seropositive but subclinically infected animals. These animals were seropositive at the time of several consecutive samplings, had visible tissue cysts in the past and, at time of slaughter, had detectable specific anti-Besnoitia spp. antibody levels, but they did not show evident clinical signs at culling. Thus, histopathological, immunohistochemical and molecular analyses of several samples from the respiratory tract, reproductive tract, other internal organs and skin from six cows were performed. The tissue cysts were located primarily in the upper respiratory tract, i.e., in the rhinarium and larynx/pharynx (four cows), followed by the distal genital tract (vulva/vagina) and the skin of the neck (three and two cows, respectively, out of the four cows with cysts in the respiratory tract). We were unable to detect any parasites in the two remaining cows. Cysts were associated with a significant non-purulent inflammatory infiltrate consisting predominantly of T lymphocytes and activated monocytes/macrophages in two cows. The parasite burden, estimated by quantitative real-time PCR, was very low. It is noteworthy that the only animal that showed a recent increase in the antibody titre had the highest parasite burden and the most conspicuous inflammatory reaction against the cysts. In conclusion, although these cows no longer displayed any visible signs of besnoitiosis, they remained infected. Therefore, cows without visible signs of disease may still be able to transmit the parasite.