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Enzymes as immobilized derivatives have been widely used in Food, Agrochemical, Pharmaceutical and Biotechnological industries. Protein immobilization is probably the most used technology to improve the operational stability of these molecules. Bromelain (Ananas comosus) and papain (Carica papaya) are cystein proteases extensively used as immobilized biocatalyst with several applications in therapeutics, racemic mixtures resolution, affinity chromatography and others industrial scenarios. The aim of this work was to optimize the covalent immobilization of bromelain and papain via rational design of immobilized derivatives strategy (RDID) and RDID1.0 program. Were determined the maximum protein quantity to immobilize, the optimum immobilization pH (in terms of functional activity retention), was predicted the most probable configuration of the immobilized derivative and the probabilities of multipoint covalent attachment. As support material was used Glyoxyl-Sepharose CL 4B. The accuracy of RDID1.0 program´s prediction was demonstrated comparing with experimental results. Bromelain and papain immobilized derivatives showed desired characteristics for industrial biocatalysis, such as: elevate pH stability retaining 95% and 100% residual activity at pH 7.0 and 8.0, for bromelain and papain, respectively; high thermal stability at 30 °C retaining 90% residual activity for both immobilized enzymes; a catalytic configuration bonded by immobilization at optimal pH; and the ligand load achieve ensure the minimization of diffusional restrictions. Las enzimas inmovilizadas han sido ampliamente utilizadas en las industrias Alimentaria, Agroquímica, Farmacéutica y Biotecnológica. La inmovilización de proteínas es, probablemente, la tecnología más empleada para elevar la estabilidad operacional de estas moléculas. La bromelina (Ananas comosus) y la papaína (Carica papaya) son cisteín proteasas extensamente usadas como biocatalizadores inmovilizados con disímiles aplicaciones en la terapéutica, resolución de mezclas racémicas, cromatografía de afinidad, entre otros escenarios industriales. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la inmovilización covalente de las enzimas bromelina y papaína a través de la estrategia de diseño racional de derivados inmovilizados (RDID) y el programa RDID1.0. Se predijo la cantidad máxima de proteína a inmovilizar, el pH óptimo de inmovilización (en términos de retención de la actividad funcional), la configuración más probable del derivado inmovilizado y la probabilidad de enlazamiento covalente multipuntual. Como soporte de inmovilización de empleó Glioxil-Sepharose CL 4B. La precisión de las predicciones llevadas a cabo con el programa RDID1.0 fue validada comparando con los resultados experimentales obtenidos. Los derivados inmovilizados de bromelina y papaína mostraron características deseadas para la biocatálisis a nivel industrial, tales como: elevada estabilidad al pH reteniendo el 95% y 100% de actividad residual a pH 7.0 y 8.0, para la bromelina y la papaína, respectivamente; una elevada estabilidad térmica con la retención del 90% de actividad residual a 30 °C para ambas enzimas; al pH de inmovilización óptimo la configuración obtenida es catalíticamente competente; y la carga de ligando alcanzada asegura la disminución de las restricciones difusionales.

Fecha de solicitud: 25.01.2001.- Titulares: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).- Universidad Politécnica de Valencia., [EN]The invention concerns a support for enzymes and proteins and a combined material comprising the support and a protein or enzyme, which comprises an inorganic solid with anchor points for organic molecules, in which the inorganic solid is selected from amongst microporous materials, microporous materials also comprising a proportion of mesopores, mesopore materials also comprising a proportion of micropores and mesopore materials obtained by delaminating precursors having a laminar structure. Said support has an outer surface of over 500 m/g, a pore volume of more than 0.5 cm/g, and is formed at least by T and O atoms, wherein T is chosen from amongst Si, Ge, Sn, Al, B, Ga, Ti, Zr and combinations thereof and O is oxygen. The anchor points for the proteins and enzymes consist of T-R points, wherein R are functional groups bonded to T atoms on the outer surface of the solid support. [ES]Soporte para enzimas y proteínas y un material combinado que comprende el soporte y una proteína o una enzima, que comprende un sólido inorgánico con puntos de anclaje para moléculas orgánicas, en el que el sólido inorgánico está seleccionado entre materiales microporosos, materiales microporosos que también comprenden una proporción de mesoporos, materiales mesoporosos que también comprenden una proporción de microporos, y materiales mesoporosos, obtenidos por deslaminación de precursores con estructura laminar, y tiene una superficie externa superior a 500 m/g, un volumen de poro superior a 0,5 cm/g, y formado al menos por átomos T y O, donde T es está seleccionado entre Si, Ge, Sn, Al, B, Ga, Ti, Zr y combinaciones de los mismos, y O es oxígeno, los puntos de anclaje para proteínas y enzimas están constituidos por puntos T-R, en los que R son grupos funcionales unidos a átomos T en la superficie externa del soporte sólido.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de lectura: 23-04-2019, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 23-10-2020, Las aminas biógenas son compuestos tóxicos presentes en alimentos y bebidas fermentadas, como el vino, que llevan asociado un relevante problema de seguridad alimentaria; pueden causar problemas de salud además de alterar las propiedades organolépticas del alimento. Las amino oxidasas son las enzimas multiméricas capaces de llevar a cabo su degradación. Pese a que las enzimas son excelentes catalizadores en Química de Alimentos: modifican selectivamente un único substrato en una mezcla muy compleja en condiciones experimentales muy suaves, para su uso biotecnológico a escala industrial tienen que estar altamente optimizadas. En esta Tesis Doctoral se aborda la Ingeniería de catalizadores bi-enzimáticos inmovilizados para la degradación de aminas biógenas en vinos. Se pretende desarrollar nuevas estrategias de preparación de biocatalizadores bi-enzimáticos amino oxidasa/catalasa con muy buenas propiedades de actividad y estabilidad. Con ese fin, se utilizaron diferentes técnicas que permitieron estabilizar la enzima principal, la amino oxidasa de Pisum sativum. En primer lugar, se llevó a cabo su estabilización por unión covalente multipuntual a soportes glioxil-agarosa, a través de dos orientaciones diferentes. En segundo lugar, se abordó la estabilización de la enzima por sinergia de dos estrategias: la agregación de enzimas en condiciones suaves y la unión covalente multipuntual de agregados enzimáticos sobre soportes glioxil-agarosa. Todos estos derivados presentan alta estabilización respecto a la enzima soluble. Además, se buscó la estabilización adicional de los derivados inmovilizados de amino oxidasa por PEGilación intensa con modificación química mínima, utilizando polímeros dextrano-aldehído como andamio, consiguiendo una estabilización global del orden de miles de veces respecto a la enzima soluble. La eliminación del peróxido de hidrógeno, producido como subproducto en la reacción de oxidación de aminas biógenas, es un proceso clave ya que este puede inactivar la amino oxidasa y modificar otros componentes presentes en la matriz del alimento. Para ello, se diseñaron catalizadores bi-enzimáticos amino oxidasa/catalasa con diferentes distribuciones de las dos enzimas dentro de un sólido poroso. Se comprobó que la co-localización de las dos enzimas es clave para una eliminación instantánea del peróxido de hidrógeno en el interior de la estructura porosa del soporte. Siguiendo esta estrategia, se pudieron elaborar derivados co-localizados de muy alta carga enzimática con los que se evaluó la degradación de aminas biógenas en vino. Los resultados más relevantes mostraron una eliminación muy rápida del 95% de putrescina e histamina en vino sintético: siendo 80 veces más rápida con en biocatalizador bi-enzimático óptimo que con un catalizador mono-enzimático no óptimo de amino oxidasa., Biogenic amines are toxic compounds found in fermented foods, such as wine, that could cause a relevant problem of food safety as they cause health problems and could alter the organoleptic properties of food. Amine oxidases are the multimeric enzymes responsible of its degradation. Although enzymes are excellent catalysts for Food Chemistry, as they could selectively modify an unique substrate in a complex matrix under mild experimental conditions, they have to be optimized for its biotechnological use in industry. The main objective of this PhD Thesis has been developing the engineering of bi-enzymatic catalysts to degrade biogenic amines in wine. It is intended to carry out new strategies to prepare bi-enzymatic amine oxidase/catalase biocatalysts with improved activity and selectivity properties. In order to stabilize the principal enzyme (amine oxidase of Pisum sativum) different stabilization techniques were analyzed. First of all, its stabilization by multipoint covalent immobilization on glyoxyl agarose supports was accomplished via two different orientations. Secondly, it was studied the synergy between two strategies: enzyme aggregation under mild conditions and multipoint covalent attachment of enzymatic aggregates on glyoxyl agarose supports. All of these derivatives achieved very high stabilization factors in comparison with the soluble preparation of the enzyme. Furthermore, the aditional stabilization of immobilized amine oxidase by PEGilation with minimal chemical modification was intented, using dextran-aldehyde as scaffold, obtaining a global stabilization of a thousand times compared with the soluble enzyme. The decomposition of hydrogen peroxide, a byproduct of biogenic amine oxidation which is able to inactivate the amine oxidase enzyme and modify other food compounds, is a key process. Thus, different bi-enzimatic derivatives of amine oxidase and catalase with different distributions on porous supports were elaborated. The efficient and instantaneous elimination of hydrogen peroxide was achieved co-immobilizing and co-localizing both enzymes inside the structure of the porous support. Therefore, highly loaded co-localized biocatalysts were obtained and their efficacy against biogenic amine degradation in wine was probed. The best result was the rapid elimination of 95% of putrescine and histamine in synthetic wine, being the optimum bi-enzymatic catalyst 80 times faster than the mono-enzymatic biocatalyst of amine oxidase., CSIC. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CSIC. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica

Tesis Doctoral realizada en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular., [ES] Los compuestos bioactivos se definen como los componentes de los alimentos que influyen en las actividades fisiológicas o celulares de los humanos que los consumen. La principal desventaja de estos componentes es su baja biodisponibilidad, para resolver este problema la glicosilación por Glicosiltransferasas (GT) se presenta como la alternativa más prometedora al cumplir con los principios de la química verde. Las GT ofrecen control sobre la reactividad y la selectividad de la reacción. Sin embargo, a pesar de su utilidad sintética, estas enzimas han sido poco usadas en la biocatálisis industrial debido, principalmente al hecho de que son enzimas dependientes de azúcares activados con nucleótidos (Leloir), es decir, la glicosilación catalizada por estas enzimas necesita cantidades estequiométricas de un sustrato muy caro, la UDP-glucosa. En este punto, la regeneración del cofactor es crucial para que el proceso sea rentable. Las Sucrosa Sintasa (SuSy) son enzimas que sintetizan UDP-glucosa a partir de sacarosa y UDP. Para llevar a cabo estas reacciones altamente valiosas, la co-inmovilización y colocalización de ambas enzimas, GT y SuSy dentro de la estructura porosa de un único soporte sólido, promueve una simplificación drástica del proceso de glicosilación, porque la UDP-glucosa sintetizada por SuSy se transfiere a una GT vecinal; esta GT glicosila el compuesto diana, liberando una molécula de UDP que se transfiere de nuevo a una SuSy vecinal. Además, con el objetivo principal de reducir el coste de esta cascada enzimática, el cofactor fosforilado cargado negativamente (UDP) puede adsorberse en un polímero catiónico a través de interacciones de intercambio iónico. La co-inmovilización de ambas enzimas y el cofactor en un soporte poli-catiónico mejora la eficiencia de la reacción. En este biocatalizador, las enzimas inmovilizadas, SuSy y GT, serían catalíticamente activas y el cofactor (UDP) sería catalíticamente accesible pero mayoritariamente retenido en la misma fase sólida durante varios ciclos de reacción, logrando un biosistema de glicosilación muy efectivo, sin la necesidad de agregar nuevo cofactor al comienzo de cada reacción. En esta Tesis doctoral, se realizó la inmovilización y estabilización de dos GT, provenientes de Malus x domestica y de Oriza sativa y tres SuSy, una de Glicine max y dos de Acidithiobacillus caldus (wild type y una variante), con el propósito de encontrar las opciones más efectivas para diseñar y desarrollar sistemas bi-enzimáticos usando diferentes estrategias de inmovilización. El mejor candidato, el biocatalizador SuSyAcmut-UGT-Ag-PEI25, que combina el uso de la variante de SuSyAc y la inmovilización del cofactor UDP, se aplicó a la glicosilación de tres compuestos diferentes. Para la glicosilación de Piceido, se obtuvo un TTN de 50 después de 5 reacciones al 100% de glicosilación. En cuanto a la glicosilación de Quercetina, se alcanzó el 100% de glicosilación en las 4 primeras reacciones, disminuyendo al 60% en la quinta reacción, ofreciendo un TTN de 46. La glicosilación de Floretina fue prácticamente del 100% en 3 reacciones, alcanzando un TTN de 30., [EN] Bioactive compounds are defined as components of food that influence physiological or cellular activities in the animals or humans that consume them. The main concern about this components are their low bioavailability; to solve this special issue selective glycosylation by glycosyl transferases appears as the most promising alternative based in the green chemistry. Glycosyl transferases offers good control over reactivity and selectivity of the reaction. However, despite their perceived synthetic utility, these enzymes are yet to see widespread application in industrial biocatalysis due to the fact that they are sugar nucleotide-dependent (Leloir) Glycosyl transferases since glycosylation catalyzed by these enzymes needs stoichiometric quantities of a very expensive substrate UDP-glucose. At this point, the regeneration of the cofactor is crucial to generate a cost-efective process. Sucrose synthases (SuSys) are enzymes that synthesize UDP-glucose from sucrose and UDP. To perform these highly valuable reactions, the co-immobilization and co-localization of both enzymes, Glycosyl transferase and Sucrose synthase inside the porous structure of a unique solid support promotes a drastic simplification of the process of glycosylation because the UDP-glucose synthesized by SuSy is transferred to vicinal GT, this GT glycosylates the target compound, releasing a UDP molecule that is transferred to a vicinal SuSy. Furthermore, with the major aim of reduced the cost of these enzymatic cascade, the negative charged phosphorylated cofactor (UDP) can be adsorbed on a cationic polymer through ion-exchange interactions. Co-immobilization of both enzymes and the cofactor on this poly-cationic support strongly improves the glycosilation rates. In this biocatalyst, the immobilized enzymes, SuSy and GT, would be catalytically active and the cofactor (UDP) would be catalytically accessible but mostly retained on the same solid phase for several reaction cycles, achieving very effective glycosylation biosystem, without the necessity of add new cofactor at the beginning of each reaction. In this Thesis project, the immobilization and stabilization of two Glycosyl transferases, one from Malus x domestica and one from Oriza sativa and three Sucrose synthases, one from Glicine max and two from Acidithiobacillus caldus (wild type and one variant) was performed, in order to find the most efective options to desing and develop bi-enzymatic systems using different immobilization strategies. The best candidate, the Biocatalyst SuSyAcmut-UGT-Ag-PEI25, combining the use of the SuSyAc enzyme variant and the immobilization of the UDP cofactor, was applied to the glycosylation of three different compounds. For the glycosylation of Piceid, a TTN of 50 was obtained after 5 reactions reaching practically 100% of glycosylation. Regarding the glycosylation of Quercetin, almost 100% of glycosylation was achieved in the first 4 reactions, decreasing to 60% in the 5th reaction, offering a TTN of 46. The glycosylation of Phloretin was practically 100% in 3 reactions , reaching a TTN of 30.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 23-03-2018, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 23-09-2019, Xylo-oligosaccharides (XOS) have been described as prebiotics and display beneficial effects upon human health. The xylanase Xys1 , from Streptomyces halstedii JM8, was immobilized on glyoxyl-agarose beads by multipoint covalent attachment. The resulting immobilized Xys1 biocatalyst was 62-fold more thermo-stable than its soluble counterpart, and was used to catalyse the hydrolysis reaction of xylan for XOS production. A strategy based on surface coating with layers of polymers was developed to further increase the thermo-stability of this biocatalyst. The optimal modification consisted of surface coating with a bilayer formed by a layer of derived dextran polymer and a layer of polyethylenimine. The optimised biocatalyst was 550-fold more stable than the soluble Xys1 enzyme (at 70 ºC, pH 7). This optimised biocatalyst was used for production of xylo-oligosaccharides from soluble xylans of various sources in batch mode. Total reaction yields for beechwood, wheat and corncob xylan were 93% in 4 h, 44% in 5 h and 100% in 1 h, respectively. At these time points, xylan conversion yields to XOS were 65 % for beechwood xylan; 31% for wheat arabinoxylan; and 76% for corncob xylan. The optimised biocatalyst was reused for 15 reaction cycles of beechwood xylan hydrolysis without affecting its catalytic activity. To further increase the thermo-stability of the immobilized Xys1 biocatalyst, a strategy based on intensification of rigidification of the enzyme surface region involved in multipoint covalent attachment was developed. For this purpose, 1 4 additional lysine residues were introduced by substitution of native arginine residues to form 1 4 additional covalent bonds between enzyme and immobilization support. These covalent bonds, if formed, did not promote increased thermo-stabilizing effects, as they did not probably provide more intense rigidification of this enzyme surface area. Continuous flow reaction of corncob xylan hydrolysis for XOS production has been developed with an optimised packed-bed reactor (PBR). For this purpose, the xylanase Xys1 was immobilized by multipoint covalent immobilization on supports consisting of methacrylic polymer matrices previously functionalized with glyoxyl groups. The aim was to avoid enzyme leaching and to allow high flow rates since these supports display enhanced mechanical properties. The optimal support presented an area BET value of 69.5 m2/g and a narrow poresize distribution (80 nm pore size diameter). The resulting immobilized Xys1 biocatalyst onto this support displayed a maximum protein loading of 20 mg/g support, and high thermostability. A PBR was developed with this biocatalyst and used for continuous xylan hydrolysis at different flow rates. The specific volumetric productivity for XOS, 3,277 gXOS genzyme -1 h-1, was achieved at 10 mL/min flow rate with minimum production of xylose.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de Lectura: 10-06-2021, El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es estudiar la relación entre las diferentes estrategias de inmovilización de lipasas y las propiedades de los diferentes derivados obtenidos: actividad, estabilidad, selectividad. Inicialmente observamos que a concentraciones moderadamente altas de lipasas (p.e. 2 mg/mL) las enzimas solubles se encuentran mayoritariamente como agregados bimoleculares de dos estructuras abiertas de la enzima. A partir de este resultado desarrollamos estrategias para inmovilizar la forma abierta y la forma cerrada de la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL). La forma abierta se inmovilizó por adsorción interfacial sobre soportes hidrofóbicos, por adsorción iónica del agregado bimolecular y por inmovilización covalente del agregado bimolecular. La forma cerrada se inmovilizó covalentemente en presencia del surfactante CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio). Todos los derivados de las formas abiertas eran bastante más estables que el derivado de la forma cerrada. El derivado más interesante (adsorción hidrofóbica más recubrimiento con polialilamina) era 10 veces más activo que la enzima soluble diluida y 1800 veces más estable en experimentos de inactivación térmica. Diseñamos una nueva estrategia para fijar e inmovilizar selectivamente los agregados bimoleculares de TLL y de otras lipasas (Cándida antárctica fracción B, Rhizomucor miehie, Lecitase). En todos los casos, los derivados de los agregados eran bastante más estables que el derivado de la forma cerrada. El derivado más estable era el de la Lecitase que 100 veces más estable que el derivado de la Lecitasa cerrada., The main objective of this Ph.D. Thesis is the study of the relationship between different strategies for immobilization of lipases and the properties of the different derivatives. Firstly, it was observed that, by using moderate or high concentrations of soluble lipases (e.g., 2 mg/mL), the soluble enzymes are mainly forming bimolecular enzyme aggregates of two open structure of the lipases. From these results, different strategies for the immobilization of the open and closed structure of Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) were developed. The open structure was immobilized by adsorption of the isolated enzyme on hydrophobic supports, by ionic adsorption of the bimolecular aggregate on anionic exchangers and by covalent immobilization of bimolecular aggregates. The closed structure of TLL was immobilized by covalent immobilization of the isolated enzyme in the presence of CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide). All immobilized derivatives of the open structure of TLL were much more stable than the derivative of the isolated closed enzyme. The most interesting derivative (hydrophobic adsorption plus coating with poly-allyl-amine) was 10 fold more active (intrinsic activity) tan the diluted soluble enzyme and 1800 fold more stable in experiments of thermal inactivation. Finally, a new strategy for selective fixation and immobilization of bimolecular lipase aggregates was developed. TLL and other lipases were studied (Candida antarctica fraction B, Rhizomucor miehei, Lecitase). In all cases, these derivatives were quite more stable than the derivative of isolated closed enzyme. Bimolecular Lecitase was 100 fold more stable than the isolated closed enzyme.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-11-2018, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 28-05-2020

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Analítica y Ánalisis Instrumental. Fecha de lectura: 25-02-2014, Enzymes are versatile biocatalysts finding an increasing application in many industrial fields including fine and organic chemistry, pharmacy, cosmetics or food industry. The enzymes unsurpassed chemo-, regioand enantioselectivity characteristics are making them interesting as fine chemistry biocatalysts since the preparation of pure intermediates is a key step for many industrially relevant processes. However, when using non-natural substrates enzyme specificity may not be as high as required for industrial purposes requesting the need of improvement of this enzyme property, possible through very different techniques, like screening, controlled immobilization, enzyme engineering, directed evolution and rational design approaches, chemical modification or combinations thereof. Strategies for the selective and efficient chemical modification of proteins have been implemented successfully for the study and modulation of enzyme specificity. However, despite the efforts made the past years the site-directed incorporation of different moieties, like carbohydrates, peptides, polymers, DNA, etc. specifically to the required position at the enzyme remains a challenging task. Applying conventional methods of chemical modification on a protein attached covalently or reversible to a surface or matrix can provide an important simplification of current protocols of modification. The main objective of this Doctoral Thesis has been the development and implementation of new strategies of site-directed chemical modifications of proteins on solid phase to improve their catalytic properties. Joining genetic and chemical modification approaches 5 strategies were developed using immobilized lipases as model enzymes: - Chemical glycosylation of lipases on solid phase - Promotion of the open conformation o lipase by two cysteine ligation - Development of semisynthetic lipases conjugates - Active center redesign with non-natural moieties - Development of hybrid catalysts: lipase active-site anchoring of organometallics These strategies were successfully applied, obtaining modified proteins with quantitative yields in almost all the cases. These new modified lipases showed improved activity, regioselectivity, enantioselectivity in several important biotransformations. The strategies developed during this thesis combine simplified and easy handling of the enzyme during all modification steps with highly selective chemical modification protocol. Methods are potentially extendable to other proteins and fields therefore offering general strategies for obtaining improved enzyme variants applying solid-phase chemical modification strategies.

274 pg., In many industrial fields such as fine chemistry, pharmacy, cosmetology, agriculture, food,etc., the need for safer and purer products leads to the use of exquisite selective processes. This goal may be achieved by exploiting enzymes as catalysts since their excellent properties. Enzyme technology in the last decades has enabled the enzyme to catalyze industrial reaction due to the numerous advances in enzyme isolation, production, purification, stabilization, as well as the great efforts done on process design to optimize their use. Dehydrogenases (DHs), which depend on nicotinamide cofactors, are among the most interesting enzymes in biocatalysis because they perform selective reductions and specific oxidations that may be key steps in the synthesis routes for fine chemicals, such as pharmaceuticals, food additives, etc. The search of new DHs has been enormously encouraged in the last times resulting in an increased number of available ones. On the other hand, due to the high costs of the nicotinamide cofactors, their stoichiometric use is not acceptable from an economical point of view. For these reasons industrial application of these enzymes requires efficient in situ replenishment of the concomitant cofactor in its right oxidation state. Therefore, the use of simple and low cost purification systems, the use of enzymes from thermophilic microorganisms and the development of cost-effective systems for nicotinamide cofactors regeneration would overcome some of the limitation of DHs in order to apply them industrially.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 22-03-2012

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-01-2010

Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise e síntese de triacilgliceróis. Estas enzimas apresentam estabilidade em diversos solventes orgânicos, podendo ser aplicadas como biocatalisadores em vários processos anteriormente realizados apenas por catalisadores químicos. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e imobilizar lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono. Inicialmente, as condições de cultivo para produção de lipases foram otimizadas através de duas ferramentas de planejamento experimental: delineamento Placket Burman (P-B) e delineamento composto central rotacional (DCCR). Determinou-se que as melhores condições para produção desta enzima são: temperatura de 36 °C; pH 8,1; 30 g/L de glicerol; 3,0 g/L de óleo de oliva e 2,5 g/L de óleo de soja. Também se verificou ser possível a utilização de glicerol residual, oriundo da síntese enzimática de biodiesel como fonte de carbono. O extrato enzimático mostrou-se estável em três solventes orgânicos testados (metanol, etanol e η-hexano). Ainda visando a otimização das condições de cultivo, foram realizados cultivos submersos em biorreatores a fim de estudar a influência da taxa volumétrica de transferência de oxigênio (kLa) e do controle do pH, na produção da enzima. A maior produção de lipases ocorreu quando aplicado um kLa de 38 h-1 e com o pH controlado em 7,0 ao longo do cultivo, o que permitiu aumentar a produção da enzima em 5 vezes, em relação ao obtido nas condições anteriormente empregadas. A purificação da lipase foi realizada baseando-se no mecanismo de ativação interfacial destas enzimas sobre superfícies hidrofóbicas. Duas resinas foram testadas, octil-Sepharose e butil- Toyopearl. A lipase produzida foi purificada em apenas um passo utilizando esta última resina. Foi estudada a hiperativação da lipase purificada na presença de detergentes, a atividade lipolítica foi aumentada em 2,5 vezes na presença de 0,1% de Triton X-100. A lipase purificada foi imobilizada através de três estratégias: adsorção em suporte hidrofóbico; união covalente unipontual e união covalente multipontual. A influência da imobilização na modulação das propriedades da enzima foi estudada. A lipase apresentou maior estabilidade quando imobilizada multipontualmente. A hidrólise de distintos ésteres quirais pelos diferentes biocatalisadores obtidos também foi estudada. Os ésteres utilizados foram: (±) mandelato de metila, (±)-2-O-butiril-2-fenilacético e (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A especificidade da enzima foi muito dependente do método de imobilização, sendo que a lipase imobilizada unipontualmente foi mais específica para o substrato (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, enquanto que para os outros dois substratos foi a lipase adsorvida hidrofobicamente. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, levando a diminuição do custo na produção da enzima, que apresenta propriedades bastante interessantes para sua aplicação em biocatálise. Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis and synthesis of triacylglycerols. These enzymes show stability in many organic solvents, being able to be used as biocatalysts in some processes that were once carried out only by chemical catalysys. The aim of this research was the production, purification, and immobilization of lipase by Staphylococcus warneri strain EX17 using glycerol as carbon source. Initially, the cultivation conditions for the production of lipases have been optimized through two statistical procedures, Plackett-Burman statistical design (PB) and central composite design (CCD). It was determined that the best conditions for this enzyme production are: temperature, 36 °C; pH, 8.1; glycerol, 30 g/L; olive oil, 3.0 g/L; and soybean oil, 2.5 g/L. It was also studied the use of raw glycerol from enzymatic synthesis of biodiesel as carbon source, and stability studies showed that this lipase from S. warneri EX17 was stable in methanol, ethanol and nhexane. Moreover, experiments were conducted in submerged bioreactors in order to study the influence of oxygen volumetric mass transfer rate (kLa) and the control of pH in the production of the enzyme. The higher lipase production occurred when the microorganism was submitted to a kLa of 38 h-1 and the pH controlled at 7.0 during the cultivation, which improved 5-fold the enzyme production, compared to the results obtained in shaker flasks. The lipase purification was carried out based on mechanisms of interfacial activation of these enzymes on hydrophobic surface. Two supports were tested, octyl-Sepharose and butyl-Toyopearl. The lipase produced was purified 20-fold in only one step of purification. The purified lipase was immobilized on cyanogens bromide activated agorese and its hyperactivation in the presence of detergents was studied. The lipolytic activity increased 2.5-fold in presence of 0.1% of Triton X-100. After this, lipase was immobilized by three strategies: adsorption on hydrophobic support, mild covalent attachment, and multipoint covalent attachment. The stability over thermal, organic solvent and detergent inactivation was verified, as well as the influence of the immobilization protocol in the modulation of the properties of the enzyme. The lipase showed higher stability when multipointly immobilized on glyoxyl agarose. The hydrolysis of different chiral esters by the three biocatalysts obtained was also studied. The esters used were: (±) methyl mandelate, ((±) methyl mandelate, (±)-2-O-butyryl-2-phenylacetic acid, (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester. The specificity of the enzyme was highly dependent of the protocol of immobilization, and the lipase mildly immobilized on cyanogen bromide agarose was more specific to the hydrolysis of (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester, while for the other two substrates was the lipase adsorbed on octyl agarose. This study demonstrated that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using raw glycerol as carbon source, contributing to the reduction in production costs of the enzyme, and the enzyme, when immobilized on different supports, presented quite interesting properties that may be usefull as biocatalysts.

Tesis doctoral leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología Molecular; Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP/CSIC).-- Fecha de lectura: 19-01-2007, Los objetivos de la presente tesis doctoral son: Estabilización de la Glutaril acilasa mediante diferentes técnicas fisico-químicas, para su uso como biocatalizador industrial. Producción de 7-ACA desde Cefalosporina C mediante un a nueva ruta en ausencia de peróxido de hidrogeno mediante un sistema tri-enzimático con dos biocatalizadores distintos. Inmovilización-rigidificación de Penicila G acilasa mediante el desarrollo de nuevos soportes bifuncionales agarosa glioxil-tiol. Mejora de la síntesis cinéticamente controlada de antibióticos. Mediante técnicas de ingeniería del medio de reacción y técnicas de ingeniería del biocatalizador. Acoplamiento del proceso producción del 7-ACA desde cefalosporina C con la sínteisis de antibióticos semi-sintéticos en dos pasos y sin etapas de purificación intermedias.

Tesis doctoral inédita de la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de lectura : 13-07-2007

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura 10-01-2007

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 07-07-2004

Tesis doctoral del Departamento de Ingeniería Química Industrial y del Medio Ambiente, E.T.S.I. Industriales (UPM)., Las β-galactosidasas (EC.3.2.1.23), son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces galactosídicos β-1,4. Estas enzimas se encuentran distribuidas en la naturaleza en numerosos microorganismos, en plantas y en tejidos animales. Su aplicación fundamental está en las reacciones de hidrólisis de lactosa en productos y subproductos lácteos (leche, sueros de quesería, etc). El motivo fundamental de su aplicación radica esencialmente en dos postulados: 1.- Eliminación total de lactosa en leche, de gran interés, ya que constituye un contratiempo importante para personas que no son capaces de metabolizar libremente ese disacárido, ya sea, porque hayan perdido esa capacidad de forma hereditaria o por algún accidente de tipo metabólico. Este problema lo padece un porcentaje basante alto de la población mundial (en torno al 70%), siendo más severo en las poblaciones de raza negra. La supresión completa del hábito de ingerir productos lácteos, puede traer graves consecuencias al organismo humano, ya que este producto constituye la dieta fundamental para el aporte de muchas proteínas, vitaminas y otras fuentes de energía, con lo cual esta deficiencia puede, incluso provocar la muerte del individuo intolerante. 2.- A escala industrial, su eliminación constituye un importante avance, en la producción y maduración de quesos, ya que el proceso se vería acelerado al usar las bacterias responsables en los procesos fermentativos glucosa, más fácilmente dirigida, en vez de hacerlo con lactosa. Otra de las implicaciones industriales importantes radica en la eliminación de este disacárido en los residuos formados tras la producción de quesos. Estos residuos poseen una elevada DQO, cerca de 50 a 100.000 mg/L, lo que en términos medioambientales constituye un handicap importante (ahora que la legislación castiga severamente estas infracciones). Así, la búsqueda de enzimas capaces de ser aplicadas de forma simultánea con procesos químicos industriales que ocurren a elevadas temperaturas (dígase Pasteurización, UHT etc), se hace imprescindible, para mejorar la asepsia del proceso, ya que por un lado realizamos el tratamiento térmico y por el otro, el tratamiento microbiológico del mismo. Así aplicando técnicas de ingeniería genética para clonación de microorganismos termófilos, difíciles de crecer en fermentadores industriales en microorganismos mesófilos, facilita su fermentación y procesamiento a escala industrial, constituyendo un importante ahorro en términos económicos del proceso. Como la industria alimentar exige unas condiciones de pureza importantes, los proceso de purificación enzimáticas previos son necesarios. De esta forma, también se pudo acudir a técnicas de ADN recombinante para insertar un vector portador de una secuencia aminoacídica constituida por Histidinas, que deben interaccionar con soportes con quelatos metálicos, por afinidad, facilitando la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad a quelatos metálicos (IMAC). Posteriormente, se llevaron a cabo estudios para la inmovilización y estabilización de la proteína, (en soportes tipo sepabeads modificados con boronatos y/o con quelatos metálicos), facilitando así la recuperación final del catalizador y su reutilización, constituyendo también un ahorro económico., La realización de esta Tesis ha sido posible gracias a la concesión de una Beca por parte del Gobierno de la República de Angola, en el programa de formación de cuadros por parte del "Instituto Nacional de Bolsas de Estudos" adscrito al Ministerio de Educación y Cultura, bajo la dirección de los Doctores Alfonso Vicente Carrascosa Santiago, José Manuel Guisán Seijas y Alicia Larena Pellejero.