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Este trabalho apresenta como objetivo estudar o processo de imobilização da enzima β-galactosidase de Aspergillus oryzae por adsorção, utilizando como suporte resinas de troca iônica Duolite A-568, Duolite S-761, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C e Amberlite 252 Na. Através de resultados preliminares a resina Duolite A-568 apresentou melhor retenção de atividade enzimática, sendo assim foi utilizada no trabalho subseqüente. A influência da concentração da enzima e do pH no processo de imobilização foi estudada empregando um Planejamento Composto Central (PCC) fixando tempo de 12 horas e temperatura de 25°C. As condições ótimas de imobilização foram pH 4,5 e concentração de β-galactosidase de 16 g/L. A atividade da enzima imobilizada após 30 usos foi de 51% em relação à inicial. A retenção da atividade enzimática pode ser otimizada utilizando agentes reticulantes, entretanto este estudo não foi realizado, ficando então como sugestão para trabalhos futuros.

In this work was studied the immobilization process β-galactosidase from Aspergillus oryzae by adsorption and cross-linking with glutaraldehyde, using as carrier ions-exchangers such as Duolite A-568, Duolite S-761, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C and Amberlite 252 Na. Through innitial results, Duolite A-568 was choosed for the continuance of the work. The influence of the enzyme concentration and pH in the immobilization process was studied using a Central Composit Design (CCD) for a fixed time of 12 hours and temperature of 25°C. The optimal conditions for enzyme immobilization were pH 4,5 and galactosidase concentration 16 g/L. In the sequence, was studied the influence of glutaraldehyde concentration as cross-linking reagent and reaction time in the activity and in stability of the immobilized biocalyst, which were of 3,5 g/L and 1,50 h. The residual activity of the immobilized enzyme without cross-linking with glutaraldehyde after 30 uses was 51% as compared with the initial activity, while the enzyme immobilized with cross-linking was 90%. The immobilized enzyme with cross-linking presented higher pH stabilyt pH when compared to that without the referred treatment. The simultaneous influence of pH and temperature on the immobilized enzyme activity was studied through a PCC with the biocalyst produced in the optimized conditions of immobilization process. With the technique response surface it was possible to obtain the optimized pH of 4,1 and temperature of 34°C. The influence of the lactose concentration was studied in the range of 5 to 140 g/L and the Michaelis-Menten model was adjusted to the experimental results, with values of Vm and Km of 0,71 U and 12.07 g/L, respectively. In the study of the influence of the galactose as inhibitor of the lactose hydrolysis, the competitive inhibition model was adjusted to the experimental results and the values of Vm, Km and Ki were 0,77 U, 12,07 g/L and 4,94 g/L respectively. Neste trabalho estudou-se o processo de imobilização da enzima β-galactosidase de Aspergillus oryzae por adsorção e ligação cruzada com glutaraldeído, utilizando como suporte resinas de troca iônica Duolite A-568, Duolite S-761, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C e Amberlite 252 Na. Resultados preliminares da resina Duolite A-568 apresentaram melhor retenção de atividade enzimática, sendo assim a mesma foi utilizada para os trabalhos subsequentes. A influência da concentração da enzima e do pH no processo de imobilização foi estudada empregando um Planejamento Composto Central (PCC) fixando tempo de 12 horas e temperatura de 25°C. As condições ótimas de imobilização foram pH 4,5 e concentração de β-galactosidase de 16 g/L. Na seqüência, foi realizado um estudo da influência da concentração de glutaraldeído como agente reticulante e do tempo de reação na atividade e na estabilidade do biocatalisador imobilizado. A concentração de glutaraldeído que implicou em um biocatalisador de maior atividade enzimática foi de 3,5 g/L, num tempo de reação de 1,50 horas. A atividade da enzima imobilizada sem tratamento com glutaraldeído após 30 usos foi de 51% em relação à inicial, enquanto que a da enzima imobilizada com reticulação foi de 90%. A enzima imobilizada empregando ligação cruzada com glutaraldeído foi muito mais estável em relação ao pH quando comparada àquela sem o referido tratamento. A seguir foi realizado um estudo da influência conjunta da temperatura e do pH na atividade da enzima imbilizada por meio de um PCC, utilizando o biocatalisador produzido nas condições otimizadas de imobilização e ligação cruzada. Com o emprego da técnica de superfície de resposta foi possível otimizar, dentro das faixas estudadas, as variáveis pH igual a 4,1 e temperatura de 34°C. A influência da concentração de lactose foi estudada para uma faixa de 5 a 140 g/L e o modelo de Michaelis-Menten ajustou-se bem aos resultados experimentais, com valores de Vm e Km de 0,71 U e 12,07 g/L, respectivamente. No estudo da influência da galactose como inibidor da reação de hidrólise, o modelo que melhor se ajustou aos resultados experimentais foi o modelo de inibição competitivo, com valores de Vm, Km e Ki iguais 0,77 U, 12,07 g/L e 4,94 g/L respectivamente. Mestre em Engenharia Química

A indústria de laticínios tem participação expressiva no setor de alimentos, tendo a produção de produtos lácteos com teor de lactose reduzido pela enzima β-galactosidase, com crescente demanda. O custo destes produtos sem lactose é maior do que produtos lácteos com lactose devido a etapa de hidrólise enzimática empregando enzimas solúveis, assim o uso da β-galactosidase imobilizada surge como alternativa face ao alto custo de enzimas em sua forma livre. As pesquisas são continuamente direcionadas para se aperfeiçoar o biocatalisador, utilizando suportes e condições que viabilizem e melhorem o processo final. No primeiro momento da pesquisa foi realizado um estudo exploratório do efeito causado pela força iônica e pH no processo de imobilização por adsorção física em suporte Duolite A 568. Empregou-se elevadas concentrações da solução tampão Britton-Robinson (BR) de 300 mM a 1000 mM variando o pH entre 3,5 a 4,5 mantendo o tempo de imobilização em 2 horas. Durante os experimentos foi observado o surgimento inesperado de aglomerados (grânulos) enzimáticos, aos quais verificou-se relevante atividade enzimática de 719 (U) em pH 4,0 (300 mM), 767 U em pH 4,5 (300 mM) e 348 U em pH 4,0 (500 mM), com indicativo de possível imobilização livre de suporte. Para as condições de alta molaridade de tampão (1000 mM), os resultados não demonstraram melhora na atividade da enzima imobilizada. Na seqüência avaliou-se a influência conjunta da força iônica e tempo de imobilização em um planejamento composto central rotacional (PCCR) juntamente com a análise do processo de imobilização pelas respostas de rendimento, eficiência e recuperação. Na atividade hidrolítica da enzima β-galactosidase os melhores resultados foram entre 396 U a 470 U, que se concentraram em tempos curtos ou longos associados a condições de baixa força iônica, evidenciando o efeito de interação nas faixas estudadas entre a concentração do tampão BR (5,12 a 99,88) e tempo (0,46 a 6,12 horas). Nos parâmetros do efeito da análise do desempenho da imobilização em observação a maior atividade da enzima de 470 U em condições de 86 mM em 5,3h uma das melhores regiões obteve-se 91,01 de rendimento, 96,71 de eficiência e 88,01 de recuperação demostrando ser uma boa abordagem de aprofundamento em novas pesquisas. Esta pesquisa demostrou que a concentração da força iônica do tampão com tempos definidos e pH da composição do meio são parâmetros importantes que afetam o sítio ativo catalítico da enzima em sua estabilidade, podendo beneficiar ou inibir a atividade da enzima imobilizada. The dairy industry has expressive participation in the food sector, with the production of dairy products with lactose content reduced by the enzyme β-galactosidase, in increasing demand. Lactose-free products have a higher production cost than dairy products with lactose due to the enzymatic hydrolysis step using soluble enzymes, so the use of immobilized β- galactosidase emerge as an alternative to the high cost of enzymes in their free form Researchesare continuously directed to improve the biocatalyst, using supports and conditions that make the final process feasible and improved. At the first moment in the research, an exploratory study was carried out on the effect caused by ionic strength and pH in the process of immobilization by physical adsorption on Duolite A 568 support. High concentrations of the Britton-Robinson (BR) buffer solution were used, from 300 mM to 1000 mM, varying the pH between 3.5 to 4.5, keeping the immobilization time at 2 hours. During the experiments, the unexpected appearance of enzymatic clusters (granules) was observed, which showed relevant enzymatic activity of 719 (U) at pH 4.0 (300 mM), 767 U at pH 4.5 (300 mM) and 348 U at pH 4.0 (500 mM), indicating possible support-free immobilization. For high buffer molarity conditions (1000 mM), the results showed no improvement in the activity of the immobilized enzyme. In sequence, the joint influence of ionic strength and immobilization time in a central rotational composite design (PCCR) was evaluated together with the analysis of the immobilization process by the yield, efficiency and recovery responses. For the hydrolytic activity of the β-galactosidase enzyme, the best results were between 396 U to 470 U, which were concentrated in short or long periods associated with low ionic strength conditions, evidencing the interaction effect in the studied ranges between the BR buffer concentration (5. 12 to 99.88) and time (0.46 to 6.12 hours).In the parameters of the effect of the analysis of the immobilization performance in observation the highest activity of the enzyme of 470 U under conditions of 86 mM in 5.3h one of the best regions was obtained 91.01 of yield, 96.71 of efficiency and 88, 01 recovery proving to be a good approach to deepening in new research. This research demonstrated that the concentration of the ionic strength of the buffer with defined times and pH of the composition of the medium are important parameters that affect the catalytic active site of the enzyme in its stability, which can benefit or inhibit the activity of the immobilized enzyme. Dissertação (Mestrado)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Ethanol s sustainable growth, energy supply structure and fuel efficiency have resulted in more worldwide increases for ethanol use than for any other renewable fuel alternative to gasoline. Thus, the study of second generation ethanol (2GE) is one of the most important steps for the valorisation of byproducts that are generated from agrofood industry activities and for promoting better use of surplus sugarcane bagasse in ethanol production. The microorganisms that are able to produce cellulase complex enzyme can be found in various environments including the Brazilian Savanna (Cerrado) ecosystem, which comprises about 5% of the biodiversity in the world. The cerrado has significant potential for producing commercial enzymes by solid state fermentation (SSF) of various agro- industrial wastes and byproducts. In this doctoral thesis, 71 select strains of fungi from the Brazilian Savanna in Minas Gerais State (Triângulo Mineiro-MG) were processed using SSF from sugarcane bagasse and rice bran to produce crude enzyme complex (CEC). The CEC and Saccharomyces cerevisiae were used to produce ethanol from sugarcane bagasse. Six strategies to increase ethanol yield from sugarcane bagasse were evaluated and simultaneous saccharification and fermentation were optimised using a neural network. The following strategies were evaluated: a) CEC was extracted after SSF by employing different extractive mediums (cheese whey, Tween 80 and hydrolysed cheese whey); b) successive fermentations; c) fed-batch fermentation; d) co-fermentations using Saccharomyces cerevisiae followed by Pichia stipitis and reversing the order of fermentation; e) separated hydrolysis and fermentation and f) use of concentrated CEC. The CECs produced by Mucor racemosus Fresenius and Aspergillus niger showed propensities for producing ethanol. In this study, the combined use of CEC and these fungi resulted in 30.1 g/l of ethanol after 72 h of fermentation using mixed biomass of cheese-whey and sugarcane bagasse and CEC from Mucor racemosus Fresenius; 29.0 and 32.0 g/l from CEC produced by Mucor racemosus Fresenius and Aspergillus niger, respectively, after 120 h of sucessive fermentations; 20.6 g/l of ethanol using CEC produced by Aspergillus niger and concentrated by rotoevaporation. The neural network study showed that a maximum ethanol concentration of 12.6 g/l was achieved under the optimal conditions of 47 h, 88.4% of CEC, 36.6 °C, 34.6 g/l of inoculum and 250 g/L of sugarcane bagasse. Results indicate that ethanol concentrations correspond with studies, reported in the literature, of commercial enzymes produced under optimised conditions, which suggests the importance of screening new strains and using CEC in 2GE production. O etanol representa o combustível renovável, alternativo à gasolina, que mais cresce em volume de produção e uso, devido a sua eficiência, sustentabilidade e a necessidade da ampliação da matriz energética mundial. Assim, o estudo da produção de etanol de segunda geração (E2G) se mostra interessante pela possibilidade de se aproveitar resíduos agroindustriais e parte do excedente de bagaço de cana-de-açúcar das usinas na produção de etanol. Os microrganismos que produzem o complexo de celulase podem ser encontrados no em vários ecossistemas incluindo o Cerrado brasileiro que detém cerca de 5% da biodiversidade do planeta e é fonte de fungos utilizados na fermentação em estado sólido (FES) de resíduos agroindustriais e subprodutos para produção de enzimas variadas. Na presente tese avaliou-se o uso de 71 amostras de fungos selecionados no Cerrado do Triângulo Mineiro, na produção de extrato enzimático bruto (EEB) por FES de bagaço de cana pré-tratado a explosão a vapor e farelo de arroz destinado a fermentação via Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol de bagaço de cana. Seis formas distintas de produzir E2G com EEB foram estudadas e também foi feita a otimização das condições operacionais de fermentação com hidrólise simultânea a fermentação pelo uso de rede neural. As seis formas estudadas foram: a) o uso de diferentes meios de extração do complexo enzimático (solução de Tween 80, soro de queijo na forma hidrolisada e não hidrolisada); b) fermentações sucessivas; c) batelada alimentada; d) fermentação sequenciais com Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis nesta ordem e na ordem inversa (Pichia stipitis e Saccharomyces cerevisiae); e) hidrólise em separado da fermentação alcoólica (FA); f) concentração dos extratos enzimáticos. Entre os fungos avaliados, Mucor racemosus Fresenius e Aspergillus niger se destacaram na produção de complexos enzimáticos capazes de gerar maior produção de etanol, sendo que os melhores resultados associados à produção de etanol com hidrólise simultânea a fermentação foram: 30,1 g/L de etanol em 72h de FA com extrato enzimático de M. racemosus Fresenius no uso conjunto de biomassa de soro de queijo hidrolisado e celulose; nas FA sucessivas foi obtido aproximadamente 29,0 g/L e 32,0 g/L de etanol celulósico (120 h de FA) para enzimas produzidas por M. racemosus Fresenius e A. niger, respectivamente; e 20,6 g/L de etanol celulósico para processo realizado com uma única fermentação alcoólica por extrato enzimático (A. niger) concentrado por evaporação a vácuo em Rotaevaporador. O estudo de otimização das condições de FA utilizando rede neuronal mostraram como melhor resultado 12,6 g/L de etanol nas condições: diluição do extrato enzimático de 88,4%, temperatura de 36,6°C, teor de bagaço de 25% e 34,6 g/L de inóculo.Os resultados obtidos para CEC e fungos selecionados são satisfatórios quando comparados com os encontrados na literatura em estudos com enzimas comerciais em condições otimizadas, o que sugere que para a produção de E2G o trabalho de coleta e seleção de microrganismos e o uso de EEB são de grande importância na produção de E2G. Doutor em Engenharia Química

O café arábica é um dos produtos agrícolas de maior expressão dentro do mercado nacional de commodities e possui grande importância para a balança comercial nacional. É um produto no qual a qualidade sensorial está diretamente relacionada ao valor comercial no mercado final, então, aprimorar tal qualidade pode significar aumento da renda do cafeicultor e de toda a região na qual este produto foi produzido. O tipo de processamento desempenha papel fundamental nas características sensoriais finais do produto, e nesse contexto a etapa de fermentação se destaca na alteração da qualidade. Neste trabalho foi estudado a qualidade sensorial final e as características físico-químicas do café arábica, da cultivar Catuaí Amarelo IAC-62, produzido na região de Carmo do Paranaíba – Minas Gerais. O café colhido manualmente, no estágio de cerejas amarelas foi inoculado com a levedura Saccharomyces cerevisiae, para a fermentação. Foi realizado um Planejamento Composto Central Rotacional (PCCR), para avaliar a etapa de fermentação com relação às variáveis tempo e temperatura de fermentação, e obtendo como respostas pH da massa fermentativa, umidade do fruto (durante o processo), teor de açúcares e ácidos orgânicos (HPLC) e qualidade sensorial avaliada pela metodologia da Associação de Cafés Especiais (Specialty Coffee Association – SCA), em dois níveis de torra diferentes (média clara e média). Foram determinadas as equações de ajuste à nota final dos cafés, em ambos os níveis de torra proporcionando um primeiro passo para a otimização da etapa da fermentação em campo. Independente do ensaio realizado em +α ou -α, observou-se que os cafés, mesmo em níveis extremos de tempo e temperatura, se comportaram sensorialmente similares com relação às notas finais (no geral entre 81 e 85), sendo que todos foram classificados como cafés especiais. A concentração de frutose variou apenas com o tempo de fermentação e não com a temperatura, enquanto a sacarose e glicose decresceram com o avanço da temperatura e do tempo. O glicerol foi formado dependendo de ambas as variáveis, e sua concentração aumentou com o tempo e com o aumento da temperatura. O pH se comportou conforme foi descrito na literatura, decrescendo durante o avanço do tempo, porém mais intensamente com as maiores temperaturas. Alguns ácidos foram medidos ao final da fermentação como o acético, propiônico, succínico e lático. Na avaliação sensorial, os atributos aroma, uniformidade, ausência de defeitos e doçura não foram afetados pelas diferentes condições de fermentação, nem pelo tipo de torra. A acidez da bebida foi influenciada pela fermentação, nos experimentos de torra clara, e maiores extensões da etapa de fermentação parecem contribuir positivamente para este atributo. Além disso, o maior grau de torra parece provocar redução na acidez da bebida. O atributo corpo foi influenciado pela fermentação, mas não pela torra, enquanto o sabor residual foi influenciado por ambos. O equilíbrio da bebida também foi afetado pela fermentação, e graus mais elevados de torra parecem influenciá-la de forma negativa. Quanto à avaliação global, as temperaturas de fermentação mais elevadas aumentaram as notas deste atributo, mas o efeito de torra não pôde ser bem estabelecido. Por meio da Análise de Componentes Principais foi possível correlacionar aroma, sabor, acidez, corpo, sabor residual, equilíbrio e nota geral como os atributos que tiveram maior influência e alta contribuição para o perfil sensorial do café Arabica coffee is one of most expression agricultural products on national commodities market and has a great importance on national trade balance and it’s a product which sensorial quality is directly related to final commercial price, and so, increase such quality may mean an increase on coffee producer final income and such of entire coffee production region. Processing type plays an important role on final sensorial quality, and on this context, fermentation step stands out on quality changes. On this work, were studied the arabica coffee’s final sensorial quality and physicochemical characteristics, of a Yellow Catuai IAC 62, produced on Carmo do Paranaiba (Minas Gerais State) Region. Coffee fruits were handpicked, only ripe yellow cherries were selected, inoculated with Saccharomyces cerevisiae for fermentation. An experimental design were done by a Composite Central Rotational Design (CCRD) to evaluate fermentation process related to fermentation time and temperature and getting as responses fermentative mass pH, fruit moisture (just as process were conducted), sugars and organic acids content (HPLC) and sensorial quality by Specialty Coffee Association (SCA) on two different roasts levels (light medium roast and medium roast). There were determined fit equations to final coffee scores, on both roasts’ levels providing a first step for field process optimization. Independent of test (from – α to + α), it was observed that coffees, even in extreme time and temperature, behave sensorially similarly related to final scores (in general from 81 to 85 in SCA score table), being all of them classified as specialty coffees. Fructose content vary only with fermentation time and not with temperature, while sucrose and glucose contents decreased while time and temperature advances. Glycerol was formed depending on both variables, and its content increase with time and temperature increase. pH behaved just as described by literature, decreasing with time advance, and more intensely as temperature increases. Organic acids such as acetic, propionic, succinic and lactic were measured at final fermentation. Sensorial evaluation attributes such aroma, uniformity, clean cup were not affected by different fermentation conditions not by roast level. Coffee drink’s acidity was affected by fermentation, mainly on light roasts tests, and increase of time seams to positively contribute for this attribute. Besides, more intense roasts levels seem to provoke acidity attribute score decrease. Attribute body were influenced by fermentation, but not by roast level, while residual taste was influenced by both. Drink balance was also affected by fermentation, and on more intense roast levels seems to influence it negatively. As for the global evaluation, higher fermentation temperatures increased this attribute scores, but roast influence couldn’t be determinate. By Main Component Analysis were possible to correlate aroma, flavor, body, residual taste, balance and final score as those ones with greater influence on contribution for coffee’s sensorial profile. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Atualmente o Brasil é o segundo maior produtor mundial de etanol, apresentando uma posição favorável por apresentar vantagens na tecnologia de produção, como grandes áreas cultiváveis e condições climáticas favoráveis. Além disso, o Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, a qual é matéria-prima mais eficiente conhecida para a produção de etanol, sendo sua produção a partir do caldo de cana um processo bem estabelecido no país. Estes fatores, juntamente com a crescente demanda mundial por etanol, tornam o Brasil altamente competitivo na sua comercialização. O melaço, principal subproduto da indústria açucareira, apresenta elevadas concentrações de açúcares fermentescíveis, sendo por isso uma potencial matéria-prima para fins de produção de bioetanol. Com a finalidade de reduzir os custos de produção, estudos são impulsionados na direção de encontrar leveduras e processos alternativos que alcancem altos rendimentos e produtividades para a fermentação alcoólica. A utilização de leveduras floculantes na produção do bioetanol permite a eliminação da etapa de centrifugação, uma vez que estas leveduras são facilmente decantáveis na ausência de açúcares fermentescíveis. Adicionalmente, a tecnologia de fermentação sob alta concentração de açúcar, conduzida em batelada alimentada minimiza o efeito da inibição pelo substrato. O objetivo deste trabalho foi estudar as condições da fermentação em batelada alimentada, utilizando uma cepa de Saccharomyces cerevisiae de características floculantes em altas concentrações de melaço de cana-de-açúcar. Foi realizado um estudo da capacidade fermentativa e de floculação de quatro cepas floculantes, que resultou na escolha da cepa Saccharomyces cerevisiae C2/00, doada pelo Centro de Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA). Após a escolha da cepa foi determinado seu tempo de geração utilizando meio sintético, obtendo um valor igual a 1,071 h. Avaliou-se a influência da suplementação com os nutrientes (KH2PO4, MgSO4∙7 H2O, [NH4]2SO4 e extrato de levedura) na fermentação em batelada de meio à base de melaço de cana-de-açúcar em diferentes concentrações, obtendo a maior eficiência (85,4%) utilizando solução de melaço 30,0% v/v sem adição de nutrientes. Verificou-se também que a adição de nutrientes no meio fermentativo à base de melaço não melhora a eficiência do processo para concentrações de melaço acima de 20,5% v/v. A aeração na fermentação NG em batelada alimentada foi estudada como forma de melhorar o processo, entretanto a aeração favoreceu o crescimento celular em detrimento da produção de etanol. Posteriormente avaliou-se três fermentações, HG e VHG, com alimentação à base de melaço com concentrações diferentes de ART. O total de ART adicionado nas fermentações foi de 209, 222 e 250 g/L. A fermentação de 225 g/L de ART resultou em melhor eficiência (89,45%) com concentração final de etanol de 104,4 g/L enquanto a fermentação de 209 g/L de ART apresentou maior produtividade (2,98 g/(L.h)) dentre elas. A concentração máxima de etanol (P’máx) que a levedura C2/00 foi capaz de alcançar foi determinada, obtendo valor igual a 105,35 g/L. A partir dos dados experimentais da fermentação de 225 g/L foi proposto um modelo cinético, onde seus parâmetros foram determinados por meio do ajuste não linear dos dados. A velocidade específica máxima de crescimento foi de 0,555 h-1 com KS e KIS iguais a 2,63 e 12,437 g/L, respectivamente. Os resultados obtidos com os experimentos foram relevantes para a fermentação HG com melaço de cana-de-açúcar utilizando cepa floculante. Para aumentar a concentração de etanol final no vinho outras estratégias devem ser adotadas para que a levedura consiga suportar maiores concentrações de etanol. Currently Brazil is the second world's largest producer of ethanol, presenting a favorable position to present advantages in the technology of production, such as large cultivable areas and favorable climatic conditions. In addition, Brazil is the world's largest producer of sugarcane, which is the most efficient raw material known for the production of ethanol, being its production from sugarcane juice is a well-established process in the country. These factors together with the growing world demand for ethanol make Brazil highly competitive in its commercialization. Molasses, the main by-product of the sugar industry, has high concentrations of fermentable sugars, being therefore a potential raw material for the production of bioethanol. In order to reduce production costs, studies are promoted in the direction of finding yeasts and alternative processes that achieve high yields and productivities for alcoholic fermentation. The use of flocculent yeasts in the production of bioethanol allows the elimination of the centrifugation step, once these yeasts decant in the absence of fermentable sugars. Additionally, fermentation technology under high concentration of sugar, conducted in fed-batch, minimizes the effect of inhibition by substrate. The objective of this work was to study the conditions of fed-batch fermentation using a strain of Saccharomyces cerevisiae with flocculent characteristics in high concentrations of sugarcane molasses. A study of the fermentation and flocculation capacity of four flocculent strains was carried out, which resulted in the selection of the Saccharomyces cerevisiae C2/00 strain donated by the Center of Chemical, Biological and Agricultural Research (CPQBA). After the choice of the strain was determined its generation time using synthetic medium, obtaining a value equal to 1,071 h. It was evaluated the influence of supplementation with nutrients (KH2PO4, MgSO4∙7H2O, [NH4]2SO4 and yeast extract) in the batch fermentation of medium based on sugarcane molasses in different concentrations obtaining the highest efficiency (85.4%) using 30.0% v/v molasses solution without addiction of nutrients. It has also been verified that the addition of nutrients in the molasses based fermentation medium does not improve the efficiency of the process for molasses concentrations above 20.5% v/v. Aeration in the NG fermentation in fed-batch was studied as a way to improve the process, however aeration favored cell growth in detriment of ethanol production. Subsequently, three fermentations, HG and VHG, with molasses based feed with different concentrations of ART were evaluated. The total amount of ART added in the fermentations was 209, 222 and 250 g/L. Fermentation of 225 g/L of ART resulted in better efficiency (89.45%) with final concentration of ethanol of 104.4 g/L while fermentation of 209 g/L of ART showed higher productivity (2.98 g/(Lh)) among them. The maximum concentration of ethanol (P'max) that the yeast C2/00 was able to reach was determined, obtaining a value equal to 105.35 g/L. From the experimental data of the fermentation of 225 g/L a kinetic model was proposed, where its parameters were determined by means of the nonlinear adjustment of the data. The maximum specific growth rate was 0.555 h-1 with KS and KIS equal to 2.63 and 12.437 g/L, respectively. The results obtained with the experiments were relevant for HG fermentation with sugarcane molasses using flocculent strain. To increase the final ethanol concentration in the wine, other strategies must be adopted so that the yeast can withstand higher concentrations of ethanol. Dissertação (Mestrado)

No Brasil não há um consenso sobre a prevalência da intolerância à lactose, mas estima-se que 40% a 60% da população seja intolerante à lactose. Nos últimos anos, a indústria alimentícia desenvolveu uma ampla gama de produtos com lactose reduzida objetivando que uma pessoa intolerante não desista de consumir produtos lácteos. A produção de leite com redução de lactose é feita utilizando a enzima β-galactosidase que tem a capacidade de quebrar a lactose em glicose e galactose. Enzimas são catalisadores de alto custo e o seu uso torna o processo oneroso. A imobilização é um processo de retenção de uma biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico. A recuperação e reutilização de enzimas através de biocatalisadores imobilizados torna o processo economicamente viável, por isso tem sido considerada uma técnica promissora para tornar competitiva a aplicação de enzimas em larga escala. Neste trabalho foi estudada a imobilização da β-galactosidase de Bacillus licheniformis em resina de troca iônica. O processo de imobilização foi testado em resinas Duolite A568 e Amberlite XAD761, sendo que a Duolite A568 apresentou melhor retenção da atividade enzimática. A influência da concentração da enzima, do tempo e da presença do substrato no processo de imobilização foi testada preliminarmente. A melhor condição de imobilização foi: 43 mL.L-1 de enzima na solução de imobilização, 2 horas de reação e que o substrato no processo de imobilização não incrementou a atividade imobilizada. Na sequência foi avaliada a imobilização em diferentes tampões e forças iônicas e o tampão BR 20 mM foi escolhido para a sequência desta pesquisa por possuir uma ampla faixa de pH ajustável. Um Planejamento Composto Central Rotacional (PCCR) foi proposto para avaliar o processo de imobilização em relação as variáveis: concentração da enzima, força iônica e pH da solução de imobilização. As condições que maximizaram a resposta foram: força iônica de 40 mM, pH 4,0 e concentração da enzima em 43 mL.L-1. Posteriormente foi estudado a influência das ligações multipontuais na atividade da enzima imobilizada, utilizando solução tampão pH 9,0 a 25oC por 24 horas, e ligações cruzada com diferentes concentrações de glutaraldeído. Foi verificado que a etapa de estabilização interferiu drasticamente na atividade da enzima imobilizada, sendo inviável a utilização desta etapa nas condições experimentais deste trabalho. A reticulação com diferentes concentrações de glutaraldeído apresentou influência significativa na atividade da enzima imobilizada, sendo que maiores concentrações do glutaraldeído (3,5 g.L-1) impactou negativamente na atividade enzimática retida no suporte, mas demonstrou 92% e 69% de estabilidade em relação ao número de usos nas temperaturas de reação de 40ºC e 5ºC respectivamente. Por outro lado, a utilização de glutaraldeído em menor concentração (1,0 g.L-1) não afetou a atividade da enzima imobilizada e também não ofereceu boa estabilidade ao biocatalisador, atingindo a atividade relativa de 63% após 6 usos à 40oC e de 48% após 3 usos à 5oC. Por fim, os testes de armazenamento por 36 dias reafirmaram a teoria de que a utilização do glutaraldeído como agente reticulante melhora a estabilidade do biocatalisador imobilizado. In Brazil, there is no consensus about prevalence of lactose intolerance, although it is estimated to be between 40% and 60% of the population. In the last years, the food industry developed a wide range of lactose-reduced products aiming to allow the intolerant person to keep consuming dairy products. The lactose-reduced milk is produced with the enzyme β-galactosidase, which has the ability of breaking the lactose into glucose and galactose. Enzymes are expensive catalyzes and their use burdens the cost of the whole process. The retention of a biomolecule inside of a reactor or analytical system is called immobilization. The recover and reuse of enzymes through immobilized biocatalyzers makes the process affordable; so, the enzymatic immobilization has been considered the most promising method to turn the use of enzyme in large-scale more competitive. The aim of this work was the study of immobilization of β-galactosidase of Bacillus licheniformis in ion exchange resin. The immobilization process was tested in Duolite A568 and Amberlite XAD761 resins. The Duolite A568 showed better retention of the enzymatic activity and was chosen to be used at this study. The influence of enzyme concentration, duration and substrate presence in the immobilization process was tested previously. The best condition of immobilization was: 43 mL.L-1 of enzyme in the immobilization solution, 2 hours of reaction and the substrate didn’t improve the immobilized activity at this process. Then, the immobilization was evaluated in different buffers with diverse ionic strengths. The best result was obtained with BR 20 mM buffer because of its wide range of adjustable pH. A Central Composite Rotational Design (CCRD) was proposed to evaluate the immobilization process for the variables: enzymatic concentration, ionic strength and pH of the immobilization solution. The conditions that maximize the response are: ionic strength of 40 mM, pH 4.0 and enzymatic concentration of 43 mL.L-1. Then, the influence of multipoint attachment on the activity of immobilized enzyme was studied by using buffer solution pH 9.0 at 25oC for 24h. The influence of cross-linking through the use of glutaraldehyde in different concentrations as reticulant agent was also assessed. The stabilization step drastically impacted the activity of the immobilized enzyme, making the use of this step impossible at the experimental conditions of this study. The reticulation with different concentrations of glutaraldehyde showed significant influence on the activity of the immobilized enzyme; higher reagent concentrations (3.5 g.L-1) negatively impacted the enzymatic activity on the support, but showed stability of 92% and 69% related to number of uses in temperatures of reaction of 40oC and 5oC, respectively. On the other hand, the use of glutaraldehyde at lower concentrations (1.0 g.L-1) didn’t affect the activity of the immobilized enzyme and didn’t show good stability to the biocatalyzer, achieving the relative activity of 63% after 6 uses at 40oC and 48% after 3 uses at 5oC. At last, the storage tests for 36 days corroborated the theory that the use of glutaraldehyde as reticulant agent improves the stability of the immobilized biocatalyzer. Dissertação (Mestrado)

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais O setor energético é um dos campos de grande relevância econômica no Brasil e em diversos países no mundo. Nesse sentido, os combustíveis fosseis são os mais empregados, mas geram grandes impactos ambientais, além de serem uma fonte não renovável. Para substituir e suprir a grande demanda por combustíveis, o etanol de segunda geração, que é produzido a partir de resíduos ou subprodutos, tem sido uma alternativa promissora. No entanto, as usinas possuem desafios para tornar viável esta operação em larga escala. A biomassa utilizada como substrato é composta por um complexo de celulose, hemicelulose e lignina, sendo a lignina uma macromolécula que confere rigidez e impermeabilidade às células vegetais. Após a etapa de pré-tratamento, responsável pela quebra da lignina, a biomassa requer a hidrólise da celulose e da hemicelulose para disponibilizar os açúcares fermentescíveis para a fermentação. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar oito cepas de fungos para produção de complexo enzimático através de fermentação em estado sólido e estudar as melhores condições de processo (sistema de aeração forçada, composição do meio e tempo de fermentação) para a produção de celulases utilizando resíduos agroindustriais de farelo da casca do milho, bagaço de cana-deaçúcar, farelo da palha do arroz e resíduo da torra e trituração do café. As melhores condições de produção das celulases foram alcançadas com sistema sem aeração forçada, composição de substrato com 40% de bagaço de cana, 30% de farelo da casca do milho e 30% de resíduo do café e tempo de 72 horas de fermentação, utilizando os microrganismos Penicillium oxalicum e Trichoderma reesei, obteve-se atividade enzimática (FPase) 0,081±0,002 FPU/mL e 0,080±0,002 FPU/mL, respectivamente. Com a utilização do complexo enzimático obteve-se uma produção de etanol celulósico para Penicillium oxalicum de 3,13±0,21 g/L e Trichoderma reesei de 3,59±0,32 g/L de etanol, em fermentação batelada com Saccharomyces cerevisiae em 48 horas a 35°C. The energy sector is one of the fields of great economic importance in Brazil and in several countries in the world. In this sense, fossil fuels are the most used, but generate large environmental impacts, besides being a non-renewable source. Second-generation ethanol, which is produced from waste or by-products, has been a promising alternative to replace and supply the great demand for fuels. However, the plants have challenges to make this operation viable on a large scale. The biomass used as substrate is composed of a complex of cellulose, hemicellulose and lignin, with lignin being a macromolecule that gives rigidity and impermeability to plant cells. After the pre-treatment stage, responsible for the breakdown of lignin, the biomass requires the hydrolysis of cellulose and hemicellulose to make fermentable sugars available. Thus, the objective of this work was to evaluate eight fungal strains for the production of enzymatic complex through solid state fermentation and to study the best process conditions (forced aeration system, medium composition and fermentation time) for the production of cellulases using agroindustrial residues from corn husk meal, sugar cane bagasse, rice bran meal and roast residue and coffee grinding. The best conditions of cellulase production were achieved with a non-aerated system, substrate composition with 40% sugarcane bagasse, 30% corn husk meal and 30% coffee residue and 72 hours fermentation time using the microorganisms Penicillium oxalicum and Trichoderma reesei, enzymatic activity (FPase) was obtained 0.081±0.002 FPU/mL and 0.080±0.002 FPU/mL, respectively. With the use of the enzymatic complex, a cellulosic ethanol production for Penicillium oxalicum of 3.13±0.21 g/L and Trichoderma reesei of 3.59±0.32 g/L of ethanol was obtained in batch fermentation with Saccharomyces cerevisiae in 48 hours at 35°C. Dissertação (Mestrado) 2021-02-19

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The increase in energy consumption, depletion of fossil fuels and growing concerns about the environment have become strong justifications for energy generation applied to the use of biofuels. In expanding production of bioethanol by Brazilian plants, the incorporation of innovative processes and technological development have had a key role, with increased production efficiency and progressive reduction of environmental impacts and agricultural economy, especially with regard to reducing the volume of stillage, a byproduct of ethanol production. In this work was studied the yeast Saccharomyces cerevisiae Y904 resistance in alcoholic fermentation process operating in fed batch reactor by analyzing the effect of the reactor feeding time, temperature, concentration of inoculum and substrate on fermentation yield, productivity and concentration residual reducing sugars. Assays were carried out in a mini fermentor using a synthetic medium sucrose-based and yeast extract. The sugar and ethanol concentrations were determined by liquid chromatography (HPLC), and cell concentrations were determined by spectrophotometric method. Through a statistical analysis in Statistica 7.0 software was possible to determine the tracks that maximized the variables in the factorial experimental design and the Central Composed Design. As a result, it was found that the maximum concentration at which ethanol production thereof was completely inhibited (P\'max) was 137 g/L obtained at 25 °C. It was observed that using the condition that maximizes generated at the CCD variables, temperature 26 °C, 5 hours filling, 240 g/L concentration of ART and 35 g/L of inoculum concentration was obtained a value productivity of 6.0 g /Lh, 93% yield and 14.4 °GL in 10 hours of incubation, indicating that the optimization equations given and managed by the CCD describe the behavior of the fermentation process. With the yeast adapted at 4 °C, were obtained low time of fermentation and using sugarcane juice as the substrate using the same adapted yeast led to higher yields (94%) and productivity (10.1 g/L.h) when using the inoculum pH 2.5. Alcoholic fermentation using Saccharomyces cerevisiae yeast fed-batch reactor provided greater productivity and income when compared to data reported in the literature in which they used the same conditions studied in this work. O aumento do consumo de energia, o esgotamento dos combustíveis fósseis e o aumento das preocupações com o meio ambiente se tornaram fortes justificativas para geração de energia aplicada ao uso de biocombustíveis. Na expansão da produção de bioetanol pelas usinas brasileiras, a incorporação de processos inovadores e o desenvolvimento tecnológico cumpriram um papel essencial, com incremento da eficiência na produção e progressiva redução dos impactos ambientais e economia agrícola, principalmente no que diz respeito à redução do volume de vinhaça, subproduto da fabricação de etanol. Neste trabalho estudou-se a resistência da levedura Saccharomyces cerevisiae Y904 no processo de fermentação alcoólica operando em reator batelada alimentada, analisando o efeito do tempo de alimentação do reator, da temperatura, da concentração de inóculo e substrato sobre o rendimento fermentativo, produtividade e concentração residual de açúcares redutores. Os ensaios foram realizados em reator de bancada utilizando meio sintético à base de sacarose e extrato de levedura. As concentrações de açúcares e etanol foram determinadas por cromatografia líquida (HPLC), e as concentrações de células foram determinadas pelo método espectrofotométrico. Através de uma análise estatística realizada no Software Statistica 7.0 foi possível determinar as faixas que maximizaram as variáveis estudadas no planejamento fatorial e no planejamento composto central. Como resultado, observou-se que a concentração máxima de etanol na qual a produção do mesmo foi completadamente inibida (P máx) foi 137 g/L obtida em 25°C. Foi observado que utilizando a condição gerada no PCC que maximiza as variáveis estudadas, com temperatura de 26°C, 5 horas de enchimento, 240 g/L de concentração de ART e 35 g/L de concentração de inóculo, obteve-se um valor de produtividade de 6,0 g/L.h, 93% de rendimento e 14,4 °GL em 10 horas de fermentação, indicando que as equações de otimização fornecidas pelo PCC conseguiram descrever bem o comportamento do processo de fermentação. Com a levedura adaptada a 4°C, foram obtidos baixos tempos de fermentação e com o uso de caldo de cana como substrato empregando essa mesma levedura adaptada conduziu a altos rendimentos (94%) e produtividades (10,1 g/L.h) quando se utilizou pH de 2,5 no inóculo. A fermentação alcoólica, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae em reator batelada alimentada forneceu maiores produtividade e rendimento quando comparados a dados reportados pela literatura, nos quais utilizaram as mesmas condições estudadas neste trabalho. Mestre em Engenharia Química

Among the various renewable feedstocks available for ethanol fuel production, special emphasis has been given to sweet sorghum because the extracted juice of its stalk is composed of sucrose, glucose, fructose and can therefore be easily fermented to produce ethanol. In this paper we evaluate the behavior of the concentrations of sugars (sucrose, glucose, and fructose), nutrients (N, Ca, Mg, P) and starch in the juice from four sweet sorghum cultivars developed by Embrapa Maize and Sorghum (BRS 506, BRS 507, BRS 509, BRS 511) during time of maturation. The industrial use period was also determining the yield of cane and ethanol production using sweet sorghum juice in different planting dates. The cultivars showed different concentrations of sugars, industrial use period, and productivity between them as well as between the ages of plantings, showing influence of climatic conditions and the characteristics of each cultivar. All cultivars showed similar behavior with regard to nutrient content which were characterized by decreased concentration of nutrients throughout the analysis and increase in starch period. After fermenting both cultivars for 8 hours, it was found that cultivar BR 508 showed the best performance in terms of productivity (9.0 g/Lh) and yield (YP/ART = 90.5 %). Also, the feasibility of freezing the juice of sweet sorghum was verified and it was observed that after 30 days the levels of total sugars were reduced in their concentrations. Characterizations of sugar content were made in different parts of the stalk for the four cultivars and found that higher concentrations of total sugars are at the base of the stalk. Fermentations of the sorghum cultivars was carried out in order to evaluate the effectiveness of nutrient addition and stirring during fermentation process, which found that these two parameters did not add gains during fermentation. The fermented broths with different concentrations of sorghum sugar , in comparison with the juice of sugar, in order to evaluate the effect of different concentrations of total sugar (160, 180, 220, 260, and 300 g/L) yield the fermentation. It was found that with increasing sugar concentration, it did not increase the production of ethanol to concentrations of 160, 180, 220, and 260 g/L and the concentration was reduced to 300 g/L, showing inhibition on ethanol production when using sorghum broth with increased initial concentration of sugar and it has been found that yield and productivity in 8 hours of fermentation broth for the sorghum was from 0.8 to 4.8% and from 2 to 3.7% higher fermentations sugarcane juice under the same conditions. Reviews the use of enzyme a-amylase and amyloglucosidase the enzymatic hydrolysis of the juice in the juice of this sweet sorghum starch were made. It was noticed that the joint action of the addition of the two enzymes in the broth provided greater hydrolysis of starch present in the juice of sweet sorghum, an increase of 1.67 gallons of ethanol per ton of processed sweet sorghum . Dentre as diversas matérias-primas renováveis disponíveis para produção de etanol, especial destaque vem sendo dado ao sorgo sacarino, pois o caldo extraído de seus colmos é composto por sacarose, glicose, frutose e podem, portanto, ser facilmente fermentados para produção de etanol. Neste trabalho avaliou-se o comportamento das concentrações de açúcares (sacarose, glicose e frutose), nutrientes (N, Ca, Mg, P) e amido no caldo do sorgo sacarino de 4 cultivares desenvolvidas pela Embrapa Milho e Sorgo (BRS 506, BRS 507, BRS 509, BRS 511) durante o seu período de maturação. Foi determinado também o período de utilização industrial, a produtividade dos colmos e a produção de etanol utilizando o caldo de sorgo sacarino em diferentes épocas de plantio. As cultivares apresentaram diferentes concentrações de açúcares, período útil industrial e produtividades entre si e entre as épocas de plantios, evidenciando influência das condições climáticas e das características de cada cultivar. Todas as cultivares apresentaram comportamentos similares com relação aos teores de nutrientes que foram caracterizados pela diminuição da concentração de nutrientes ao longo do período analisado e aumento na concentração de amido. Após 8 horas de fermentação alcoólica do caldo das cultivares, verificou-se que a cultivar BR 508 apresentou o melhor desempenho em termos de produtividade (9,0g/L.h) e rendimento (YP/ART = 90,5%). Também verificou-se a viabilidade do congelamento do caldo do sorgo sacarino e foi observado que após 30 dias, os teores de açúcar total sofreram redução em suas concentrações. Foram feitas caracterizações dos teores de açúcares em diferentes partes dos colmos para as quatro cultivares e constatouse que maiores concentrações de açúcar total encontram-se na base dos colmos. Foram realizadas fermentações alcoólicas a fim de avaliar o efeito da adição de nutrientes e de agitação durante a fermentação e verificou-se que estes dois parâmetros não acrescentavam ganhos durante a fermentação. Fermentaram-se caldos de sorgo sacarino com diferentes concentrações de açúcares, de forma comparativa com o caldo de açúcar, afim de avaliar o efeito de diferentes concentrações de açúcar total (160, 180, 220, 260 e 300 g/L) no rendimento da fermentação. Foi verificado que com o aumento da concentração de açúcar não houve aumento na produção de etanol para as concentrações de 160, 180, 220 e 260 g/L e houve redução para a concentração de 300 g/L, mostrando inibição na produção de etanol quando utilizou-se caldo com maior concentração inicial de açúcar e verificou-se que o rendimento e a produtividade em 8 h de fermentação para o caldo de sorgo foi de 0,8 a 4,8 % e de 2 a 3,7 % superior as fermentações do caldo de cana nas mesmas condições. Foram feitas avaliações da utilização da enzima a-amilase e amiloglicosidase na hidrólise enzimática do amido presente no caldo do sorgo sacarino. Verificou-se que a ação conjunta da adição das duas enzimas no caldo proporcionou uma maior hidrólise do amido presente no caldo do sorgo sacarino, com aumento de 1,67 litros de etanol para cada tonelada de sorgo processada. Doutor em Engenharia Química