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Orientador: Maricilda Palandi de Mello Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Síndrome Nefrótica (SN) é a principal doença renal na infância, sendo caracterizada por proteinuria, edema, hipoalbuminuria e hiperlipidemia. Usualmente é classificada de acordo com a idade em que se apresenta em Congênita (SNC), quando se manifesta intraútero ou durante os primeiros três meses de vida, Infantil durante o primeiro ano de vida, na Infância, entre o primeiro ano até os 12 anos de idade e Juvenil, entre os 12 e os 18 anos de idade, aproximadamente. De acordo com a resposta ao tratamento com corticoesteróides os pacientes podem ser divididos em córtico-resistentes (CR), córtico-sensíveis (CS) ou córtico-sensíveis com recidiva frequente (CS,RF). Uma disfunção na barreira de filtração glomerular leva às manifestações clínicas decorrentes da síndrome, tais como proteinúria maciça na urina. Mutações em diversos genes vêm sendo correlacionadas com a SN em crianças. No entanto, os genes mais estudados e responsáveis pela maioria dos casos são os genes NPHS1, NPHS2 e WT1. Os objetivos deste trabalho foram identificar e verificar a distribuição de mutações nestes três genes em uma casuística brasileira com SN ou proteinúria isolada e avaliar cada alteração identificada utilizando diversas predições in silico, com o intuito de se esclarecer suas respectivas funções biológicas. Para isto foi realizada a análise molecular de 150 crianças e adolescentes, sendo três não aparentados com SNC e os demais 147 com SN Infantil, SN na infância, SN juvenil e proteinúria isolada, dos quais 134 eram não aparentados. Além destes 150 pacientes, também foram analisados os materiais de biópsias renais fixadas em bloco de parafina de sete pacientes que já foram a óbito com SNC. Para verificar a segregação alélica nas famílias, para os casos nos quais foram identificadas alterações, a análise molecular dos pais foi realizada, quando possível. Um grupo controle de indivíduos saudáveis foi incluído para se avaliar a frequência de alterações não depositadas em bancos de dados. No estudo do gene NPHS1 para os casos com SNC identificamos mutações missense, frameshift e em região de splicing nos três pacientes encaminhados no período da tese e em um dos materiais proveniente de biópsia renal. Assim, um total de quatro pacientes com SNC apresentaram mutações que se correlacionam com o grave quadro clínico apresentado. Para os pacientes com SN infantil, SN infância/juvenil e proteinúria isolada, foram triados o gene NPHS2 e os éxons 8-9 do gene WT1. No estudo do gene NPHS2 foram identificadas duas alterações em heterozigose nos padrões de herança autossômica recessiva em 2,7% (4/147), todos CR, enquanto que apenas uma alteração em heterozigose simples foi identificada em 9,5% (14/147) em casos de SN com apresentação menos grave e tardia. Em três dos 14 pacientes com uma alteração no gene NPHS2, alterações no gene NPHS1 foram também identificadas, todas já descritas como polimorfismos frequentes na população em geral. Para o gene WT1, com herança autossômica dominante, foram identificadas mutações em heterozigose simples em 2,04% (3/147). A avaliação da frequência e distribuição de mutações nestes genes em crianças com SN é inédita no Brasil e traz um direcionamento para a análise molecular de grupos específicos das crianças com SN. Além disto, este trabalho contribui para o estabelecimento das bases moleculares da doença na população brasileira, o que tem uma repercussão importante na conduta dos pacientes, uma vez que, nos que apresentam mutações, pode-se considerar o transplante renal a partir de doador vivo, pois para estes considera-se um risco menor de recidiva de glomérulo esclerose focal e segmentar após transplante do que para pacientes sem mutações Abstract: Nephrotic syndrome (NS) is the main kidney disease in children. It is characterized by proteinuria, edema, hypoalbuminemia and hyperlipidemia. Acccording to the age of the diagnosis, it is usually classified as Congenital (CNS) when it manifests in utero or during the first three months of life, Infantile when the event occurs during the first year of life, in Childhood when symptoms occur between one year and 12 years and Juvenile, with onset between 12 and 18 years old. NS is traditionally separated on the basis of the response to standard steroid treatment as steroid-resistant (SRNS), steroid-sensitive (SSNS) or steroid sensitive with frequent relapses. A dysfunction in the glomerular filtration barrier leads to the characteristic clinical manisfestations of the syndrome such as massive loss of essential proteins in the urine. Mutations in different genes have been associated with NS in children. However, the most studied genes are NPHS1, NPHS2 and WT1, which are responsible for the great majority of the cases. The aims of this study were to identify and verify mutation distributions in those three genes in a Brazilian cohort with NS or isolated proteinuria and to characterize each identified variation by using different in silico prediction programs in order to understand its biological functions. For that, we performed molecular analyses of 150 children and adolescents, being three unrelated children with CNS and the remaining 147 with Infantile, Childhood, Juvenile NS and isolated proteinuria, being 134 unrelated. Besides those 150 patients, paraffin-embebbed renal biopsies of seven patients who had died from CNS have been also analysed. To verify allelic segregation in the family, molecular analyses were also held, whenever possible, for parents of patients in whom mutations were identified. A healthy control group was included in the study to evaluate the frequency of alterations that were absent in the databanks. In the NPHS1 study for CNS cases, we identified missense, frameshift and splicing mutations in the three patients included during the thesis project and in the paraffin-embedded renal biopsy tissue of a patient who had died of CNS. Therefore a total of four CNS cases bore mutations that are associated with the disease. NPHS2 gene and exons 8-9 of WT1 were screened for the 147 patients with infantile NS, childhood/juvenile NS and isolated proteinuria. In the NPHS2 study, two heterozygous alterations compatible to an autossomal recessive inheritance have been identified in 2,7% (4/147), all of the cases were SRNS; whereas, only one heterozygous alteration was identified in 9,5% (14/147), such cases had a less severe and late onset form of NS. Three out of those 14 patients presented sequence variations also in NPHS1 gene, but they have been described as neutral polymorphisms. For the WT1 gene whose mutations present a dominant pattern of inheritance, heterozygous alterations have been identified in 2,04% (3/147). This is the first study focusing frequency evaluation and mutation distribution in Brazilian children with NS and provides a guidance to the molecular analysis of specific case groups of SN. Moreover, this work contributes to the establishment of the molecular bases of this disease in the Brazilian population, what reflects mainly in the conduction of patients, since those bearing mutations can be considered for receiving a kidney from a living donor, because for them it is considered a lower risk of recurrent focal segmental glomerulosclerosis after kidney transplant than for patients without mutations Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular

Nephrotic syndrome is one of the most common kidney pathologies in childhood, being characterized by proteinuria, edema, and hypoalbuminemia. In clinical practice, it is divided into two categories based on the response to steroid therapy: steroid-sensitive and steroid resistant. Inherited impairments of proteins located in the glomerular filtration barrier have been identified as important causes of nephrotic syndrome, with one of these being podocin, coded by NPHS2 gene. NPHS2 mutations are the most frequent genetic cause of steroid resistant nephrotic syndrome. The aim of this review is to update the list of NPHS2 mutations reported between June 2013 and February 2017, with a closer look to mutations occurring in Latin American countries.

Frasier syndrome (FS) is characterized by gonadal dysgenesis and nephropathy. It is caused by specific mutations in the Wilms' tumor suppressor gene (WT1) located in 11p23. Patients with the 46,XY karyotype present normal female genitalia with streak gonads, and have higher risk of gonadal tumor, mainly, gonadoblastoma. Therefore, elective bilateral gonadectomy is indicated. Nephropathy in FS consists in nephrotic syndrome (NS) with proteinuria that begins early in childhood and progressively increases with age, mainly due to nonspecific focal and segmental glomerular sclerosis (FSGS). Patients are generally unresponsive to steroid and immunosuppressive therapies, and will develop end-stage renal failure (ESRF) during the second or third decade of life. We report here four cases of FS diagnosis after identification of WT1 mutations. Case 1 was part of a large cohort of patients diagnosed with steroid-resistant nephrotic syndrome, in whom the screening for mutations within WT1 8-9 hotspot fragment identified the IVS9+5G>A mutation. Beside FS, this patient showed unusual characteristics, such as urinary malformation (horseshoe kidney), and bilateral dysgerminoma. Cases 2 and 3, also bearing the IVS9+5G>A mutation, and case 4, with IVS9+1G>A mutation, were studied due to FSGS and/or delayed puberty; additionally, patients 2 and 4 developed bilateral gonadal tumors. Since the great majority of FS patients have normal female external genitalia, sex reversal is not suspected before they present delayed puberty and/or primary amenorrhea. Therefore, molecular screening of WT1 gene is very important to confirm the FS diagnosis. Arq Bras Endocrinol Metab. 2012;56(8):525-32 A síndrome de Frasier (SF), caracterizada por disgenesia gonadal e nefropatia, é causada por mutações específicas no gene supressor do tumor de Wilms (WT1) localizado em 11p23. Pacientes com cariótipo 46,XY apresentam genitália feminina normal com gônadas disgenéticas e alto risco de tumor gonadal, principalmente o gonadoblastoma. Por isso, a gonadectomia bilateral eletiva está indicada. A nefropatia na SF consiste de síndrome nefrótica com proteinúria que se inicia na infância e aumenta progressivamente com a idade, principalmente devido à glomeruloesclerose focal e segmentar (GESF). Esses pacientes não respondem ao tratamento com esteroides e imunossupressores e desenvolverão insuficiência renal crônica durante a segunda ou terceira década de vida. Neste trabalho, são relatados quatro casos de SF cujo diagnóstico foi definido após o rastreamento molecular do gene WT1. O caso 1 faz parte de um grande grupo de pacientes que tiveram diagnóstico de síndrome nefrótica corticorresistente e no qual o rastreamento de mutações no fragmento 8-9 do gene WT1 identificou a mutação IVS9+5G>A. Além da SF, essa paciente apresentou características incomuns, tais como malformação urinária (rins em ferradura) e disgerminoma bilateral. Os casos 2 e 3 também apresentaram a mutação IVS9+5G>A, e, no caso 4, foi identificada a mutação IVS9+1G>A, sendo que esses três casos foram encaminhados para estudo molecular em decorrência de GESF e/ou atraso no desenvolvimento puberal. Além disso, as pacientes 2 e 4 desenvolveram tumor gonadal bilateral. Visto que a maioria dos pacientes com SF apresenta genitália externa feminina, não há suspeita de sexo reverso até apresentarem atraso puberal e/ou amenorreia primária. Portanto, o rastreamento molecular do gene WT1 é de fundamental importância para se confirmar o diagnóstico de SF. Arq Bras Endocrinol Metab. 2012;56(8):525-32

AIM: To present phenotypic variability of WT1-related disorders. METHODS: Description of clinical and genetic features of five 46,XY patients with WT1 anomalies. RESULTS: Patient 1: newborn with genital ambiguity; he developed Wilms tumor (WT) and chronic renal disease and died at the age of 10 months; the heterozygous 1186G>A mutation compatible with Denys-Drash syndrome was detected in this child. Patients 2 and 3: adolescents with chronic renal disease, primary amenorrhea and hypergonadotrophic hypogonadism; patient 2 had a gonadoblastoma. The heterozygous IVS9+4, C>T mutation, compatible with Frasier syndrome was detected. Patient 4: 9-year-old boy with aniridia, genital ambiguity, dysmorphisms and mental deficiency; a heterozygous 11p deletion, compatible with WAGR syndrome was detected. Patient 5: 2 months old, same diagnosis of patient 4; he developed WT at the age of 8 months. CONCLUSIONS: Constitutional abnormalities of WT1 cause gonadal and renal anomalies and predisposition to neoplasia and must be investigated in patients with ambiguous genitalia, chronic renal disease and(or) Wilms tumors; primary amenorrhea with chronic renal disease; and aniridia, genital ambiguity and dysmorphisms. OBJETIVO: Descrever a variabilidade fenotípica das anomalias relacionadas ao WT1. MÉTODOS: Descrição das características clínicas e genéticas de cinco pacientes 46,XY com anomalias no WT1. RESULTADOS: Paciente 1: Recém-nascido com ambigüidade genital desenvolveu tumor de Wilms (TW) e insuficiência renal crônica (IRC), com óbito aos 10 meses. Detectada a mutação 1186G>A em heterozigose, compatível com síndrome de Denys-Drash. Pacientes 2 e 3: Adolescentes com IRC, amenorréia primária e hipogonadismo hipergonadotrófico; a paciente 2 apresentava gonadoblastoma. Ambas apresentavam mutação IVS9+4, C>T em heterozigose, característica da síndrome de Frasier. Paciente 4: Idade 9 anos, aniridia, ambigüidade genital, dismorfismos e deficiência mental; deleção 11p, compatível com síndrome WAGR foi encontrada em heterozigose. Paciente 5: Dois meses, mesmo diagnóstico do paciente 4, desenvolveu TW aos 8 meses. CONCLUSÕES: Alterações constitucionais do WT1 determinam anomalias gonadais, renais e predisposição a neoplasias; devem ser pesquisadas em casos de ambigüidade genital associada a IRC e(ou) TW; de amenorréia primária com IRC; e aniridia, ambigüidade genital e dismorfismos.

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, José Paulo Cabral de Vasconcellos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível no mundo, sendo o glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), a forma mais comum desta doença. Indivíduos afrodescendentes, latino-americanos e caucasianos apresentam as maiores prevalências da doença. Por meio de estudos de associação de amplitude genômica, do inglês Genome-Wide Association Studies (GWAS) mais de 100 variantes já foram associadas ao risco para o desenvolvimento do GPAA, principalmente em populações de ascendência europeia e asiática. Poucos são os estudos em populações afrodescendentes e miscigenadas, demonstrando a disparidade existente nas pesquisas em genômica do glaucoma, com o consequente desconhecimento da aplicabilidade dos resultados de GWAS em populações geneticamente heterogêneas como a brasileira. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de replicar a associação das variantes rs1362756 e rs33912345 dos genes SALL1 e SIX6, respectivamente, com o desenvolvimento do GPAA em uma amostra da população brasileira do Sudeste do Brasil. Um estudo do tipo caso-controle com 600 indivíduos foi realizado, sendo 300 do grupo caso e 300 controles. Para o grupo caso foram selecionados indivíduos com idade superior a 18 anos, com ângulo aberto à gonioscopia, lesões do disco óptico e perda de campo visual característicos da doença. No grupo controle foram selecionados indivíduos com idade superior a 40 anos, com ângulo aberto à gonioscopia, sem lesões ou alterações glaucomatosas, com campo visual normal e sem histórico familiar de glaucoma ou cegueira. Para todos os indivíduos foi realizada a genotipagem de cada uma das variantes por meio de ensaios Taqman e para confirmação dos resultados 10% das amostras de cada grupo foram sequenciadas pelo método de Sanger. A associação das variantes foi testada por teste de Qui-quadrado e regressão logística. Identificamos a associação da variante rs33912345 do gene SIX6 com o desenvolvimento de GPAA na presença do alelo C (p = 0,048; OR 1,501; IC95% 1,003-2,245) e na presença do genótipo CC (p = 0,017 OR 1,877, IC 95% 1,190-2,961). Não foi identificada associação estatisticamente significante da variante rs1362756 do gene SALL1 com o GPAA (p = 0,079, OR 1,343, IC 95% 0,969-1,862). Quando ambas as variantes foram avaliadas em relação ao risco de desenvolvimento da doença, observamos que indivíduos que apresentaram o genótipo CC para a variante rs1362756 do gene SALL1 e CC para a variante rs3312345 do gene SIX6 apresentaram um risco 5,6 vezes maior para o desenvolvimento do GPAA quando comparados aos indivíduos que apresentavam qualquer genótipo para a variante do gene SALL1 mais o genótipo AA do gene SIX6 (p = 0,020 OR 5,629, IC 95% 1,877-16,881). Os resultados desta análise replicaram os achados prévios da literatura para a variante do gene SIX6 e mostraram o efeito aditivo das variantes nos genes SALL1 e SIX6 em relação ao risco aumentado de GPAA nesta população, fornecendo informações importantes em relação à arquitetura genética da população brasileira com glaucoma Abstract: Primary open-angle glaucoma (POAG) is the leading cause of irreversible blindness worldwide. Africans, Latin-Americans, and Caucasian have the highest prevalence of the disease. Genome-wide association studies (GWAS) have identified more than 100 single nucleotide variants (SNV) associated with POAG risk, mainly in European and Asian descendants. There are few studies in Afro-descendant and mixed-race populations, demonstrating the existing disparity in glaucoma genomics research, with the consequent lack of knowledge of the applicability of GWAS results in genetically heterogeneous populations such as the Brazilian. Therefore, the aim of the present study was to replicate the association of the variants rs1362756 and rs33912345, in SALL1 and SIX6 genes, respectively, with the risk of development of POAG in a sample of the Brazilian population from the Southeast. A case-control study was performed with 600 subjects, 300 cases and 300 controls. In the case group subjects over 18 years old were selected, with open angle at gonioscopy, optic nerve damage and visual field loss typical of POAG. In the control group individuals over 40 years old were selected, with open angle at gonioscopy, no glaucomatous alterations, normal visual field and no family history of glaucoma or blindness. Taqman® assays were used to genotype each SNV. To confirm the results, Sanger sequencing was performed in 10% of the samples from each group. The association of the SNVs with the disease was tested by chi-square test and logistic regression. We identified the association of the rs33912345 variant of the SIX6 gene with POAG development in presence of the C allele (p=0.048; OR=1.501; 95% CI=1.003-2.245), and in the presence of the CC genotype (p=0.017; OR=1.877; 95% CI=1.190-2.961). No significant association was found for rs1362756 in the SALL1 gene (p=0.079; OR=1.343; 95% CI=0.969-1.862). When variants rs1362756 and rs33912345 were concurrently evaluated in relation to the risk of developing the disease, we observed that individuals who presented the CC genotype for both variants had a 5.6-fold increased risk for developing the disease when compared to individuals who had any genotype for the SALL1 gene variant plus the AA genotype of the SIX6 gene (p = 0.020 OR 5.629, IC 95% 1.877-16.881). The results of this analysis replicated the previous findings in the literature for the SIX6 gene variant and showed the additive effect of the variants in the SALL1 and SIX6 genes in relation to the increased risk of POAG in this population, providing important information regarding the genetic architecture of the Brazilian population with glaucoma Mestrado Oftalmologia Mestre em Ciências CNPQ 132188/2019-8

Orientadores: Mara Sanches Guaragna, Maricilda Palandi de Mello Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A proteinúria é um sinal importante e um marcador do prognóstico da doença renal, geralmente refletindo aumento na permeabilidade glomerular principalmente para albumina. Em 10-50% dos pacientes está associada ao desenvolvimento de doença renal crônica. Um dos principais mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de proteinúria patológica é o dano na barreira de filtração glomerular, constituída por três camadas: endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos, células viscerais especializadas. Desta forma, já se sabe que lesão dos podócitos contribui para albuminúria progressiva. No entanto existem controvérsias se as proteínas presentes no filtrado glomerular de indivíduos com dano desencadeiam a lesão, ou se atuam como coadjuvante nas podocitopatias. Outra questão pouco abordada é se o aumento de consumo de proteínas na dieta, seja por indivíduos comuns, seja por atletas, pode causar ou agravar lesão renal e quais são as consequências moleculares nos podócitos. Algumas moléculas importantes que participam da manutenção da barreira de filtração glomerular são a nefrina, podocina, podocalixina e o canal de cálcio receptor potencial transitório C, codificados, respectivamente, pelos genes "NPHS1, NPHS2, PODXL e TRPC6". Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão desses genes após suplementação progressiva de albumina em podócitos in vitro, em duas condições: 1) sem tratamento; 2) após a exposição com a droga nefrotóxica puromicina aminoglicosídeo (PA). Antes dos experimentos de exposição à albumina foram realizados alguns experimentos de padronização: a) confirmação da diferenciação dos podócitos; b) viabilidade celular após exposição à albumina; c) viabilidade celular após exposição à PA; avaliação da expressão dos marcadores de autofagia LC3-II e p62 e da taxa de transcrito do "PODXL" após privação de soro no meio de cultura durante 24 horas. Para os experimentos de exposição dos podócitos à albumina, foram utilizadas diferentes concentrações de albumina (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 30 e 40 mg/mL) por 24 horas, com e sem tratamento com PA. Para avaliação da expressão relativa foi PCR em tempo real para os genes. Para avaliação da expressão proteica e localização celular foram realizados Western Blot e imunocitoquímica indireta, respectivamente. As condições sem albumina foram utilizadas como controle em ambos os grupos e os resultados foram analisados com teste ANOVA e Tukey, com p?0,05. Observamos maior taxa de transcrito do gene PODXL após suplementação de albumina, com e sem PA. O "TRPC6", este apresentou diminuição do transcrito após a suplementação no grupo sem PA e aumento dessa taxa à 40 mg/mL no grupo com PA. Esta diferença foi confirmada nos experimentos de ICI. Já no caso dos genes "NPHS2 e NPHS1", não houve amplificação por real-time PCR e a expressão baixa não permitiu observar diferença, por Western Blot e por ICI. Este estudo é um passo inicial para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares nos podócitos que podem estar associados aos danos fisiológicos causados pelo aumento de proteínas no filtrado glomerular e pelas dietas hiperproteicas Abstract: Proteinuria is an important sign and a prognostic marker of kidney disease and usually reflects an increase in glomerular permeability for albumin. In 10¿50% of patients it is associated with the development of chronic kidney disease. One of the main mechanisms responsible for the development of pathological proteinuria is the glomerular filtration barrier (GFB) damage. GFB consists of three main layers: fenestrated endothelium, glomerular basement membrane and the visceral specialized cells called podocytes. Podocyte lesion contributes to progressive albuminuria. However, there is controversy if the proteins in the glomerular filtrate may trigger the lesion, or if they act as coadjuvant in the podocytopathies. Another question is whether increased protein intake in diets may trigger or worsen kidney damage and the molecular consequences to the podocytes. Several molecules participate in the maintenance of the glomerular filtration barrier, among them, nephrin, podocin, podocalyxin and short transient receptor potential channel 6, encoded by the genes NPHS1, NPHS2, PODXL and TRPC6, respectively. Therefore, this study aimed to evaluate the expression of these genes after a progressive supplementation of albumin in podocytes in vitro, under two conditions: 1) without treatment; 2) after exposure with the nephrotoxic drug puromycin aminoglycoside (PAN). Several standardization experiments were performed before the albumin exposure experiments, such as: a) confirmation of podocyte differentiation; b) cell viability evaluation after albumin exposure; c) cell viability evaluation after PAN exposure; d) evaluation of expression of autophagy markers LC3-II and p62 markers and PODXL mRNA expression after serum depletion for 24 hours before albumin exposure experiments. For albumin exposure experiments, we exposed podocytes to to different concentrations of albumin (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 30 and 40 mg / ml) for 24 hours, with and without PAN exposure. After 24 hours, we performed total RNA extraction, cDNA synthesis and real-time PCR for the genes using RPLP0 as the endogenous control. For protein expression and cellular localization, we performed Western Blot and immunocytochemistry, respectively. Conditions without albumin were used as control in both groups, and the results were analyzed using ANOVA and Tukey test, with p?0.05. We observed a higher transcript rate of PODXL gene after albumin supplementation, in both groups, with and without PA. On the other hand, the TRPC6 presented a decrease in the transcript level after supplementation in the non-PA group and an increase in the rate in the 40 mg/mL condition in the PA treatment group. This difference was confirmed after Western Blot and ICC experiments. Regarding NPHS2 and NPHS1 genes, there was no amplification by real-time PCR and there was no protein difference in the expression level after Western Blot and ICC experiments. This study is an initial step towards a better understanding of the molecular mechanisms that may be associated with the physiological renal damages caused by proteins in the glomerular filtrate and by high-content diets Mestrado Genética Médica Mestra em Ciências CAPES 02P4565/2018

Orientadores: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, Társis Antônio Paiva Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A síndrome de deleção 22q11.2 (S. Del 22q11.2) representa a microdeleção mais comum na espécie humana, com prevalência de 1/4000 -1/5000 nascidos vivos. O quadro clínico é heterogêneo, e os principais sinais incluem defeitos cardíacos congênitos (DCC) principalmente conotruncais, anomalias palatais, hipocalcemia, deficiência imunológica, dificuldade de aprendizagem, atraso no desenvolvimento e manifestações psiquiátricas. Diferentes métodos laboratoriais são utilizados para detectar a deleção. Devido à grande heterogeneidade clínica, em uma porcentagem significativa dos pacientes com essa hipótese diagnóstica, a deleção em 22q11.2 não é detectada após a triagem por FISH (Fluorescence in situ Hybridization) ou MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). O objetivo desse trabalho foi identificar e caracterizar desequilíbrios genômicos em pacientes com hipótese diagnóstica de S. Del 22q11.2. Todos os indivíduos foram investigados por meio da técnica de Hibridação genômica em arrays (aGH), utilizando o chips CytoScan HD e 750K (Affymetrix). Para a caracterização dos pontos de quebra, correlação genótipo-fenótipo e investigação de outras CNVs (Copy Number Variations) no genoma, foram incluídos 27 indivíduos com deleção em 22q11.2. Para a identificação de desequilíbrios genômicos em outras regiões, foram incluídos 32 indivíduos previamente testados pelas técnicas de FISH e/ou MLPA, sem deleção em 22q11.2. Entre os indivíduos com deleção em 22q11.2, os pontos de quebra proximais variaram entre as posições genômicas 18.644.790 a 18.916.842 (hg19 - 272 kb ¿ quatro genes) e os pontos de quebra distais variaram entre as posições genômicas 21.465.659 a 21.915.509 (hg 19 - 449 kb ¿ nove genes) e além disso, foram identificadas outras 794 CNVs no genoma de todos os indivíduos, sendo 237 duplicações e 557 deleções. Entre os 32 indivíduos sem deleção em 22q11.2, foram encontrados desequilíbrios genômicos patogênicos em quatro indivíduos (12,5%) e variantes de significado incerto em outros quatro indivíduos (12,5%). A investigação por aGH permitiu a determinação dos pontos de quebra nos casos com deleção em 22q11.2, além da definição diagnóstica em quatro indivíduos. Ainda, reforçou o papel da investigação de genitores e da necessidade de diferentes técnicas laboratoriais para a elucidação diagnóstica de desequilíbrios genômicos Abstract: The 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2 DS) is the most common microdeletion in humans, with an incidence of 1/4000 ¿ 1/5000 live births. The clinical phenotype is highly heterogeneous, but commonly includes conotruncal cardiac defects, palatal abnormalities, hypocalcemia, imunnodeficiency, learning disabilities, developmental delay and psychiatrics disorders. Different methods are used for deletion screening of patients with 22q11.2 DS clinical suspicion. However, due to heteronegenous phenotype, many patients do not show 22q11.2 deletion after screening with FISH (Fluorescence in situ Hybridization) and/or MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe Amplification). The aim of this study was to investigate and characterize genomic imbalances in patients with 22q11.2 DS clinical suspicion. Genomic imbalances screening was performed by array Genomic Hybridization (aGH) (CytoScan chip HD / 750K, Affymetrix). To investigate proximal/distal breakpoints, genotype-phenotype correlation and other CNVs throughout the whole genome, 27 individuals with 22q11.2 DS were included. Genomic imbalances were investigated in 32 patients with clinical suspicion, but without 22q11.2 deletion. Among the 27 individuals with 22q11.2 DS, aGH showed proximal breakpoints ranging from 18.644.790 ¿ 28.916.842 genomic positions (hg19 - 272 kb ¿ four genes) and distal breakpoints ranging from 21.465.659 ¿ 21.915.509 genomic positions (hg19 - 449 kb ¿ nine genes). In addition, 794 CNVs were identified throughout the genome (237 duplications and 557 deletions). Among the 32 individuals without 22q11.2 deletion, four individuals (12,5%) showed pathogenic genomic imbalances and four (12,5%) showed variants of uncertain significance (VOUS). This strategy allowed the breakpoints mapping of individuals with 22q11.2 deletion, besides diagnostic conclusion for four individuals. Also, reinforces the need for investigation of the patient¿s parents and the need to use distinct laboratorial techniques to elucidate genomic imbalances Mestrado Genética Médica Mestre em Ciências CAPES

Orientador: Edi Lúcia Sartorato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A perda auditiva é a deficiência sensorial mais frequente em humanos, afetando cerca de um em cada 500 recém-nascidos. Dentre as causas da perda auditiva, mais de 60% dos casos de perda auditiva congênita são genéticos. Acredita-se que no Brasil a surdez com origem genética pode chegar a 16% dos casos sendo que em 70% deles a surdez é não-sindrômica. Em 80% das perdas auditivas não-sindrômicas a herança é autossômica recessiva, em 10 a 20% autossômica dominante, em 2 a 3% ligada ao cromossomo X e em 1% é de herança materna. Mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido associadas à surdez induzida por aminoglicosídeos e a surdez não-sindrômicas em diferentes populações. Ao todo, 52 mutações distribuídas em 15 genes mitocondriais, responsáveis pela síntese de tRNA ou rRNA, estão envolvidos com a perda auditiva. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a padronização de um método molecular, no qual um grande número de indivíduos pôde ser analisado de forma simultânea, com o rastreamento de 50 alterações esclarecendo a etiologia em alguns casos, além de servir de grande valia para as políticas públicas na área dos estudos da surdez. Utilizando tecnologia high-throughput de genotipagem de espectrometria de massa Iplex Gold/Maldi TOF MS, foram estudadas 50 alterações. Ao todo 256 indivíduos foram analisados, sendo 152 pacientes com perda auditiva neurossensorial e 104 controles ouvintes. A técnica foi posteriormente validada através de análise por sequenciamento pelo método de Sanger. Foram detectadas 15 alterações mitocondriais conhecidas (G709A, A735G, A827G, G988A, A1555G, T4363C, T5628C, T5655C, G5821A, C7462T, G8363A, T10454C, G12236A, T1291C, G15927A). Este estudo contribuiu para mostrar o espectro de variantes mitocondriais em pacientes brasileiros com perda auditiva, além de reforçar a extrema importância do estudo do gene MT-RNR1, que apresentou 80% das alterações encontradas. A frequência da A1555G foi relativamente alta (2,6%), indicando que essa mutação é uma importante causa de perda auditiva em nossa população. Este trabalho relata pela primeira vez a investigação e a detecção da mutação G8363A em pacientes brasileiros com perda auditiva neurossensorial maternal. A técnica de genotipagem por espectrometria de massa se mostrou extremamente confiável com todos os seus resultados confirmados pelo sequenciamento direto. Tais resultados comprovam que essa tecnologia é uma ótima ferramenta a ser empregada nos testes de diagnóstico molecular da perda auditiva, pois apresenta um baixo custo e alta acurácia Abstract: Hearing loss is the most common sensory deficit in humans, affecting about one in five hundred newborns. Among the causes of hearing loss, more than 60% of cases of congenital hearing loss are genetic. It is believed that in Brazil deafness with genetic origin can reach 16% of the cases and in 70% of them the deafness is non-syndromic. In 80% of the non-syndromic hearing losses the inheritance is autosomal recessive, in 10 to 20% autosomal dominant, in 2 to 3% linked to the X chromosome and in 1% it is of maternal inheritance. Mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) have been associated with aminoglycoside-induced and non-syndromic deafness in different populations. Altogether, 52 mutations distributed in 15 mitochondrial genes, responsible for the synthesis of tRNA or rRNA, are involved in hearing loss. Thus, the present study aimed to standardize a new molecular method, in which a large number of individuals could be analyzed simultaneously, with the tracking of a vast amount of alterations clarifying the etiology in some cases, besides serving of great value for public policies in the area of studies of deafness. Using high-throughput genotyping of Iplex Gold / Maldi TOF MS mass spectrometry, 50 changes were studied. A total of 256 individuals were analyzed, of which 152 patients had sensorineural hearing loss and 104 hearing controls. The technique was later validated by direct sequencing analysis. Fifteen known mitochondrial alterations were detected (G709A, A727G, G988A, A1555G, T4363C, T5628C, T5655C, G5821A, C7462T, G8363A, T10454C, G12236A, T1291C, G15927A). This study contributed to show the spectrum of mitochondrial variants in Brazilian patients with hearing loss, besides reinforcing the extremely important study of the MT-RNR1 gene, which presented 80% of the alterations found. The frequency of A1555G was relatively high (2.6%), indicating that this mutation is an important cause of hearing loss in our population. This paper reports for the first time the investigation and detection of the G8363A mutation in Brazilian patients with maternal sensorineural hearing loss. The mass spectrometry genotyping technique proved to be extremely reliable with all its results confirmed by direct sequencing. These results prove that this technology is a great tool to be used in molecular diagnostic tests of hearing loss, because it presents a low cost and high accuracy Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas CAPES

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Mara Sanches Guaragna Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: O distúrbio da diferenciação sexual ovariotesticular (DDS-OT) é uma afecção rara definida pela presença de tecido ovariano e testicular no mesmo indivíduo. Nos pacientes com DDS-OT 46,XX e ausência do gene SRY acredita-se que a diferenciação de tecido testicular ocorra por mutação em um dos genes envolvidos na diferenciação gonadal, como descrito recentemente em relação ao gene NR5A1. Com o avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, tal como a abordagem de sequenciamento de exoma, é possível a investigação do genoma humano em busca de variantes patogênicas e/ou genes candidatos, o que auxilia no estudo de condições geneticamente heterogêneas e com etiologia indefinida, como é o caso dos DDS-OT 46,XX. Objetivos: Investigar a origem do DDS-OT 46,XX SRY-negativo em pacientes de um único serviço com essa condição, em busca de variantes patogênicas do gene NR5A1 ou de variantes raras que permitam identificar novos genes envolvidos na origem dessa afecção. Método: Foi realizado sequenciamento do gene NR5A1 em sete pacientes com DDS-OT 46,XX SRY-negativo e, posteriormente, sequenciamento de exoma em dois pacientes que apresentam recorrência familiar de DDS 46,XX (famílias 1 e 2). Resultados e Discussão: O sequenciamento do NR5A1 não detectou variantes patogênicas nem potencialmente patogênicas. O estudo do exoma também não detectou variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas. Na família 1 foram encontradas variantes de significado incerto em HHAT e USP44; na família 2, foram encontradas variantes de significado incerto em CBX2, CCN2, POU6F2 e INSRR. Desses, destacam-se HHAT, pelo resultado de estudos em animais, e principalmente CBX2, que tem papel bem estabelecido no processo de diferenciação gonadal e já foi associado a casos de DDS. Conclusões: Variantes patogênicas no NR5A1 não são causa de DDS-OT 46,XX SRY-negativo em nossa amostra, e o estudo do exoma não permitiu que se chegasse a um diagnóstico etiológico. Apesar disso, as variantes encontradas podem ter contribuído para o fenótipo de forma oligogênica. A etiologia dessa condição permanece indefinida, exigindo reanálise futura dos dados obtidos e o emprego de novas abordagens genômicas Abstract: Introduction: Ovotesticular Disorder of Sex Development (OT-DSD) is a rare condition defined by the presence of ovarian and testicular tissue in the same individual. In patients with 46,XX OT-DSD and absence of the SRY gene, it is believed that testicular tissue differentiation occurs by variants in one of the genes involved in gonadal differentiation, such as NR5A1. With the advancement of high-throughput sequencing technologies, such as the exome sequencing approach, it is possible to investigate the human genome in search for pathogenic variants and/or candidate genes, which aids in the study of genetically heterogeneous conditions and those with undefined etiology, such as 46,XX OT-DSD. Objectives: To investigate the origin of SRY-negative 46,XX OT-DSD in patients from a single service, searching for pathogenic variants in NR5A1 or rare variants that allow the identification of new genes involved in the origin of this condition. Methods: NR5A1 gene sequencing was performed in seven patients with SRY-negative 46,XX OT-DSD, followed by exome sequencing of two patients that presented familial recurrence of 46,XX DSD (families 1 and 2). Results and Discussion: NR5A1 sequencing did not detect pathogenic or probably pathogenic variants. The study of the exome also did not detect pathogenic or probably pathogenic variants. In family 1, variants of uncertain significance were found in HHAT and USP44,; in family 2, variants of uncertain significance were found in CBX2, CCN2, POU6F2 and INSRR. Of these, HHAT stands out, due to the results of studies in animals, and especially CBX2, which has a well-established role in the process of gonadal differentiation and has already been associated with cases of DSD. Conclusion: Pathogenic variants in NR5A1 are not the cause of SRY-negative 46,XX OT-DSD in our sample, and the study of the exome did not allow us to reach an etiological diagnosis. Nevertheless, the variants found may have contributed to the phenotype in an oligogenic way. The etiology of this condition remains undefined, requiring future reanalysis of the data obtained and the use of new genomic approaches Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências CAPES 001 FAPESP 2019/26382-3

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, Sueli Matilde da Silva Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A anemia falciforme é uma das doenças genéticas mais frequentes na população mundial. Os pacientes apresentam quadro clínico heterogêneo e dentre as complicações oculares, as alterações retinianas são as mais importantes. A retinopatia falciforme (RF) é deflagrada pela vaso-oclusão da microvasculatura na retina periférica, podendo levar a um processo de neovascularização que pode se desdobrar em hemorragia vítrea e descolamento de retina causando perda de visão. As células endoteliais desempenham papel fundamental na fisiopatologia da RF, especialmente na formação de neovasos. O objetivo central deste estudo foi identificar e validar genes diferencialmente expressos (GDEs) em vias que podem estar envolvidas com a RF. Com este propósito foram utilizados dados obtidos de um estudo preliminar de transcriptômica de células endoteliais progenitoras isoladas de sangue periférico de pacientes com hemoglobinopatia S (HbSS) com e sem retinopatia. Além disso, para obter informações adicionais sobre as funções biológicas, foram realizadas análises de enriquecimento funcional e redes de interação proteína-proteína (IPP). Nesse contexto, o transcriptoma foi montado por meio do programa STAR, utilizando como referência o genoma humano. Para detecção da diferença de expressão foi utilizado o pacote DESeq2, sendo aplicado o ajuste de FDR. Foram identificados 826 GDEs quando comparados os grupos com e sem retinopatia (GI x GII). Já na comparação entre os grupos com retinopatia falciforme proliferativa e sem retinopatia (GIP x GII), 501 genes apresentaram expressão diferencial. Dos GDEs identificados, 16 foram selecionados para validação por RT-qPCR: RAB38, RAB3C, PODN, SH3RF2, SEMA5A, SLC2A4, CDCP1, CCDC178, NR5A2, HTR1D, ADAMTS15, TGFA, STAT6, LHX6, CPS1, TYRP1. Ainda, análises de enriquecimento foram conduzidas por meio da ferramenta online PANTHER. Adicionalmente, utilizando-se o plug-in stringApp e MCODE presentes no software Cytoscape, redes de IPP e clusters foram gerados. Dentre os genes selecionados para validação, destacamos o gene RAB38, que teve seus resultados validados por RT-qPCR (p-valor= 0.03). O RAB38 tem sido associado à proliferação, migração e invasão in vitro, podendo indicar uma possível participação em diversas vias envolvidas na RF. Os demais genes não atingiram significância estatística na etapa de validação. Ademais, as análises de enriquecimento funcional demonstraram envolvimento em processos biológicos que podem estar associados com a RF, desses processos, 171 são distintos quando contrapostas as análises GI x GII e GIP x GII. Interessantemente, vias de angiogênese, migração, adesão, diferenciação, e proliferação celular estão presentes em ambas as análises. Entre os processos biológicos identificados, a regulação da resposta inflamatória e a regulação positiva da 7 atividade MAP quinase, assim como a regulação positiva da cascata MAPK se mostraram significantes apenas na análise GI x GII, enquanto a regulação positiva da sinalização fosfatidilinositol 3-quinase e regulação positiva da via de sinalização de receptor via STAT foram identificados apenas na análise GIP x GII. Dentre as proteínas presentes nos clusters identificados quando utilizado o plug-in MCODE, destacamos VEGFC, FLT1, FLT4, NRP1, HGF, IL-6, IL-1A e IL-18. Curiosamente, a análise dos dados de RNA-Seq mostrou uma superexpressão dos genes VEGFC, FLT1 e NRP1 e subexpressão de FLT4 quando comparados os grupos GI x GII. Estes resultados podem indicar uma possível associação entre VEGFC e os receptores FLT1 e NRP1, ativando vias de sinalização como PI3K/AKT e MAPK/ERK e assim contribuindo para os mecanismos envolvidos na angiogênese e na fisiopatologia da retinopatia falciforme. Portanto, nosso estudo apresenta dados preliminares que fornecem novas percepções que podem guiar importantes estudos nessa área, cujos mecanismos moleculares envolvidos ainda permanecem pouco elucidados Abstract: Sickle cell anemia is one of the most frequent genetic disorders worldwide. Patients present a diverse clinical presentation, and among ocular manifestations, retinal alterations are the most important. Sickle cell retinopathy (SCR) occurs due to vaso-oclusion of the microvasculature in the peripheral retina, which can lead to neovascularization and possibly vitreous hemorrage and retinal detachment with vision loss. Endothelial cells play a key role in SCR pathophysiology, especially in the generation of new blood vessels. The main goal of this study was to identify and validate differentially expressed genes (DEGs) present in pathways that may be involved in SCR. For this purpose, data obtained from a preliminary transcriptomic study of endothelial progenitor cells isolated from peripheral blood of patients with hemoglobin S (HbSS) with and without retinopathy were used. Furthermore, functional enrichment analysis and protein-protein interaction networks (PPI) were performed to gain further insights of biological functions. In this context, transcriptome assembly was performed by STAR, with human genome as reference. The DESeq2 package was used to obtain the differential gene expression, with FDR adjustment. A total of 826 DEGs were identified when the groups with and without retinopathy (GI x GII) were compared. In the comparison between the groups with proliferative sickle cell retinopathy and without retinopathy (GIP x GII), 501 genes showed differential expression. Sixteen genes of the DEGs identified were selected for RT-qPCR validation: RAB38, RAB3C, PODN, SH3RF2, SEMA5A, SLC2A4, CDCP1, CCDC178, NR5A2, HTR1D, ADAMTS15, TGFA, STAT6, LHX6, CPS1, TYRP1. Moreover, PANTHER online tool was utilized for enrichment analysis. The stringApp and MCODE plug-ins in Cytoscape software were used to generate PPI networks and clusters. The differential expression analysis identified 826 DEGs when comparing the groups with and without SCR (GI x GII). The comparison between the groups with proliferative SCR and without SCR (GIP x GII) generated 501 DEGs. Among the genes selected for validation, we highlight RAB38, with differential expression validated by RT-qPCR (p-value = 0.03). This gene has been associated with proliferation, migration and invasion in vitro. These pathways are relevant in SCR pathophysiology, and indicate a possible role of RAB38 in this context. The other genes did not reach statistical significance in the validation stage. Furthermore, functional enrichment analysis showed the DEGs participation in biological processes possibly associated with SCR. Of these, 171 are distinct between GI x GII and GIP x GII. Curiously, angiogenesis, cell migration, adhesion, differentiation and proliferation pathways are present in both comparisons. Among the identified biological processes, regulation of inflammatory response and positive 9 regulation of MAP kinase activity and positive regulation of MAPK cascade were significant only in GI x GII analysis, whereas positive regulation of phosphatidylinositide3-kinase and positive regulation of STAT receptor signaling pathway were found only in GIP x GII comparison. Among the proteins present in the clusters identified through the MCODE plugin, we highlight VEGFC, FLT1, FLT4, NRP1, HGF, IL-6, IL-1A and IL-18. Interestingly, the analysis of RNA-Seq data showed an overexpression of VEGFC, FLT1 and NRP1 genes and underexpression of FLT4 when comparing the GI x GII groups. These results may indicate a possible association between VEGFC and FLT1 and NRP1 receptors, activating signaling pathways such as PI3K/AKT and MAPK/ERK, therefore contributing to the mechanisms involved in angiogenesis and in the pathophysiology of sickle cell retinopathy. Thus, our findings contain preliminary results which can guide relevant studies in the field, since molecular mechanisms of SCR are yet poorly understood Mestrado Genética Médica Mestre em Ciências FAPESP 2014/00984-3 CNPQ 130373/2020-6

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, José Paulo Cabral de Vasconcellos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) é uma condição multifatorial e progressiva, representando uma das principais causas de perda visual irreversível nos países desenvolvidos. As evidências atuais favorecem fortemente ao sinergismo de mecanismos envolvendo a interação entre genes e vias na patogênese da DMRI. Dentre as principais vias estudadas, destacam-se os sistemas complemento e de transporte lipídico, que estão relacionadas a diferentes genes, incluindo o CFB e APOE, respectivamente. Estudos prévios demonstraram a relação da variante rs641153 do gene CFB (CFB R32Q) e dos haplótipos compostos pelas variantes rs429358 e rs7412 do gene APOE com o risco para DMRI. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a influência das variantes dos genes CFB (rs116453) e APOE (rs429358 e rs7412) em relação ao desenvolvimento da DMRI em uma amostra da população brasileira. Métodos: Setecentos e trinta e três indivíduos não relacionados foram analisados, sendo 337 com DMRI (grupo caso) e 396 sem a doença (grupo controle). No grupo caso, os pacientes foram estratificados de acordo com os fenótipos da doença, divididos em DMRI seca e úmida, e DMRI não avançada e avançada. As variantes rs116453 do gene CFB e rs429358 e rs7412 do gene APOE foram avaliadas por meio da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento direto. As estimativas de associação foram feitas por meio de regressão logística ajustada para idade, com p-valor corrigido pelo método de Bonferroni para cada comparação considerada. Resultados: Para a avaliação da variante rs641153, 337 casos e 396 controles foram analisados. Na avaliação de genótipos, a comparação entre casos e controles sugeriu efeito protetor dos genótipos contendo a variante A nas comparações entre AA/AG versus GG (OR 0,576; p-valor 0,009) e AG versus GG (OR 0,591; p-valor 0,016). Entretanto, esses resultados não sobreviveram ao ajuste do limiar de significância (p = 0,003). Já nas comparações entre DMRI avançada versus controles, tanto no modelo homozigoto (OR = 0,441; p-valor = 0,001) quanto no autossômico dominante (OR = 0,428; p-valor = 0,001); e entre DMRI úmida versus controles no modelo austossômico dominante (OR = 0,067; p-valor = 0,002), a associação dos genótipos contendo o alelo A foi confirmada. Essas associações se mantiveram na análise de alelos. Para a avaliação dos polimorfismos rs429358 e rs7412, 334 casos e 371 controles foram estudados. Na avaliação por genótipos, ao comparar os grupos caso e controle, nenhuma das associações alcançou significância estatística, considerando o p-valor ajustado de 0,002, embora tenha havido uma proteção sugestiva para o genótipo E3E4 (OR = 0,626; valor p = 0,037) e portadores de E4 (OR = 0,651; valor p = 0,047). O efeito protetor foi demonstrado para o genótipo E3E4 e portadores E4 nas comparações: DMRI avançada versus controles (OR = 0,366, p-valor = 0,491 x 10-3 e OR = 0,403, p-valor = 0,814 x 10-3, respectivamente), DMRI avançada versus DMRI não avançada (OR = 0,253, p-valor = 0,659 x 10-4 e OR = 0,269, p-valor = 0,631 x 10-4, respectivamente). Na comparação de DMRI úmida versus controle, a proteção foi observada apenas para E3E4 (OR = 0,405, p-valor = 0,001). Já na avaliação por alelos, E4 mostrou-se protetor na comparação entre doença avançada vs. não avançada (OR 0,424; p-valor 0,002). Conclusões: Este estudo confirmou o papel protetor da variante rs641153 do gene CFB e do alelo E4 do gene APOE em relação ao risco para a DMRI em uma amostra da população brasileira Abstract: Introduction: Age-related Macular Degeneration (AMD) is a multifactorial and progressive condition, representing one of the main causes of irreversible visual loss in developed countries. Current evidence strongly favors the synergism of mechanisms involving the interaction between genes and pathways in the pathogenesis of AMD. Among the main studied pathways, complement and lipid transport systems are very important, and are related to different genes, including CFB and APOE, respectively. Previous studies have demonstrated the relationship between rs641153 variant of the CFB gene (CFB R32Q) and the haplotype composed by rs7412 and rs429358 (E2 and E4 haplotypes) of the APOE gene with the risk of AMD. Purpose: The aim of this study was to evaluate whether the variants of CFB (rs116453) and APOE (rs7412 e rs429358) genes are associated with AMD in a Brazilian cohort. Methods: Seven hundred and thirty-three unrelated individuals were analyzed, 337 with AMD (case group) and 396 without the disease (control group). In the case group, patients were stratified according to disease phenotypes, divided into dry and wet AMD, and non-advanced and advanced AMD. The variants of CFB rs116453, and APOE rs7412 and rs429358 were evaluated through polymerase chain reaction and direct sequencing. Associations estimates were made using age-adjusted logistic regression, with p-value adjusted by Bonferroni correction for each comparison. Results: For the evaluation of the rs641153 variant, 337 cases and 396 controls were analyzed. In the evaluation of genotypes, the analysis of cases and controls suggests a protective effect of the genotypes containing variant A in the comparisons between AA / AG versus GG (OR 0,576; p-value 0,009) and AG versus GG (OR 0,591; p-value 0,016). However, these results did not survive the adjustment of significance threshold (p = 0,003). In the comparisons between advanced AMD versus controls, both in the homozygous (OR = 0,441; p-value = 0.001) and in the autosomal dominant models (OR = 0.428; p-value = 0,001); and between wet AMD versus controls in the austosomal dominant model (OR = 0,0671; p-value = 0,002) the association of genotypes containing allele A was confirmed. These associations were maintained in the evaluation of alleles. For rs429358 and rs7412 polymorphisms, 334 cases and 371 controls were studied. In the evaluation of genotypes, when comparing case and control groups, none of the associations reached statistical significance considering the adjusted p-value of 0,002, although there was suggestive protection for the E3E4 genotype (OR = 0,626; p value = 0,037) and E4 carriers (OR = 0,6515; p-value = 0,047). The protective effect was demonstrated for E3E4 genotype and E4 carriers in the comparisons: advanced AMD versus controls (OR = 0,3666, p-value = 0,491 x 10-3 and OR = 0.4031, p-value = 0,814 x 10-3, respectively), advanced AMD versus non-advanced AMD (OR = 0,2529, p-value = 0,659 x 10-4 and OR = 0,2692, p-value = 0,631 x 10-4, respectively). In the comparison of wet AMD vs. control, protection was observed only for E3E4 (OR = 0,4052, p-value = 0,001). In the evaluation of alleles, E4 was significantly protective when comparing advanced versus non advanced disease (OR 0,424; p-value 0,002). Conclusions: This study confirmed the protective role of the polymorphisms rs641153 and E4 in the risk for AMD in a sample of the Brazilian population Mestrado Oftalmologia Mestra em Ciências FAPESP 2010/18353-9

Orientadores: Vera Gil da Silva Lopes, Isabella Lopes Monlleó Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Fendas orais típicas (FOT) têm prevalência global de 1:700 nascidos vivos e etiologias diversas. A técnica de Chromosomal Microarray Analysis (CMA) provou ser uma ferramenta importante para o diagnóstico etiológico de indivíduos com deficiências intelectuais. Entretanto, sua relevância na investigação de indivíduos com FOT ainda não foi completamente estabelecida. Objetivo: Identificar características clínicas para auxílio de suspeição de desequilíbrios genômicos e caracterizar a aplicação da técnica de CMA na investigação etiológica de FOT. Método: Estudo transversal e descritivo, a partir de indivíduos com FOT registrados na Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais. Foram incluídos: indivíduos com FOT apresentando 4 ou mais sinais minor e nenhum defeito major (Fenda Oral Não-Sindrômica - FOTNS) e indivíduos com FOT apresentando pelo menos um outro defeito major, independentemente do número de sinais minor (Fenda Oral Sindrômica - FOTS-DCM). Foram excluídos: FOTS com etiologia conhecida e fendas orais atípicas. Desequilíbrios genômicos foram investigados em 100 indivíduos utilizando a plataforma Affymetrix® (GeneChip System CytoScan 750K ou CytoScan HD). A análise empregou o programa Chromosome Analysis Suite v.3.3 (Affymetrix®). Casos com variantes patogênicas e possivelmente patogênicas conforme recomendações internacionais foram agrupadaos para análise. A inferência de ancestralidade dos casos e controles foi obtida em painel de 345 SNP-AIMs (Single nucleotide polymorphism-Ancestry informative markers). A análise supervisionada de ancestralidade utilizou o software Admixture v.1.3.0. As populações parentais de referência foram obtidas de bancos de dados públicos. Resultados: Foram identificados nove casos com desequilíbrios genômicos, todos haviam sido classificados clinicamente como FOTS-DCM. Idade gestacional (p= 0,0078) e a média de peso (p= 0,0007), comprimento (p= 0,0009) e perímetro cefálico (p= 0,0108) ao nascimento foram menores no grupo com desequilíbrios genômicos. Em relação aos defeitos associados, a média de sinais minor (p= 0,009) foi estatisticamente maior nos casos com CMA alterado, bem como a presença de sinais major (p= 0,0044). A composição ancestral de indivíduos com FOT e os controles brasileiros está de acordo com a estimativa de estratificação de ancestralidade da população brasileira. Além dos desequilíbrios genômicos, foram identificadas 308 CNVs (Copy Number Variations), a análise destas quanto à classificação se FOTS-DCM, FOTNS ou controle mostrou diferença estatisticamente significante em 19 variantes, das quais dez estão presentes predominantemente em controles. Conclusão: A idade gestacional, biometria neonatal e presença de defeitos associados devem ser valorizadas como sinais de alerta de desequilíbrios genômicos em FOT. Não foram identificados novos genes causativos ou regiões de interesse para FOT. Regiões com CNVs específicas em indivíduos da população geral sugerem efeito protetor, o que deverá ser abordado em estudos futuros. Abstract: Typical oral clefts (OC) have an overall prevalence of 1:700 live births and different etiologies. The Chromosomal Microarray Analysis (CMA) technique proved to be an important tool for the etiological diagnosis of individuals with intellectual disabilities. However, its relevance in the investigation of individuals with OC has not been completely clarified yet. Objective: Identify clinical characteristics to aid in the suspicion of genomic imbalances and characterize the application of the CMA technique in the etiological investigation of OC. Method: Cross-sectional and descriptive study, from individuals with OC registered at the Brazilian Base of Craniofacial Anomalies. Individuals with OC showing 4 or more minor signs and no major defect (Non-Syndromic Oral Cleft - NSOC) and individuals with OC showing at least one other major defect, regardless of the number of minor signs (Syndromic Oral Clefts - SOC) were included. OCs with known etiology and atypical oral clefts were excluded. Genomic imbalances were investigated in 100 individuals using the Affymetrix® platform (GeneChip System CytoScan 750K or CytoScan HD). The analysis employed the program Chromosome Analysis Suite v.3.3 (Affymetrix®). Cases with pathogenic and possibly pathogenic variants according to international recommendations were grupped for analysis. The ancestry inference of the cases and controls was obtained from a panel of 345 SNP-AIMs (Single nucleotide polymorphism-Ancestry informative markers). Supervised ancestry analysis used Admixture v.1.3.0 software. The parental reference populations were obtained from public databases. Fisher's test was used for statistical analysis; a p-value of

Orientador: Katlin Brauer Massirer Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: SRPKs são serina arginina proteínas quinases que reconhecem e fosforilam de forma específica repetições de dipeptídeos arginina (R) e serina (S). Seus principais substratos estão envolvidos na regulação de splicing de pre-mRNA, como por exemplo SRSF1. As SR proteínas são necessárias à formação dos componentes do spliceossoma, sendo SRSF1 especificamente associada com a snRNP U1, que se liga à porção 5¿SS do éxon e que leva a formação do pre-spliceossoma. SRPK1 tem sido mostrado super regulado em diversos tipos de canceres, inclusive em tumores do sistema nervoso, como por exemplo gliomas. Já foi demonstrado na literatura que a redução da expressão de SRPK1 em glioblastomas inibe o crescimento, invasão e migração celular. Com objetivo de pesquisar novos alvos de splicing alternativo ligados a SRPK1 foi usada a estratégia de modular geneticamente essa quinase, em linhagens de glioblastoma, tanto por super-expressão quanto por knockdown com short-hairpin. Após diversos tratamentos dos dados por análises de bioinformática foi gerada uma lista de eventos de splicing alternativo relevantes. Dentre os eventos validados por real time PCR destacam-se os genes MBNL1, RBM39, TAU e MYL6, que tiveram alteração regulada pela modulação de SRPK1 Com este trabalho foi possível achar e validar novos eventos de splicing alternativo relacionados com glioblastoma que são regulados por SRPK1. Dentre eles houve o achado de uma isoforma inédita na literatura, da miosina de cadeia leve MYL6. Foi demonstrado com esta pesquisa que este alvo teve alteração no splicing de forma específica pela quinase SRPK1. Também colhemos evidências que indicam que o éxon alternativamente usado por SRPK1 em MYL6 poder estar relacionado à capacidade de migração celular desta miosina. Em paralelo, através de ensaios de fosfoproteômica foi realizada uma busca inicial por novos substratos de fosforilação em células da linhagem HEK sob tratamento com inibidor químico específico para SRPK1 Abstract: SRPKs are serine arginine protein kinases that recognize and phosphorylate repeats of dipeptides arginine (R) and serine (S). The major substrates are involved in the regulation of pre-mRNA splicing, such as SRSF1. The neurological proteins are related to the formation of spliceosome components, SRSF1 being associated with a snRNP U1, which binds to the 5'SS portion of the exon and leads to pre-spliceosome formation. SRPK1 has been shown to be over-regulated in cancers, including nervous system tumors, such as gliomas. It has already been demonstrated in the literature the reduction of SRPK1 expression in glioblastomas can inhibit cell growth, invasion and migration. In order to investigate new splicing targets linked to SRPK1, the strategy of genetically modulating this kinase in glioblastoma lines was used both for superexpression and knockdown. After several data treatments by bioinformatics analyzes, a list of relevant alternative splicing events was generated. Among the events validated by real time PCR, the genes MBNL1, RBM39, TAU and MYL6 were regulated by the modulation of SRPK1. In this present research it was possible to find and validate new alternative splicing events related to glioblastoma that are regulated by SRPK1. Among them it was possible to find an isoform unpublished in the literature of MYL6, a light chain myosin. It has been demonstrated by this research that this target had alternative splicing specifically by the SRPK1 kinase. We also gather evidence indicating that the exon alternatively used by SRPK1 in MYL6 may be related to the cell migration capacity of this myosin. In parallel, an initial search for new phosphorylation substrates was carried out in phosphoprotein assays in HEK cells under treatment with SRPK1-specific chemical inhibitor Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 400906/2014-7 CNPQ 141297/2017-4

Orientador: Adriana Souza Torsoni Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: Nas últimas décadas a obesidade se tornou um problema de saúde pública. Durante a gestação, o excesso de peso e obesidade podem acarretar um risco aumentado para complicações gestacionais e alterações permanentes na prole decorrentes de um processo conhecido como programação metabólica. Diferentes mecanismos epigenéticos são capazes de atuar na modulação da expressão de diversos genes e a expressão diferencial de microRNAs representa um desses mecanismos. Indivíduos obesos apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de alterações hepáticas, como a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que podem evoluir para quadros extremamente graves que requerem intervenção cirúrgica, com remoção do tecido lesionado para preservação da função do órgão, dada a capacidade regenerativa desse tecido. Diversas vias são ativadas no processo de regeneração hepática, dentre elas, a via da Hippo/YAP e a do TGF?. A via da Hippo/YAP possui um papel importantíssimo no controle do tamanho dos órgãos, já a do TGF? é responsável pelo bloqueio do ciclo celular. Utilizando prole de camundongos Swiss, que consumiram dieta controle ou dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação, e que foram submetidos na vida adulta à cirurgia de hepatectomia parcial, pudemos observar que, até 48 horas após a cirurgia de hepatectomia parcial, aparentemente tanto a prole de mães controle, quanto a prole de mães hiperlipídicas, apresenta capacidade de regenerar o tecido à ponto de manter a taxa de sobrevivência em 100% dos indivíduos. Alterações nos níveis de miR-370 e miR-122 parecem impactar muito pouco na expressão de proteínas-chaves das vias do TGF? e Hippo, reduzindo de maneira pouco significativa os marcadores de proliferação de hepatócitos, sem causar grandes alterações na deposição de lipídeos nessas células. Possivelmente os resultados observados são um reflexo de que os mecanismos de sobrevivência da prole sobressaem às modificações epigenéticas induzidas pela dieta da mãe Abstract: In recent decades obesity has become a public health problem. During pregnancy, overweight and obesity may carry an increased risk for gestational complications and permanent changes in offspring resulting from a process known as metabolic scheduling. Different epigenetic mechanisms are capable of modulating the expression of several genes and the differential expression of microRNAs represents one of these mechanisms. Obese individuals are at increased risk for the development of hepatic abnormalities, such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which can progress to extremely severe conditions requiring surgical intervention, with removal of injured tissue to preserve organ function, given the ability regeneration of this tissue. Several pathways are activated in the hepatic regeneration process, among them the Hippo / YAP pathway and the TGF? pathway. The Hippo / YAP pathway plays a very important role in the control of organ size, whereas TGF? is responsible for blocking the cell cycle. Using offspring from Swiss mice, who consumed a control diet or a high-fat diet during pregnancy and lactation, who underwent partial hepatectomy surgery in their adulthood, we could observe that up to 48 hours after partial hepatectomy surgery, apparently both offspring of control mothers, as far as the offspring of hyperlipidic mothers, has the capacity to regenerate the tissue to the point of maintaining the survival rate in 100% of the individuals. Alterations in miR-370 and miR-122 levels appear to have very little impact on the expression of TGF? and Hippo pathway key proteins, reducing immaterially the hepatocyte proliferation markers without causing major changes in lipid deposition in these cells . Possibly the observed results are a reflection that the survival mechanisms of the offspring stand out to the epigenetic modifications induced by the mother's diet Mestrado Metabolismo e Biologia Molecular Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAPESP 2015/20991-7