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Grapevine Pinot gris virus (GPGV) is a recently described trichovirus, discovered by next generation sequencing (NGS) in the cv Pinot gris, seemingly associated to a new grapevine disease. To define the aetiology of the disease, the virome of two additional Pinot gris accessions, showing or not symptoms, were analysed by NGS. Virus content consistently reproduced the already known virome with GPGV, Grapevine rupestris stem pitting virus (GRSPaV), Grapevine Rupestris vein feathering virus (GRVFV) and the two viroids Hop stunt viroid (HSVd) and Grapevine yellow speckle viroid 1 (GYSVd-1), infecting either the symptomatic or the symptomless plants. Whole genome phylogenetic analysis on seven GPGV isolates, including three isolates originating from Czech Republic and Slovak Republic and consensus sequences assembled by NGS, clearly clustered those infecting symptomatic vines. We therefore extended the analysis to two genomic regions, comprising the RNA polymerase RNA dependent domain of the replicase gene and part of the movement protein, on a group of accessions from Trentino, free from relevant viruses involved in leafroll, infectious degenerations and rugose-wood associated grapevine diseases. Maximum likelihood and Bayesian phylogenetic analyses of nucleotide sequences, proved that isolates from vines with symptoms form a clade distinct from those of symptomless vines, thus confirming studies on the whole genome. These results showed that GPGV virus populations from Trentino underwent, in the infected vines, a different evolutionary dynamic, not related with the vine variety, which selected for isolates with different pathogenicity.

Grapevine pinot gris virus (GPGV) has been originally found in Northern Italy associated to symptoms of stunting, chlorotic mottling and leaf deformations in grapevine plants. Successively, its presence has been reported in many countries even on asymptomatic plants. The study of this virus with regard to its biological and molecular characterization, its etiological role and spread by Eryophid mites vectors Colomerus vitis, the symptoms on different grapevine varieties cannot disregard the use of reliable, robust and validated diagnostic methods to implement possible prevention strategies. To this aim, a test performance study (TPS) was carried out to evaluate, harmonize and validate four diagnostic protocols used in the detection of GPGV in symptomatic and asymptomatic grapevine material. Specifically, two end point RT-PCR (Glasa et.al. 2014 - protocol 1; Saldarelli et al. 2015 - protocol 2) and two real time RT-PCR (Bianchi et al. 2015 - protocol 3; Ratti personal communication 2015- protocol 4) protocols have been compared. Obtained performance data from the four molecular protocols are reported and evaluated in the present Abstract. Both diagnostic methods, (end point and real time RT-PCR) were proven to be highly effective, although analytical sensitivity was more efficient for real time protocols, as expected. No statistically significant differences were observed for the other validation parameters. Moreover, all protocols gave satisfactory results even if six samples with low virus concentration were selected to stress the tests. Despite the large number of laboratories that performed the TPS and the different instruments and extraction methods (Nitrogen or different mechanic grinding system), no statistically significant differences were observed in the analytical specificity using the non target samples infected by other viruses than GPGV. All protocols showed good accuracy and robustness as proven using a large number of samples in a high number of laboratories. In conclusion, harmonized and validated reference protocols for the diagnosis of GPGV are, for the first time, available.

Symptoms of stunting, chlorotic mottling and leaf deformation with reduced yields and low quality of berries, were observed on cv. Pinot gris, in Trentino vineyards since 2003. Afterwards, similar symptoms were reported from cvs. Traminer, Pinot Noir in Trentino and Friuli-Venezia Giulia. Analysis by high throughput sequencing led to the discovery of a new trichovirus, named grapevine pinot gris virus (GPGV), closely related to grapevine inner berry necrosis (GINV). To define the aetiology and the biological features of the disease, field, greenhouse and laboratory studies were made. Field observations on a time span of three years (2010-12) indicated a progressive increase of diseased vines from 14,7 to 33,9 % in a cv. of Pinot gris vineyard whereas the incidence in a cv. Traminer vineyard was stationary and lower (ca.3%). RT-PCR assays showed that, in these vineyards, GPGV was present in all symptomatic but also in 70% of symptomless vines. Biological indexing demonstrated that GPGV is efficiently transmitted by grafting to Vitis riparia and V. vinifera cvs Pinot gris and Traminer inducing specific symptoms. A screening on different varieties and vineyards in the area suggests a widespread distribution of GPGV. Its presence appears closely associated with a disease condition although latent infections in symptomless vines can also occur.

Grapevine pinot gris virus (GPGV), a new trichovirus , was recently suggested to be associated with symptoms of leaf chlorotic mottling and deformations observed on grapevine plants of cv. Pinot gris in Trentino. GPGV has a genomic organization identical to that of grapevine inner berry necrosis virus (GINV), which is known to be transmitted by the erineum or leaf blister grape mite, Columeris vitis.This mite species is quite common in infected vineyards so that 2 experimental trails were carried out in order to investigate its possible involvment in GPGV transmission. C. vitis was transferred from galls of virus-free leaves to GPGV-infected grapevine leaves for the acquisition-access feeding. After various periods, some mites were analyzed by RT-PCR for the presence of GPGV and some were moved to virus-free grapevine seedlings for virus transmission. The second transmission experiment consisted in collecting C. vitis directly from galls of GPGV-infected leaves, then proceeding, as described above, with RT-PCR analysis and placing the mites on virus-free seedlings. Results demonstrated the presence of the virus in 2 pools of eriophyids analyzed, whereas no amplification was obtained from seedlings used for transmission trials. Parallel experiments were also conducted on pools or single individuals of C. vitis to characterize their ITS1 region, amplified using the specific primer pair 18S and 5.8S rev.

I protocolli diagnostici descritti in questo volume sono il prodotto dell'attività effettuata nell'ambito del Progetto Finalizzato 'ARON-ARNADIA', finanziato dal Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e Forestali (DM 19738/7303/08 del 29/12/2008). I protocolli forniscono le linee guida per la diagnosi e l'identificazione di patogeni delle piante (funghi, batteri, fitoplasmi, virus e viroidi) nei laboratori preposti alla diagnosi degli organismi di qualità e/o quarantena, presenti sul territorio italiano. L'uso di protocolli diagnostici armonizzati è alla base di un'efficiente applicazione delle misure fitosanitarie e consente il confronto dei risultati ottenuti da diversi laboratori in diverse condizioni operative. Le metodologie di laboratorio riportate nei protocolli di questo volume sono state selezionate sulla base del valore, ottenuto per ciascuna di esse, dei parametri di sensibilità diagnostica (inclusività per le colture batteriche), specificità diagnostica (esclusività per le colture batteriche), selettività, accuratezza, sensibilità analitica (limite di rilevabilità), specificità analitica, ripetibilità e riproducibilità (ISO/IEC standard 16140:2003; ISO/IEC standard 17025:2005; EPPO standard PM7/98).

Il Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e Forestali (MiPAAF) nel 2009 ha finanziato il Progetto "ARNADIA" finalizzato alla produzione di protocolli diagnostici, armonizzati e validati, che fossero di riferimento per il controllo e il monitoraggio dei patogeni vegetali di interesse fitosanitario. In questo ambito, è stato costituito il "Gruppo di Lavoro ARNADIA - virus della vite" composto da 8 Università ed Enti di Ricerca, 3 Laboratori privati accreditati, un Laboratorio dei Servizi Fitosanitari e un'Associazione di vivaisti viticoli. L'obiettivo del Gruppo di Lavoro è stato quello di produrre protocolli diagnostici di riferimento, sia sierologici che molecolari, calcolandone i parametri di validazione al fine di ottenere l'armonizzazione della diagnosi di 8 virus vite: Grapevine leafroll-associated virus-1, -2, -3, (GLRaV 1, 2, 3 ) Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine fanleaf virus (GFLV) e Grapevine fleck virus (GFkV). La validazione di un protocollo consiste nella valutazione di specifici parametri volti a determinare la loro idoneità per identificare la presenza di un "target" specifico. I parametri che influenzano la capacità di un protocollo di definire accuratamente lo stato sanitario del campione in esame sono: la sensibilità diagnostica (capacità del metodo utilizzato di rilevare la presenza del patogeno nei campioni veramente infetti dal patogeno in questione - veri positivi) e la specificità diagnostica (capacità del metodo utilizzato di non per rilevare la presenza del patogeno in campioni non infetti dal patogeno in questione - veri negativi). Altri parametri che devono essere considerati e che determinano l'efficienza di un protocollo sono: la sensibilità analitica (la più piccola quantità di entità infettiva che può essere identificata dal protocollo), la ripetibilità o accordanza (grado di conformità dei risultati ottenuti nella replicazione del protocollo, in intervalli di tempo brevi, utilizzando gli stessi campioni di riferimenti nelle stesse condizioni di lavoro cioè apparecchiature, operatore, laboratorio) e riproducibilità o concordanza (grado di conformità dei risultati ottenuti con lo stesso metodo con gli stessi campioni di riferimento in diversi laboratori). Quest'ultimo parametro è stato definito con la collaborazione di altri 5 laboratori dei Servizi Fitosanitari Regionali. Nello specifico, 122 campioni di vite (varietà, portainnesti e campioni "pool" composti da 5 piante, di cui solo una infetta) sono stati analizzati mediante ELISA, utilizzando 25 antisieri di tre società commerciali (Agritest, Bioreba e Sediag) e multiplex RT-PCR. Per l'ELISA i test sono stati condotti seguendo le indicazioni fornite dalle Ditte; per la multiplex RT-PCR è stato utilizzato il protocollo descritto da Gambino e Gribaudo, (2006). I test sono stati eseguiti in 18 laboratori utilizzando gli stessi campioni (analizzati in condizioni di anonimato) e reagenti; i risultati sono stati ottenuti utilizzando lo stesso valore di soglia calcolato sulla base delle letture spettrofotometriche per l'ELISA e analizzando i gel elettroforetici per la multiplex RT-PCR. L'elaborazione dei risultati (circa 24.000 dati) ha portato alla definizione dei parametri di validazione secondo le norme UNI / EN / ISO 16140 e 17025 e gli standard EPPO PM7/76 e PM7/98.L'ELISA ha dimostrato di essere una tecnica molto efficace, paragonabile al metodo molecolare, anche se quest'ultimo si è rivelato, come previsto, più efficiente e sensibile per alcuni virus e su alcuni campioni specifici (portainnesti e "pool"). L'efficienza e l'affidabilità dei protocolli sono stati provati e dimostrati, per la prima volta per quanto riguarda la diagnosi dei virus della vite, utilizzando un gran quantità di campioni in un ampio panorama di laboratori. Sulla base dell'attività svolta e dei risultati ottenuti, si può affermare che sia l'ELISA che la multiplex RT-PCR si sono dimostrati altamente validi, e il loro impiego ottimale è in funzione delle diverse esigenze e scopi diagnostici.